CN101221129B - 磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒 - Google Patents
磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101221129B CN101221129B CN2008100452605A CN200810045260A CN101221129B CN 101221129 B CN101221129 B CN 101221129B CN 2008100452605 A CN2008100452605 A CN 2008100452605A CN 200810045260 A CN200810045260 A CN 200810045260A CN 101221129 B CN101221129 B CN 101221129B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sba
- fluorescence
- bile acid
- kit
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Abstract
本发明公开了磺酸化胆汁酸(SBA)酶荧光毛细分析法及SBA荧光定量试剂盒(SBA-FCA-Kit)，属于临床生化检验领域，适用于肝胆疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症的早期发现。生物样品与荧光反应液混合后，用一个含有磺酸化胆汁酸磺酸酯酶、β-羟基类固醇脱氢酶的SBA毛细生物反应器(SBA-CBR)吸入，在给定的激发波长和发射波长下，测定SBA-CBR的空白荧光强度；然后使其继续反应一定时间，再测其荧光强度；用荧光强度差值定量样品中的SBA。SBA-FCA-Kit由一个SBA-CBR和含有β-NAD+、电子传递体及刃天青等的荧光反应液构成。
Description
技术领域
本发明涉及磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及实现该方法的SBA酶荧光定量试剂盒，属于临床生化分析领域。本发明适用于健康人群肝胆系统的普查、临床患者肝胆疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症和肝炎的早期发现。
背景技术
胆汁酸在肝脏合成，正常情况下99％存在于肠肝循环内，进入体循环的量极少。但是肝胆有疾病受损伤时，胆汁酸逆流入血，导致血中胆汁酸显著增加。作为体内的解毒机制，血中的胆汁酸发生磺酸化，使其水溶性增加，容易通过尿排出体外，使尿中的磺酸化胆汁酸(SBA)与血中SBA变得容易测定。因此，可以根据尿中SBA含量的大小诊断肝胆系统机能是否正常。在临床检查中，发现SBA的测定与谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰转肽酶(γ-GTP)、总胆汁酸(TBA)等血液化学检查方法有同等诊断效率(肝胆膵，1995，31，315；Jpn.J.Clin.Chem.1997，26，95；J.Pediatr.Surgery，2002，37，1707；Pediatr.Int，2003，45.281)，并且更具有特异性和灵敏性，是肝胆机能的重要指标。
目前，在日本，尿中SBA测定已成为判断肝胆系统机能和诊断肝硬化、肝癌等疾病的一项新指标，成为“日本国民健康保险”体检的检查项目(检查编码：0715儿童，6208成人，SBA试剂盒法承认番号：20800AMZ10064000)。尿中SBA含量的指标基准值：新生儿出生后2～4周内，其尿中SBA的正常值为：≤5μmol/L、或SBA≤55μmol/g·CRE(CRE：肌酐校正)；成人尿中SBA的正常值为：≤10μmol/L或SBA≤8μmol/g·CRE。
在国外，SBA的测定也有气相色谱(Lipids.1973，8，47)和高效液相色谱法(Lipids，1978，13，908；J.Chromatogr.1987，415，45)。用这些方法测定SBA时，试样要进行抽提、溶剂分解、衍生物化等繁杂的预处理过程，非常费时、复杂，很难真正应用到日常的临床诊断和检验中。近年来，也报道了一些其它方法，如利用甲基吩嗪硫酸二甲脂异鲁米诺-过氧化物酶化学反应体系用于血清中总胆汁酸的测定，利用SBA磺酸酯酶(BSS)水解SBA建立的酶比色测定法(Jpn.J.Clin.Chem.，1992，21，249)。后一种方法是一个先进的SBA测定法。其原理是：SBA在BSS作用下水解成β-羟胆汁酸，在3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)存在下与氧化型辅酶I(β-NAD+)作用，生成NADH和3-酮胆汁酸，NADH与硝基四唑蓝(NTB)显色试剂反应，生成有色的甲臢，通过比色来定量SBA。但是，由于在反应体系中使用了NTB作显色试剂，其反应产物易沉淀，比色皿易发生吸附、着色，测定结果难以达到准确、快速、简便的临床检查要求。在此基础上，将显色试剂NTB换成水溶性的WST-1(日本特许平7-33336)，使比色皿吸附着色，空白信号不稳定的情况有所改善。
现有的SBA酶比色测定法存在的主要问题是：使用的酶和试剂种类太多(BSS、β-HSD、3-酮胆汁酸-Δ4-脱氢酶、心肌黄酶、β-NAD、WST-1，ASOD，Tween20，山梨醇，4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES)、酶耗量大，成本高，灵敏度较低，所用的贵重试剂只能一次性使用；而且反应产物甲臢类，也不完全溶于水，定量比色皿使用后也存在不同程度的试剂污染，如果再利用，必须反复多次洗净，这对于自动分析装置的应用来说仍然是一个难题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术存在的问题，减少酶和试剂的种类和耗量，降低成本，提高灵敏度，消除试剂和产物对测定系统的吸附、着色，实现贵重酶和试剂的重复多次使用，减少临床生化分析废液量，利于环境保护，实现微量样品的微量分析；在此基础上，开发一种新的SBA酶荧光毛细分析法及实现该方法的SBA酶荧光定量试剂盒(SBA-FCA-Kit)，实现快速、简便的SBA测定，用于肝胆系统疾病的快速筛查与诊断。
