JPS5856699A - グアナ−ゼの迅速定量法 - Google Patents
グアナ−ゼの迅速定量法Info
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- JPS5856699A JPS5856699A JP56152807A JP15280781A JPS5856699A JP S5856699 A JPS5856699 A JP S5856699A JP 56152807 A JP56152807 A JP 56152807A JP 15280781 A JP15280781 A JP 15280781A JP S5856699 A JPS5856699 A JP S5856699A
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- xanthine
- guanase
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- hydrogen peroxide
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（Ａ） 発明の背景
本発明は、体液中のグアナーゼ活性の迅速定量法に関す
る。
る。
グアナーゼ（ｇｕａｎａｓｅ）は、生体内のヌクレオシ
ド代謝系において、グアニンをキサンチンに変換−する
化学反応を触媒する重要な酵素である。高等動物では、
本酵粱により生成せしめられたキサンチンは、キサンチ
ンオキシダーゼの作用で尿酸に酸化されるが、下等動物
（昆虫など）では、さらにアラントインにまで分解され
た後、尿として排出される。
ド代謝系において、グアニンをキサンチンに変換−する
化学反応を触媒する重要な酵素である。高等動物では、
本酵粱により生成せしめられたキサンチンは、キサンチ
ンオキシダーゼの作用で尿酸に酸化されるが、下等動物
（昆虫など）では、さらにアラントインにまで分解され
た後、尿として排出される。
グアニン（ケト型） キサンチン尿酸
アラントイン今日、診断医
学の進歩と共に血清等の体液の病理学的検査が重視され
るようになり、肝疾患に右いてもトランスアミナーゼ（
ＧＯＴ 、ＧＰ′ｒ）、アルカリ７オスフアターゼ及び
γ−グルタミル・トランス・ペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ
）の検査が広く行われている。これらの中、トランスア
ミナーゼ及びアルカリフォスにターゼは、肝臓以外の組
織中に広く分布しているため肝疾患のみの指標となりに
くい。この点、後者のγ−Ｇ′ｒＰは肝疾患に対し特異
的であることが知られているので診断的価値が高い（Ｓ
ｚａｓｚ、Ｇ、。
アラントイン今日、診断医
学の進歩と共に血清等の体液の病理学的検査が重視され
るようになり、肝疾患に右いてもトランスアミナーゼ（
ＧＯＴ 、ＧＰ′ｒ）、アルカリ７オスフアターゼ及び
γ−グルタミル・トランス・ペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ
）の検査が広く行われている。これらの中、トランスア
ミナーゼ及びアルカリフォスにターゼは、肝臓以外の組
織中に広く分布しているため肝疾患のみの指標となりに
くい。この点、後者のγ−Ｇ′ｒＰは肝疾患に対し特異
的であることが知られているので診断的価値が高い（Ｓ
ｚａｓｚ、Ｇ、。
Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、Ｐ、＆ Ｆｒ１ｔｚｓｃｈｅ、Ｗ
、＋ Ｄｔ、Ｍｅｄ、Ｗｓｃｈｒ、。
、＋ Ｄｔ、Ｍｅｄ、Ｗｓｃｈｒ、。
９４、ｐｐ、１９１１−１９１７（１９６９））。この
γ−ＧＴＰも、胆道障害を鋭敏に反映するため慢性肝炎
、肝硬変及び閉塞性黄痕に対しては有力な指標となるが
、急性肝炎に際しては殆んど変動しない（藤沢 渉Ｊ：
癌と化学療法、 ５ 、５ｕｐｐｌ、ＩＩ。
γ−ＧＴＰも、胆道障害を鋭敏に反映するため慢性肝炎
、肝硬変及び閉塞性黄痕に対しては有力な指標となるが
、急性肝炎に際しては殆んど変動しない（藤沢 渉Ｊ：
癌と化学療法、 ５ 、５ｕｐｐｌ、ＩＩ。
３７３〜３７９（１９７Ｂ））ので、急性肝炎の指標と
しては役立たない。しかるに、グアナーゼ活性は急性ウ
ィルス性肝炎に際して特異的に上昇し慢性肝炎や肝硬変
時には殆んど変動しないことが知られている（Ｗｈｉｔ
ｅｈｏｕｓｅ 、Ｊ、Ｌ、Ｋｎｉｇｈｔ−ｓ。
しては役立たない。しかるに、グアナーゼ活性は急性ウ
ィルス性肝炎に際して特異的に上昇し慢性肝炎や肝硬変
時には殆んど変動しないことが知られている（Ｗｈｉｔ
ｅｈｏｕｓｅ 、Ｊ、Ｌ、Ｋｎｉｇｈｔ−ｓ。
Ｅ、Ｍ、、 Ｓａｎ ｔｏｚ 、Ｃ、Ｌ、 ＆Ｈｕｅ
、Ａ、Ｃ、： Ｃ１ｉｎ 、Ｃｈｅｍ、、 １０ 、ｐ
７゜６３２（１９６４）： Ｂｅ１．Ａ、ｅｔａｌ、：
Ｐｒｅｓｓｅ、Ｍｅｄ、、７８゜１）１）、４９５〜
４９９（１９７０））ので、本酵素活性の検定は急性ウ
ィルス肝炎の診断上有力な手紐りを与える。
、Ａ、Ｃ、： Ｃ１ｉｎ 、Ｃｈｅｍ、、 １０ 、ｐ
７゜６３２（１９６４）： Ｂｅ１．Ａ、ｅｔａｌ、：
Ｐｒｅｓｓｅ、Ｍｅｄ、、７８゜１）１）、４９５〜
４９９（１９７０））ので、本酵素活性の検定は急性ウ
ィルス肝炎の診断上有力な手紐りを与える。
さらに、今日大きな社会問題と化している輸血後肝炎は
、その大部分がｎ ｏ ｎ−Ａ及びｎｏｎ−Ｂ型ウィル
スにより発生するため適当なスクリーニング法が未だ見
つかっていない。しがし最近グアナーゼ活性を指標とし
てスクリーニングすると前記急性ウィルス性肝炎の発生
を相当予防できるという成績が得られているので１．。
、その大部分がｎ ｏ ｎ−Ａ及びｎｏｎ−Ｂ型ウィル
スにより発生するため適当なスクリーニング法が未だ見
つかっていない。しがし最近グアナーゼ活性を指標とし
てスクリーニングすると前記急性ウィルス性肝炎の発生
を相当予防できるという成績が得られているので１．。
予防医学上も本酵素測定の意義が増大して、いる。
ところで、本酵素に対する診断的意義が高まるにつれ、
その測定手段の能率化（自動化）に対する要望も高まっ
ているが、後述するように適当な自動化手段はこれまで
存在しなかった。それは、本酵素のヒト血、清正常値が
低いため、その測定に長時間を要するという事実である
。
その測定手段の能率化（自動化）に対する要望も高まっ
ているが、後述するように適当な自動化手段はこれまで
存在しなかった。それは、本酵素のヒト血、清正常値が
低いため、その測定に長時間を要するという事実である
。
即ち、今日の検査技術においては、短時間内に多量の試
料を処理する必要上、高度に自動化された自動分析装置
の導入が活発に行われているが、本装置によれば、１つ
