JPS63233799A - ビタミンｅ欠乏症の検査のためのピルビン酸キナーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明はピルビン酸キナーゼ（以下ＰＫと略記する）活
性の測定方法および測定試薬に関する。

すなわち本発明の産業上の利用分野はＰＫ活性を測定す
ることに生化学的ないし医学的意義が見られる分野であ
り９例えば臨床検査のための診断薬の分野をあげること
ができる。

（２）従来技術 ＰＫは、解糖系の重要酵素で全身のすべての組織に存在
する。臨床検査の領域においてＰＫ活性の測定は先天性
の溶血性貧血等の血液疾患の一部の診断に日常的に利用
されている。

ＰＫは、（１）式の左右両方向の反応を触媒する酵素で
ある。

（略号は、ＰＥＰ　：ホスホエノールビルビン酸。

ＡＤＰ　：アデノシンニリン酸、ＡＴＰ　：アデノシン
ニリン酸） ＰＫ活性の測定にはこれまで種々の方法が提案されて来
たが、それらを大きく分けると■上記（１）の反応の生
成物を直接測定する方法（直接法）と。

■上記（１）の反応の生成物を、それを基質とする他の
酵素反応に流れ込ませ、その酵素反応に関与する別の基
質の吸光度の変化を測定する方法（間接法）とに分けら
れる。

直接法としては、ＰＫ反応の基質であるアデノシンニリ
ン酸（以下ＡＤＰと略記する）あるいはホスホエノール
ピルビン酸（以下ＰＰＰと略記する）をラジオアイソト
ープで標識し、それらからの生成物即ちアデノシンニリ
ン酸（以下ＡＴＰと略記する）あるいはピルビン酸を分
離しその放射能を測定する方法（アナル、バイオケム、
、　ｉ　１３５−１４０（１９７１）　（ＡｎａＬ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、、　３９．１３５−１４０（１９７１）
　）　、アナル、バイオケム、、　　１３４．　４９５
−４９８　（１９８３）（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３４．４９５−４９８（１９８
３））参照）がある。これらの方法はいずれも感度は高
いものの放射性同位元素を使うという欠点があるため広
く使われるに至っていない。

φ 直接法のも１つの方法はＰＫ反応によって生じるＡＴＰ
をルシフェリン・ルシフェラーゼで測定する方法である
。この方法は原理としてはすでに公知（メソード　バイ
オケムーアナル、、胆、　１６４−１６８゜（１９８６
）　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａｎａｌ、
、　１６．１６４−１６８．（１９６８））。

スカンド、ジェー、デンタ、リサ、、３３．３７５−３
８１（１９７５）（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｄｅｎｔ、　
Ｒｅｓ、、　８３．３７５−３８１（１９７５）　）で
あるが、測定法として詳細な検討を加えた報告は現在に
至るまで見出せない。

間接法としては、乳酸脱水素酵素共存下に還元型β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドの吸光度の減少を
測定する方法があり、その測定原理は次の通りである。

この原理を応用した特許として特公昭５５−４２６３６
がある。

（上記略号のうち、　ＮＡＤＨは還元型β−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤはβ−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド、ＬＤＨは乳酸脱水素酵素
である） 即ち（１）の反応でＰＫの作用によって生じたピルビン
酸ヲ還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドと乳
酸脱水素酵素の共存丁番ζ乳酸に変換し。

同時に起る還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドのβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドへ
の酸化を分光学的に測定するものである。

この方法は現在ＰＫ活性の測定に最も広（用いられてい
るものである。この方法は通常の分光器さえあればどこ
ででもＰＫ活性を測定できるという利点を備えている。

しかし欠点としては測定感度が低いこと、そのため測定
に用いる試料（血液等）の量が必然的に多くなり患者等
に負担をかけること、また測定には試料をほとんど原液
のまま用いねばならず共存する他の物質の影響を考慮に
入れる必要があること等があげられる。また第２の欠点
としては１検体の測定に時間を要するため多検体の同時
処理が困難であることがあげられる。

（３）発明が解決しようとする問題点 以上に述べたごと（、現在に至るも生体試料中のＰＫ活
性を簡便かつ短時間に精度よ（測定する方法はない。即
ち直接法では原理としてはルシフェリン−ルシフェラー
ゼ法が公知であるが、その詳細な検討は加えられていな
い。この理由は第１には安定でノイズの少ないルシフェ
リン・ルシフエラーゼの入手が困難であったこと、第２
には生体試料中には必ずＡＴＰが存在し、そのものがＰ
Ｋ反応によって生じたＡＴＰの測定のバック・グラウン
ドとして検出されるため、測定法を複雑にすると共にそ
の精度を低下させること等が考えられる。さ、らに生体
試料中のＰＫは不安定であり、特に希釈溶液中では活性
低下が著しいため、ＰＫを成る程度安定化させることが
測定を容易かつ再現可能にするため１ζ重要である。