本发明的技术方案是由测定原理和测定方法及SBA-FCA-Kit组成。
本发明的测定原理：SBA在BSS催化作用下水解脱磺酸基，生成3β-羟胆汁酸；后者在β-HSD催化作用下与β-NAD+反应转化为3-酮胆汁酸，同时β-NAD+被还原成NADH；通过检测NADH的特征荧光强度来定量SBA；或者为了达到循环增敏目的，再使NADH与氧化型电子传递体反应，生成NAD+和还原型电子传递体，后者与刃天青(7-羟基吩噁嗪酮)反应生成具有强烈荧光的试卤灵(3，7-二羟基吩噁嗪)，通过试卤灵的荧光强度来定量SBA。
本发明的测定方法：先将一个代替常规荧光试液槽的专用毛细管定位座(见专利200510021542.8)置于荧光光度计光路中；适量生物样品与荧光反应液混匀后，在适当温度下反应一定时间，用一个固定有BSS和β-HSD的SBA-CBR，利用毛细现象吸入上述反应混合液，然后插入荧光光度计的毛细管定位座插孔中，在给定的激发波长和发射波长条件下，立即测定SBA-CBR内所含反应混合液的荧光强度，此值作为试剂和样品的空白值(F1)；然后使其继续反应数分钟后，再测其荧光强度(F2)；此值减掉空白值(ΔF＝F2-F1)，得到的吸光度增加值(ΔF)用于定量样品中的SBA值。毛细管做为荧光反应、测定或酶固定化的载体。
本发明的各种特征如下：
本发明用于实现SBA酶荧光毛细分析法的SBA-FCA-Kit试剂盒的示意图如图1所示。它包括一根SBA-CBR和一种荧光反应液、或两根SBA-CBR。使用时，用SBA-CBR和一个毛细管定位座替代常规荧光分析中的试液槽，将其置于荧光分析仪光路中。
本发明包含的荧光反应液可以只含有β-NAD+的试剂，也可以含有β-NAD+、电子传递体、刃天青等。
本发明可以将所用的酶固定化，成为SBA固定化酶荧光定量试剂盒(IE-SBA-FCA-Kit)；也可以使酶不固定化，成为SBA液态酶荧光定量试剂盒(LE-SBA-FCA-Kit)；IE-SBA-FCA-Kit可以根据用途变成高灵敏固定化酶荧光定量试剂盒(HIE-SBA-FCA-Kit)和低灵敏固定化酶荧光定量试剂盒(LIE-SBA-FCA-Kit)。同样，LE-SBA-FCA-Kit也可以根据用途变成高灵敏液态酶荧光定量试剂盒(HLE-SBA-FCA-Kit)和低灵敏液态酶荧光定量试剂盒(LLE-SBA-FCA-Kit)。
本发明包含的IE-SBA-FCA-Kit主要由一根SBA-CBR和一种荧光反应液、或两根SBA-CBR组成。
本发明包含的HIE-SBA-FCA-Kit，其特征是：BSS和3β-HSD同时固定化在一根SBA-CBR内表面，荧光反应液含有β-NAD+、电子传递体和刃天青等混合试剂；如果在一根SBA-CBR内表面单独固定BSS，将β-HSD加入荧光反应液内而形成的定量试剂盒也属于此范畴。
本发明包含的LIE-SBA-FCA-Kit的特征是：BSS和β-HSD同时固定化在一根SBA-CBR内表面，但荧光反应液中只含有β-NAD+试剂，通过测定NADH的荧光强度来定量SBA。
本发明也可以将荧光反应液固定化在毛细管内，由两根SBA-CBR组成SBA固定化酶荧光定量双毛细管试剂盒(IE-SBA-FCA-2C-Kit)。其特征是：由SBA-CBR-1和SBA-CBR-2组成。SBA-CBR-1内表面同时固定有β-HSD、β-NAD+、电子传递体和刃天青，SBA-CBR-2内表面固定有BSS、β-HSD、β-NAD+、电子传递体和刃天青，用于高灵敏SBA测定。进一步，SBA-CBR-1内表面也可以同时固定β-HSD和β-NAD+，SBA-CBR-2内表面同时固定有BSS、β-HSD、β-NAD+，用于低灵敏SBA测定。
本发明包含的LE-SBA-FCA-Kit主要由1号液、2号液、定量毛细管构成。
本发明包含的HLE-SBA-FCA-Kit的特征是：1号液含有β-HSD和荧光反应液，2号液含有BSS、β-HSD和荧光反应液。
本发明包含的LLE-SBA-FCA-Kit的特征是：1号液含有β-HSD、β-NAD+，2号液含有BSS、β-HSD、β-NAD+。
本发明包含的LE-SBA-FCA-Kit测定SBA的过程是，在一个空白管和一个测定管内先加入等量的被测样品，再分别将1号液加入空白管内，将2号液加入测定管内；反应一定时间后，依次将上述两管中的反应混合液吸入定量毛细管内，插入荧光光度计的毛细管定位座中，在给定的激发波长和发射波长条件下，测定毛细管内所含反应混合液的荧光强度；根据空白管(F1)和测定管(F2)的荧光强度差值(ΔF＝F2-F1)定量样品中的SBA值。毛细管在此做为样品定量、酶荧光反应混合液测定的载体。
本发明所述的电子传递体可以从1-甲氧基-5-甲基吩嗪-二甲酯硫酸盐(1-MPMS)、或心肌黄酶、或麦尔多拉蓝等电子传递体类中选1种。本发明的试剂盒可用于已商品化的荧光光度计或自动临床荧光生化分析装置，实施SBA的测定及研究。
本发明包含的SBA-CBR的制备方法有三个步骤：毛细管的氨基化修饰、毛细管中酶的固定化和毛细管化学修饰基团的封闭。
毛细管的氨基化修饰：先用0.05～0.5mol/L NaOH溶液将毛细管浸泡1～2h，用超纯水清洗，再用50～75％的乙醇溶液浸泡1～2h，最后用超纯水清洗、吹干。然后，将前处理后的毛细管放入0.1～2％(v/v)作为偶联剂的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(以正己烷为溶剂)，在40～65℃反应4～6h，使ATPES共价结合在毛细管内壁上；最后用无水乙醇将毛细管洗净，吹干；最后，将2.5％(v/v)戊二醛试剂吸入毛细管内，在真空状态下60℃放置1～2h，使戊二醛共价结合在ATPES上。
毛细管中酶及试剂的固定化：用磷酸缓冲液(pH 7.5)洗掉毛细管中未结合的戊二醛之后，用毛细管吸入由磷酸缓冲液配制的1～10kU/L BSS和β-HSD溶液，在4℃下旋转固定6～12h，使BSS和β-HSD的氨基与戊二醛的醛基共价结合，最后用磷酸盐缓冲溶液清洗干净。