の試料毎に、平行して多種の検査を同時に１０〜１５分
以内に完了するように構成されているため、ある特定の
データ（この場合ではグアナーゼのデータ）を得るため
に全体の測定時間を延長するのは実際上不可能であり、
仮にできたとしても、それでは折角高価な自動機械を導
入した意味がないことになる。この理由から、グアナー
ゼの測定は要望されながらも日常検査として普及するに
至らない。本発明は従来本酵素測定手段として用いられ
て来た公知方法を改良することによって、精度に影響を
与えることなしに測定所要時間を飛躍的に短縮し、延い
てはこれによりグアナーゼの測定を自動化する途を啓こ
うとするものである。
料を処理する必要上、高度に自動化された自動分析装置
の導入が活発に行われているが、本装置によれば、１つ
の試料毎に、平行して多種の検査を同時に１０〜１５分
以内に完了するように構成されているため、ある特定の
データ（この場合ではグアナーゼのデータ）を得るため
に全体の測定時間を延長するのは実際上不可能であり、
仮にできたとしても、それでは折角高価な自動機械を導
入した意味がないことになる。この理由から、グアナー
ゼの測定は要望されながらも日常検査として普及するに
至らない。本発明は従来本酵素測定手段として用いられ
て来た公知方法を改良することによって、精度に影響を
与えることなしに測定所要時間を飛躍的に短縮し、延い
てはこれによりグアナーゼの測定を自動化する途を啓こ
うとするものである。
ところで、従来から知られているグアナーゼの代表的な
測定方法としては以下記載の諸方法がある。
測定方法としては以下記載の諸方法がある。
■ ラウシューノリス法（Ｒｏｕｓｈ、Ａ、＆ Ｎｏｒ
ｒｉｓ。
ｒｉｓ。
Ｅ、Ｒ，＋ Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２９．ＰＰ
、１２４−１２９（１９５０）） ：本性はグアニンと
キサンチンの吸光度の相違を利用し、グアニンの減少量
を測定するものである。ｂ−−フリー法（Ｈｕｅ、Ａ嘘
、Ｆｒｅｅ、Ａ、Ｈ＋ Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、 １１．
ＰＰ。
、１２４−１２９（１９５０）） ：本性はグアニンと
キサンチンの吸光度の相違を利用し、グアニンの減少量
を測定するものである。ｂ−−フリー法（Ｈｕｅ、Ａ嘘
、Ｆｒｅｅ、Ａ、Ｈ＋ Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、 １１．
ＰＰ。
７０８〜７１５（１９６５）） は水沫の改良法で、
試料中のキサンチンオキシダーゼの影響を除くため、ホ
ウ酸塩緩衝液を用いて測定する。
試料中のキサンチンオキシダーゼの影響を除くため、ホ
ウ酸塩緩衝液を用いて測定する。
吸光強度（分子吸光係数）（ε） ＝ ０．５３５Ｘ１
０’■ カル７カー法（Ｋａｌｃｋｅｒ、Ｈ，Ｍ、＋
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ。
０’■ カル７カー法（Ｋａｌｃｋｅｒ、Ｈ，Ｍ、＋
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ。
１６７、ＰＰ、４２９〜４４４．４４５〜４５９（１９
５７））：水沫はグアニンより生成したキサンチンにキ
サンチンオキシダーゼを作用させ、生成する尿酸量を吸
光値（２９０ｎｍ）の変化により追跡する方法である。
５７））：水沫はグアニンより生成したキサンチンにキ
サンチンオキシダーゼを作用させ、生成する尿酸量を吸
光値（２９０ｎｍ）の変化により追跡する方法である。
ε＝ １．２３ＸｌＯ’■ アンモニア定量法
（１） エリス・ゴールドバーブ法（Ｅｌｌｉｓ。
Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ｄａｖｉｄ Ｍ
、＋Ｂｉｏｃｈｅｍ。
、＋Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｍｅｄ、、６．ＰＰ、３８０〜３９１（１９７２））
： 水沫ではグアニンよりキサンチンを生成する際に
傍生ずるアンモニア量を測る。アンモニアの測定は、グ
ルタメート・デヒドロゲナーゼの存在下にα−ケトゲル
タール酸とＮＡＤＨ（還元型ニコチン酸アミドアデニン
ジヌクレオチド）を反応させ、消費されるＮＡＤＨ量の
変化を追跡する。ε＝０．６２２Ｘ１０’（２） 伊
藤ら法（伊藤進、香用正博、神原勉及び村上劉；臨床病
理、 ２３．ＰＰ、７３３〜７３６（１９７５）） ：
水沫ではアンモニア量をインドフェノール反応を利用し
て定量する。
： 水沫ではグアニンよりキサンチンを生成する際に
傍生ずるアンモニア量を測る。アンモニアの測定は、グ
ルタメート・デヒドロゲナーゼの存在下にα−ケトゲル
タール酸とＮＡＤＨ（還元型ニコチン酸アミドアデニン
ジヌクレオチド）を反応させ、消費されるＮＡＤＨ量の
変化を追跡する。ε＝０．６２２Ｘ１０’（２） 伊
藤ら法（伊藤進、香用正博、神原勉及び村上劉；臨床病
理、 ２３．ＰＰ、７３３〜７３６（１９７５）） ：
水沫ではアンモニア量をインドフェノール反応を利用し
て定量する。
ε＝ １．９６ Ｘ １０’
■ 過酸化水素定量法
水沫では、カルツカ−法で傍生ずる過酸化水素量を測る
。これには過酸化水素測定手段により以下の２法がある
。
。これには過酸化水素測定手段により以下の２法がある
。
（り フリックら法（Ｉ（ｅｉｎｔｚ Ｆｒ１ｔｚ
、Ｒｅｃｋｅｌ ５ｙｌｖｉａ＆ Ｋａｌｄｅｎ Ｊ
ｏａｃｈｉｍ、Ｒ，、Ｅｎｚｙｍｅ、２４．ＰＰ、２４
７〜２５４（１９７９）） ：水沫では過酸化水素にエ
タノールの存在下でカタラーゼを作用させ、生成するア
セトアルデヒドにさらにＮＡＤ （酸化型ニコチン酸ア
ミドアデニンジヌクレオチド）及びアセトアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼを作用させることにより生成する夷 ＮＡＤＨｆｆｉの変、を追跡する。ε＝０．６２２Ｘ１
０’（２）松浦ら法（加藤憲二１足立哲夫、伊藤吉将、
平野和行及び松浦衛：日本薬学 会編、生体成分の分析化学シンポジウ ム講演要旨集、 ＰＰ、４１〜４４（１９７９）） ：
水沫では過酸化水素に３−メチル−２ ＝ペンゾチアゾリノンヒ′ドラシン（ＭＢＴＨ）とジメ
チルアニリン（ＤＭＡ）とベル井キ、シダーゼとを反応
させ、生成するインダミン色素量を比色法により定量す
る。
、Ｒｅｃｋｅｌ ５ｙｌｖｉａ＆ Ｋａｌｄｅｎ Ｊ
ｏａｃｈｉｍ、Ｒ，、Ｅｎｚｙｍｅ、２４．ＰＰ、２４
７〜２５４（１９７９）） ：水沫では過酸化水素にエ
タノールの存在下でカタラーゼを作用させ、生成するア
セトアルデヒドにさらにＮＡＤ （酸化型ニコチン酸ア