（４）問題点を解決するための手段 本発明者らは、このような問題点を解決すぺ（鋭意研究
を重ねた結果、安定でノイズの少ないルシフェリン・ル
シフェラーゼを用いることにより。

生体試料中のＰＫ活性を簡便かつ高精度で測定でき、さ
らに血清アルブミン含有緩衝液を使用し検体中のＰＫの
安定化をはかることにより、一層再現性が高まることを
見出し９本発明を完成した。

すなわち１本発明は生体試料中のピルビン酸キナーゼ活
性の測定にあたり、アデノシンニリン観ホスホエノール
ピルビン酸およびルシフェリン・ルシフェラーゼを使用
することを特徴とするピルビン酸キナーゼの測定方法お
よび測定試薬である。

本発明の試薬はＡＤＰ、　ＰＥＰ、ルシフェリン・ルシ
フェラーゼが主成分であり、その他通常の緩衝塩、賦活
剤、安定化剤などが含まれるのは自由であり、この中に
安定化剤として牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記す
る）を共存させることが好ましい。ここでＢＳＡは試薬
として入手できるものを使用すればよい。このＢＳＡの
濃度としては０．０１％〜０．５％が適当であり、特に
０．１〜０．３％が好ましい。

本発明に用いられるＡＤＰとしては、その給源が限定さ
れるものではな（、たとえばウマ骨格筋由来のものなど
を使用することができる。ただＡＤＰ２ζは１９６前後
のＡＴＰが含まれることが多く、このＡＴＰがＰＫ活性
の測定を妨害するので、あらかじめ公知の方法（ア　フ
レキシブル　システム　オプ　エンザイマチック　アナ
リシス、　　ｐ１５３．アカデミツク　プレス、二Ｘ−
ヨーク（１９７２）（ＡＦｌｅｎｂｌｅ　Ｓｙｓｔｅｍ
　ｏｆ　Ｆａｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　ｐ
１５３．　Ａｃａｄｅ−ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　
Ｙ　（１９７２））　）でＡＴＰ含有量を０．０１９６
以下にしてお（必要がある。

ＰＥＰについてもＡＤＰと同様に、その供源が限定され
るものではない。

ルシフェリン・ルシフェラーゼはホタル（Ｐｈｏ−ｔｉ
ｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）由来のもので純度が高く、バ
ックグラウンドの発光が少ないものを用いる。

また賦活剤としては塩化カリウム、酢酸カリウムなどの
カリウム塩類、塩化マグネシウムや酢酸マグネシウム等
のマグネシウム塩類およびエチレンジアミン四酢酸カリ
ウム塩（以下ＥＤＴＡ二にと略記する。）を緩衝塩類と
しては１例えばトリスヒドロ牛メチルアミノメタン（以
下トリスと略記する。）などの公知のものを使用するこ
とができる。

本発明のＰＫ測定試薬の各成分の濃度は、公知技術を適
用すればよいが一般には次の濃度が好ましい。例えばＡ
ＤＰを０．１〜１０／ＪＭ、　ｐＥｐを１０１Ｍ〜１ｍ
Ｍ、塩化カリウムを０．１ｍＭ　〜１０ｍＭ、塩化マグ
ネシウムを０．１ｍＭ　〜３０ｍＭ、　ＲＤＴＡ二Ｋを
０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、）　９スを１〜１００ｍＭ使用
すればよい。

より好ましくはＡＤＰ　０．５〜む４．　Ｐ即５０〜５
００　ＩＭｉ。

塩化カリウム０．５〜５ｍＭ、塩化マグネシウム０．５
−１５ｍＭ、　ＥＤＴＡ二Ｋ　Ｏ，５〜５ｍＭ、　　）
すｘ　５〜５０ｍＭを使用すればよい。

さらに、　ＰＫの同位酵素（アイソザイム、　ｉｓｏ−
ｑｍｅ　）の活性化を調べるためにはフルクトース１゜
６ニリン酸を加えればよいが、この濃度は０．１ｍＭ〜
１０ｍＭが適当であり、特に０．５〜５ｍＭが好ましい
。

本発明の試薬は実施例においては三試薬系として示すが
９分析機器等の都合によっては公知技術を適宜組み合せ
て二試薬系あるいは一試薬系として使用することも可能
である。この場合、各々の試薬の最終濃度を上でのべた
試薬の濃度範囲に入れるよう調製すればよい。

（５）実施例 次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ １）測定に用いる試薬 以下に示す３つの試薬を組み合せてＰＫ活性を測定する
ための本発明の測定試薬とした。

第１試薬、　ＥＤＴＡ二に２ｍＭ、　ＢＳＡｏ、１％、
　ＡＤＰ２μＭ、トリｙ、、２０ｍＭ−硫酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，７０）第２試薬、　ＥＤＴＡ二に２ｍＭ、　ＢＳ
Ａｏ、１％、塩化カリウム１７．５ｍＭ、塩化マグネシ
ウム３１．５ｍＭ、　ＰＥＰｌ、４ｍＭ、）すＸ２０ｍ
Ｍ−硫酸緩衝液（ｐＨ７，７０）第３試薬、ルシフェリ
ン・ルシフヱラーゼ溶液（ＬＫＢ−ｗａｌｌａｃｋ社製
）。

以上３つの試薬は調製後水冷下番こおいた。

２）測定方法 本発明の測定方法は上で述べた測定に用いる試薬を用い
、以下の通りに行う。

すなわち、まず測定に供する試料を第２試薬で溶解ある
いは希釈する。次に第１試薬６容に対して、試料を溶解
あるいは希釈した第２試薬１容を加え、よく振とう撹拌
した後、３７℃の恒温槽内あるいは恒温板上に放置する
。３０分後に第３試薬１．５容を加え、１分間の発光量
を適当な発光検出器（ルミネッセンス・リーダー（アロ
カ株式会社。

東京））で測定する。試料中の含有ＰＫ単位数は検量線
から算出する。

（６）発明の効果 本発明の効果を以下に述べる実験例で示す。実験例では
精製ＰＫあるいはラット血漿を対象として用いた。

実験例１　精製ＰＫの検量線 実施例りでのべた試薬を用い、家兎骨格筋より精製純化
したＰＫ標品を測定試料としてこれを第２試薬で溶解・
希釈し、実施例２）でのべた測定方法によってＰＫ活性
を測定した。この結果を図１に示した。この測定は試薬
の調製、　ＰＫの溶解・希釈を含めて全て異った５日の
日に１回ずつ測定した（約２週問おきに）がそのバラツ
キは小さいものであった。比較のためＰＫの同位酵素（
アイソザイム）を活性化させるフルクトース１，６ニリ
ン酸を第２試薬に１ｍＭを加えた時の試験も行っ九その
結果は、すでに公知のとと（骨格筋ＰＫでは活性化が起
らないため、上で述べたフルクトース１．６ニリン酸を
添加しない測定の結果とほとんど同じとなった（図２）
。

なお上記の試験は同一日内でもくり返したがＰＫの１　
ｍＵ／　ａｔという高希釈条件でも１０時間以内には活
性低下は見られなかった。

実験例２　精製ＰＫによる反応の時間依存性実験例１と
同様にして家兎骨格筋から精製純化したＰＫを用い、　
ＰＫ活性の反応時間依存性を検討した。測定方法は実施
例２）でのべた測定方法によった。すなわち実験例１と
同様にして第２試薬に溶解・希釈したＰＫ溶液を実施例
２）でのべた測定方法に従って第１試薬と混合・撹拌し
、３７℃の恒温槽内に放置し、適当な時間間隔で一定量
の混合液をとり出し、第３試薬を加え、その１分間の発
光量を測定した。図３にその結果を示した。図中ノａ、
　　ｂ、　　ｃ、　　ｄはそれぞれ精製ＰＫ　１ｍＵ／
ｍ。

３　ｍＵ／ｌｕｔ　、　１０　ｍＵ／ｍｌおよび３０　
ｍＵ／ｌｎｌの溶液の結果を示している。ＰＫの何れの
濃度においても反応時間３０分までの発光量は直線的に
増加していった。

実験例３　ラット血漿中ＰＫによる反応の時間依存性 精製純化したＰＫをラット血漿に代えた。すなわちラッ
ト血漿を実施例１）の第２試薬で４００倍こ希釈した以
外はすべて実験例２と同様にして、ラット血漿中ＰＫ活
性の反応時間依存性を検討しへその結果を図４に示した
。測定にはラット４例（ラット番号ａ、　　ｂ、　　ｃ
、　　ｄ）を用い、そのそれぞれの血漿を対象とした。

図中のａ、　　ｂ、　　ｃ、　　ｄの直線はラット番号
ａ、ｂ、ｃ、ｄに対応するラットの血漿中ＰＫの測定結
果をそれぞれ示している。

この場合においても反応時間３０分までの発光量は直線
的に増加した。

実験例４　添加回収実験 ラットをビタミンＥ欠乏食で飼育すると、その血漿中に
骨格筋からＰＫが漏出すると言われている。本方法がこ
の場合の測定に有用であることを調べるため添加回収実
験を行った。正常対照ラットおよびビタミンＥ欠乏食飼
育ラットの血漿を実施例１）の第２試薬で４００倍に希
釈し、はぼ当活性量の精製純化したＰＫを添加して、実
施例２）の測定方法によってＰＫ活性を測定し、添加し
た精製ＰＫの回収率を計算した。その結果を図５に示し
た。図中には測定の対象とした正常対照ラット、ビタミ
ンＥ欠乏食飼育７週、１０週、１４週のラットの結果を
左から順番に示し、ビタミンＥ欠乏食飼育ラットの場合
には飼育週による変動を見やす（するため各週での結果
を実線または点線で結んだ。また図中の・あるいは−・
−は本実験例の結果を、Ｏあるいは・・・○・・・は比
較のためＰＫの同位酵素（アイソザイム）を活性化させ
るフルクトース１，６ニリン酸を第２試薬に１ｍＭ添加
した時の結果を示す。結果は何れもラット６例の平均値
で示した。

正常対照ラットでもビタミンＥ欠乏食飼育ラットでも添
加回収率は９０％〜１１０％の間にあった。

実験例５　測定量変動 実験例４と同じ目的で、正常対照ラットおよびビタミン
Ｅ欠乏食飼育ラットの血漿を対象に測定量変動（同一日
内、３回測定）を求めた。採取したラット血漿を実施例
１）の第２試薬で４００倍に希釈する以外はすべて実験
例１と同様にし、同一検体について同一日内の午前、午
後、夕方の３回にわたってＰＫ活性を測°定した（結果
は表１に示す）。３回測定の測定量変動が１０％をこえ
たケースが１例あったが、その他については良好な結果
を得た。この場合も実験例１と同様に血ｉ　４００倍希
釈という高希釈条件でも同一日内で１０時間以内には活
性低下がほとんどないことが示された。

実験例６　ビタミンＥ欠乏食飼育ラットの血漿中ＰＫ活
性の変化 実験例５までで測定方法の骨組みの検討はすんだので実
際にビタミンＥ欠乏食飼育ラットの血漿中ＰＫ活性の変
化を本発明による試薬および方法で調べた。正常対照ラ
ットおよびビタミンＥ欠乏食飼育ラットの血漿を第２試
薬で４００倍に希釈し。

それ以外はすべて実験例１と同様にして血漿中ＰＫ活性
を測定した。その結果を図６に示した。図中には９図５
と同様に測定の対象とした正常対照ラット、ビタミンＥ
欠乏食飼育７週、１０週、１４週のラットの結果を左か
ら順番に示した。また図中の点描カラムは本実験例の結
果を、白ヌキカラムは比較のためＰＫの同位酵素（アイ
ソザイム）を活性化させるフルクトース１，６ニリン酸
を第２試薬Ｉζ１ｍＭ添加した時の結果を示す。結果は
何れもラット６例の平均値上標準誤差で示した。ビタミ
ンＥ欠乏食飼育ラットの血漿中ＰＫ活性はその飼育７週
目から上昇し始め、１４４週目とは正常対照ラットのそ
れの８〜１０倍に上昇した。このことは血漿中ＰＫ含有
量も含めて、これまで報告されているデータとほぼ一致
した。

以上の１〜６までの実験例においてＰＫの安定化をはか
るためＢＳＡを添加したが、さらに安定化をよくするた
めにはＰＫ検体の溶解・希釈をガラス以外の容器（プラ
スチック等公知のもの）で行うことが好ましい。

【図面の簡単な説明】

図１は第２試薬中のＰＫ濃度と１分間の発光量の関係を
示すグラフである。 図２はフルクトース１，６−ニリン酸１ｍｌを添加した
第２試薬中のＰＫｆｉ度と１分間の発光量の関係を示す
グラフである。 図３は反応時間と１分間の発光量の関係を示すグラフで
ある。 図４は反応時間と１分間の発光量の関係を示すグラフで
ある。 図５は正常対照ラットおよびビタミンＥ欠乏食飼育の週
と平均回収率の関係を示すグラフである。 図６は正常対照ラットおよびビタミンＥ欠乏食飼育の週
とピルビン酸キナーゼ活性の関係を示すグラフである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）生体試料中のピルビン酸キナーゼ活性の測定にあ
   たり、アデノシン二リン酸、ホスホエノールピルビン酸
   およびルシフェリン・ルシフェラーゼを使用することを
   特徴とするピルビン酸キナーゼ活性の測定方法
2. （２）測定方法が血液疾患の診断方法である特許請求の
   範囲第１項記載の測定方法
3. （３）牛血清アルブミンを含有する緩衝液を使用するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項記載
   の測定方法
4. （４）生体試料中のピルビン酸キナーゼ活性の測定試薬
   において、アデノシン二リン酸、ホスホエノールピルビ
   ン酸およびルシフェリン・ルシフェラーゼを必須の成分
   とするピルビン酸キナーゼ活性測定試薬
5. （５）測定方法が血液疾患の診断試薬である特許請求の
   範囲第３項記載の測定試薬
6. （６）牛血清アルブミンを含有する緩衝液を添加するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項または第５項記載
   の測定試薬