毛细管化学修饰基团的封闭：再将固定有BSS、β-HSD的毛细管浸泡在1～5％(w/v)牛血清白蛋白中1～2h，封闭未结合的醛基，制成SBA-CBR；最后，将SBA-CBR保存在4℃的磷酸盐缓冲液中(pH 7.5)。
本发明的基本技术参数为：SBA的测定范围在0.1-50μmol/L，检出限为0.06μmol/L，相对标准偏差＜3.0％，Tris-HCl缓冲液浓度0.05～0.5mol/L，pH6.5～9.0，β-NAD+浓度50-800μmol/L，BSS和3β-HSD固定化酶的浓度均为2～10kU/L；酶催化反应时间5～20min，反应温度20～40℃。1-MPMS浓度10～50μmol/L，刃天青浓度10～50μmol/L；总反应液用量5～20μL；样品用量1～20μL；SBA-CBR的长度为3～5cm，容量为2～20μL，内径为0.14～0.90mm，外径为0.55～1.20mm，壁厚为0.10～0.25mm；其材质可以是石英玻璃、光学玻璃或透明光学塑料。
本发明使用的酶类BSS和β-HSD是已知物质，由生物提取而来。BSS可以按文献(Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58，889)所述的方法精制而得；β-HSD、β-NAD+、心肌黄酶、1-MPMS、麦尔多拉蓝可以使用市面销售的产品，如Sigma Chemical Co.的制品。
本发明的优点和积极效果是：显著降低了贵重酶制剂、化学试剂和被测液用量，减少废液，提高灵敏度，实现不连续的批量临床样品快速测定。
a)用SBA-CBR代替常规的荧光试液槽，实现酶荧光毛细分析法；实现微量样品的微量分析；
b)酶在SBA-CBR中固定化后可以重复使用多次，克服了液态酶容易变性和不稳定的弱点，能节约大量的酶、辅酶及其它贵重酶试剂，显著降低了实验成本和化学分析废液向环境中的排放量，有利于推广利用；
c)基于酶荧光毛细分析法制成的SBA酶荧光定量试剂盒，便于携带、保存；具有较好的长期稳定性、不易变性失活等良好的理化特性；
d)本发明无需对样品进行前处理，可以直接测定，操作简便；
e)本发明使用试剂种类少，操作耗时短，适合于不连续的批量临床样品中SBA快速测定；
f)本发明可成为国家标准中有关临床检验的一个新方法；
g)SBA酶荧光定量试剂盒可用于已商品化的荧光光度计或自动临床荧光生化分析装置，实施SBA的测定及研究。
本发明可用于尿中SBA的测定，无需采血就能实现肝机能检查；也可用于血中SBA的测定。本发明适用于临床检查中对肝胆系统疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于对新生儿期及幼儿期黄疸、先天性胆道闭锁症和肝炎的早期发现，这对保护人类健康具有很重要的实用意义和社会意义。
附图说明
图1 SBA实现酶荧光毛细分析法的SBA酶荧光定量试剂盒的示意图
图中S样品、1荧光反应液(电子传递体、刃天青、β-NAD+等)、2SBA-CBR、3毛细管、43-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、5戊二醛、6磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)、7β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)、8反应混合液
图2实施例1考察SBA-CBR中BSS固定化浓度对荧光强度影响的曲线图
图3实施例1考察SBA-CBR中β-HSD用量对荧光强度影响的曲线图
图4实施例1考察β-NAD+浓度对荧光强度影响的曲线图
图5实施例1考察1-MPMS浓度对荧光强度影响的曲线图
图6实施例1考察SBA-CBR中刃天青浓度对荧光强度影响的曲线图
图7实施例1考察反应体系pH对荧光强度影响的曲线图
图8实施例1考察Tris-HCl缓冲液浓度对荧光强度影响的曲线图
图9实施例1考察反应温度影响SBA-CBR荧光强度的曲线图
图10实施例1考察反应时间对荧光强度影响的曲线图
图11实施例1考察本发明SBA-CBR日内稳定性的曲线图
图12实施例1考察本发明SBA-CBR日间稳定性的曲线图
图13实施例1考察尿样空白反应时间对SBA-CBR影响的曲线图
图14实施例1用本发明IE-SBA-FCA-Kit测定SBA标准得到的曲线图
图15实施例1考察本发明HIE-SBA-FCA-Kit和HLE-SBA-FCA-Kit的灵敏度曲线图
图16实施例1用本发明LIE-SBA-FCA法测定SBA标准得到的标准曲线的曲线图
实施例
结合附图对本发明的实施例作进一步描述：
实施例1
本实施例是考察SBA-CBR(2)中固定化BSS(6)浓度对荧光强度的影响。实验条件：激发波长540nm，发射波长580nm，反应液用量18μL，500μmol/Lβ-NAD+，50μmol/L1-MPMS，50μmol/L刃天青，5kU/Lβ-HSD(7)，pH8.0，反应温度37℃，反应时间10min；在1-10kU/L范围内改变BSS(6)浓度，分别用1.0μmol/L、2.0μmol/L的GLCA-S标准液作为测定样品，优选了SBA-CBR中固定化BSS(6)浓度，结果见图2。BSS(6)用量为5kU/L时产物的荧光强度达到最大。
实施例2
本实施例是考察SBA-CBR(2)中β-HSD(7)用量对荧光强度的影响。基于以上条件，BSS(6)用量为5kU/L，在1-10kU/L范围内改变β-HSD(7)浓度，考察其对灵敏度的影响。结果见图3。β-HSD(7)在1-5kU/L范围内，荧光强度逐渐增强；当β-HSD(7)用量为5kU/L时，荧光强度达到最大。
实施例3
本实施例是考察β-NAD+浓度对荧光强度的影响。β-HSD(7)用量为5.0kU/L，其他实验条件同实施例2。在50-800μmol/L范围内改变β-NAD+浓度，考察β-NAD+浓度对本方法灵敏度的影响。得到的结果如图4所示。β-NAD+在50-400μmol/L范围内，反应体系的荧光强度随之逐渐增加，在400μmol/L时荧光强度达到最大值；当β-NAD+浓度高于400μmol/L时，荧光强度反而减小。