ミドアデニンジヌクレオチド）及びアセトアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼを作用させることにより生成する夷 ＮＡＤＨｆｆｉの変、を追跡する。ε＝０．６２２Ｘ１
０’（２）松浦ら法（加藤憲二１足立哲夫、伊藤吉将、
平野和行及び松浦衛：日本薬学 会編、生体成分の分析化学シンポジウ ム講演要旨集、 ＰＰ、４１〜４４（１９７９）） ：
水沫では過酸化水素に３−メチル−２ ＝ペンゾチアゾリノンヒ′ドラシン（ＭＢＴＨ）とジメ
チルアニリン（ＤＭＡ）とベル井キ、シダーゼとを反応
させ、生成するインダミン色素量を比色法により定量す
る。
ε＝３．３７Ｘ１０’
■ ラジオアイソトープ法（Ｖａｎ Ｂｅｎｎｅｋｏｍ
、Ｃ。
、Ｃ。
ん、Ｖａｎ Ｌａａｒｈｏｖｅｎ、Ｊ、Ｐ、、Ｄｅ Ｂ
ｒｕｙｎ Ｃ，Ｈ，Ｍ。
ｒｕｙｎ Ｃ，Ｈ，Ｍ。
Ｍ、＆ Ｏｅ ｉ 、Ｔ、Ｌ、、 Ｊ 、ＣＩ ｉｎ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、１６ 、ＰＰ 。
、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、１６ 、ＰＰ 。
２４５〜２４８（１９７８）） ： 本性＋ｔ１４ｃ
ヲ−ＩＦ ヘルＬ。
ヲ−ＩＦ ヘルＬ。
たグアニンを用い、生成したキサンチンを電気泳動で分
離し、その放射能をシンチレーションカウンターで測る
方法である。この方法は感度が高いが、危険な１４ｃを
用いるので特殊な設備や専門技術者が必要であり、この
ため−膜検査法としては利用しにくい。
離し、その放射能をシンチレーションカウンターで測る
方法である。この方法は感度が高いが、危険な１４ｃを
用いるので特殊な設備や専門技術者が必要であり、この
ため−膜検査法としては利用しにくい。
以上のように多くの方法があるが、ヒト血清中のグアナ
ーゼ活性は通常１〜２１Ｕ／ｌ（自Ｕ＝３７℃で１分間
当り１μｍｏ＋の基質を分解する活性）に過ぎないので
、１５分程度の反応時間内に測定を完了するためにはε
値が２Ｘ１０’以上であることが要求される。この条件
を満足する方法は前■（２）の松浦ら法だけであるが、
この方法は、血清中に存在するカタラーゼの作用を排除
できないため真のグアナーゼを測定できないという本質
的な欠点を有する。即ち、阻害剤として加えられるアジ
化ナトリウム（ナトリウムアジド）は、完全にはカタラ
ーゼ活性を阻害しないため、水沫のように長ａｉ−Ｊｌ
に亘って過酸化水素とカタラーゼが共存す°る条件下で
はその影響を無視できない。さらに、水沫では過酸化水
素を安定化させるためグアナーゼ反応（基質の分解反応
）をｐＨ６，２で行っているが、グアナーゼの至適ｐＨ
は８，０附近であるから、上記ｐＨでは至適ｐＨ時の６
０％程度の活性しかなく、このことが反応時間を延長さ
せる原因となっている。
ーゼ活性は通常１〜２１Ｕ／ｌ（自Ｕ＝３７℃で１分間
当り１μｍｏ＋の基質を分解する活性）に過ぎないので
、１５分程度の反応時間内に測定を完了するためにはε
値が２Ｘ１０’以上であることが要求される。この条件
を満足する方法は前■（２）の松浦ら法だけであるが、
この方法は、血清中に存在するカタラーゼの作用を排除
できないため真のグアナーゼを測定できないという本質
的な欠点を有する。即ち、阻害剤として加えられるアジ
化ナトリウム（ナトリウムアジド）は、完全にはカタラ
ーゼ活性を阻害しないため、水沫のように長ａｉ−Ｊｌ
に亘って過酸化水素とカタラーゼが共存す°る条件下で
はその影響を無視できない。さらに、水沫では過酸化水
素を安定化させるためグアナーゼ反応（基質の分解反応
）をｐＨ６，２で行っているが、グアナーゼの至適ｐＨ
は８，０附近であるから、上記ｐＨでは至適ｐＨ時の６
０％程度の活性しかなく、このことが反応時間を延長さ
せる原因となっている。
（Ｂ） 発明の内容
本発明者は上記従来測定手段に＃ける問題点を解決し、
これらを自動測定法に適合せしめるべく鋭意努力した結
果、１５分以内に定量が可能で、しかも精度及び試−の
安定度共に４優れた測定手段を創出することができな。
これらを自動測定法に適合せしめるべく鋭意努力した結
果、１５分以内に定量が可能で、しかも精度及び試−の
安定度共に４優れた測定手段を創出することができな。
２本発明方法は必須の工程として以下の３段１階を含む
。
。
（１１グアナーゼ反応段階（キサンチン生成段階）基質
グアニンの緩衝溶液（ｐＨ７〜９）に試料溶液を加え、
１０〜３０分間イン札ベイトして試料中のグアナーゼに
より基質をキサンチンとアンモニアとに分解する工程。
グアニンの緩衝溶液（ｐＨ７〜９）に試料溶液を加え、
１０〜３０分間イン札ベイトして試料中のグアナーゼに
より基質をキサンチンとアンモニアとに分解する工程。
（■）過酸化水素生成段階：（■）の反応液にキサンチ
ンオキシダーゼの緩衝溶液（ｐＨ７〜９）を加え、キサ
ンチンを尿酸と過酸化水素とに分解する工程。
ンオキシダーゼの緩衝溶液（ｐＨ７〜９）を加え、キサ
ンチンを尿酸と過酸化水素とに分解する工程。
（Ｉｌｌ） 発色反応段階：■の溶液にＭＢＴＨ、ア
ニリン誘導体及びペルオキシダーゼを同時に作用させ、
イ２ンダミン色素を生成させる工程。
ニリン誘導体及びペルオキシダーゼを同時に作用させ、
イ２ンダミン色素を生成させる工程。
以上の各工程は下記の化学式により具体的に示される。
グアニン ま並２ヱ２ン
ミ゛ ｍ 以上の発明において、最重要なことは（１）工程が（１
１グアナ一ゼ反応、（Ｉｌｌ過酸化水素生成反応及び（
＠発色反応の３ステツプから構成されている点及び（Ｉ
ｌｌ第■ステップのグアナーゼ反応がｐｉ（７〜９、好
ましくは約ｐｌ（８の近辺で行われることである。前述
の杉油ら法はこのグアナーゼ反応が次の過酸化水素生成
反応と同時的に行われるため、生成し゛た過酸化水素の
安定化を図る目的でグアナーゼの至適ｐＨを離れたｐＨ
６，２で行っているため反応に長時間、を要し、しかも
カタラーゼの影響を受けて正確な測定が期待できない。
ミ゛ ｍ 以上の発明において、最重要なことは（１）工程が（１
１グアナ一ゼ反応、（Ｉｌｌ過酸化水素生成反応及び（
＠発色反応の３ステツプから構成されている点及び（Ｉ
ｌｌ第■ステップのグアナーゼ反応がｐｉ（７〜９、好
ましくは約ｐｌ（８の近辺で行われることである。前述
の杉油ら法はこのグアナーゼ反応が次の過酸化水素生成
反応と同時的に行われるため、生成し゛た過酸化水素の
安定化を図る目的でグアナーゼの至適ｐＨを離れたｐＨ
６，２で行っているため反応に長時間、を要し、しかも
カタラーゼの影響を受けて正確な測定が期待できない。
これに反し、本発明では反応をステップＩと■とに分割
して行うため、第１工程をグアナーゼの至適ｐＨである
