CN115724925A - 谷氨酸转运变体蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了谷氨酸转运变体蛋白及其应用。本发明通过定向进化的方法获得了谷氨酸外运能力提高的外运变体，并提供了一种生产L‑谷氨酸的方法，包括如下步骤：在受体菌中表达所述谷氨酸外运蛋白变体，得到重组菌；对所述重组菌进行发酵培养，从发酵液中获得谷氨酸。本发明为丰富谷氨酸外运的理解及提高生产中谷氨酸的产量奠定了基础。
Description
本申请是申请号为202010062047.6、申请日为2020年1月19日、发明创造名称为“一种生产L-谷氨酸的方法”的分案申请
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种谷氨酸转运变体蛋白及其应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌的历史始于20世纪50年代，当时日本科学家Kinoshita和Udaka分离出这种细菌并发现了它们分泌大量谷氨酸的能力。后来，用细菌发酵来生产谷氨酸，从而完全用生物过程取代化学合成。随后，该细菌不断被科学家研究，并利用其独特的生理学特性来改善谷氨酸的生产。此外，谷氨酸棒杆菌现已成为生产各种氨基酸的工业主力菌。在氨基酸市场中，广泛用作增味剂的L-谷氨酸市场规模巨大，每年生产总量约250万吨，占氨基酸生产总量的60％-70％左右。因此，研究如何提高谷氨酸的产量是十分必要的。
但近年来随着分子生物学的快速发展，分子生物学技术在谷氨酸研究领域的应用越来越广泛，大量谷氨酸发酵的机理被不断揭示。发现负责谷氨酸外运是由外运蛋白负责的，如：mscCG基因编码的外运蛋白。目前对于这类外运蛋白的研究较少，未发现通过突变提高其转运能力的文献。所以，通过对外运蛋白进行基因改造，筛选出外运谷氨酸能力较强的L-谷氨酸棒杆菌菌株，从而提高谷氨酸产量是非常有必要的。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种外运能力提高的谷氨酸外运蛋白变体及其编码基因和相关应用。
第一方面，本发明要求保护谷氨酸外运蛋白变体。
本发明所要求保护的谷氨酸外运蛋白变体，为将MscCG谷氨酸外运蛋白进行点突变后所得，突变位点含有(或为)如下中的部分或全部：自N端起第166位、第86位、第344位、第385位、第165位、第103位、第393位、第399位、第173位、第343位、第310位、第168位、第504位、第186位、第141位、第200位、第205位、第14位、第334位和第362位。
优选的，所述谷氨酸外运蛋白变体的氨基酸序列与仅含有上述各突变位点的序列相比具有95％以上的同一性。
进一步地，所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第166位。
更进一步，所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第166位、第86位、第344位、第385位。
进一步地，所述谷氨酸外运蛋白变体可为如下任一：
(A1)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第86位、第166位、第344位、第385位和第141位(对应突变体M7)；
(A2)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第86位、第166位、第344位、第385位、第200位和第205位(对应突变体M8)；
(A3)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第86位、第166位、第344位、第385位、第168位和第504位(对应突变体M5)；
(A4)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第86位、第166位、第344位、第385位和第186位(对应突变体M6)；
(A5)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第86位、第166位、第344位、第385位和第14位(对应突变体M9)；
(A6)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第166位和第310位(对应突变体M4)；
(A7)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第334位和第362位(对应突变体M10)；
(A8)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第165位(对应突变体M1)；
(A9)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第173位和第343位(对应突变体M3)；
(A10)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点(或如下位点)的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第103位、第393位和第399位(对应突变体M2)。
其中，所述MscCG谷氨酸外运蛋白可为来自于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的MscCG谷氨酸外运蛋白。
所述来自于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的MscCG谷氨酸外运蛋白的氨基酸序列具体如SEQ ID No.1所示。