实施例4
本实施例是考察1-MPMS浓度对荧光强度的影响。β-NAD+浓度用量为400μmol/L、其它实验条件同实施例3。改变1-MPMS浓度(5、10、25、50、100μmol/L)，考察1-MPMS浓度对SBA-IE-FCA反应体系灵敏度的影响。结果如图5所示。荧光强度随1-MPMS浓度增加而增强，当浓度超过25μmol/L，其荧光强度降低；故最佳1-MPMS浓度为25μmol/L。
实施例5
本实施例是考察刃天青浓度对荧光强度的影响。固定1-MPMS浓度为25μmol/L，其他条件同实施例4，在5-50μmol/L范围内改变刃天青浓度，测定反应混合液(8)的荧光强度。实验所得结果如图6所示。反应体系的荧光强度随刃天青浓度的增加而增强，当浓度超过10μmol/L后，其荧光强度降低。这可能是由于浓度太高导致荧光猝灭所致，本方法所用刃天青的最佳浓度选择为10μmol/L。
实施例6
本实施例是考察反应体系pH对荧光强度的影响。pH是影响酶促反应速率和荧光量子产率的一个重要因素。固定刃天青浓度为10μmol/L，其他实验条件同实施例5。分别用pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCl缓冲液，改变反应体系的酸度，考察反应体系pH对荧光强度的影响。实验结果如图7所示。由图可知，pH为8.0时，荧光强度出现最大值。
实施例7
本实施例是考察Tris-HCl缓冲液浓度对荧光强度的影响。固定反应体系pH为8.0，其它实验条件同实施例6。改变反应体系Tris-HCl缓冲液的浓度，用SBA-IE-FCA法测定其荧光强度，考察缓冲液浓度的影响。其结果如图8所示。荧光强度随Tris-HCl缓冲液浓度的增加而增加，当其浓度为100mmol/L时荧光强度值最大。
实施例8
本实施例是考察反应温度对SBA-CBR(2)的影响。固定反应体系Tris-HCl缓冲液浓度为100mmol/L，其它实验条件同实施例7。用SBA-CBR(2)吸取反应混合液(8)后，分别在25、30、35、37、40、45℃，恒温反应15min后，测定反应体系的荧光强度，结果如图9所示。可以看出，当温度低于37℃时，随反应温度增加，反应混合液(8)的荧光强度也随着增加；当温度超过37℃，荧光强度逐渐下降。其原因主要是由于反应温度对酶促反应具有双重影响。一方面，温度能加速反应；另一方面，升高温度会导致酶的变性失活。所以本实验选用37℃为最佳反应温度。
实施例9
本实施例是考察反应时间对荧光强度的影响。固定反应体系温度为37℃，其它实验条件同实施例8。考察反应混合液(8)的荧光强度随时间的变化。其结果如图10。可以看出，当反应时间为15min时，其荧光强度达到恒定值，不再随着时间发生明显变化。所以，本实验选定的反应时间为15min。
实施例10
本实施例是考察SBA-CBR(2)的日内和日间稳定性。用2μmol/L和2.5μmol/LGLCA-S标准溶液，分别进行日内重复性实验和进行日间重复性实验，日内和日间稳定性实验结果分别如图11、图12所示。从图12中可以看出，SBA-CBR(2)连续重复测定10次，其荧光强度基本不变，呈现出良好的日内稳定性。重复测定11次以后，随测定次数增加，荧光强度呈逐渐衰减趋势。前10次测定结果的相对标准偏差为1.4％。
在图12中，横座标表示SBA-CBR(2)的保存时间(天数)，纵座标表示相对荧光强度(％)，第一天用SBA-CBR(2)测得的相对荧光强度为标准(100％)。可以看出，在29天内，用同一SBA-CBR(2)测定相同浓度的GLCA-S标准液，其荧光强度基本不变；即，SBA-CBR(2)中固定化的酶可保持很好的酶活性；也说明，SBA-CBR(2)具有较好的长期稳定性。
实施例11
本实施例是考察尿样(S)空白反应时间对SBA-CBR(2)的影响。在25μL尿样(S)中加入10μLβ-NAD+(400μmol/L)、2.5μL 1-MPMS(25μmol/L)、2.5μL刃天青(25μmol/L)，充分混匀后，在37℃下，考察尿样(S)中本身的干扰物质所产生荧光强度随时间的变化趋势。结果表明，荧光强度在0-10min内随时间逐渐增加；10-30min之间其荧光强度基本不变(见图13)。这说明尿样(S)中干扰物质在10min内完全反应。故尿样(S)与β-NAD+、1-MPMS、刃天青的空白反应时间定为10min。
实施例12
本实施例是考察本发明HIE-SBA-FCA-Kit法的抗干扰能力。为了考察尿中共存物对本发明测定尿样中(S)SBA浓度是否存在干扰，进行了此实验。向2.5μmol/L的GLCA-S标准液中分别加入一定浓度的抗坏血酸、尿酸、尿素、葡萄糖、NaCl等，考察加入前后反应体系荧光强度的变化，计算回收率。结果如表1所示。由结果发现，所用的考察物质对本方法基本无影响。
表1尿中共存物对本方法的影响
| 干扰物 | 加入浓度 | 回收率(％) |
| 抗坏血酸尿酸尿素葡萄糖NaCl | 0.25-2.0mmol/L0.25-2.5mmol/L50-1000mmol/L50-200mg/L100-500mg/L | 99.8-103.6100.3-101.199.4-103.497.2-102.298.2-101.3 |
实施例13
本实施例是用本发明包含的HIE-SBA-FCA-Kit测定SBA标准和实际尿样的结果。先将25μL标准液与15μL荧光反应液(1)混匀后，在37℃条件下预孵10min，用一个固定有BSS和3β-HSD的SBA-CBR(2)，利用毛细现象吸入上述反应混合液(8)，然后插入荧光光度计的毛细管(3)定位座插孔中，在λex 540nm和λem 580nm条件下，立即测定SBA-CBR(2)内所含反应混合液(8)的荧光强度，此值作为空白值(F1)；然后在37℃使其继续反应15min后，再测其荧光强度(F2)；此值减掉空白值(ΔF＝F2-F1)，得到的荧光强度增加值(ΔF)用于定量样品中的SBA值。用一系列不同浓度的GLCA-S标准液考察了其浓度与荧光强度之间的相关性，结果如图14中的b曲线所示。可以看出，GLCA-S浓度在0.5-2.5μmol/L范围与荧光强度呈良好的直线相关性(y＝71.286x+1.8095，r＝0.9991)。尿样(S)测定过程和上述相同，测定结果见表2。本发明的检出限为0.06μmol/L。
