JP2001252081A - 光合成微生物によるｌ−グルタミンの生産法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決課題】 光合成細菌、緑藻類等の光合成微生物に
L-グルタミンを生産させ、細胞内に蓄積した、および／
または細胞外に分泌されたL-グルタミンを回収すること
によるL-グルタミンを生産する方法を提供する。 【解決手段】 Fd-GOGAT欠損光合成微生物を高濃度の二
酸化炭素下および／または強光下で培養することを特徴
とする、L-グルタミンの生産方法。特に、照度70〜250
μEm^-2s^-1、二酸化炭素濃度0.5〜２％(v/v)で前記光合
成微生物を培養する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は光合成微生物により
L-グルタミンを生産する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、L-グルタミンは主としてブレビバ
クテリウム属、コリネバクテリウム属に属するグルタミ
ン生産菌を用いた発酵法により製造されてきた。その生
産菌は、グルタミン酸生産菌を親株として、サルファグ
アニジン耐性、ケトマロン酸耐性、チロシルグルタミン
酸耐性などを付与することにより育種されてきている。
また、培地中にマンガンイオンを含まないことがL-グル
タミン高蓄積の上で重要であることも知られている。高
等植物においては、光呼吸変異株としてフェレドキシン
依存型グルタミン酸合成酵素(以下Fd-GOGATと略す)遺伝
子欠損シロイヌナズナ（Somervilleら、Nature 286:25
7-259(1980)）およびオオムギ（Kendallら、Planta 16
8:316-323(1986)）についての研究があり、その生育に
は、低酸素濃度(例えば1％程度)または高二酸化炭素濃
度(例えば0.8％程度)の環境が必須である。これらの変
異株は空気中では、光呼吸障害のため最終的には枯れて
しまう。オオムギの例では、この条件で生育させた植物
を空気中に戻した場合に、一過的（1週間程度）にL-グ
ルタミンやL-アスパラギンが増加するとの報告（Kendal
lら、Planta 168:316-323(1986)）があるが、この状態
での栽培の継続は前述したように光呼吸障害のため極め
て困難であり、これらの植物を高グルタミン含有素材と
して利用するのは実用的には困難である。また、これら
の植物は高CO₂濃度下ではL-グルタミンやL-アスパラギ
ン酸の蓄積を起こさないことが知られている（Kendall
ら、前述）。

【０００３】一方、光合成細菌、緑藻類などの光合成微
生物では、ChlamydomonasでL-アスパラギン酸、L-ロイ
シン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシ
ン、L-バリンの蓄積、EuglenaでL-アラニン、L-グルタ
ミン酸、L-プロリン、L-セリンの蓄積に関する報告（Vo
gelら、J. Phycol. 14:403-406(1978)）をはじめ、Anab
aenaでL-フェニルアラニン、L-スレオニン、L-グルタミ
ン酸やグリシン等のアミノ酸の細胞外蓄積例（Antarika
nondaら、Curr. Microbiol. 11:191-195(1984)）、Syne
chococcusの菌体を固定化した高密度培養により、L-グ
ルタミン酸を蓄積させた例（松永是ら、特開平6-98785
(1994）、Matsunagaら、Appl. Microbiol.Biotechnol.
28:373-376 (1988))や、アミノ酸アナログ耐性を付与し
た光合成微生物でのアミノ酸蓄積に関する報告がある。
アナログ耐性付与の例としては、Anacystisでは、アザ
ロイシンやフルオロチロシン耐性（Bagchiら、J. Micro
biol. Biotechnol. 7:341-344(1997)）、Phormidiumで
は、フルオロフェニルアラニン、アザトリプトファン、
フルオロチロシン、アザロイシン耐性（Raoら、WorldJ.
Microbiol. Boitechnol. 11:665-668 (1995)）、Anaba
enaでは、D-α-アミノ酪酸や1,2,4-トリアゾール-3-ア
ラニン耐性（Thomasら、Appl. Biochem.Biotechnol. 3
7:111-121 (1992)）、Spirulinaでは、5-フルオロトリ
プトファン、β-2-チエニルアラニン、エチオニン、p-
フルオロフェニルアラニン、アゼチジン-2-カルボン酸
耐性（Ricardiら、J. Bacteriol. 147:1002-1007 (198
1)）等で、対応アミノ酸の蓄積が報告されている。しか
しながら、L-グルタミンを蓄積させた例は、出願人の知
る限りにおいてこれまで見当たらない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、光合
成細菌、緑藻類等の光合成微生物菌体内にL-グルタミン
を高濃度に蓄積させる方法を提供し、それによってL-グ
ルタミンを生産する方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ラン藻の
変異株によるL-グルタミンの蓄積について鋭意研究を重
ねた結果、Fd-GOGAT活性が欠損若しくは低下した変異株
が、二酸化炭素通気、強光下で培養した場合にその細胞
内にL-グルタミンを蓄積することを見出し、本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明は、Fd-GOGAT欠損光
合成微生物を高濃度の二酸化炭素下および／または強光
下で培養することを特徴とする、L-グルタミンの生産方
法である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明において使用する微生物は
光合成微生物一般であるが、ラン藻類、クラミドモナス
（Chlamydomonas）、クロレラ（Chlorella）等が好まし
く、特にラン藻類（以後、シアノバクテリアという）が
好ましい。これらの光合成微生物において、Fd-GOGATが
欠損したL-グルタミン生産能を有する変異株は例えば以
下のようにして調製される。Fd-GOGAT遺伝子に変異を導
入するためには、前記の出発親株に通常の変異処理法、
例えばX線や紫外線の照射あるいはN-メチルN'-ニトロ-N
-ニトロソグアニジン（以下、NGと略す）やエチルメタ
ンスルフォン酸（以下EMSと略す）等の変異剤に接触せ
しめる等の方法を使用することができる。あるいは、遺
伝子工学的手法、例えば遺伝子組換え法を用いることに
よっても目的の変異を効率よく導入することが出来る。
このような方法のためには、一般に種々の光合成微生物
について知られた分子生物学的手法の何れもが利用可能
であるが、本方法において使用されるFd-GOGAT欠損変異
株のFd-GOGAT活性は充分に低下していることが必要であ
り、Fd-GOGAT遺伝子の発現が低下していることが好まし
く、Fd-GOGAT遺伝子が完全に破壊されていることが最も
好ましい。

【０００７】本発明の目的を達成するための遺伝子導入
法および導入条件、あるいは適切なベクター等は、導入
される光合成微生物に応じて最適な方法が選択されるこ
とが好ましい。そのような方法は当業者によく知られた
ものである。例えばシアノバクテリアの場合、遺伝子組
換え法によるFd-GOGAT活性の欠損株の取得方法はH.Okuh
araら、Plant Physiol, 120, 1999, 33-41に記載された
通りに行うことができる。簡単に言えば、以下の通りで
ある。既に明らかにされているFd-GOGAT遺伝子（以下、
glsF遺伝子と略す）の塩基配列、例えばトウモロコシの
glsF遺伝子の塩基配列（Sakakibaraら、J. Biol. Chem.
266:2028-2035(1991)）に基づいてプライマーを合成
し、シアノバクテリア染色体DNAを鋳型にしてPCR法によ
りglsF遺伝子を増幅し、適切な制限酵素切断部位を利用
して薬剤耐性遺伝子をglsF遺伝子内に挿入し、機能を失
ったglsF遺伝子を作製する。この場合の薬剤耐性遺伝子
は形質転換体選抜マーカーとして利用される。

【０００８】次に、このキメラ遺伝子をFujitaらの方法
(Plant Cell Physiol 33:81-92(1992))によりエレクト
ロポレーション法でシアノバクテリア細胞に導入し、相
同組換えを利用して染色体上のglsF遺伝子を薬剤耐性遺
伝子の挿入によりその機能を失ったglsF遺伝子に置換
し、目的とするFd-GOGAT欠損株を得ることができる（図
１）。このようにして作製された形質転換体は、前述の
薬剤耐性をマーカーとして１次選抜することができる。
さらに、染色体上のglsF遺伝子がマーカー遺伝子の挿入
によって破壊されていることは、既知の種々の方法で確
認することができる。例えば、Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版 (1
989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spr
ing Harbor, New York等に記載されているようなストリ
ンジェントな条件でサザンハイブリダイゼーションを行
い、あるいはPCRによって対応する領域を増幅し、増幅
またはハイブリダイズした断片の大きさを測定すること
等により、あるいは、適当な制限酵素による切断パター
ンの相違および生成断片の大きさ等を測定することによ
り、glsF遺伝子が薬剤耐性遺伝子の挿入によって破壊さ
れていることが容易に確認できる。このような手順は、
シアノバクテリア以外の他の光合成微生物に対しても同
様に適用可能であり、プライマーの配列、遺伝子導入方
法および条件、選抜マーカー等は必要に応じて最適なも
のを選択することができる。

【０００９】また、シアノバクテリアの場合には、野生
株に変異処理を施した後、目的変異株選抜のためのより
直接的な手段として次のような方法が使用できる。すな
わち、Fd-GOGAT活性が欠損若しくは低下した変異株は、
通常の条件（通常の大気および弱光条件下、例えば、照
度約25μE m^-2 s^-1）では緑色に生育し、特定の条件
（高濃度の二酸化炭素、例えば約２％CO₂、および強光
条件下、例えば照度約165μE m^-2 s^-1）で培養すると黄
色に生育する（Okuharaら、Plant Physiol. 120:33-41
(1999)）。これらの現象を指標として目的変異株の選抜
が可能である。以上のようにして得られるFd-GOGAT活性
が欠損した変異株の具体例としては、以下の実施例で使
用したプレクトネマ・ボリアヌム（Plectonema boryanu
m）IAM-M101glsF::Km^rが挙げられる。これらのFd-GOGAT
欠損株のFd-GOGAT活性は例えばMartinらの方法(Anal. B
iochem., 125:24-29(1982))により測定することができ
る。

【００１０】Fd-GOGAT活性が欠損若しくは低下したL-グ
ルタミン生産能を有する変異株を用いてL-グルタミンを
生産せしめるには、窒素源、無機塩類、微量金属イオ
ン、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微
量栄養素を含有する通常の培地を用いて常法により（田
宮博ら、藻類実験法、p46-68(1965)、南江堂）行なうこ
とができる。この培地中、窒素源としては、アンモニ
ア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のア
ンモニウム塩又は硝酸塩等を使用することができる。無
機塩類としては例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩、鉄塩等が使用される。微量金属としては、
ホウ素、マンガン、亜鉛、モリブデン、銅、コバルトを
使用することができる。一般には、本発明で使用する光
合成微生物は実施例で示したシアノバクテリアを含めて
完全独立栄養生物であるので有機微量栄養素を必要とし
ないが（但し、鉄イオン供給のためにクエン酸第２鉄ア
ンモニウムを使用する）、栄養要求変異株を使用する場
合は必要な栄養素を補給することが必要である。また、
Fd-GOGATをコードする遺伝子を破壊するため、および選
抜マーカーとして使用する薬剤耐性遺伝子等に応じて、
抗生物質等の物質が添加されることがある。

【００１１】具体的な培養方法において、例えば培養容
器としては扁平型藻類培養ビンを使用することができ、
窒素源としてNaNO₃を使用し、K₂HPO₄・3H₂O、MgSO₄・7H
₂O、CaCl₂・2H₂O、Na₂CO₃、クエン酸第２鉄アンモニウ
ム、EDTAの他、ホウ素、マンガン、亜鉛、モリブデン、
銅、コバルト等の微量金属イオンを含む培地（pH7.5前
後）で、照明下（25〜250μEm^-2s^-1）、通常の大気条件
の空気または二酸化炭素を補填した空気を通気しながら
25℃〜30℃にて培養する。本発明においては、一般には
光合成微生物は充分量の培養細胞を用意するため弱光下
で培養され、その後各々の光合成微生物種に応じた照度
の強光条件に移される。シアノバクテリアの場合は、例
えば照度約25μEm^-2s^-1〜約50μEm^-2s^-1で前培養され、
次にL-グルタミン産生のために強光条件に移される。シ
アノバクテリアにおけるL-グルタミンの産生のために
は、強光条件下、すなわち、照度が約70〜約250μEm^-2s
^-1で培養することが好ましく、照度約100〜約250μEm^-2
s^-1であることがより好ましく、特に約160〜約250μEm
^-2s^-1であることが更に好ましい。他の光合成微生物の
場合は、通常培養する際の照度を基準として、シフトす
べき照度が設定される。例えば、緑藻類などは通常培養
条件においてシアノバクテリアよりも高い照度が適切で
あることから、シフトすべき照度もそれに応じて高いこ
とが要求される。

【００１２】通気は通常の大気条件よりも高い濃度で二
酸化炭素を含み、約0.5〜約２％(v/v)で含むことが好ま
しく、特に二酸化炭素濃度が約１〜２％(v/v)の条件下
で培養することが好ましい。更に好ましい条件は、照度
が約70〜約250μEm^-2s^-1であり、かつ、通気される空気
の二酸化炭素濃度が約0.5〜約２％(v/v)である。また、
特に好ましい培養条件は、照度が約100〜約250μEm^-2s
^-1であり、かつ、通気される空気が約１〜２％(v/v)の
濃度で二酸化炭素を含む条件である。このような強光
下、高二酸化炭素濃度下で約６〜約24時間培養すること
により微生物細胞内に多量のL-グルタミンが蓄積され
る。

【００１３】培養終了後の菌体または培養液からのL-グ
ルタミンの回収は公知の方法によって行なうことができ
る。例えば、遠心濾過分離を使用してL-グルタミン高含
有微生物細胞を回収し、回収された微生物細胞を適当な
緩衝液中に懸濁した後、既知の適切な方法、例えば超音
波処理、過塩素酸処理等によって破壊し、更に遠心等に
よって細胞破砕物を除去した後、破砕微生物細胞および
細胞抽出物を含む溶液を公知の精製手段、例えば濃縮晶
析、イオン交換クロマトグラフィー等で処理することに
よってL-グルタミンを得ることができる。L-グルタミン
を高蓄積した光合成微生物細胞それ自体をL-グルタミン
高含有食品素材として利用してもよい。培養液から回収
する場合は、菌体を遠心分離で除去した後、濃縮晶析す
る方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によっ
てL-グルタミンを得ることができる。あるいは、培養液
と菌体とを分離せずに菌体を破砕し、細胞破砕物を除去
した後上述の公知の方法によってL-グルタミンを得るこ
ともできる。

【００１４】

【実施例】実施例１．プレクトネマ・ボリアヌム（P.bo
ryanum）IAM-M101株の染色体DNA上のglsF遺伝子の破壊 （１）相同組換えによるglsF遺伝子の破壊 Fd-GOGAT活性の欠損株の取得方法は、H.Okuharaら、Pla
nt Physiol, 120, 1999, 33-41に記載された方法に準じ
て行なった（図１）。最初に以下の手順に従って、プレ
クトネマ・ボリアヌムのFd-GOGAT遺伝子,glsF（配列番
号１；アミノ酸配列は配列番号２）をクローニングし
た。すなわち、既に明らかにされているトウモロコシの
glsF遺伝子（Sakakibaraら、J. Biol.Chem. 266:2028-2
035(1991)）の塩基配列に基づいて縮退したプライマー
（5'-CC(ACGT)CA(TC)CA(TC)GA(TC)AT(TC)TA-3'：配列番
号３、および、5'-CC(ACGT)CC(AGCT)AT(AG)TA(CT)TC(A
G)CA-3'：配列番号４）を合成し、染色体DNAを鋳型にし
てPCR法によりglsF遺伝子の一部を含むDNA断片を得た。
なお、カッコ内に記載した塩基配列部分は縮退している
ことを示す。次に、この断片をプローブとして、P. bor
yanumの約９〜22kbpのゲノムDNA断片を含むλファージ
ゲノムライブラリー（H.Okuharaら、Plant Physiol, 12
0, 1999, 33-41）をスクリーニングし、完全長glsF遺伝
子配列（配列番号１）を含むクローンを同定した。次
に、薬剤耐性遺伝子(neo遺伝子)をこのクローンに含ま
れるglsF遺伝子のNheI部位へ挿入し、機能を失ったglsF
遺伝子を作成した。この遺伝子配列を有するクローンに
おけるneo遺伝子の挿入位置と方向を図１に示した。以
下では、neo遺伝子の挿入によって機能を失ったこの遺
伝子をglsF::Km^rと表す。ついでこのクローンを制限酵
素で切断し、直線状にしたDNA断片をエレクトロポレー
ション法によりP. boryanumへ導入し、相同組換えを利
用して染色体上のglsF遺伝子をglsF::Km^r遺伝子に置換
した。

【００１５】前述のようにしてneo遺伝子を導入したプ
レクトネマ・ボリアヌムをKm（カナマイシン）(15μg/m
l)を含む寒天培地上に広げ、前記培地上で生育するクロ
ーンを選抜した。培養温度は30℃とし、照射光の強度は
25μEm^-2s^-1とした。このような方法に従って、glsF遺
伝子が破壊され、かつ、カナマイシン耐性を有する株と
して分離したプレクトネマ・ボリアヌムIAM-M101の候補
をいくつか得た。 以下において、glsF遺伝子が破壊さ
れ、かつ、カナマイシン耐性を有する株として分離した
プレクトネマ・ボリアヌムIAM-M101 をプレクトネマ・
ボリアヌムIAM-M101 glsF::Km^r株と表記する。 ＜配列表フリーテキスト＞ 配列番号３，４：glsF遺伝子増幅のためのPCRプライマ
ー

【００１６】（２）サザンハイブリダイゼーションによ
るglsF遺伝子破壊の確認 次に、プレクトネマ・ボリアヌムIAM-M101 glsF::Km^r候
補株から常法に従ってDNAを抽出し、制限酵素EcoRIまた
はHindIIIで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行
ない、ストリンジェントな条件でサザンハイブリダイゼ
ーションを行なうことにより、これらの株において、目
的の位置、即ちglsF遺伝子中にKm耐性遺伝子が導入さ
れ、glsFが破壊されていることを確認した。プローブは
glsF遺伝子のHindIIII断片（図１のFH2断片）を使用し
た。

【００１７】（３）野生株およびglsF遺伝子破壊株のFd
-GOGAT活性の測定 プレクトネマ・ボリアヌムIAM-M101 glsF::Km^r株ならび
に野生株IAM-M101株のFd-GOGAT活性をMartinらの方法
（Anal. Biochem.,125:24-29 (1982)）に従い、グルタ
ミン酸生成量を指標として測定した。最初に、アッセイ
用の細胞抽出液を以下のように調製した。すなわち、P.
boryanum細胞をPMSF存在下で超音波処理し、４℃にて１
時間、100,000gで遠心した。この遠心上清をNap-10カラ
ムにかけて低分子物質を除き、アッセイ用細胞抽出液と
した。次に100mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）、５
mMグルタミン、５mM２−オキソグルタル酸、40μMフェ
レドキシン、10mM亜ジチオン酸ナトリウムからなる反応
液に適量の酵素液、すなわち前述の細胞抽出液を加えて
合計200μlとし、30℃にて30分間反応させ生成したグル
タミン酸を以下のように定量した。

【００１８】反応終了後酵素を熱失活させた後、遠心上
清20μlとo-フタルアルデヒド(OPA)溶液（4mM OPA、360
mMホウ酸緩衝液、pH9.5、10％(v/v)メタノール、２％(v
/v)メルカプトエタノール）100μlと混合し、25℃で10
分間反応させた。この反応液を10μlとり、SynCropak C
18カラム（100x2.1mm）を用いてグルタミンとグルタミ
ン酸を分離し（溶媒：22％(v/v)メタノール、２％(v/v)
テトラヒドロフランを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ7.0））、340nmの吸光度で定量した。NADH-GOGAT
の場合は、フェレドキシン(Fd)を含まない混合液を使用
し、亜ジチオン酸ナトリウムの代わりに20μlの10mMNAD
Hを添加した。反応物の分析は高速液体クロマトグラフ
ィーによって行なった。この酵素活性測定結果を以下の
表１に示す。

【００１９】

【表１】表１．野生株およびglsF::Km^r株におけるGOGAT
活性 単位：nmol グルタミン酸・min^-1・mg^-1タンパク質^a ：検出限界以下 表１から明らかなように、プレクトネマ・ボリアヌムIA
M-M101 glsF::Km^r株ではフェレドキシン（Fd）を電子供
与体とした場合には、GOGAT活性は検出されなかった。
すなわち、プレクトネマ・ボリアヌムIAM-M101 glsF::K
m^r株はFd-GOGATを欠損している株である。

【００２０】実施例２．Fd-GOGAT欠損株プレクトネマ・
ボリアヌムIAM-M101 glsF::Km^r の培養評価（１） （１）培地および培養条件 実施例１で得られたFd-GOGAT欠損株プレクトネマ・ボリ
アヌムIAM-M101 glsF::Km^rおよび野生株を照度以外の培
養条件を一定に保ち、低照度条件、および後には強光条
件下で培養し、そのL-グルタミン生産能を評価した。使
用した培養条件は以下の通りである。すなわち、東京理
化機器(EYELA)の培養棚（MLS-2000）を用い、同社製の
扁平型藻類培養ビン（MAB-2000）に必要に応じてカナマ
イシンを15μg/lの濃度で添加した表２の組成の培地（p
H7.4〜7.5）を600ml張り込み、同培地で前培養したプレ
クトネマ・ボリアヌムIAM-M101 glsF::Km^rを２％(v/v)
接種し、光照射下（25μEm^-2s^-1）、二酸化炭素濃度２
％(v/v)になるように補填した空気を通気しながら30℃
にて培養した。

【００２１】

【表２】表２．培地組成 ^* 微量金属溶液組成（１Lあたり）：H₃BO₄ 2.86g、MnCl
₂・4H₂O 1.81g、ZnSO₄・7H ₂O 0.22g、Na₂MoO₄・2H₂O 0.39
g、CuSO₄・5H₂O 79mg、Co(NO₃)₂・6H₂O 49mg

【００２２】（２）アミノ酸分析 野生株およびFd-GOGAT欠損株を上記の条件（照度25μEm
^-2s^-1）で培養し、各々のクロロフィル濃度が3.8 mg ml
^-1及び2.7 mg ml^-1に達した時点（表３中の０分）で、
光強度のみを照度165μEm^-2s^-1にシフトさせて培養を継
続し、経時的に5mlの培養液を1mlの35% HClO₄の入った5
0ml容ファルコンチューブに取り、撹拌し、過塩素酸処
理により細胞を破壊した。細胞残渣を含む抽出物を氷中
でそのまま15分以上保持した後、2.6N KOHを加え中和
し、遠心上清をアミノ酸分析に供した。アミノ酸分析
は、日立高速アミノ酸分析計（L-8800）を用いて行っ
た。表３に示す通り、野生株に比較してFd-GOGAT欠損株
では照度シフト後約３０分から少なくとも６時間に亘っ
て時間の経過と共に著しいL-グルタミンの増加が見られ
た。

【表３】表３．野生株およびFd-GOGAT欠損株におけるア
ミノ酸含量

【００２３】

【表４】表３．続き ^*：０分にて光強度を25μEm^-2s^-1から165μEm^-2s^-1にシ
フト^a ：測定限界以下

【００２４】実施例３．Fd-GOGAT欠損株プレクトネマ・
ボリアヌム IAM-M101 glsF::Km^r の培養評価（２） （１）菌株および培養条件 菌株はFd-GOGAT欠損株および、比較のために野生株、NA
DH-GOGAT欠損株を使用した。実施例２と同じ培養装置
（東京理化機器製培養棚MLS-2000）を用い、扁平型藻類
培養ビン(MAB-2000)に表２の組成の培地(pH7.4〜7.5)を
600ml張り込み、同培地で前培養した種菌12mlを各菌株
毎に２本ずつ接種し、光照射下(35μEm^-2s^-1)で二酸化
酸素濃度が２％(v/v)になるように補填した空気を通気
しながら30℃で20時間培養を行なった。

【００２５】（２）アミノ酸分析 他の培養条件は不変のまま、各菌株の一方の培養ビンに
ついて光量を160μEm^{- 2}s^-1に上げ、他方は35μEm^-2s^-1
のままで更に24時間培養を続けた。培養６時間後および
24時間後にサンプリングし、濁度(A₇₅₀)およびクロロフ
ィル量の測定を行ない、実施例２に示した方法でアミノ
酸分析用の試料を調製して菌体込のアミノ酸を定量し
た。その結果を表４に示す。更に24時間後のサンプルに
ついては、遠心分離により上清（培地）と沈殿（菌体）
に分別し、各々の試料についてもアミノ酸分析を行なっ
た。その結果を表５に示す。

【００２６】

【表５】表４．野生株、Fd-GOAGTおよびNADH-GOGAT欠損
株におけるアミノ酸含量 −^a：測定限界以下

【００２７】

【表６】表５．培地および菌体中のアミノ酸量 −^a：測定限界以下

【００２８】表４より明らかなように、L-グルタミンの
蓄積はFd-GOGAT欠損株を強光度にシフトして培養したと
きに生じるが、野生株やNADH-GOGAT欠損株では蓄積は起
こらない。また表５に示されているように、L-グルタミ
ンはかなりの割合で菌体内に蓄積する 微生物の寄託 プレクトネマ・ボリアヌム（Plectonema boryanum）IAM
-M101 glsF::Km^r株をAJ13689と名づけ通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに
寄託（受託番号FERM P-17768）した。

【発明の効果】本発明の方法により、光合成微生物にL-
グルタミン生産能を付与することができ、得られた光合
成微生物を特定条件で培養することによりL-グルタミン
を高濃度に細胞内蓄積させることができる。また、産生
されたL-グルタミンの一部は培養液中に分泌される。従
って、本発明により、比較的簡単な培養条件で光合成微
生物を培養することにより、その培養菌体および／また
は培養液から多量のL-グルタミンを得ることが可能とな
る。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> A method of producing L-glutamine by photosynthetic microorganism s <130> Y1G-0866 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 6063 <212> DNA <213> Plectonema boryanum <220> <221> CDS <222> (542)..(5194) <400> 1 tctagacaag atttcgtgaa agagattccg caatacctgc ggtattttac tgcgatcgtc 60 caaaggtgaa actatcaaca aaccataact ttcctcaggg gactttatgg gaatctactg 120 gctcagcaaa gcgattgggc tgagaacgtc agtctatttc agttgaaacc gcaattttac 180 agggattgtc agaagtcaaa attttctata atattcttaa tccggtcttt ataaaaattc 240 agtcaagcta agatctcttc ggcgattggg tataggctgg ctagttcagc tctgataaat 300 ctgacatcac catgaacgag tgaatggttt ctcagacttg aggtttggca acagatttgg 360 ctgttttgtt gtgatagatc ttttacgatg ccttcgtcac aggtaagcgt ggctacagaa 420 ctgcttgacg agcagaatct tttccttgat tgttaagttt atgtgatcgt tcttctcctt 480 tcttcataaa agtttctcaa gtcccagcgc tctccgttct aaccctcaaa ttctcattga 540 a atg aat cga atc aat cca ccc atg agt caa gca agt gtt ccg tct ccg 589 Met Asn Arg Ile Asn Pro Pro Met Ser Gln Ala Ser Val Pro Ser Pro 1 5 10 15 aat gaa tct cag tca atc tcg aat gga tat gca ggg cag cgc tgg tta 637 Asn Glu Ser Gln Ser Ile Ser Asn Gly Tyr Ala Gly Gln Arg Trp Leu 20 25 30 gtc gag gaa cgc gat gcc tgt gga gtt ggt ttt att gtc gat cag caa 685 Val Glu Glu Arg Asp Ala Cys Gly Val Gly Phe Ile Val Asp Gln Gln 35 40 45 ggt cga gcc agt cat gat ctg atg tcc aaa gcg ctg att gcc ctg tct 733 Gly Arg Ala Ser His Asp Leu Met Ser Lys Ala Leu Ile Ala Leu Ser 50 55 60 tgt atg gag cat cgg ggc gga tgc agc gcg gat caa gac tcc gga gac 781 Cys Met Glu His Arg Gly Gly Cys Ser Ala Asp Gln Asp Ser Gly Asp 65 70 75 80 ggc gcg ggt gtg atg gca gaa att cct tgg gag att ctg aat caa tgg 829 Gly Ala Gly Val Met Ala Glu Ile Pro Trp Glu Ile Leu Asn Gln Trp 85 90 95 gca agc gat cgc ggt gtg acg ctc aag ccc ggt tat acc gga gtt ggc 877 Ala Ser Asp Arg Gly Val Thr Leu Lys Pro Gly Tyr Thr Gly Val Gly 100 105 110 atg gtt ttc ttg cca caa gac tct gcg atc gcg gct gaa aca aaa cag 925 Met Val Phe Leu Pro Gln Asp Ser Ala Ile Ala Ala Glu Thr Lys Gln 115 120 125 gtc gca gag aaa att att gct gaa gaa ggg ctg acc ctt tta ggt tgg 973 Val Ala Glu Lys Ile Ile Ala Glu Glu Gly Leu Thr Leu Leu Gly Trp 130 135 140 cga agc gtt cca gtc caa ccc gaa gtt tta ggc gtt caa gct cga gac 1021 Arg Ser Val Pro Val Gln Pro Glu Val Leu Gly Val Gln Ala Arg Asp 145 150 155 160 aat cag ccg ctg att gaa cag tta att gtg cag tct gaa gtt gcc gat 1069 Asn Gln Pro Leu Ile Glu Gln Leu Ile Val Gln Ser Glu Val Ala Asp 165 170 175 gaa gaa tta gag cgc aag ctt tat gtt gct cgc aaa cgc att cat cgc 1117 Glu Glu Leu Glu Arg Lys Leu Tyr Val Ala Arg Lys Arg Ile His Arg 180 185 190 aca ctt gca gta aga cct gaa gcc gga ttt gat gag ctt tat gtt tgc 1165 Thr Leu Ala Val Arg Pro Glu Ala Gly Phe Asp Glu Leu Tyr Val Cys 195 200 205 tct ttc tcg acg cgg acg atc gtg tac aag ggc atg gtg cga tcg gag 1213 Ser Phe Ser Thr Arg Thr Ile Val Tyr Lys Gly Met Val Arg Ser Glu 210 215 220 att tta ggc aag ttc tat ctt gac ttg caa aat cca gaa tac aaa acc 1261 Ile Leu Gly Lys Phe Tyr Leu Asp Leu Gln Asn Pro Glu Tyr Lys Thr 225 230 235 240 acc ttc gcg ctg tat cac cgc agg ttt agt acc aac aca atg ccg aag 1309 Thr Phe Ala Leu Tyr His Arg Arg Phe Ser Thr Asn Thr Met Pro Lys 245 250 255 tgg caa ctc gcg cag ccg atg cga ttg ctc ggt cat aac ggc gaa att 1357 Trp Gln Leu Ala Gln Pro Met Arg Leu Leu Gly His Asn Gly Glu Ile 260 265 270 aac acc cag ttg ggc aat gtc aac tgg atg aga gcg cga gaa gcg gat 1405 Asn Thr Gln Leu Gly Asn Val Asn Trp Met Arg Ala Arg Glu Ala Asp 275 280 285 tta gcg cat gag gtt tgg ggc gat cgc att gat ctg ctc aaa cca act 1453 Leu Ala His Glu Val Trp Gly Asp Arg Ile Asp Leu Leu Lys Pro Thr 290 295 300 gtg aat tcc aac aac agt gat tcc gcg aat ttg gac aac gtg atg gaa 1501 Val Asn Ser Asn Asn Ser Asp Ser Ala Asn Leu Asp Asn Val Met Glu 305 310 315 320 ttg tta gtg cga tct gga cgt agc ccg gtc gaa gcg cta atg atg atg 1549 Leu Leu Val Arg Ser Gly Arg Ser Pro Val Glu Ala Leu Met Met Met 325 330 335 gtt cca gaa gcg tac aag aac cag ccg gaa cta gca gat cac cct gaa 1597 Val Pro Glu Ala Tyr Lys Asn Gln Pro Glu Leu Ala Asp His Pro Glu 340 345 350 atc acc aat ttt tac gag tac aac agc ggt gtt caa gag gct tgg gat 1645 Ile Thr Asn Phe Tyr Glu Tyr Asn Ser Gly Val Gln Glu Ala Trp Asp 355 360 365 ggt cct gca ctg ctg gca ttt tgt gac gga aaa att gtt gga gca act 1693 Gly Pro Ala Leu Leu Ala Phe Cys Asp Gly Lys Ile Val Gly Ala Thr 370 375 380 ctc gat cgg aac ggt ttg cgt cca gcg cgc tac agc att acg cgc gat 1741 Leu Asp Arg Asn Gly Leu Arg Pro Ala Arg Tyr Ser Ile Thr Arg Asp 385 390 395 400 ggc tac ttt gta gtc ggt tca gaa gcg ggt gtt gta gat ctg cca gaa 1789 Gly Tyr Phe Val Val Gly Ser Glu Ala Gly Val Val Asp Leu Pro Glu 405 410 415 tcc gaa atc att gag aaa ggg cgg ctt ggt cca ggg caa atg att gca 1837 Ser Glu Ile Ile Glu Lys Gly Arg Leu Gly Pro Gly Gln Met Ile Ala 420 425 430 ttc gat ttg caa tct cgt gaa gtg ctg aaa aat tgg gaa atc aag caa 1885 Phe Asp Leu Gln Ser Arg Glu Val Leu Lys Asn Trp Glu Ile Lys Gln 435 440 445 cgc att gcc aac gct cat ccc tat gga gag tgg ttg aag caa aat cgt 1933 Arg Ile Ala Asn Ala His Pro Tyr Gly Glu Trp Leu Lys Gln Asn Arg 450 455 460 aaa act ctg aaa tct cat gct ttc ttg gaa tca acg gca ttg gat gca 1981 Lys Thr Leu Lys Ser His Ala Phe Leu Glu Ser Thr Ala Leu Asp Ala 465 470 475 480 aaa tcg ctg ctg acg cat caa act gcc ttt ggc tac acc ttg gaa gat 2029 Lys Ser Leu Leu Thr His Gln Thr Ala Phe Gly Tyr Thr Leu Glu Asp 485 490 495 ttg gaa atg gtc atc caa gac atg gcg gct caa ggt aaa gaa cca act 2077 Leu Glu Met Val Ile Gln Asp Met Ala Ala Gln Gly Lys Glu Pro Thr 500 505 510 ttc tgt atg ggg gat gat att cct ctt gct gtg ctg tct gag cgt ccg 2125 Phe Cys Met Gly Asp Asp Ile Pro Leu Ala Val Leu Ser Glu Arg Pro 515 520 525 cat ttg ttg tat gac tac ttc aag cag cgc ttt gct cag gtg acg aat 2173 His Leu Leu Tyr Asp Tyr Phe Lys Gln Arg Phe Ala Gln Val Thr Asn 530 535 540 ccg ccg atc gat cca ctg cgc gaa aaa ctc gtc atg tcg ttg acg atg 2221 Pro Pro Ile Asp Pro Leu Arg Glu Lys Leu Val Met Ser Leu Thr Met 545 550 555 560 cag cta ggt gag cgc gga aat ctg ctg aaa att aat tca gat ggc gca 2269 Gln Leu Gly Glu Arg Gly Asn Leu Leu Lys Ile Asn Ser Asp Gly Ala 565 570 575 aat ctc ttc tta ctt gat tct cca gta tta act gaa cct gag tta gat 2317 Asn Leu Phe Leu Leu Asp Ser Pro Val Leu Thr Glu Pro Glu Leu Asp 580 585 590 cag att cgt gaa tcg ggt ttg gcg act gca aat ctt tcg act tta ttt 2365 Gln Ile Arg Glu Ser Gly Leu Ala Thr Ala Asn Leu Ser Thr Leu Phe 595 600 605 gaa gtc gca gca ggc cca gaa ggt ttg aaa gct gcg gtg gct cgc tta 2413 Glu Val Ala Ala Gly Pro Glu Gly Leu Lys Ala Ala Val Ala Arg Leu 610 615 620 tgt gag cag gcg acg gaa gca gtg cga tcc gga agc aag att ttg gtc 2461 Cys Glu Gln Ala Thr Glu Ala Val Arg Ser Gly Ser Lys Ile Leu Val 625 630 635 640 ttg agc gat cgc tta gat caa tct ggc aat cca act caa ctg aat gcg 2509 Leu Ser Asp Arg Leu Asp Gln Ser Gly Asn Pro Thr Gln Leu Asn Ala 645 650 655 gac tac agc tac att ccg ccc atg ttg gca gtg gga gct gtt cac cat 2557 Asp Tyr Ser Tyr Ile Pro Pro Met Leu Ala Val Gly Ala Val His His 660 665 670 cat ttg att cag aaa ggc tta cgg atg aga gct tct ctg gtc gtc gat 2605 His Leu Ile Gln Lys Gly Leu Arg Met Arg Ala Ser Leu Val Val Asp 675 680 685 acg gct cag gct tgg agt acg cat cat ttc gct tgc tta att ggc tat 2653 Thr Ala Gln Ala Trp Ser Thr His His Phe Ala Cys Leu Ile Gly Tyr 690 695 700 ggt gca agt gcg gtt tgt cct tac ttg gca ttg gaa tct gtg cgt cag 2701 Gly Ala Ser Ala Val Cys Pro Tyr Leu Ala Leu Glu Ser Val Arg Gln 705 710 715 720 tgg tgg tcg gat tct aag act caa gcg ctg atg gaa cgt gga aaa att 2749 Trp Trp Ser Asp Ser Lys Thr Gln Ala Leu Met Glu Arg Gly Lys Ile 725 730 735 aaa tct gct agc att gca gcc gtt caa gcg aac ttt aga aaa gcg atc 2797 Lys Ser Ala Ser Ile Ala Ala Val Gln Ala Asn Phe Arg Lys Ala Ile 740 745 750 gaa gat ggt ttg ctg aag att ctc tca aaa atg gga att tca ctg ctc 2845 Glu Asp Gly Leu Leu Lys Ile Leu Ser Lys Met Gly Ile Ser Leu Leu 755 760 765 tcg agc tat caa ggt gca cag att ttt gaa gcg atc gga atc ggg ggc 2893 Ser Ser Tyr Gln Gly Ala Gln Ile Phe Glu Ala Ile Gly Ile Gly Gly 770 775 780 gat tta ctc aat act gga ttc ttc gga aca gct tca cgc ttg ggt ggt 2941 Asp Leu Leu Asn Thr Gly Phe Phe Gly Thr Ala Ser Arg Leu Gly Gly 785 790 795 800 ttg acc tta gcg gaa ctg gct caa gaa att ctc tcc ttc cat agc aag 2989 Leu Thr Leu Ala Glu Leu Ala Gln Glu Ile Leu Ser Phe His Ser Lys 805 810 815 gca ttc cct gag ctg aca acc aag aag ctg gaa aac ttt ggc ttt gtg 3037 Ala Phe Pro Glu Leu Thr Thr Lys Lys Leu Glu Asn Phe Gly Phe Val 820 825 830 caa tac cgt cca ggc ggc gag tat cac atg aac agt cca gag atg gcg 3085 Gln Tyr Arg Pro Gly Gly Glu Tyr His Met Asn Ser Pro Glu Met Ala 835 840 845 aag cac ttg cac cag gcg gtt aga acg aag aat ccg gat cat tac gat 3133 Lys His Leu His Gln Ala Val Arg Thr Lys Asn Pro Asp His Tyr Asp 850 855 860 ctc tat cag aag cat tta gcc ggt cgt ccg ctc acg gca ttg aga gat 3181 Leu Tyr Gln Lys His Leu Ala Gly Arg Pro Leu Thr Ala Leu Arg Asp 865 870 875 880 tta ctc gat ttc aag agc gat cgc gcg gct atc tcg att gac gaa gta 3229 Leu Leu Asp Phe Lys Ser Asp Arg Ala Ala Ile Ser Ile Asp Glu Val 885 890 895 gaa ccc gcg atc gac att gtg aaa cgc ttc tgc aca ggc gga atg tct 3277 Glu Pro Ala Ile Asp Ile Val Lys Arg Phe Cys Thr Gly Gly Met Ser 900 905 910 ctt ggt gct tta tct cgt gaa gcg cat gaa gtc tta gcg atc gcg atg 3325 Leu Gly Ala Leu Ser Arg Glu Ala His Glu Val Leu Ala Ile Ala Met 915 920 925 aat cga atc ggc ggt aag tct aac tct gga gaa ggt ggc gaa gat cca 3373 Asn Arg Ile Gly Gly Lys Ser Asn Ser Gly Glu Gly Gly Glu Asp Pro 930 935 940 gtt cga tac aag atc ctg aat gaa gtt gag aac ggg aca tcc ccg ctc 3421 Val Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Glu Val Glu Asn Gly Thr Ser Pro Leu 945 950 955 960 ttg ccg cat ctc aaa gga ctg caa aca ggc gac act gca aac tct gcg 3469 Leu Pro His Leu Lys Gly Leu Gln Thr Gly Asp Thr Ala Asn Ser Ala 965 970 975 att aaa caa gtc gca tca gga cgt ttc gga gtt acg cct gag tat ttg 3517 Ile Lys Gln Val Ala Ser Gly Arg Phe Gly Val Thr Pro Glu Tyr Leu 980 985 990 atg agc gcg aag caa atc gaa atc aag atg gct caa ggt gca aaa ccg 3565 Met Ser Ala Lys Gln Ile Glu Ile Lys Met Ala Gln Gly Ala Lys Pro 995 1000 1005 ggt gaa ggt gga caa tta cct ggg cca aaa gtc agt cct tac att gct 3613 Gly Glu Gly Gly Gln Leu Pro Gly Pro Lys Val Ser Pro Tyr Ile Ala 1010 1015 1020 ctc ctg cgt cga tcg aag cct gga gta acg ctg att tct cca cct ccg 3661 Leu Leu Arg Arg Ser Lys Pro Gly Val Thr Leu Ile Ser Pro Pro Pro 1025 1030 1035 1040 cat cac gac att tac tcg atc gaa gat ctt gcc caa ctg att ttc gac 3709 His His Asp Ile Tyr Ser Ile Glu Asp Leu Ala Gln Leu Ile Phe Asp 1045 1050 1055 ttg cac caa atc aat ccg ctg gct caa gtg tcc gtg aaa ttg gtt gca 3757 Leu His Gln Ile Asn Pro Leu Ala Gln Val Ser Val Lys Leu Val Ala 1060 1065 1070 gaa gta gga atc ggt acg atc gcc gct ggg gtt gcc aaa gcg aat gct 3805 Glu Val Gly Ile Gly Thr Ile Ala Ala Gly Val Ala Lys Ala Asn Ala 1075 1080 1085 gac atc att caa att tct gga cat gat ggc ggt aca ggt gca tct cct 3853 Asp Ile Ile Gln Ile Ser Gly His Asp Gly Gly Thr Gly Ala Ser Pro 1090 1095 1100 ctc agc tca atc aaa cac gct gga agt cct tgg gaa ttg ggc tta acc 3901 Leu Ser Ser Ile Lys His Ala Gly Ser Pro Trp Glu Leu Gly Leu Thr 1105 1110 1115 1120 gaa gtg cat cga gtc ttg atg gaa aat caa ttg cgc gat cgt gtg att 3949 Glu Val His Arg Val Leu Met Glu Asn Gln Leu Arg Asp Arg Val Ile 1125 1130 1135 ctg cgt gtt gat ggc ggt atc aag acg gga tgg gat gtt gtc atg ggc 3997 Leu Arg Val Asp Gly Gly Ile Lys Thr Gly Trp Asp Val Val Met Gly 1140 1145 1150 gcg ttg atg ggt gct gaa gaa tat gga ttt ggc tcg atc gca atg atc 4045 Ala Leu Met Gly Ala Glu Glu Tyr Gly Phe Gly Ser Ile Ala Met Ile 1155 1160 1165 gcg gaa ggc tgc atc atg gct cgg att tgc cat acc aat agt tgt cca 4093 Ala Glu Gly Cys Ile Met Ala Arg Ile Cys His Thr Asn Ser Cys Pro 1170 1175 1180 gtc ggt gtt gcg agt cag aag gaa gaa ctt cgc aaa cgc ttc cct ggc 4141 Val Gly Val Ala Ser Gln Lys Glu Glu Leu Arg Lys Arg Phe Pro Gly 1185 1190 1195 1200 aca cct gag cat gtt gtg aat ttc ttc ttg ttc atc gca gaa gaa gta 4189 Thr Pro Glu His Val Val Asn Phe Phe Leu Phe Ile Ala Glu Glu Val 1205 1210 1215 cga tcg ctc ttg gct cgc tta ggg tac aaa tct ctg gat gaa att att 4237 Arg Ser Leu Leu Ala Arg Leu Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Ile Ile 1220 1225 1230 gga cgt gct gat ctg ctc aag ccc aga gaa gct gtg aat ctg acc aag 4285 Gly Arg Ala Asp Leu Leu Lys Pro Arg Glu Ala Val Asn Leu Thr Lys 1235 1240 1245 act caa ctg ttg aac tta gat tgt ttg act cag ttg ccg gat act cgc 4333 Thr Gln Leu Leu Asn Leu Asp Cys Leu Thr Gln Leu Pro Asp Thr Arg 1250 1255 1260 agc gat cgc act tgg ctg aat cac gaa act gtg cat agc aat ggt gct 4381 Ser Asp Arg Thr Trp Leu Asn His Glu Thr Val His Ser Asn Gly Ala 1265 1270 1275 1280 gtt ctg gat gat caa ttg ctc agt gat cca gat ctt caa gct gcg att 4429 Val Leu Asp Asp Gln Leu Leu Ser Asp Pro Asp Leu Gln Ala Ala Ile 1285 1290 1295 caa aat caa ggc gat gtg acc aaa tcc gtt gaa gtc gtt aac acg gat 4477 Gln Asn Gln Gly Asp Val Thr Lys Ser Val Glu Val Val Asn Thr Asp 1300 1305 1310 cga acg gtt ggg act cgg att tca gga gcg atc gcg aaa caa tat ggt 4525 Arg Thr Val Gly Thr Arg Ile Ser Gly Ala Ile Ala Lys Gln Tyr Gly 1315 1320 1325 aac tct ggc ttc agc ggt cag gtc act cta aac ttt acc gga gcg gtg 4573 Asn Ser Gly Phe Ser Gly Gln Val Thr Leu Asn Phe Thr Gly Ala Val 1330 1335 1340 ggt caa agc ttt ggt gcg ttt aac tta cct tgt atg acg ttg aat ctc 4621 Gly Gln Ser Phe Gly Ala Phe Asn Leu Pro Cys Met Thr Leu Asn Leu 1345 1350 1355 1360 gtt gga gaa gca aac gat tac gtc ggt aaa gga atg cat ggc ggt gag 4669 Val Gly Glu Ala Asn Asp Tyr Val Gly Lys Gly Met His Gly Gly Glu 1365 1370 1375 att gct atc aaa cct tct cct gaa gca acg tat gat cca tct cag aat 4717 Ile Ala Ile Lys Pro Ser Pro Glu Ala Thr Tyr Asp Pro Ser Gln Asn 1380 1385 1390 gtg atc att ggt aat act tgc ctt tac ggt gcg acg ggc ggc aga cta 4765 Val Ile Ile Gly Asn Thr Cys Leu Tyr Gly Ala Thr Gly Gly Arg Leu 1395 1400 1405 ttt gcg aat ggt caa gct ggg gaa cgg ttt gca gtt cgt aac tct ctg 4813 Phe Ala Asn Gly Gln Ala Gly Glu Arg Phe Ala Val Arg Asn Ser Leu 1410 1415 1420 gct gaa gct gtg gtt gaa ggt gtg ggt gac cac tgc tgt gaa tat atg 4861 Ala Glu Ala Val Val Glu Gly Val Gly Asp His Cys Cys Glu Tyr Met 1425 1430 1435 1440 aca ggc ggt gtg gtc gtt gtt ctc ggt cga gca ggt cgg aac gtt ggc 4909 Thr Gly Gly Val Val Val Val Leu Gly Arg Ala Gly Arg Asn Val Gly 1445 1450 1455 gca ggg atg acc gga gga tta gct tac ttc tta gat gaa gat ggc agc 4957 Ala Gly Met Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Phe Leu Asp Glu Asp Gly Ser 1460 1465 1470 ttc caa gag aaa gtc aat cct gag att gtc aaa gtt cag cga gtt gtc 5005 Phe Gln Glu Lys Val Asn Pro Glu Ile Val Lys Val Gln Arg Val Val 1475 1480 1485 gca cct gcg ggt gag caa cag tta aaa gaa ctg ctt gag gct cat gtt 5053 Ala Pro Ala Gly Glu Gln Gln Leu Lys Glu Leu Leu Glu Ala His Val 1490 1495 1500 gag cat acg ggt agc ccg aaa gcg aag gct gtt ttg gcg aac tgg tcg 5101 Glu His Thr Gly Ser Pro Lys Ala Lys Ala Val Leu Ala Asn Trp Ser 1505 1510 1515 1520 gag tat ttg ccg aag ttc tgg cag gtg gtt ccg ccg tct gag aag gac 5149 Glu Tyr Leu Pro Lys Phe Trp Gln Val Val Pro Pro Ser Glu Lys Asp 1525 1530 1535 acg ccg gaa gca aat cca gat gtt gag aag gta gct gtc tcg gct 5194 Thr Pro Glu Ala Asn Pro Asp Val Glu Lys Val Ala Val Ser Ala 1540 1545 1550 taatgaaaaa aaggagcgat cgcagaaata gcgatcgctc cttttttttc aatattcaag 5254 ttttgaatcg cttagcgcca ggaataagta ttttattttt ataatgagac atcacaatcg 5314 gggcaagctg atgaacatgc cagaagcgga ttccgagaca gcaaagcata cagtttctgg 5374 attggatctc tacgaagctg atttctacgg ttggacacaa cagcaagtac gacttctgca 5434 cagtcagcag tgggagcaga ttgatctgcc aaatatcatt gaggaaatcg aatctttggg 5494 aaagcagcag cgccaagaac ttcggaatcg tctcagtatt ttaattgggc atttgctgaa 5554 atggcagtat cagcctcaac atcgtagccg tagctggttg tcaacgctgc gaattcagcg 5614 tttagatatt aatgatctac ttgacgagaa tcctagcttg aagccttaca tcgaagaagc 5674 gctttgtaaa gcctatttga gaggagttga acttgcggtg agagagacag atttaccgaa 5734 ttctactttt ccgatcgatt gtccttacaa cttggaagag atattgagcg atcgctttta 5794 tccgggtgaa ccaagcgagt tagtagcgga ctaaactcac ttattattca ttattcgtct 5854 gtagatgctg tctgcctctg cttccgcaac actcaaaatc ttaatccggt agctcatgcg 5914 ggcaaattgt atttacggcg ttgttcggca gcgaattcgt caaaaccgcg aaaattgcct 5974 gcttcaaaat cattcaatcc ctgcttaata ccttgaattg cttcttctga atcctgggct 6034 tcccattcca gaacacttgc caaaagctt 6063 <210> 2 <211> 1551 <212> PRT <213> Plectonema boryanum <400> 2 Met Asn Arg Ile Asn Pro Pro Met Ser Gln Ala Ser Val Pro Ser Pro 1 5 10 15 Asn Glu Ser Gln Ser Ile Ser Asn Gly Tyr Ala Gly Gln Arg Trp Leu 20 25 30 Val Glu Glu Arg Asp Ala Cys Gly Val Gly Phe Ile Val Asp Gln Gln 35 40 45 Gly Arg Ala Ser His Asp Leu Met Ser Lys Ala Leu Ile Ala Leu Ser 50 55 60 Cys Met Glu His Arg Gly Gly Cys Ser Ala Asp Gln Asp Ser Gly Asp 65 70 75 80 Gly Ala Gly Val Met Ala Glu Ile Pro Trp Glu Ile Leu Asn Gln Trp 85 90 95 Ala Ser Asp Arg Gly Val Thr Leu Lys Pro Gly Tyr Thr Gly Val Gly 100 105 110 Met Val Phe Leu Pro Gln Asp Ser Ala Ile Ala Ala Glu Thr Lys Gln 115 120 125 Val Ala Glu Lys Ile Ile Ala Glu Glu Gly Leu Thr Leu Leu Gly Trp 130 135 140 Arg Ser Val Pro Val Gln Pro Glu Val Leu Gly Val Gln Ala Arg Asp 145 150 155 160 Asn Gln Pro Leu Ile Glu Gln Leu Ile Val Gln Ser Glu Val Ala Asp 165 170 175 Glu Glu Leu Glu Arg Lys Leu Tyr Val Ala Arg Lys Arg Ile His Arg 180 185 190 Thr Leu Ala Val Arg Pro Glu Ala Gly Phe Asp Glu Leu Tyr Val Cys 195 200 205 Ser Phe Ser Thr Arg Thr Ile Val Tyr Lys Gly Met Val Arg Ser Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Lys Phe Tyr Leu Asp Leu Gln Asn Pro Glu Tyr Lys Thr 225 230 235 240 Thr Phe Ala Leu Tyr His Arg Arg Phe Ser Thr Asn Thr Met Pro Lys 245 250 255 Trp Gln Leu Ala Gln Pro Met Arg Leu Leu Gly His Asn Gly Glu Ile 260 265 270 Asn Thr Gln Leu Gly Asn Val Asn Trp Met Arg Ala Arg Glu Ala Asp 275 280 285 Leu Ala His Glu Val Trp Gly Asp Arg Ile Asp Leu Leu Lys Pro Thr 290 295 300 Val Asn Ser Asn Asn Ser Asp Ser Ala Asn Leu Asp Asn Val Met Glu 305 310 315 320 Leu Leu Val Arg Ser Gly Arg Ser Pro Val Glu Ala Leu Met Met Met 325 330 335 Val Pro Glu Ala Tyr Lys Asn Gln Pro Glu Leu Ala Asp His Pro Glu 340 345 350 Ile Thr Asn Phe Tyr Glu Tyr Asn Ser Gly Val Gln Glu Ala Trp Asp 355 360 365 Gly Pro Ala Leu Leu Ala Phe Cys Asp Gly Lys Ile Val Gly Ala Thr 370 375 380 Leu Asp Arg Asn Gly Leu Arg Pro Ala Arg Tyr Ser Ile Thr Arg Asp 385 390 395 400 Gly Tyr Phe Val Val Gly Ser Glu Ala Gly Val Val Asp Leu Pro Glu 405 410 415 Ser Glu Ile Ile Glu Lys Gly Arg Leu Gly Pro Gly Gln Met Ile Ala 420 425 430 Phe Asp Leu Gln Ser Arg Glu Val Leu Lys Asn Trp Glu Ile Lys Gln 435 440 445 Arg Ile Ala Asn Ala His Pro Tyr Gly Glu Trp Leu Lys Gln Asn Arg 450 455 460 Lys Thr Leu Lys Ser His Ala Phe Leu Glu Ser Thr Ala Leu Asp Ala 465 470 475 480 Lys Ser Leu Leu Thr His Gln Thr Ala Phe Gly Tyr Thr Leu Glu Asp 485 490 495 Leu Glu Met Val Ile Gln Asp Met Ala Ala Gln Gly Lys Glu Pro Thr 500 505 510 Phe Cys Met Gly Asp Asp Ile Pro Leu Ala Val Leu Ser Glu Arg Pro 515 520 525 His Leu Leu Tyr Asp Tyr Phe Lys Gln Arg Phe Ala Gln Val Thr Asn 530 535 540 Pro Pro Ile Asp Pro Leu Arg Glu Lys Leu Val Met Ser Leu Thr Met 545 550 555 560 Gln Leu Gly Glu Arg Gly Asn Leu Leu Lys Ile Asn Ser Asp Gly Ala 565 570 575 Asn Leu Phe Leu Leu Asp Ser Pro Val Leu Thr Glu Pro Glu Leu Asp 580 585 590 Gln Ile Arg Glu Ser Gly Leu Ala Thr Ala Asn Leu Ser Thr Leu Phe 595 600 605 Glu Val Ala Ala Gly Pro Glu Gly Leu Lys Ala Ala Val Ala Arg Leu 610 615 620 Cys Glu Gln Ala Thr Glu Ala Val Arg Ser Gly Ser Lys Ile Leu Val 625 630 635 640 Leu Ser Asp Arg Leu Asp Gln Ser Gly Asn Pro Thr Gln Leu Asn Ala 645 650 655 Asp Tyr Ser Tyr Ile Pro Pro Met Leu Ala Val Gly Ala Val His His 660 665 670 His Leu Ile Gln Lys Gly Leu Arg Met Arg Ala Ser Leu Val Val Asp 675 680 685 Thr Ala Gln Ala Trp Ser Thr His His Phe Ala Cys Leu Ile Gly Tyr 690 695 700 Gly Ala Ser Ala Val Cys Pro Tyr Leu Ala Leu Glu Ser Val Arg Gln 705 710 715 720 Trp Trp Ser Asp Ser Lys Thr Gln Ala Leu Met Glu Arg Gly Lys Ile 725 730 735 Lys Ser Ala Ser Ile Ala Ala Val Gln Ala Asn Phe Arg Lys Ala Ile 740 745 750 Glu Asp Gly Leu Leu Lys Ile Leu Ser Lys Met Gly Ile Ser Leu Leu 755 760 765 Ser Ser Tyr Gln Gly Ala Gln Ile Phe Glu Ala Ile Gly Ile Gly Gly 770 775 780 Asp Leu Leu Asn Thr Gly Phe Phe Gly Thr Ala Ser Arg Leu Gly Gly 785 790 795 800 Leu Thr Leu Ala Glu Leu Ala Gln Glu Ile Leu Ser Phe His Ser Lys 805 810 815 Ala Phe Pro Glu Leu Thr Thr Lys Lys Leu Glu Asn Phe Gly Phe Val 820 825 830 Gln Tyr Arg Pro Gly Gly Glu Tyr His Met Asn Ser Pro Glu Met Ala 835 840 845 Lys His Leu His Gln Ala Val Arg Thr Lys Asn Pro Asp His Tyr Asp 850 855 860 Leu Tyr Gln Lys His Leu Ala Gly Arg Pro Leu Thr Ala Leu Arg Asp 865 870 875 880 Leu Leu Asp Phe Lys Ser Asp Arg Ala Ala Ile Ser Ile Asp Glu Val 885 890 895 Glu Pro Ala Ile Asp Ile Val Lys Arg Phe Cys Thr Gly Gly Met Ser 900 905 910 Leu Gly Ala Leu Ser Arg Glu Ala His Glu Val Leu Ala Ile Ala Met 915 920 925 Asn Arg Ile Gly Gly Lys Ser Asn Ser Gly Glu Gly Gly Glu Asp Pro 930 935 940 Val Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Glu Val Glu Asn Gly Thr Ser Pro Leu 945 950 955 960 Leu Pro His Leu Lys Gly Leu Gln Thr Gly Asp Thr Ala Asn Ser Ala 965 970 975 Ile Lys Gln Val Ala Ser Gly Arg Phe Gly Val Thr Pro Glu Tyr Leu 980 985 990 Met Ser Ala Lys Gln Ile Glu Ile Lys Met Ala Gln Gly Ala Lys Pro 995 1000 1005 Gly Glu Gly Gly Gln Leu Pro Gly Pro Lys Val Ser Pro Tyr Ile Ala 1010 1015 1020 Leu Leu Arg Arg Ser Lys Pro Gly Val Thr Leu Ile Ser Pro Pro Pro 1025 1030 1035 1040 His His Asp Ile Tyr Ser Ile Glu Asp Leu Ala Gln Leu Ile Phe Asp 1045 1050 1055 Leu His Gln Ile Asn Pro Leu Ala Gln Val Ser Val Lys Leu Val Ala 1060 1065 1070 Glu Val Gly Ile Gly Thr Ile Ala Ala Gly Val Ala Lys Ala Asn Ala 1075 1080 1085 Asp Ile Ile Gln Ile Ser Gly His Asp Gly Gly Thr Gly Ala Ser Pro 1090 1095 1100 Leu Ser Ser Ile Lys His Ala Gly Ser Pro Trp Glu Leu Gly Leu Thr 1105 1110 1115 1120 Glu Val His Arg Val Leu Met Glu Asn Gln Leu Arg Asp Arg Val Ile 1125 1130 1135 Leu Arg Val Asp Gly Gly Ile Lys Thr Gly Trp Asp Val Val Met Gly 1140 1145 1150 Ala Leu Met Gly Ala Glu Glu Tyr Gly Phe Gly Ser Ile Ala Met Ile 1155 1160 1165 Ala Glu Gly Cys Ile Met Ala Arg Ile Cys His Thr Asn Ser Cys Pro 1170 1175 1180 Val Gly Val Ala Ser Gln Lys Glu Glu Leu Arg Lys Arg Phe Pro Gly 1185 1190 1195 1200 Thr Pro Glu His Val Val Asn Phe Phe Leu Phe Ile Ala Glu Glu Val 1205 1210 1215 Arg Ser Leu Leu Ala Arg Leu Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Ile Ile 1220 1225 1230 Gly Arg Ala Asp Leu Leu Lys Pro Arg Glu Ala Val Asn Leu Thr Lys 1235 1240 1245 Thr Gln Leu Leu Asn Leu Asp Cys Leu Thr Gln Leu Pro Asp Thr Arg 1250 1255 1260 Ser Asp Arg Thr Trp Leu Asn His Glu Thr Val His Ser Asn Gly Ala 1265 1270 1275 1280 Val Leu Asp Asp Gln Leu Leu Ser Asp Pro Asp Leu Gln Ala Ala Ile 1285 1290 1295 Gln Asn Gln Gly Asp Val Thr Lys Ser Val Glu Val Val Asn Thr Asp 1300 1305 1310 Arg Thr Val Gly Thr Arg Ile Ser Gly Ala Ile Ala Lys Gln Tyr Gly 1315 1320 1325 Asn Ser Gly Phe Ser Gly Gln Val Thr Leu Asn Phe Thr Gly Ala Val 1330 1335 1340 Gly Gln Ser Phe Gly Ala Phe Asn Leu Pro Cys Met Thr Leu Asn Leu 1345 1350 1355 1360 Val Gly Glu Ala Asn Asp Tyr Val Gly Lys Gly Met His Gly Gly Glu 1365 1370 1375 Ile Ala Ile Lys Pro Ser Pro Glu Ala Thr Tyr Asp Pro Ser Gln Asn 1380 1385 1390 Val Ile Ile Gly Asn Thr Cys Leu Tyr Gly Ala Thr Gly Gly Arg Leu 1395 1400 1405 Phe Ala Asn Gly Gln Ala Gly Glu Arg Phe Ala Val Arg Asn Ser Leu 1410 1415 1420 Ala Glu Ala Val Val Glu Gly Val Gly Asp His Cys Cys Glu Tyr Met 1425 1430 1435 1440 Thr Gly Gly Val Val Val Val Leu Gly Arg Ala Gly Arg Asn Val Gly 1445 1450 1455 Ala Gly Met Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Phe Leu Asp Glu Asp Gly Ser 1460 1465 1470 Phe Gln Glu Lys Val Asn Pro Glu Ile Val Lys Val Gln Arg Val Val 1475 1480 1485 Ala Pro Ala Gly Glu Gln Gln Leu Lys Glu Leu Leu Glu Ala His Val 1490 1495 1500 Glu His Thr Gly Ser Pro Lys Ala Lys Ala Val Leu Ala Asn Trp Ser 1505 1510 1515 1520 Glu Tyr Leu Pro Lys Phe Trp Gln Val Val Pro Pro Ser Glu Lys Asp 1525 1530 1535 Thr Pro Glu Ala Asn Pro Asp Val Glu Lys Val Ala Val Ser Ala 1540 1545 1550 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for amplification of glsF gene <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> degenerated primer <400> 3 ccncaycayg ayatyta 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for amplification of glsF gene <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> degenerated primer <400> 4 ccnccnatrt aytcrca 17

【図面の簡単な説明】

【図１】プレクトネマ・ボリアヌムIAM-M101のゲノム上
のglsF遺伝子の破壊。glsF領域の制限酵素地図、および
挿入されたneo遺伝子断片の挿入位置を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA74 CA03 DA05 EA03 GA14 GA19 HA01 HA12 4B064 AE19 CA02 CA19 CC05 CC08 CC12 CC24 CE02 CE11 CE15 DA10 DA16 4B065 AA01X AA01Y AB01 AC14 AC16 BA03 BA25 BD01 BD15 BD16 CA17 CA41

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Fd-GOGAT活性が欠損若しくは低下した光
   合成微生物変異株を培養し、前記微生物細胞にL-グルタ
   ミンを生産させ、前記微生物細胞内に蓄積したL-グルタ
   ミンおよび／または培養液中に分泌されたL-グルタミン
   を回収することを特徴とする、L-グルタミン生産方法。
2. 【請求項２】 照度100〜250μEm^-2s^-1の光照射条件下
   で培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 更に二酸化炭素濃度が0.5〜２％(v/v)で
   ある通気条件で培養することを特徴とする、請求項２に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 光合成微生物がシアノバクテリアである
   ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 シアノバクテリアが受託番号FERM P-177
   68であるプレクトネマ・ボリアヌム変異株であることを
   特徴とする、請求項４に記載の方法。