ｐＨ８附近で行うことが、これにより反応時間を１５分
以内に短縮することが可能となり、延いては本定量に自
動分析装置を適用するのを可能ならしめる最大の理由と
なる。
して行うため、第１工程をグアナーゼの至適ｐＨである
ｐＨ８附近で行うことが、これにより反応時間を１５分
以内に短縮することが可能となり、延いては本定量に自
動分析装置を適用するのを可能ならしめる最大の理由と
なる。
次に、本定量手段を臨床化学検査のルーティンにのせる
ため必要なもの一つの条件は、発色液の安定化と検量線
の直線化である。即ち、第ｎ段階で使用されるミルク起
源のキサンチンオキシダーゼは、普通のオキシダーゼと
異って直接過酸化水素を生成させるこきはなく、中間で
−Ｈスーパー・オキサイド・ラジカル（δ２）を生成さ
せた後、溶媒中で後者を過酸化水素に変換させる機能を
持つ。従って、中間のスーパー・オキサイド・ラジカル
が過酸化水素に変化する際、電子受容体が存在するとこ
れに電子を供与する（つまり電子受容体を還元する。）
。このため、過酸化水素生成反応系と発色反応系とが併
存すると（換言すれば過酸化水素生成反応と発色反応と
を同時に行うと）、ペルオキシダーゼの作用で折角生成
した色素が還元され褪色し、この結果、検量線に曲がり
を生じるようになる。しかしこり欠点を避けるためステ
ップ■とステップ■を分割すると、血清中のカタラーゼ
などの作用を受けて真のグアナーゼ値を測定できなくな
るという懸念が生まれる。そこで種々研究の結果、発明
者は基質反応液中にカタラーゼ阻害剤を加え、かつ過酸
化水素生成反応時間を短縮すること番こよって試料中の
カタラーゼの悪影響を実費的に回避できることを見出し
た。
ため必要なもの一つの条件は、発色液の安定化と検量線
の直線化である。即ち、第ｎ段階で使用されるミルク起
源のキサンチンオキシダーゼは、普通のオキシダーゼと
異って直接過酸化水素を生成させるこきはなく、中間で
−Ｈスーパー・オキサイド・ラジカル（δ２）を生成さ
せた後、溶媒中で後者を過酸化水素に変換させる機能を
持つ。従って、中間のスーパー・オキサイド・ラジカル
が過酸化水素に変化する際、電子受容体が存在するとこ
れに電子を供与する（つまり電子受容体を還元する。）
。このため、過酸化水素生成反応系と発色反応系とが併
存すると（換言すれば過酸化水素生成反応と発色反応と
を同時に行うと）、ペルオキシダーゼの作用で折角生成
した色素が還元され褪色し、この結果、検量線に曲がり
を生じるようになる。しかしこり欠点を避けるためステ
ップ■とステップ■を分割すると、血清中のカタラーゼ
などの作用を受けて真のグアナーゼ値を測定できなくな
るという懸念が生まれる。そこで種々研究の結果、発明
者は基質反応液中にカタラーゼ阻害剤を加え、かつ過酸
化水素生成反応時間を短縮すること番こよって試料中の
カタラーゼの悪影響を実費的に回避できることを見出し
た。
従って、本発明では、第■段階の過酸化水素生成反応が
（−）カタラーゼ阻害剤の存在において、しかも（Ｍ可
及的急速に行われることも目的上必要な条件であると云
え淋。
（−）カタラーゼ阻害剤の存在において、しかも（Ｍ可
及的急速に行われることも目的上必要な条件であると云
え淋。
本発明の定量法は原則として自動分析装６置を利用して
行われる。今日数社から自動臨床化学分析装置が市販さ
れているが、これらはいづれも間欠的に回転するエンド
レスへ一ン又は乃スクに一定の間隔で多数の試料管を取
りつけ、これらの試料管に一定量づつの試料（血液標本
）及び試薬を加えて３７℃で一定時間インもベイトした
後、測定スティ均ンで分光々度肝を用いて計測し、この
計測結果をデータ処理装置を介してプリントアウトする
か又は／及び必要に応じたＣＲＴディスプレイに画像と
して表示する一方、測定の終った試料管を洗浄、乾燥し
て次の試料採取に鐙える過程を自動的に反復するように
構成されている・この装置では前述のように％採取され
た単位試料毎にアルカリにス々ターゼ、グルタミン酸、
オギザロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ
、トリグリセライド、グルコースなど多数の項目につい
て平行的に測定を行い、試料の採取より調定の完了まて
１５〜３０分間のサイクルで終らせるように設計されて
いるので、多数の項目中の１！ｊ［目についてのみ測定
時開を変更するようなことは操作的に不可能である。従
って、現存の各社のカタログにもグアナーゼの測定につ
いては記載されていない、しかるに本発明では、前記各
条件を採用したことによりグアナーｄの測定を自動化す
ること′が可能となった。故に、測定を自動分析機を利
用して行うことは発明の重要な目的の一つである。しか
しながら、発明の本質はグアナーゼの測定を迅速かつ正
確化することであって、この利点は手動分析でも当然顕
われるものであるから、自動分析機の利用自体は発明の
必須の構成ではないＯ 第ｆ段階の牛チンチン生成段階（グアナーゼ反応段階）
では、基質グアニンを溶かしたアルカリ溶液とマクイル
パイン緩衝液（リン酸二ナトリウム−クエン酸）′及び
カタラーゼ阻害剤（例えばアジ化ナトリウム）を川崎混
合して基質緩衝液とする。緩衝液のｐＨｇｔ７〜・９の
領域内、殊にグアナーゼの最高活性域であるｐＨ８附近
であるのが好ましい。このｐＨではグアナーゼ反応は３
７℃の恒温槽内で１５分以内に完了する。阻害剤として
はシアン化合物、アジド化合物又はフッ素化合物等の酵
素の鉄ポルフイリン活性中心に可逆的に結合する化合物
が使用されるが、グアナーゼへの影響を考慮してアジ化
ナトリウムのようなアジ化化合物を用いるのが好ましい
。
行われる。今日数社から自動臨床化学分析装置が市販さ
れているが、これらはいづれも間欠的に回転するエンド
レスへ一ン又は乃スクに一定の間隔で多数の試料管を取
りつけ、これらの試料管に一定量づつの試料（血液標本
）及び試薬を加えて３７℃で一定時間インもベイトした
後、測定スティ均ンで分光々度肝を用いて計測し、この
計測結果をデータ処理装置を介してプリントアウトする
か又は／及び必要に応じたＣＲＴディスプレイに画像と
して表示する一方、測定の終った試料管を洗浄、乾燥し
て次の試料採取に鐙える過程を自動的に反復するように
構成されている・この装置では前述のように％採取され
た単位試料毎にアルカリにス々ターゼ、グルタミン酸、
オギザロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ
、トリグリセライド、グルコースなど多数の項目につい
て平行的に測定を行い、試料の採取より調定の完了まて
１５〜３０分間のサイクルで終らせるように設計されて
いるので、多数の項目中の１！ｊ［目についてのみ測定
時開を変更するようなことは操作的に不可能である。従