上述的荧光反应液(1)组成是：400μmol/Lβ-NAD+、25μmol/L 1-MPMS及25μmol/L刃天青。用于SBA-CBR(2)固定化的BSS(6)和β-HSD(7)的浓度为5kU/L。
表2实际样品测定(n＝3)
| 样品编号 | SBA浓度(μmol/L) | 标准偏差(μmol/L) | 相对标准偏差(％) |
| 123 | 2.728.834.96 | 0.110.200.12 | 3.92.22.4 |
实施例14
本实施例是用本发明包含的HIE-SBA-FCA-Kit进行回收率测定。取三份尿样(S)，按样品∶标准＝9∶1的体积比，在三份尿样(S)中分别加入25和100μmol/L的GLCA-S标准液，用其进行回收率测定，以考察方法的准确性。结果如表3所示，所得尿样回收率为95.5-105.0％，因此本发明测定尿样(S)SBA的浓度是准确可靠的。
表3尿中SBA添加回收试验结果
| 样品号 | 尿样浓度(μmol/L) | 添加标准液(μmol) | 理论浓度(μmol/L) | 实测浓度(μmol/L) | 回收浓度(μmol/L) | 回收率(％) |
| 1 | 2.72 | 25100 | 4.9512.45 | 4.9912.65 | 2.5410.20 | 101.6102.0 |
| 2 | 8.83 | 25100 | 9.4519.45 | 9.3517.43 | 2.4010.50 | 95.5105.0 |
| 3 | 4.96 | 25100 | 6.9614.46 | 6.8814.76 | 2.4210.30 | 96.8103.0 |
实施例15
本实施例是考察本发明包含的HIE-SBA-FCA-Kit的精密度。用HIE-SBA-FCA-Kit，分别对浓度为0.5、1.0、2.0μmol/L的GLCA-S标准液进行了11次荧光强度测定，得到的结果见表4。HIE-SBA-FCA-Kit的相对标准偏差(RSD)在3.4-2.5％之间，其精密度满足分析定量要求。根据回归方程可计算出本发明的检出限为0.06μmol/L(3S/K)。
表4HIE-SBA-FCA-Kit的精密度测定结果
| 样品号 | GLCA-S标准液(μmol/L) | 荧光强度平均值(ΔF) | RSD(％) |
| 123 | 0.51.02.0 | 50.7±1.7101.7±3.0180.0±4.6 | 3.42.92.5 |
实施例16
本实施例是考察本发明包含的HIE-SBA-FCA-Kit和HLE-SBA-FCA-Kit的灵敏度。先将25μL标准液与15μL荧光反应液(1)混匀后，在37℃条件下预孵10min，用一个固定有BSS(6)和β-HSD(7)的SBA-CBR(2)，利用毛细现象吸入上述反应混合液(8)，然后插入荧光光度计的毛细管(3)定位座插孔中，在λex 540nm和λem 580nm条件下，立即测定SBA-CBR(2)内所含反应混合液(8)的荧光强度，此值作为空白值(F1)；然后在37℃使其继续反应15min后，再测其荧光强度(F2)；此值减掉空白值(ΔF＝F2-F1)，得到的荧光强度增加值(ΔF)用于定量样品(S)中的SBA值。测定一系列不同浓度的GLCA-S标准液，得到的GLCA-S标准曲线如图14中的b曲线所示。用HLE-SBA-FCA-Kit，测定得到的结果如图15中的a曲线所示。可以看出，在各自的最佳实验条件下，HIE-SBA-FCA-Kit比HLE-SBA-FCA-Kit的灵敏度要高1倍左右。
实施例17
本实施例是用本发明包含的HLE-SBA-FCA-Kit测定GLCA-S和实际尿样(S)中的SBA。在一个空白管和一个测定管内先各加入25μL标准样，再分别将25μL荧光反应1号液加入空白管内，将25μL荧光反应2号液加入测定管内；在37℃反应15min后，依次将上述两管中的反应混合液(8)吸入定量毛细管(3)内，插入荧光光度计的毛细管(3)固定座中，在激发波长540nm和发射波长580nm条件下，测定毛细管(3)内所含反应混合液(8)的荧光强度；根据空白管(F1)和测定管(F2)的荧光强度差值(ΔF＝F2-F1)定量标样中的SBA值。结果如图14中的a曲线所示。可以看出，GLCA-S浓度与荧光强度在0.5-10μmol/L范围内呈良好的线性关系(y＝38.055x+5.6223，r＝0.9989)。尿样(S)测定过程和上述相同，测定结果见表5。RSD为1.4-2.7％。
另外，按样品∶标准＝9∶1的体积比，在所述尿样(S)中分别加入浓度为25和100μmol/L的GLCA-S标准溶液，进行了回收率测定(见表5)，尿样的回收率为95.5-105.7％，因此本发明测定尿中SBA浓度是准确可靠的。经计算本发明的检出限为0.40μmol/L。
上述的荧光反应1号液和荧光反应2号液中各种酶及试剂浓度如下：
荧光反应1号液：200U/Lβ-HSD(7)、500μmol/Lβ-NAD+、25μmol/L 1-MPMS及25μmol/L刃天青；荧光反应2号液：200U/L BSS(6)、200U/Lβ-HSD(7)、500μmol/Lβ-NAD+、25μmol/L1-MPMS及25μmol/L刃天青。
表5尿中SBA的测定结果和回收实验
| 样品 | 样品浓度(μmol/L) | 添加标准液(μmol/L) | 理论浓度(μmol/L) | 实测浓度(μmol/L) | 回收浓度(μmol/L) | 回收率(％) |
| 1 | 4.39±0.12 | 25100 | 6.4513.95 | 6.3413.61 | 2.399.66 | 95.596.6 |
| 2 | 8.18±0.16 | 25100 | 9.8617.36 | 9.8217.59 | 2.4610.23 | 98.1102.3 |
| 3 | 9.09±0.12 | 25100 | 10.6818.18 | 10.7318.75 | 2.5510.57 | 102.0105.7 |
实施例18