在所述谷氨酸外运蛋白变体中，自N端起第166位的点突变具体为T166A、第86位的点突变具体为M86V、第344位的点突变具体为I344V、第385位的点突变具体为Y385C、第165位的点突变具体为E165G、第103位的点突变具体为A103T、第393位的点突变具体为I393V、第399位的点突变具体为R399C、第173位的点突变具体为T173A、第343位的点突变具体为V343E、第310位的点突变具体为S310P、第168位的点突变具体为I168T、第504位的点突变具体为Q504L、第186位的点突变具体为R186C、第141位的点突变具体为N141D、第200位的点突变具体为N200D、第205位的点突变具体为I205V、第14位的点突变具体为L14S、第334位的点突变具体为D334G、第362位的点突变具体为L362P。
对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸(野生型)，位置(即在SEQ ID No.1中的位置)，取代氨基酸。相应地，在SEQ ID No.1的第166位用丙氨酸取代原有的苏氨酸氨酸命名为“T166A”。
在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸外运蛋白变体具体为如下任一：
(a1)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：M86V、T166A、I344V、Y385C、N141D(对应突变体M7，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示)；
(a2)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：M86V、T166A、I344V、Y385C、N200D、I205V(对应突变体M8，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示)；
(a3)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：M86V、T166A、I344V、Y385C、I168T、Q504L(对应突变体M5，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示)；
(a4)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：M86V、T166A、I344V、Y385C、R186C(对应突变体M6，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示)；
(a5)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：M86V、T166A、I344V、Y385C、L14S(对应突变体M9，氨基酸序列如SEQ ID No.10所示)；
(a6)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：T166A、S310P(对应突变体M4，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)；
(a7)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：D334G、L362P(对应突变体M10，氨基酸序列如SEQ ID No.11所示)；
(a8)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：E165G(对应突变体M1，氨基酸序列如SEQID No.2所示)；
(a9)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：T173A、V343E(对应突变体M3，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示)；
(a10)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：A103T、I393V、R399C(对应突变体M2，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)。
第二方面，本发明要求保护谷氨酸外运蛋白变体相关的生物材料。
本发明所要求保护的谷氨酸外运蛋白变体相关的生物材料，可为如下任一：
(I)编码所述谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子；
(II)含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
其中，编码所述来自于谷氨酸棒杆菌的MscCG谷氨酸外运蛋白的核酸分子为SEQID No.12所示DNA分子。
进一步地，编码所述谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子具体为如下任一：
(B1)SEQ ID No.19所示DNA分子(对应突变体M7)；
(B2)SEQ ID No.20所示DNA分子(对应突变体M8)；
(B3)SEQ ID No.17所示DNA分子(对应突变体M5)；
(B4)SEQ ID No.18所示DNA分子(对应突变体M6)；
(B5)SEQ ID No.21所示DNA分子(对应突变体M9)；
(B6)SEQ ID No.16所示DNA分子(对应突变体M4)；
(B7)SEQ ID No.22所示DNA分子(对应突变体M10)；
(B8)SEQ ID No.13所示DNA分子(对应突变体M1)；
(B9)SEQ ID No.15所示DNA分子(对应突变体M3)；
(B10)SEQ ID No.14所示DNA分子(对应突变体M2)。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将所述“编码所述谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子”克隆到pTRCmob载体的多克隆位点SacI和BamHI之间得到的重组质粒。
所述重组菌可为含有所述核酸分子的谷氨酸棒杆菌。
第三方面，本发明要求保护前文所述谷氨酸外运蛋白变体或生物材料在如下任一中的应用：
(C1)生产谷氨酸；
(C2)提高谷氨酸产量；
(C3)提高谷氨酸外运能力；
(C4)生产味精、香料或食品添加剂；
(C5)制备代盐剂、营养增补剂或生化试剂。
第四方面，本发明要求保护一种生产谷氨酸和/或提高谷氨酸产量和/或提高谷氨酸外运能力的方法。
本发明所要求保护的生产谷氨酸和/或提高谷氨酸产量的方法，可包括如下步骤：在受体菌中表达前文所述的谷氨酸外运蛋白变体，得到重组菌；对所述重组菌进行发酵培养，从发酵液中获得谷氨酸。
进一步地，在所述受体菌中表达所述谷氨酸外运蛋白变体，可通过像所述受体菌中导入前文所述的“编码所述谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子”来实现。
更进一步地，所述“编码所述谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子”可通过重组载体的形式导入所述受体菌中。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将所述“编码所述谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子”克隆到pTRCmob载体的多克隆位点SacI和BamHI之间得到的重组质粒。
进一步地，所述受体菌为谷氨酸棒杆菌。
在所述方法中，所述发酵培养的培养基可为CGXII培养基，培养条件可为30℃、220r/min培养38h。
在本发明的具体实施方式中，是将所述重组菌接种于CGXII种子培养基中，以30℃、220r/min培养12h，然后以起始OD600为0.15的接种量接种于CGXII发酵培养基中，以30℃、220r/min培养38h。
在本发明中，所述谷氨酸具体为L-谷氨酸。
本发明通过定向进化的方法获得了谷氨酸外运能力提高的外运变体。相比于野生型，外运变体的外运能力提高。本发明所得谷氨酸外运蛋白变体更有利于提高谷氨酸的产量，为丰富谷氨酸外运的理解及提高生产中谷氨酸的产量奠定了基础。
附图说明
图1为在25mlCGXII发酵培养基中培养的外运变体与野生型谷氨酸产量对比图。
图2为在50mlCGXII发酵培养基中培养的外运变体与野生型谷氨酸产量对比图。
图3为在50mlCGXII发酵培养基中培养的外运变体与野生型谷氨酸产量对比图。
图1-3中标注MscCG的为野生型对照，纵坐标处“谷氨酸g/L”指的是每L发酵液中产L-谷氨酸的量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、谷氨酸外运蛋白的基因克隆
从谷氨酸棒杆菌的基因组中克隆出MscCG谷氨酸外运蛋白目的基因，基因序列如SEQ ID NO.12所示，然后连接到pTRCmob载体中，测序确定载体构建成功得到重组质粒，命名为pTRCmob-MscCG。
pTRCmob-MscCG的结构描述为：将SEQ ID NO.12所示DNA片段克隆到pTRCmob载体的酶切位点SacI和BamHI之间后得到的重组质粒。SEQ ID NO.12为野生型MscCG谷氨酸外运蛋白目的基因，编码SEQ ID NO.1所示的野生型MscCG谷氨酸外运蛋白。
实施例2、外运能力提高的谷氨酸外运蛋白突变体筛选
为了提高上述谷氨酸外运蛋白外运能力，以实施例1中构建得到的重组质粒pTRCmob-MscCG为模板，设计引物(上游引物：5′-ATGATTTTAGGCGTACCCAT-3′；下游引物：5′-CTAAGGGGTGGACGTCGGCG-3′)，加入Mn2+用PCR的方法对目的基因进行随机突变。将突变产物电转到谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，30℃过夜培养得到重组菌之后，将长出的单克隆分别用无菌牙签接种到96孔板中(含有150μl LBG培养基，25mg/ml Kana)，30℃、800rpm摇床培养45h后检测谷氨酸的产量。对检测结果进行分析，最终筛选出10株谷氨酸外运量提高的突变菌株，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10。
对上述各突变菌株进行基因测序，其具体的突变氨基酸位点，以及突变后的具体氨基酸序列和基因序列详见表1。
表1突变氨基酸位点
注：表中的氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸(野生型)，位置(即在SEQ IDNo.1中的位置)，取代氨基酸。相应地，在SEQ ID No.1的第166位用丙氨酸取代原有的苏氨酸氨酸命名为“T166A”。
实施例3、谷氨酸外运蛋白及其外运变体在谷氨酸棒杆菌中的表达
接种环刮取野生型和实施例2获得的表1中所示10个突变体的阳性菌接种于10mLCGXII种子培养基中，以30℃、220rpm在恒温培养摇床(上海知楚仪器有限公司，上海，中国)培养12h，然后以起始OD600为0.15的接种量分别接种于25ml CGXII发酵培养基和50mlCGXII发酵培养基中(接种到500ml的锥形瓶中)，以30℃、220rpm在恒温培养摇床(上海知楚仪器有限公司，上海，中国)培养。培养38h后离心收集发酵液，用SBA-40D生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所，山东，中国)测发酵液中L-谷氨酸的产量。
其中，CGXII种子培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：5g/L葡萄糖，20g/L硫酸铵，5g/L尿素，1g/L磷酸二氢钾，1.3g/L磷酸氢二钾，80g/L MOPS，0.01g/L氯化钙，0.25g/L硫酸镁，0.01g/L硫酸亚铁，0.01g/L硫酸锰，0.001g/L硫酸锌，0.2mg/L硫酸铜，0.02mg/L氯化镍，0.03g/L二羟基苯甲酸，2.5μg/L生物素，0.1mg/LThiamine HCL VB1。
CGXII发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：80g/L葡萄糖，20g/L硫酸铵，5g/L尿素，1g/L磷酸二氢钾，1.3g/L磷酸氢二钾，80g/L MOPS，0.01g/L氯化钙，0.25g/L硫酸镁，0.01g/L硫酸亚铁，0.01g/L硫酸锰，0.001g/L硫酸锌，0.2mg/L硫酸铜，0.02mg/L氯化镍，0.03g/L二羟基苯甲酸，1μg/L生物素，0.1mg/L Thiamine HCL VB1。
检测结果如图1、图2、图3所示。图1是在25ml CGXII发酵培养基中培养的，结果表明外运变体M2、M6、M7、M10谷氨酸的产量分别比野生型谷氨酸的产量高33.3％、37.5％、33.3％、25％。图2是在50ml CGXII发酵培养基中培养的，结果表明外运变体M5、M8、M9谷氨酸的产量分别是野生型谷氨酸产量的4.4倍、6.6倍、5.2倍。图3是在50ml CGXII发酵培养基中培养的，结果表明外运变体M1、M3、M4、谷氨酸的产量分别比野生型谷氨酸的产量高50％、50％、25％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.谷氨酸外运蛋白变体，为将MscCG谷氨酸外运蛋白进行点突变后所得，突变位点含有如下中的部分或全部：自N端起第165位、第103位、第393位、第399位、第173位、第343位、第334位和第362位。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸外运蛋白变体，其特征在于：所述谷氨酸外运蛋白变体为如下任一：
(A1)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第334位和第362位；
(A2)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第165位；
(A3)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第173位和第343位；
(A4)所述谷氨酸外运蛋白变体为将所述MscCG谷氨酸外运蛋白的至少如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第103位、第393位和第399位。
3.根据权利要求1或2所述的谷氨酸外运蛋白变体，其特征在于：所述MscCG谷氨酸外运蛋白为来自于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的MscCG谷氨酸外运蛋白。
4.根据权利要求3所述的谷氨酸外运蛋白变体，其特征在于：所述来自于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的MscCG谷氨酸外运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.根据权利要求1-4中任一所述的谷氨酸外运蛋白变体，其特征在于：在所述谷氨酸外运蛋白变体中，自N端起第165位的点突变为E165G、第103位的点突变为A103T、第393位的点突变为I393V、第399位的点突变为R399C、第173位的点突变为T173A、第343位的点突变为V343E、第334位的点突变为D334G、第362位的点突变为L362P。
6.根据权利要求1-5中任一所述的谷氨酸外运蛋白变体，其特征在于：所述谷氨酸外运蛋白变体为如下任一：
(a1)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：D334G、L362P；
(a2)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：E165G；
(a3)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：T173A、V343E；
(a4)所述谷氨酸外运蛋白变体为将SEQ ID No.1所示的MscCG谷氨酸外运蛋白的如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：A103T、I393V、R399C。
7.谷氨酸外运蛋白变体相关的生物材料，为如下任一：
(I)编码权利要求1-6中任一所述的谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子；
(II)含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于：编码所述来自于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的MscCG谷氨酸外运蛋白的核酸分子为SEQ ID No.12所示DNA分子；
进一步地，编码所述谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子为如下任一：
(B1)SEQ ID No.22所示DNA分子；
(B2)SEQ ID No.13所示DNA分子；
(B3)SEQ ID No.15所示DNA分子；
(B4)SEQ ID No.14所示DNA分子；
和/或
所述重组菌为含有所述核酸分子的谷氨酸棒杆菌。
9.权利要求1-8中任一所述的谷氨酸外运蛋白变体或生物材在如下任一中的应用：
(C1)生产谷氨酸；
(C2)提高谷氨酸产量；
(C3)提高谷氨酸外运能力；
(C4)生产味精、香料或食品添加剂；
(C5)制备代盐剂、营养增补剂或生化试剂。
10.一种生产谷氨酸和/或提高谷氨酸产量和/或提高谷氨酸外运能力的方法，包括如下步骤：在受体菌中表达权利要求1-6中任一所述的谷氨酸外运蛋白变体，得到重组菌；对所述重组菌进行发酵培养，从发酵液中获得谷氨酸；
进一步地，在所述受体菌中表达所述谷氨酸外运蛋白变体，是通过像所述受体菌中导入权利要求7或8中所述的“编码所述谷氨酸外运蛋白变体的核酸分子”来实现的；和/或
进一步地，所述受体菌为谷氨酸棒杆菌。
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