って、現存の各社のカタログにもグアナーゼの測定につ
いては記載されていない、しかるに本発明では、前記各
条件を採用したことによりグアナーｄの測定を自動化す
ること′が可能となった。故に、測定を自動分析機を利
用して行うことは発明の重要な目的の一つである。しか
しながら、発明の本質はグアナーゼの測定を迅速かつ正
確化することであって、この利点は手動分析でも当然顕
われるものであるから、自動分析機の利用自体は発明の
必須の構成ではないＯ 第ｆ段階の牛チンチン生成段階（グアナーゼ反応段階）
では、基質グアニンを溶かしたアルカリ溶液とマクイル
パイン緩衝液（リン酸二ナトリウム−クエン酸）′及び
カタラーゼ阻害剤（例えばアジ化ナトリウム）を川崎混
合して基質緩衝液とする。緩衝液のｐＨｇｔ７〜・９の
領域内、殊にグアナーゼの最高活性域であるｐＨ８附近
であるのが好ましい。このｐＨではグアナーゼ反応は３
７℃の恒温槽内で１５分以内に完了する。阻害剤として
はシアン化合物、アジド化合物又はフッ素化合物等の酵
素の鉄ポルフイリン活性中心に可逆的に結合する化合物
が使用されるが、グアナーゼへの影響を考慮してアジ化
ナトリウムのようなアジ化化合物を用いるのが好ましい
。
第ｕ段階の過酸化水素生成反応では、キサンチンオキシ
ダーゼの硫酸アンモニウム懸洩液と第■段階で用いたと
同様の緩衝液が第１段階の反応液に添加され、短時間（
例えば１分間）放置される。カタラーゼ阻害剤は本段階
で加えられてもよい。
ダーゼの硫酸アンモニウム懸洩液と第■段階で用いたと
同様の緩衝液が第１段階の反応液に添加され、短時間（
例えば１分間）放置される。カタラーゼ阻害剤は本段階
で加えられてもよい。
第■段階ではＭＢＴＨ及びアニリン誘導体のハロゲン水
素酸塩（例えば塩酸塩）がベルオキダーゼと共にマクイ
ルパイン緩衝液（ｐＨ３，０）中に川崎混合され、第■
段階の反応液に加えられる。反応はこの場合も１分以内
に終了する。アニリン誘導体としてはＮ、Ｎ−ジメチル
アニリン、 Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジ−
ｎ−プロピルアニリンの如きＮ、Ｎ −’） −低級ア
ルキルアニリンが好ましい。
素酸塩（例えば塩酸塩）がベルオキダーゼと共にマクイ
ルパイン緩衝液（ｐＨ３，０）中に川崎混合され、第■
段階の反応液に加えられる。反応はこの場合も１分以内
に終了する。アニリン誘導体としてはＮ、Ｎ−ジメチル
アニリン、 Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジ−
ｎ−プロピルアニリンの如きＮ、Ｎ −’） −低級ア
ルキルアニリンが好ましい。
以下、本発明の基礎とならた実験事実につき記載する。
実験ｌ（発色液の安定性とｐｌ（との関係）０．１ｍＡ
！のマクイルバイン緩衛液（ｐＨ３，５〜７．０の間で
ｐＨ０，５刻みに変化させたもの） 、０．３ｘｔｌの
１５０ｍＭジエチルアニリン（ＤＥＡ）、０．１５ ｍ
ｌの５ｍＭ ＭＢＴＨ、０，３ｍｌの８ｍＵキサンチン
オキシダーゼ、０．３Ｍの１５Ｕペルオキシダーゼ及び
０．４ ａｔの蒸留水を混合した溶液に５０ｐｌのヒト
血清を加え、３７℃で１０分間放置し、１分間毎に５９
０ｎｍに＃ける吸光度の変化を追跡した。結果は第１図
に示される。図示の如く発色液のｐＨが増加する程、か
つ時間が経過する程吸光度は増大する。ｐＨ４，０以上
では吸光線に曲りが見られｐＨ３，５以下が好ま、しい
。
！のマクイルバイン緩衛液（ｐＨ３，５〜７．０の間で
ｐＨ０，５刻みに変化させたもの） 、０．３ｘｔｌの
１５０ｍＭジエチルアニリン（ＤＥＡ）、０．１５ ｍ
ｌの５ｍＭ ＭＢＴＨ、０，３ｍｌの８ｍＵキサンチン
オキシダーゼ、０．３Ｍの１５Ｕペルオキシダーゼ及び
０．４ ａｔの蒸留水を混合した溶液に５０ｐｌのヒト
血清を加え、３７℃で１０分間放置し、１分間毎に５９
０ｎｍに＃ける吸光度の変化を追跡した。結果は第１図
に示される。図示の如く発色液のｐＨが増加する程、か
つ時間が経過する程吸光度は増大する。ｐＨ４，０以上
では吸光線に曲りが見られｐＨ３，５以下が好ま、しい
。
実験２．（過酸化水素生成反応と発色民心と・を同時に
行った場合の発色状況） ５０１ｔｌのヒト血清に０．４５ ｍｌの０．３ ｍＭ
のグアニン緩衝溶液（ｐＨ８，０）を加え、３７℃で１
５分間インもベイトした後、反応液に０．５ ｍＭのＭ
ＢＴＨ及び３０ｍＭのＤＥＡを含む緩衝溶液（ｐＨ４，
０）並びに０．２Ｕのキサンチンオキシダーゼ（Ｘ、Ｏ
）及び５Ｕのペルオキシダーゼ（ｐｏｘ ）を含む酵素
液０．５ ｆｆ１ｔを加え、３７℃で５分間・イン転ベ
ート、発色状況を５９０ｎｍにおける吸光度とにより測
定した０結果を第２図に示す。各点の上下を挾む短線は
１２回の測定における標準偏差を示す（変動係数（ＣＶ
）＝１．４％）。図示の如く吸光′線に弯曲が見られる
が、これはスーパーオキサイドラジカルの作パ用による
インダミン色素の褪色に因るもので、末法が定量法とし
て望ましくないことを物語っている。
行った場合の発色状況） ５０１ｔｌのヒト血清に０．４５ ｍｌの０．３ ｍＭ
のグアニン緩衝溶液（ｐＨ８，０）を加え、３７℃で１
５分間インもベイトした後、反応液に０．５ ｍＭのＭ
ＢＴＨ及び３０ｍＭのＤＥＡを含む緩衝溶液（ｐＨ４，
０）並びに０．２Ｕのキサンチンオキシダーゼ（Ｘ、Ｏ
）及び５Ｕのペルオキシダーゼ（ｐｏｘ ）を含む酵素
液０．５ ｆｆ１ｔを加え、３７℃で５分間・イン転ベ
ート、発色状況を５９０ｎｍにおける吸光度とにより測
定した０結果を第２図に示す。各点の上下を挾む短線は
１２回の測定における標準偏差を示す（変動係数（ＣＶ
）＝１．４％）。図示の如く吸光′線に弯曲が見られる
が、これはスーパーオキサイドラジカルの作パ用による
インダミン色素の褪色に因るもので、末法が定量法とし
て望ましくないことを物語っている。
実験３（本発明法）
５０ｐｌのキサンチン溶液ニ０．４ ｍ７？（７） ０
．３ｍＭ り７二ン緩衝溶液（ｐＨ８，０）を加え、３
７℃で１３分間イン本ベイト後、０．３ ｍｌの０．２
０Ｘ、Ｏを加え、再び３７℃で１分間イン本ベイトし、
さらに１、Ｏｒｕｌの０．５ｍＭ ＭＢＴＨ，３０ｍＭ
のＤＥＡ及び５０ＵのＰＯＸを含むｐｌ（３，０の緩衝
溶液を加え１、もう一度３７℃で１分間インキュベイト
後、直ちに５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。結礫
を第３図に示す。ＣＶ ＝ ０．７％（回数１２）、相
関係数（γ） ０．９９９９ （ε＝ ３．３３ Ｘ
１０’ ）。この図から本方法では検量線が直線状で充
分実用に耐えることが判る。
．３ｍＭ り７二ン緩衝溶液（ｐＨ８，０）を加え、３
７℃で１３分間イン本ベイト後、０．３ ｍｌの０．２
０Ｘ、Ｏを加え、再び３７℃で１分間イン本ベイトし、
さらに１、Ｏｒｕｌの０．５ｍＭ ＭＢＴＨ，３０ｍＭ
のＤＥＡ及び５０ＵのＰＯＸを含むｐｌ（３，０の緩衝
溶液を加え１、もう一度３７℃で１分間インキュベイト
後、直ちに５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。結礫
を第３図に示す。ＣＶ ＝ ０．７％（回数１２）、相
関係数（γ） ０．９９９９ （ε＝ ３．３３ Ｘ
１０’ ）。この図から本方法では検量線が直線状で充
分実用に耐えることが判る。
実験４（アニリン誘導体の種類と発色率の関係）
０〜０．２５ｍＭの過酸化水素０．１−と０．４−の０
．３ｍＭグアニン緩衝溶液（ｐＨｓ、ｏ） ノ混液ニ１
．０ ｆｆ１７！ノ０．５ｍＭ ＭＢＴＨｌｌｏｍＭの
ＤＭＡ又はＤＥＡ及び５０ＵのＰＯＸ緩衝溶液（ｐＨ３
，０）を加え、３７℃で１分間インキュベート後、さら
に１．５ Ｗｌｌの１．５Ｎ硫酸を加え、直ちに５９０
ｎｍにおける吸光度を測った。結果を第４図に示す。図
示の如く過酸化水素の量が増加するにつれ吸光度が増加
するが、変化はいづれも直線的で、ＤＭＡの方が僅かに
吸光度が大きい以外差異は認められない。
．３ｍＭグアニン緩衝溶液（ｐＨｓ、ｏ） ノ混液ニ１
．０ ｆｆ１７！ノ０．５ｍＭ ＭＢＴＨｌｌｏｍＭの
ＤＭＡ又はＤＥＡ及び５０ＵのＰＯＸ緩衝溶液（ｐＨ３
，０）を加え、３７℃で１分間インキュベート後、さら
に１．５ Ｗｌｌの１．５Ｎ硫酸を加え、直ちに５９０
ｎｍにおける吸光度を測った。結果を第４図に示す。図
示の如く過酸化水素の量が増加するにつれ吸光度が増加
するが、変化はいづれも直線的で、ＤＭＡの方が僅かに
吸光度が大きい以外差異は認められない。
実験５（グアナーゼ活性と酵素量との関係）ラット肝臓
より抽出した粗グアナーゼ液を標本としてグアナーゼ活
性と酵素量との相関を調べた。粗グアナーゼ量は前記伊
藤らの方法に基き測定した。
より抽出した粗グアナーゼ液を標本としてグアナーゼ活
性と酵素量との相関を調べた。粗グアナーゼ量は前記伊
藤らの方法に基き測定した。
また、グアナーゼ活性は粗グアナーゼ液にヒト血清を加
えたものを試料として実験３の方法に従って測定した。
えたものを試料として実験３の方法に従って測定した。
結果を第５図に示す。
図示の如く、グアナーゼ活性と酵素量との間には明らか
な相関々係が認められる。
な相関々係が認められる。
各点の上下を挾む短線は１２回測定時の標準偏差値を示
す（ＣＶ ＝ １．４％、ｒ＝０．９９９９）。
す（ＣＶ ＝ １．４％、ｒ＝０．９９９９）。
本発明に基＜５００検体用処法の例を以下に示す。
■ 緩衝液Ａ
ＫＨ２Ｐ０．０．２１５ ｇ及びに２ＨＰ０．３．９９
８ ｇ ／ １００検体／パック これを５包、各レト
ルトパックとする。
８ ｇ ／ １００検体／パック これを５包、各レト
ルトパックとする。
■ 緩衝液Ｂ
クエン酸（１水塩） ４．０９６ｇ ％Ｎａ２ＨＰＯ４
１，５６４ｇＭＢＴＨ２６，９６１ＦＩｇ及びＤＥＡ
１．３９３ ｇ ／ １００検体／パック これを５包
、各レトルトパックとする。
１，５６４ｇＭＢＴＨ２６，９６１ＦＩｇ及びＤＥＡ
１．３９３ ｇ ／ １００検体／パック これを５包
、各レトルトパックとする。
■ ３ｍＭグアニン
グアニン １３，６２ｓｙ、ＮａＮ５２］Ｊ９４１１ｙ
を３０−の１２ｍＭ ＮａＯＨに溶かし、バイアル瓶中
に封入。１瓶。
を３０−の１２ｍＭ ＮａＯＨに溶かし、バイアル瓶中
に封入。１瓶。
０１２ｍＭ Ｎａ０Ｈ
ＮｔＮ８２１．９４ｍｙを３０−の１２ｍＭ ＮａＯ■
溶液に溶かし、バイアル瓶中に封入。ｌ瓶。
溶液に溶かし、バイアル瓶中に封入。ｌ瓶。
■ ＩＯＵ／ｍ／キサンチンオキシダーゼキサンチン
オキシダーゼを下記濃度となるように３．２Ｍ （ＮＨ
，）２ｓｏ；溶液２６−に懸、濁し、バイアル瓶中に封
入。１瓶。
オキシダーゼを下記濃度となるように３．２Ｍ （ＮＨ
，）２ｓｏ；溶液２６−に懸、濁し、バイアル瓶中に封
入。１瓶。
■ １２５００ Ｕペルオキシダーゼ
１２５００ Ｕ／バイアルの凍結乾燥ペルオキシダーゼ
粉末を１０−容バイアル瓶中に封入（１００検体用）。
粉末を１０−容バイアル瓶中に封入（１００検体用）。
−５瓶。
■ ０．５ｍＭキサンチン
０．５ｍＭのキサンチン溶液１０−をバイアル瓶中に封
入。１瓶。
入。１瓶。
以上の各包装物は未開封のまま冷所に貯蔵されれば長期
に亘り安定である。
に亘り安定である。
以上の各包装物は次のように１日分の試薬を予製するの
に使用する。
に使用する。
■ 基質緩衝溶液
緩衝液Ａの１パツクの内容物を蒸留水に溶かし、全量を
２００１ｎｌとする。この稀釈液の４！１１−を採り、
これに３ｍＭグアニン５−を加える（試薬■）。
２００１ｎｌとする。この稀釈液の４！１１−を採り、
これに３ｍＭグアニン５−を加える（試薬■）。
■無基質緩衝溶液（盲検用）
■の緩衝液Ａの稀釈液に１２ ｍＭ ＮａＯＨ５ｖｌを
加える（試薬■）。
加える（試薬■）。
■ キサンチンオキシダーゼ溶液
１０Ｕ／−キサンチンオキシダーゼ懸独液５−に■の緩
衝液Ａの稀釈液４５ＩｌｌＩ！！を加える（試薬ｍ）。
衝液Ａの稀釈液４５ＩｌｌＩ！！を加える（試薬ｍ）。
■ 発色液
緩衝液Ｂの１パツクの内容物を蒸留水に溶かし、全量を
２５０−とじ、これにペルオキシダーゼの１瓶を溶かす
（試薬■）。
２５０−とじ、これにペルオキシダーゼの１瓶を溶かす
（試薬■）。
血清サンプル５０μｔに試薬ｌ０１４−を加え、３７℃
で１３分間インキエベイトする。この反応液に試薬１１
１０．２ｍ／を加えて３７°Ｃで１分間放置後、さらに
試薬ＩＶ１ｍ／を加えて３７℃で１分間保つ。終了後、
直ちに５７０ ｎｍにおける吸°光度又は５７０ｎｍと
７００ｎｍとにおける吸光度の差を測定し、予め定めら
れた検量線からサンプル中のグアナーゼ活性を求める。
で１３分間インキエベイトする。この反応液に試薬１１
１０．２ｍ／を加えて３７°Ｃで１分間放置後、さらに
試薬ＩＶ１ｍ／を加えて３７℃で１分間保つ。終了後、
直ちに５７０ ｎｍにおける吸°光度又は５７０ｎｍと
７００ｎｍとにおける吸光度の差を測定し、予め定めら
れた検量線からサンプル中のグアナーゼ活性を求める。
なお、測定が自動分析機を用いて行われる場合は、検量
線の各点に対応゛するデータは予′め附属のコンピュー
ター中に入力さ昨ているので、即時デジタルの数字とし
て自７動的に印字されることができる。
線の各点に対応゛するデータは予′め附属のコンピュー
ター中に入力さ昨ているので、即時デジタルの数字とし
て自７動的に印字されることができる。
前述のように、本発明分析法はマニュアルで行っても従
来のグアナーゼ測定法に比し検査所要時間を著しく短縮
しつるという利点があるが、その効果は自動分析機の利
用により最高度に発揮される。現在、国内でも数社から
この種自動分析機が販売されており、例えば日立製作新
製７０６Ｄ型機では同時に１２の項目について分析する
能力がある。これらの自動分析装置では、試薬をセット
し、測定項目、サンプル番号、分析法、測光波長、′デ
ィスペンサ一番号、試験管番号、正常範囲、較正値など
の諸項目を予め操作ボタンにより入力し、後はスタート
ボタンを押すだけで自動的に分析が行われ、結果が印字
される。従って、発明方法を臨床検査のルーティンにの
せるには最も好ましい。
来のグアナーゼ測定法に比し検査所要時間を著しく短縮
しつるという利点があるが、その効果は自動分析機の利
用により最高度に発揮される。現在、国内でも数社から
この種自動分析機が販売されており、例えば日立製作新
製７０６Ｄ型機では同時に１２の項目について分析する
能力がある。これらの自動分析装置では、試薬をセット
し、測定項目、サンプル番号、分析法、測光波長、′デ
ィスペンサ一番号、試験管番号、正常範囲、較正値など
の諸項目を予め操作ボタンにより入力し、後はスタート
ボタンを押すだけで自動的に分析が行われ、結果が印字
される。従って、発明方法を臨床検査のルーティンにの
せるには最も好ましい。
本発明方法においても、血清中のグアナーゼ以外の成分
や試薬の純度や力価（殊に酵素類の）の已むを得ない変
動による影響を避けるため、グアニンを含まない試料に
ついて盲検を行ってブランク値を決定し、このブランク
値を観測値から控除して正確な値を定めるのが理想的で
ある。上述の自動分析装置はこのための対照機能を備え
−ているので、試薬■はこの目的のため利用される。
や試薬の純度や力価（殊に酵素類の）の已むを得ない変
動による影響を避けるため、グアニンを含まない試料に
ついて盲検を行ってブランク値を決定し、このブランク
値を観測値から控除して正確な値を定めるのが理想的で
ある。上述の自動分析装置はこのための対照機能を備え
−ているので、試薬■はこの目的のため利用される。
以上詳述したように、本発明は従来測定に長時間を要し
たグアナーゼの測定所要時間を著しく短縮することによ
り本測定を臨床検査用自動分析装置により行うことを可
能とし、ひいては本測定を日常臨床検査の項目中に取り
入れることを可能としたものであって、肝疾患の診断及
び治療の面で医療上重要な貢献をするものである。
たグアナーゼの測定所要時間を著しく短縮することによ
り本測定を臨床検査用自動分析装置により行うことを可
能とし、ひいては本測定を日常臨床検査の項目中に取り
入れることを可能としたものであって、肝疾患の診断及
び治療の面で医療上重要な貢献をするものである。
第１図は本発明における発色液の安定性とｐＨとの関係
を示すグラフ、第２図は過酸化水素生成反応と発色反応
とを同時に行った場合の発色状況を示すグラフ、第３図
は本発明に従ってグアナーゼ反応と、過酸化水素生成反
応と発色反応とを別々に行った場合における発色状況を
示すグラフ、第４図はアニリン誘導体の種類による発色
状況の変化を示すグラフ及び第５図はグアナーゼの活性
と酵素量との相関を示すグラ・フである。 第１図 第３図 第２図 Ｘａｎｔｈｉ ｎｅ （ｎ ｍｏｌ／ｌｕｂｅ）第 ４
ｍ １５ ［Ｉ Ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ ｍｅｔｈｏｄ（Ｕ／Ｌ）手続
補正書〔自発〕 ２、発明の名称 グアナーゼの迅速定量法オオヨド
ナカツ 住 所 大阪市大淀区中津１丁目６番２４４、代理人 とをつなぐｕ）。
を示すグラフ、第２図は過酸化水素生成反応と発色反応
とを同時に行った場合の発色状況を示すグラフ、第３図
は本発明に従ってグアナーゼ反応と、過酸化水素生成反
応と発色反応とを別々に行った場合における発色状況を
示すグラフ、第４図はアニリン誘導体の種類による発色
状況の変化を示すグラフ及び第５図はグアナーゼの活性
と酵素量との相関を示すグラ・フである。 第１図 第３図 第２図 Ｘａｎｔｈｉ ｎｅ （ｎ ｍｏｌ／ｌｕｂｅ）第 ４
ｍ １５ ［Ｉ Ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ ｍｅｔｈｏｄ（Ｕ／Ｌ）手続
補正書〔自発〕 ２、発明の名称 グアナーゼの迅速定量法オオヨド
ナカツ 住 所 大阪市大淀区中津１丁目６番２４４、代理人 とをつなぐｕ）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （＋ｌ 体液試料中にグアニンを加え、このグアニン
を該試料中グアナーゼによりキサンチンに変化させ、こ
のキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより尿酸に分
解さ奢る際に副生ず。 ろ過酸化水素をベルオキシターゼの存在下、に３−メチ
ル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン及びアニリン誘
導体と反応させてインダミン色素に変化させ、この色素
の５７０〜６００ｎｍにおける吸光度を測定することに
より前記試料中のグアナーゼを定量する方法において、
（イ）反応を、（Ｉ）キサンチン生成反応、（■）過酸
化水素生成反応及び（＠発色反応の３段階に分けて行わ
せること、 （ロ） キサンチン生成反応をグアナーゼの好適ｐＨ作
用域内で行わせること、及び （／ウ 過酸化水素生成反応をカタラーゼ阻害剤こと
、 を特徴とするグアナーゼの迅速定量法。 （２） アニリン誘導体がＮ、Ｎ−ジ低級アルキルア
ニリンである特許請求の範囲第（１１項記載の方法０ （３） カタラーゼ阻害剤がアジ化ナトリウムであ＼
イ る特許請求の範囲第ｉｌ＋項記載の方法。 （４） キサンチン生成反応がｐＨ７〜９、好ましく
はｐＨ８附近で行われる特許請求の範囲第（１）項記載
の方法。 （５）測定が臨床化学的自動分析装置を利用して行われ
る特許請求の範囲第（１１項から第（４）項のいづれか
に記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56152807A JPS5856699A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | グアナ−ゼの迅速定量法 |
| EP82108856A EP0075894A1 (en) | 1981-09-25 | 1982-09-24 | A rapid assaying method for guanase |
| US06/424,182 US4550076A (en) | 1981-09-25 | 1982-09-27 | Rapid assaying method for guanase |