本实施例是用本发明包含的LLE-SBA-FCA-Kit检测NADH的荧光强度定量尿样(S)中SBA。在一个空白管和一个测定管内先各加入20μL标准样，再分别将5μL荧光反应1号液加入空白管内，将5μL荧光反应2号液加入测定管内；在37℃反应10min后，依次将上述两管中的反应混合液(8)吸入定量毛细管(3)内，插入荧光光度计的毛细管(3)定位座中，在激发波长348nm和发射波长460nm条件下，测定毛细管(3)内所含反应混合液(8)的荧光强度；根据空白管(F1)和测定管(F2)的荧光强度差值(ΔF＝F2-F1)定量样品中的SBA值。得到的GLCA-S标准曲线如图15所示。可以看出，GLCA-S浓度与荧光强度在3.0-50μmol/L范围内呈良好的线性关系(y＝0.3901x+0.6756，r＝0.9994)。尿样(S)测定过程和上述相同，测定结果见表6，RSD＜3％。
另外，按样品∶标准＝9∶1的体积比，在三份尿样(S)中分别加入50、100、200μmol/L的GLCA-S标准液，用其进行回收率测定(见表6)，尿样的回收率为96-106％。因此本发明检测NADH的荧光强度定量尿样(S)中SBA的方法是准确可靠的。经计算本发明的检出限为2.2μmol/L。
上述的荧光反应1号液和荧光反应2号液中各种酶及试剂浓度如下：荧光反应液(1)1号：200U/Lβ-HSD(7)、200μmol/Lβ-NAD+；荧光反应液(1)2号：200U/L BSS(6)、200U/Lβ-HSD(7)、500μmol/Lβ-NAD+。
表6尿中SBA及回收率的测定
| 样品编号 | 尿中SBA浓度(μmol/L) | GLCA-S加入量(μmol/L) | 理论浓度(μmol/L) | 实测浓度(μmol/L) | 回收量(μmol/L) | 回收率(％) |
| 1 | 5.2 | 50100200 | 9.6814.6824.68 | 9.8815.4824.18 | 5.210.819.5 | 10410898 |
| 2 | 10.3 | 50100200 | 14.2719.2729.27 | 14.2719.3729.37 | 5.010.120.1 | 100101106 |
| 3 | 20.8 | 50100200 | 23.7228.7238.72 | 23.8227.8238.22 | 5.19.119.5 | 1029198 |
实施例19
本实施例是用本发明包含的LIE-SBA-FCA-Kit测定SBA标准和实际尿样的结果。先将25μL标准液(或尿样)与15μL荧光反应液(1)混匀后，在37℃条件下预孵10min，用一个SBA-CBR(2)(固定有BSS和β-HSD)，利用毛细现象吸入上述反应混合液(8)，然后插入荧光光度计的毛细管定位座插孔中，在λex 348nm和λem 460nm条件下，立即测定SBA-CBR(2)内所含反应混合液(8)的荧光强度，此值作为空白值(F1)；然后在38℃使其继续反应10min后，再测其荧光强度(F2)；此值减掉空白值(ΔF＝F2-F1)，得到的ΔF用于定量样品中的SBA值。用一系列不同浓度的GLCA-S标准液考察了其浓度与荧光强度之间的相关性，结果如图16中所示。可以看出，GLCA-S浓度在2.5-50μmol/L范围与荧光强度呈良好的直线相关性(y＝0.3075x+1.6914，r＝0.9998)。
上述的荧光反应液(1)组成是：500μmol/Lβ-NAD+；用于SBA-CBR(2)固定化的BSS和β-HSD(7)的浓度为4kU/L。
Claims (9)
1.一种测定磺酸化胆汁酸(SBA)的酶荧光毛细分析法，其特征在于：先将一个代替常规荧光试液槽的毛细管定位座置于荧光光度计或自动临床荧光生化分析装置光路中；由β-NAD+、电子传递体、刃天青构成的荧光反应液(1)与适量生物样品(S)混匀后，在适当温度下反应一段时间，用一个在内表面修饰有磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)和β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)、称为磺酸化胆汁酸毛细生物反应器(SBA-CBR)(2)的毛细管(3)吸入上述反应混合液(8)，然后插入荧光光度计的毛细管(3)定位座插孔中，在给定的激发波长和发射波长条件下，立即测定磺酸化胆汁酸毛细生物反应器(SBA-CBR)(2)内所含反应混合液的荧光强度，此值作为样品和试剂空白值(F1)；然后使其继续反应数分钟后，再测其荧光强度(F2)；此值减掉样品和试剂空白值(ΔF＝F2-F1)，得到的吸光度增加值(ΔF)用于定量样品(S)中的磺酸化胆汁酸(SBA)值，毛细管(3)做为荧光反应、测定或酶固定化的载体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：被测样品(S)在磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)催化作用下水解形成3β-羟胆汁酸，然后在β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)的催化作用下与β-NAD+反应，生成NADH；NADH与氧化型电子传递体反应形成还原型电子传递体，后者与刃天青反应生成试卤灵，测定其荧光强度来定量磺酸化胆汁酸(SBA)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：制成含有一个内表面固定有磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)和β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)的磺酸化胆汁酸毛细生物反应器(SBA-CBR)(2)和一种含有β-NAD+、电子传递体和刃天青的荧光反应液(1)的高灵敏磺酸化胆汁酸固定化酶荧光定量试剂盒(HIE-SBA-FCA-Kit)。