CN110923129A - 一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Fd‑谷氨酸合成酶活性检测技术领域，且公开了一种Fd‑谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法。包括试剂盒、盖板、转轴和固定座，所述试剂盒的顶部与盖板的底部固定连接，所述转轴的外壁与试剂盒的外壁固定连接，所述固定座的外壁与盖板的外壁固定连接。该Fd‑谷氨酸合成酶活性测定试剂盒，提供一种直观快速的检测方法，可从实验结果的颜色深浅来直观判断待检样本的酶活性大小，颜色越深代表酶活性越大，反之越小，采用高温加热使实验反应统一停止，降低实验操作难度，提高检测数据的精确性和重复性，另外，所需仪器耗材便宜，不需要昂贵的带有紫外波段检测的紫外分光光度计和配套石英比色皿或UV板，降低实验成本，使实验易实现。
Description
技术领域
本发明涉及Fd-谷氨酸合成酶活性检测技术领域，具体为一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
检测Fd-谷氨酸合成酶，传统方法是用检测该酶催化一系列反应生成的NADH 于340nm波长下的增加量来反应该酶的活性大小，此种方法对检测人员的操作熟练程度要求较高。尤其是色素含量较高的样本如绿色叶片会在340nm波长下干扰测定结果，整个反应过程无颜色变化使检测人员无法直观把控实验进程，且操作过程中会用到比较昂贵的石英比色皿和带有紫外波段检测的紫外分光光度计。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，具备可见光下检测，使用仪器和耗材便宜，操作过程更简单，实验重复性好，设置对照排除样本自身本底水平干扰，使实验数据更灵敏精确等优点，解决了传统方法是用检测该酶催化一系列反应生成的NADH于340nm波长下的增加量来反应该酶的活性大小，此种方法对检测人员的操作熟练程度要求较高的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，包括试剂盒、盖板、转轴和固定座，所述试剂盒的顶部与盖板的底部固定连接，所述转轴的外壁与试剂盒的外壁固定连接，所述固定座的外壁与盖板的外壁固定连接。
所述试剂盒的内部包括盒腔、试剂管、LEP管放置槽和锁紧装置，所述盒腔位于试剂盒的顶部开设，所述试剂管的底板与盒腔的底部固定连接，所述LEP 管放置槽远离盒腔的一侧位于试剂盒的顶部开设，所述锁紧装置的外壁与试剂盒的外壁固定连接。
所述锁紧装置的内部包括卡环、按钮、弹簧、卡钩、通孔、卡口和固定环，所述卡环的外壁与卡口的内壁滑动连接，所述按钮的外壁与锁紧装置的内壁滑动连接，所述弹簧的左端与按钮的外壁固定连接，所述弹簧的右端与锁紧装置的内壁搭接，所述弹簧的两端与固定环的内壁卡接，所述卡钩的外壁与按钮的内壁固定连
进一步的，所述卡环的顶部与固定座的底部固定连接。
进一步的，所述卡环的内壁与卡钩的外壁卡接。
进一步的，所述固定环的外壁与锁紧装置的内壁固定连接。
一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，包括以下步骤：
1)、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至460nm，蒸馏水调零。
2)、取两个1.5mLEP管：一个记为测定管，一个记为对照管，向两个EP 管中同时加入100μL的L-谷氨酰胺(150mM)和100μL的α-酮戊二酸(150mM) 和100μL的MV(5mg/mL)。
3)、在25-37℃温度下培养10min(准确控制时间)。
4)、向测定管中加入200μL的待测样本制备的上清液和200μL碳酸氢钠 (1mM)，向对照管中加入200μL的待测样本制备的上清液和200μL蒸馏水。
5)、混匀，30℃反应5min(准确时间)，立即于95℃沸水中水浴10分钟使反应停止，于12000rpm离心10分钟，测定管和对照管的上清液待测。
6)、另外取两个新的1.5mLEP管，测定管和对照管中分别加入600μL的PH7.0 的磷酸缓冲液，60μL的NAD+(40mM)和20μL的谷氨酸脱氢酶(2U)和40μL的2-(4- 碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(硫代苯)-2H-四唑盐溶液，测定管中再加50μL的测定管上清液，对照管中再加50μL的对照管上清液。
7)、混匀，40℃反应10min，液体全部转移至1mL玻璃比色皿中，于460nm 处读取吸光值A，计算△A＝A测定-A对照。
本发明的有益效果是：
1、该Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，在使用时，本试剂盒提供一种直观快速的检测方法，可从实验结果的颜色深浅来直观判断待检样本的酶活性大小，颜色越深代表酶活性越大，反之越小。采用高温加热使实验反应统一停止，降低实验操作难度，提高检测数据的精确性和重复性；另外，所需仪器耗材便宜，不需要昂贵的带有紫外波段检测的紫外分光光度计和配套石英比色皿或UV板，降低实验成本，使实验易实现，且整个实验过程所用试剂无毒环保，普通实验室即可完成，为广大科研工作者提供一个简单，精确且经济的实验手段。
2、该Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，Fd-谷氨酸合成酶(Fd-GOGAT,EC 1.4.7.1)催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸，再用特异于谷氨酸的酶复合体分解谷氨酸，伴随有NADH的产生，接着与特异灵敏显色剂(2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(硫代苯)-2H-四唑盐溶液)反应生成黄色可溶性物质，该物质在460nm处有最大吸收峰，进而得到Fd- 谷氨酸合成酶的酶活性大小，该酶催化反应：
L-glutamine+2-oxoglutarate+2reduced
ferredoxin+2H+＝2L-glutamate+2oxidized
ferredoxin。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中或现有技术中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明结构示意图；
图2为本发明图1的俯视图；
图3为本发明锁紧装置剖视图。
附图标记说明：1、试剂盒；2、盒腔；3、试剂管；4、盖板；5、LEP管放置槽；6、转轴；7、锁紧装置；8、固定座；9、卡环；10、按钮；11、弹簧；12、卡钩；13、通孔；14、卡口；15、固定环。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
请参阅图1-3，一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，包括试剂盒1、盖板4、转轴6和固定座8，试剂盒1的顶部与盖板4的底部固定连接，转轴6的外壁与试剂盒1的外壁固定连接，固定座8的外壁与盖板4的外壁固定连接。
试剂盒1的内部包括盒腔2、试剂管3、LEP管放置槽5和锁紧装置7，盒腔 2位于试剂盒1的顶部开设，试剂管3的底板与盒腔2的底部固定连接，LEP管放置槽5远离盒腔2的一侧位于试剂盒1的顶部开设，通过设置LEP管放置槽5 为了放置LEP管方便使用，锁紧装置7的外壁与试剂盒1的外壁固定连接，其中，通过设置锁紧装置7为了锁紧盖板2和试剂盒1。
锁紧装置7的内部包括卡环9、按钮10、弹簧11、卡钩12、通孔13、卡口 14和固定环15，卡环9的外壁与卡口14的内壁滑动连接，卡环9的顶部与固定座8的底部固定连接，卡环9的内壁与卡钩12的外壁卡接，按钮10的外壁与锁紧装置7的内壁滑动连接，弹簧11的左端与按钮10的外壁固定连接，弹簧11 的右端与锁紧装置7的内壁搭接，弹簧11的两端与固定环15的内壁卡接，固定环15的外壁与锁紧装置7的内壁固定连接，卡钩12的外壁与按钮10的内壁固定连
一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，包括以下步骤：
1)、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至460nm，蒸馏水调零。
2)、取两个1.5mLEP管：一个记为测定管，一个记为对照管，向两个EP 管中同时加入100μL的L-谷氨酰胺(150mM)和100μL的α-酮戊二酸(150mM)和 100μL的MV(5mg/mL)。
3)、在25-37℃温度下培养10min(准确控制时间)。
4)、向测定管中加入200μL的待测样本制备的上清液和200μL碳酸氢钠 (1mM)，向对照管中加入200μL的待测样本制备的上清液和200μL蒸馏水。
5)、混匀，30℃反应5min(准确时间)，立即于95℃沸水中水浴10分钟使反应停止，于12000rpm离心10分钟，测定管和对照管的上清液待测。
6)、另外取两个新的1.5mLEP管，测定管和对照管中分别加入600μL的PH7.0 的磷酸缓冲液，60μL的NAD+(40mM)和20μL的谷氨酸脱氢酶(2U)和40μL的2-(4- 碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(硫代苯)-2H-四唑盐溶液，测定管中再加50μL的测定管上清液，对照管中再加50μL的对照管上清液。
7)、混匀，40℃反应10min，液体全部转移至1mL玻璃比色皿中，于460nm 处读取吸光值A，计算△A＝A测定-A对照。
在使用时，本试剂盒提供一种直观快速的检测方法，称取约0.1g组织，加入1mL试剂盒里面准备的提取液，进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测，可从实验结果的颜色深浅来直观判断待检样本的酶活性大小，颜色越深代表酶活性越大，反之越小，采用高温加热使实验反应统一停止，降低实验操作难度，提高检测数据的精确性和重复性，另外，所需仪器耗材便宜，不需要昂贵的带有紫外波段检测的紫外分光光度计和配套石英比色皿或UV板，降低实验成本，使实验易实现，且整个实验过程所用试剂无毒环保，普通实验室即可完成，为广大科研工作者提供一个简单，精确且经济的实验手段，本试剂盒可以在可见光下检测，使用仪器和耗材便宜，操作过程更简单，实验重复性好，设置对照排除样本自身本底水平干扰，使实验数据更灵敏精确，Fd-谷氨酸合成酶(Fd-GOGAT,EC1.4.7.1)催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸，再用特异于谷氨酸的酶复合体分解谷氨酸，伴随有NADH的产生，接着与特异灵敏显色剂(2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(硫代苯)-2H-四唑盐溶液)反应生成黄色可溶性物质，该物质在460nm处有最大吸收峰，进而得到Fd- 谷氨酸合成酶的酶活性大小，该酶催化反应： L-glutamine+2-oxoglutarate+2reduced ferredoxin+2H+＝ 2L-glutamate+2oxidized ferredoxin，本试剂盒同时也提供了标准曲线，方便客户直接带入计算公式计算，
1)标准曲线方程：y＝0.0329x-0.0003，x是标准品摩尔质量，y是△A。
2)按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
GOGAT(nmol Glu/min/mg prot)＝[(ΔA+0.0003)÷0.0329]×(V2÷V3)÷(V1 ×Cpr)÷T＝212.5×(ΔA+0.0003)÷Cpr。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，包括试剂盒(1)、盖板(4)、转轴(6)和固定座(8)，其特征在于：所述试剂盒(1)的顶部与盖板(4)的底部固定连接，所述转轴(6)的外壁与试剂盒(1)的外壁固定连接，所述固定座(8)的外壁与盖板(4)的外壁固定连接；
所述试剂盒(1)的内部包括盒腔(2)、试剂管(3)、LEP管放置槽(5)和锁紧装置(7)，所述盒腔(2)位于试剂盒(1)的顶部开设，所述试剂管(3)的底板与盒腔(2)的底部固定连接，所述LEP管放置槽(5)远离盒腔(2)的一侧位于试剂盒(1)的顶部开设，所述锁紧装置(7)的外壁与试剂盒(1)的外壁固定连接；
所述锁紧装置(7)的内部包括卡环(9)、按钮(10)、弹簧(11)、卡钩(12)、通孔(13)、卡口(14)和固定环(15)，所述卡环(9)的外壁与卡口(14)的内壁滑动连接，所述按钮(10)的外壁与锁紧装置(7)的内壁滑动连接，所述弹簧(11)的左端与按钮(10)的外壁固定连接，所述弹簧(11)的右端与锁紧装置(7)的内壁搭接，所述弹簧(11)的两端与固定环(15)的内壁卡接，所述卡钩(12)的外壁与按钮(10)的内壁固定连接。
2.根据权利要求1所述的一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述卡环(9)的顶部与固定座(8)的底部固定连接。
3.根据权利要求1所述的一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述卡环(9)的内壁与卡钩(12)的外壁卡接。
4.根据权利要求1所述的一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述固定环(15)的外壁与锁紧装置(7)的内壁固定连接。
5.一种Fd-谷氨酸合成酶活性测定试剂盒及其检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至460nm，蒸馏水调零。
2)、取两个1.5mLEP管：一个记为测定管，一个记为对照管，向两个EP管中同时加入100μL的L-谷氨酰胺(150mM)和100μL的α-酮戊二酸(150mM)和100μL的MV(5mg/mL)。
3)、在25-37℃温度下培养10min(准确控制时间)。
4)、向测定管中加入200μL的待测样本制备的上清液和200μL碳酸氢钠(1mM)，向对照管中加入200μL的待测样本制备的上清液和200μL蒸馏水。
5)、混匀，30℃反应5min(准确时间)，立即于95℃沸水中水浴10分钟使反应停止，于12000rpm离心10分钟，测定管和对照管的上清液待测。
6)、另外取两个新的1.5mLEP管，测定管和对照管中分别加入600μL的PH7.0的磷酸缓冲液，60μL的NAD+(40mM)和20μL的谷氨酸脱氢酶(2U)和40μL的2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(硫代苯)-2H-四唑盐溶液，测定管中再加50μL的测定管上清液，对照管中再加50μL的对照管上清液。
7)、混匀，40℃反应10min，液体全部转移至1mL玻璃比色皿中，于460nm处读取吸光值A，计算△A＝A测定-A对照。
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