| CA000412233A CA1203154A (en) | 1981-09-25 | 1982-09-27 | Rapid assaying method for guanase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56152807A JPS5856699A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | グアナ−ゼの迅速定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5856699A true JPS5856699A (ja) | 1983-04-04 |
| JPH0228320B2 JPH0228320B2 (ja) | 1990-06-22 |
Family
ID=15548579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56152807A Granted JPS5856699A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | グアナ−ゼの迅速定量法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4550076A (ja) |
| EP (1) | EP0075894A1 (ja) |
| JP (1) | JPS5856699A (ja) |
| CA (1) | CA1203154A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6117519A (ja) * | 1984-07-04 | 1986-01-25 | Maruho Kk | 輸血用血液の選別方法 |
| JPH0335967U (ja) * | 1989-08-22 | 1991-04-08 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2109429T3 (es) * | 1992-02-03 | 1998-01-16 | Lifescan Inc | Colorante mejorado de copulacion oxidativa para el analisis cuantitativo espectrofotometrico de analitos. |
| US7312197B2 (en) * | 2003-02-24 | 2007-12-25 | University Of Maryland, Baltimore | Method of modifying glucose activity using polypeptides selectively expressed in fat tissue |
| US7299082B2 (en) | 2003-10-31 | 2007-11-20 | Abbott Diabetes Care, Inc. | Method of calibrating an analyte-measurement device, and associated methods, devices and systems |
| US7699964B2 (en) * | 2004-02-09 | 2010-04-20 | Abbott Diabetes Care Inc. | Membrane suitable for use in an analyte sensor, analyte sensor, and associated method |
| US8165651B2 (en) | 2004-02-09 | 2012-04-24 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte sensor, and associated system and method employing a catalytic agent |
| US7885698B2 (en) | 2006-02-28 | 2011-02-08 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and system for providing continuous calibration of implantable analyte sensors |
| CA2933166C (en) | 2013-12-31 | 2020-10-27 | Abbott Diabetes Care Inc. | Self-powered analyte sensor and devices using the same |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2600526C3 (de) * | 1976-01-08 | 1981-06-19 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H↓2↓O↓2↓ bildenden Substanzen und Reagens zu seiner Durchführung |
-
1981
- 1981-09-25 JP JP56152807A patent/JPS5856699A/ja active Granted
-
1982
- 1982-09-24 EP EP82108856A patent/EP0075894A1/en not_active Ceased
- 1982-09-27 CA CA000412233A patent/CA1203154A/en not_active Expired
- 1982-09-27 US US06/424,182 patent/US4550076A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6117519A (ja) * | 1984-07-04 | 1986-01-25 | Maruho Kk | 輸血用血液の選別方法 |
| JPH0335967U (ja) * | 1989-08-22 | 1991-04-08 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4550076A (en) | 1985-10-29 |
| JPH0228320B2 (ja) | 1990-06-22 |
| EP0075894A1 (en) | 1983-04-06 |
| CA1203154A (en) | 1986-04-15 |
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