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：制成磺酸化胆汁酸毛细生物反应器(SBA-CBR)(2)内表面同时固定有磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)和β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)、荧光反应液(1)只含有β-NAD+的低灵敏磺酸化胆汁酸(SBA)固定化酶荧光定量试剂盒(LIE-SBA-FCA-Kit)，通过测定NADH的荧光强度来定量磺酸化胆汁酸(SBA)。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：磺酸化胆汁酸毛细生物反应器(SBA-CBR)(2)内表面可单独固定磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)，将β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)包含在荧光反应液(1)内而形成的定量试剂盒。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：由含有一个空白磺酸化胆汁酸毛细生物反应器(SBA-CBR)(2)和一个测定磺酸化胆汁酸毛细生物反应器(SBA-CBR)(2)组成固定化酶荧光定量双毛细管试剂盒(IE-SBA-FCA-2C-Kit)。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在一个空白管和一个测定管内加入被测样品(S)，再分别将含有β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)和荧光反应液(1)的1号液加入空白管内，将含有磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)、β-NAD+和荧光反应液(1)的2号液加入测定管内；反应一定时间后，依次将上述两管中的反应混合液(8)吸入毛细管(3)内，插入荧光光度计的毛细管(3)定位座中，在给定的激发波长和发射波长条件下，测定毛细管(3)内所含反应混合液(8)的荧光强度；根据空白管(F1)和测定管(F2)的荧光强度差值(ΔF＝F2-F1)定量样品(S)中的磺酸化胆汁酸(SBA)值。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：由1号液、2号液和定量毛细管(3)可构成高灵敏磺酸化胆汁酸(SBA)液态酶荧光定量试剂盒(HLE-SBA-FCA-Kit)；是1号液含有β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)和荧光反应液(1)，2号液含有磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)、β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)和荧光反应液(1)的磺酸化胆汁酸(SBA)定量试剂盒。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：制成含有1号液、2号液和定量毛细管(3)的低灵敏磺酸化胆汁酸(SBA)液态酶荧光定量试剂盒(LLE-SBA-FCA-Kit)，是一种1号液含β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)和β-NAD+，2号液含磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)、β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)和β-NAD+的磺酸化胆汁酸(SBA)定量试剂盒，通过测定NADH的荧光强度来定量磺酸化胆汁酸(SBA)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100452605A CN101221129B (zh) | 2008-01-25 | 2008-01-25 | 磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100452605A CN101221129B (zh) | 2008-01-25 | 2008-01-25 | 磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101221129A CN101221129A (zh) | 2008-07-16 |
| CN101221129B true CN101221129B (zh) | 2010-12-01 |
Family
ID=39631100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008100452605A Expired - Fee Related CN101221129B (zh) | 2008-01-25 | 2008-01-25 | 磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101221129B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102818866B (zh) * | 2012-08-03 | 2014-01-22 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 用于新生儿胆道闭锁的诊断标记物的应用 |
| WO2015076361A1 (ja) * | 2013-11-21 | 2015-05-28 | 国立大学法人東京大学 | 蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ａｄｐの測定方法、ａｄｐを生成する酵素の活性測定方法、及び糖転移酵素の活性測定方法 |
| CN108267585A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-07-10 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 基于血清标志物mmp-7的胆道闭锁诊断试剂盒 |
-
2008
- 2008-01-25 CN CN2008100452605A patent/CN101221129B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101221129A (zh) | 2008-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI97551B (fi) | Analyysimenetelmä, reagenssikoostumus ja sen käyttö glukoosin määritykseen | |
| Walters et al. | Fiber-optic biosensor for ethanol, based on an internal enzyme concept | |
| Li et al. | A novel immobilization multienzyme glucose fluorescence capillary biosensor | |
| CN105671127B (zh) | 一种稳定的酶法血清镁离子检测试剂盒 | |
| CN110006885B (zh) | 一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法 | |
| Wu et al. | Chemiluminescence biosensor system for lactic acid using natural animal tissue as recognition element | |
| CN107505273A (zh) | 血清总胆汁酸含量测定试剂盒及其使用方法 | |
| US20110053192A1 (en) | Method Of Rapid Detection Of An Analyte In Bodily Fluids Using A Fluorescent Dry Test Strip Biosensor | |
| CN101221129B (zh) | 磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒 | |
| CN101498662A (zh) | 单胺氧化酶mao单试剂测定试剂盒 | |
| CN102375066B (zh) | 一种肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法 | |
| Arnold | Fluorophore-and chromophore-based fiberoptic biosensors | |
| Nagaraja et al. | Development of quantitative enzymatic method and its validation for the assay of glucose in human serum | |
| CN103048282A (zh) | 一种胆红素的检测方法及检测试剂盒 | |
| Li et al. | Immobilized enzymatic fluorescence capillary biosensor for determination of sulfated bile acid in urine | |
| CN111829999B (zh) | 钙钛矿荧光微球和多巴胺体系的应用方法 | |
| Salinas-Castillo et al. | Immobilization of a trienzymatic system in a sol–gel matrix: A new fluorescent biosensor for xanthine | |
| CN108896750A (zh) | 一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法和用途 | |
| CN104807995B (zh) | 一种灵敏度高的连续检测法gldh检测试剂 | |
| Zhao et al. | Determination of pyruvic acid by using enzymic fluorescence capillary analysis | |
| Li et al. | A novel analysis method for lactate dehydrogenase activity in serum samples based on fluorescence capillary analysis | |
| CN100547390C (zh) | 光学快速检测谷丙转氨酶试剂 | |
| Chen et al. | Application of rhodamine B hydrazide as a new fluorogenic indicator in the highly sensitive determination of hydrogen peroxide and glucose based on the catalytic effect of iron (III)-tetrasulfonato-phthalocyanine | |
| CN101587076B (zh) | 定量检测肌氨酸含量的方法及反应试剂盒 | |
| Arnold | Fiber optic biosensing probes for biomedically important compounds |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20101201 Termination date: 20170125 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |