WO2015076361A1 - 蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ａｄｐの測定方法、ａｄｐを生成する酵素の活性測定方法、及び糖転移酵素の活性測定方法 - Google Patents

蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ａｄｐの測定方法、ａｄｐを生成する酵素の活性測定方法、及び糖転移酵素の活性測定方法 Download PDF

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    • G01N2333/91215—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases with a definite EC number (2.7.1.-)

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence or absorbance detection method, a background suppression method, an ADP measurement method, an ADP production such as a kinase, which can measure with high sensitivity the fluorescence intensity or absorbance produced by the reduction of resazurin to resorufin.
  • the present invention relates to a method for easily and highly sensitively measuring the activity of an enzyme or glycosyltransferase, a method for screening an activity regulator of an ADP-producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase, and a measurement kit for them.
  • Glycosyltransferase is a general term for enzymes that catalyze the reaction of transferring a glycosyl group from a donor (G) containing a glycosyl group to an acceptor (A) to produce GA (Non-patent Document 1).
  • GDP-fucos GDP-mannose, UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-glucuronic acid, UDP-xylose, UDP-N-acetylglucosamine, UDP-N-acetylgalactosamine, CMP -Sialic acid
  • CMP -Sialic acid is the main donor molecule.
  • glycosyltransferases that transfer the glycosyl group from these donor molecules are fucosyltransferase, mannosyltransferase, glucosyltransferase, galactosyltransferase, glucuronosyltransferase, xylosyltransferase, N-acetylglucosaminyltransferase, N-acetylgalactosaminyl, respectively. It is called transferase or sialyltransferase.
  • GDP is an abbreviation for guanosine 5′-niphosphate
  • UDP is uridine 5′-niphosphate
  • CMP is cytidine 5′-monophosphate.
  • Receptor molecules include monosaccharides, oligosaccharides, proteins, lipids, glycoproteins, glycolipids and the like.
  • glycosyltransferase activity regulators inhibitors or activators are expected to become new therapeutic agents for these diseases.
  • Non-patent Document 4 Non-patent Document 4
  • these methods require chemical synthesis of labeled sugar donors and require special equipment for measurement (liquid scintillator and LC-MS), making it difficult to assay easily. It was difficult to perform large numbers of assays (high throughput screening) using plates. Moreover, it was a costly method.
  • nucleotides produced by the glycosyltransferase reaction are quantified by fluorescence polarization using commercially available assay kits (Transscreener (registered trademark) GDP Assay, UDP2 Assay, AMP2 / GMP2 Assay) manufactured by Bellbrook Labs,
  • Transscreener registered trademark
  • GDP Assay UDP2 Assay
  • AMP2 / GMP2 Assay AMP2 / GMP2 Assay
  • Non-patent Document 8 a method for rapidly assaying the transfer of fluorescently labeled sugars using fluorescence polarization has been reported (Non-patent Document 8), but it can be used only for high molecular weight substrates. It cannot be applied to glycosyltransferases. Thus, it is difficult for conventional glycosyltransferases to be assayed easily and with high sensitivity using a microplate, and high-throughput screening of glycosyltransferase activity regulators is difficult.
  • kinase is a general term for enzymes that catalyze a reaction in which a terminal phosphate group of a nucleoside triphosphate such as ATP (adenosine 5′-triphosphate) is transferred to a compound other than water to produce a phosphate compound.
  • a nucleoside triphosphate such as ATP (adenosine 5′-triphosphate)
  • ATP adenosine 5′-triphosphate
  • kinases are also important enzyme molecules involved in in vivo signal transduction. It is known that kinase activity is enhanced in certain types of cancer cells, and inhibitors of kinases are used as so-called molecular target drugs for the treatment of cancer. Kinases are also known to be involved in inflammation, immune response, diabetes and the like. Therefore, kinases are excellent target molecules for the development of therapeutic agents for diseases such as cancer, inflammation, autoimmune diseases, diabetes, and the like.
  • the main methods for measuring the kinase activity include a method of quantifying phosphorylated products, a method of measuring a decrease in ATP, and a method of quantifying ADP (adenosine 5′-niphosphate) generated from ATP. As mentioned.
  • a radioactive product generated from radioactive ATP is measured by radioactivity count, and the phosphorylated product is measured by thin layer chromatography (TLC) or high performance liquid chromatography (HPLC ),
  • TLC thin layer chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • a method for measuring the amount of ATP decrease a method of quantifying the amount of residual ATP in the kinase reaction solution by chemiluminescence using luciferase (for example, “Cellular” ATP measurement reagent (trademark) manufactured by Toyo B-Net Co., Ltd.) Can be mentioned.
  • luciferase for example, “Cellular” ATP measurement reagent (trademark) manufactured by Toyo B-Net Co., Ltd.
  • Methods for quantifying ADP generated from ATP include 1) a method of re-converting to ATP, reacting with luciferase, and quantifying by chemiluminescence (for example, ADP-Glo (trademark) Kinase Assay manufactured by Promega), 2) anti-ADP Method for spectroscopic quantification using antibody using time-resolved fluorescence method or fluorescence polarization method (for example, Transscreener (registered trademark) ADP TR-FRET Assay, Transscreener (registered trademark) ADP Assay, manufactured by Bell Brook Labs), 3) A method of measuring fluorescence by allowing 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine and peroxidase to further react with hydrogen peroxide produced by allowing ADP to react with phosphoenolpyruvate, pyruvate kinase, or pyruvate oxidase (for example, Disc) veRx ADP Hunter (trademark) HS As
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a fluorescence or absorbance detection method and background suppression capable of highly sensitively measuring fluorescence intensity or absorbance generated by the reduction of resazurin to resorufin.
  • Method, method for measuring ADP method for measuring the activity of an enzyme that produces ADP, method for measuring the activity of a glycosyltransferase that can easily and highly sensitively measure the activity of a target enzyme, kit for measuring ADP, and generating ADP
  • An enzyme activity measurement kit and a glycosyltransferase activity measurement kit are provided.
  • Reaction with diphosphate kinase) or CMP kinase (cytosine 5′-monophosphate kinase) to produce ADP, which is converted to glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6) -P dehydrogenase), diaphorase, NADP, and resazurin can be used to carry out enzyme coupling to quantify the activity of almost all glycosyltransferases easily, sensitively and quantitatively on a microplate with fluorescence.
  • the present invention has been further studied and completed as a method for detecting fluorescence or absorbance, and a simple and highly sensitive activity measurement method for ADP-producing enzymes such as glycosyltransferases or kinases. That is, the present invention is a fluorescence or absorbance detection method, background suppression method, ADP measurement method, enzyme activity measurement method, glycosyltransferase activity measurement method, ADP measurement method having the following characteristics: A kit, an enzyme activity measurement kit for producing ADP, and a glycosyltransferase activity measurement kit are provided.
  • a method for detecting fluorescence or absorbance wherein resazurin is reduced to resorufin by diaphorase in the presence of an SH reagent and NADH or NADPH, and the resulting fluorescence intensity or absorbance is measured.
  • the SH reagent is a maleimide compound or 2-iodoacetamide represented by the following general formula [1].
  • R 1 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, or a straight chain having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent.
  • R 2 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an optionally substituted linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 linear or branched alkoxy groups, optionally having 1 to 6 carbon atoms, which may have a linear or branched hydroxyalkyl group, or having a substituent.
  • a linear or branched sulfoalkyl group having 1 to 6 carbon atoms is represented.
  • n represents the number of R 2 and is 0 or 1.
  • Step 2-1 in which ADP and ADP-dependent hexokinase are allowed to act on glucose to produce glucose-6-phosphate
  • Step 2-2 for producing NADH or NADPH by allowing NAD or NADP and glucose-6-phosphate dehydrogenase to act on glucose-6-phosphate obtained in Step 2-1
  • a step 2-3 in which NADH or NADPH obtained in the step 2-2 and diaphorase are allowed to act on resazurin in the presence of an SH reagent, and the resulting fluorescence intensity or absorbance is measured
  • a method for measuring ADP comprising: (6) The ADP measurement method according to (5), wherein the SH reagent is a maleimide compound or 2-iodoacetamide represented by the following general formula [1].
  • a method for measuring the activity of an enzyme that produces ADP comprising: (9) The method for measuring an activity of an enzyme producing ADP according to (8), wherein the SH reagent is a maleimide compound represented by the following general formula [1] or 2-iodoacetamide.
  • the enzyme that produces ADP is at least one selected from the group consisting of kinase, ATPase, nitrogenase, tetrahydrofolate synthase, acetyl-CoA carboxylase, pyruvate carboxylase, and glutathione synthase.
  • the method for measuring the activity of an enzyme that produces ADP according to any one of 10).
  • a first step of generating ADP according to the amount of CMP A second step of causing glucose to act on ADP obtained in the first step and ADP-dependent hexokinase to produce glucose-6-phosphate; Step 2-2 for producing NADH or NADPH by allowing NAD or NADP and glucose-6-phosphate dehydrogenase to act on glucose-6-phosphate obtained in Step 2-1; Step 2-3 in which the NADH or NADPH and diaphorase obtained in Step 2-2 are allowed to act in the presence of an SH reagent, and the resulting fluorescence intensity or absorbance is measured;
  • a method for measuring the activity of a glycosyltransferase comprising: (13) The method for measuring a glycosyltransferase activity according to (12), wherein the SH reagent is a maleimide compound or 2-iodoacetamide represented by the following general formula [1].
  • the glycosyltransferase is selected from fucosyltransferase, mannosyltransferase, glucosyltransferase, galactosyltransferase, glucuronosyltransferase, xylosyltransferase, N-acetylglucosaminyltransferase, N-acetylgalactosaminyltransferase, and sialyltransferase.
  • the method for measuring the activity of a glycosyltransferase according to any one of the above (12) to (14), which is at least one selected from the group consisting of:
  • a kit for measuring ADP comprising glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, diaphorase, NAD and / or NADP, resazurin and SH reagent.
  • the SH reagent is a maleimide compound represented by the following general formula [1] or 2-iodoacetamide.
  • a kit for measuring the activity of an enzyme that produces ADP comprising glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, diaphorase, NAD and / or NADP, resazurin, and an SH reagent.
  • (22) a first solution containing ATP and NMP kinase, NDP kinase or CMP kinase;
  • a second fluid comprising glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, diaphorase, NAD and / or NADP, resazurin, and SH reagent;
  • a kit for measuring the activity of glycosyltransferase comprising: (23) The kit for measuring a glycosyltransferase activity according to (22), wherein the first liquid further contains a reducing agent.
  • the present invention it is possible to measure with high sensitivity the fluorescence intensity or absorbance generated by the reduction of resazurin to resorufin.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION the method of measuring easily and highly sensitively the activity of ADP producing enzymes, such as a glycosyltransferase or a kinase, can be provided. Since the present invention is suitable for assays using microplates, according to the present invention, high-throughput screening of activity regulators of ADP-producing enzymes such as glycosyltransferases or kinases becomes possible.
  • FIG. 18B The results of measuring the inhibitory effect on the assay system itself are shown in FIG. 18B.
  • the horizontal axis represents 1280 compounds. It is the result of screening a galactosyltransferase (human B4GalT1) inhibitor using a commercially available compound library in Examples (LOPAC1280 (trademark) manufactured by Sigma-Aldrich). Compounds were assayed at 10 ⁇ M. The inhibition rate considered as the net B4GalT1 inhibitory activity obtained by subtracting the latter inhibition rate from the former inhibition rate is shown in FIG. 18C.
  • the horizontal axis represents 1280 compounds. It is a result of determination of ADP in the presence of maleimides or iodoacetamide in the examples.
  • FIG. 1 is an example of a reaction route according to the fluorescence or absorbance detection method of the present invention, and is a reaction route when measuring the activity of glycosyltransferase. As shown in Step 2-3 in FIG.
  • the method for detecting fluorescence or absorbance of the present invention is the reduction of resazurin to resorufin by diaphorase in the presence of SH reagent and NADH or NADPH, and the resulting fluorescence intensity or absorbance. Measure.
  • the fluorescence intensity or absorbance can be measured, for example, by obtaining a mixture with SH reagent, NADH or NADPH, diaphorase, and resazurin (hereinafter referred to as the mixture for the second and third steps) and performing an enzyme coupling reaction. NADPH is led to the fluorescence emission of resorufin, which is fluorimetrically determined.
  • the SH reagent, NADH or NADPH, diaphorase, and resazurin used in the enzyme coupling reaction for the measurement can be added alone, but one of these may be added in advance. It is also possible to add a mixture of parts.
  • the diaphorase used in Step 2-3 can be any of animal and plant origin, microorganism origin, and those prepared by gene recombination techniques, but purified one is preferred.
  • the concentration of each component after the addition is preferably such that diaphorase is 0.2 to 20 ⁇ g / ml, NADH or NADPH is 1 to 500 ⁇ M, 10 to 500 ⁇ M, and resazurin is 5 to 250 ⁇ M.
  • the concentration of the SH reagent is usually preferably 1 ⁇ M to 100 mM, and an amount equivalent to the reducing agent present in the mixed solution for the second and third steps or an amount up to about 20 times that is suitable.
  • the buffer to be used include Tris-hydrochloric acid buffer, Good buffer such as HEPES buffer, and phosphate buffer.
  • the buffer concentration is preferably 10 to 200 mM, and the pH is preferably 7 to 9.
  • salts such as 10 to 200 mM NaCl, 10 to 200 mM KCl, 5 to 40 mM NaF, 1 to 40 mM MgCl 2 , 1 to 20 mM CaCl 2 , 100 to 500 ⁇ M Na 3 VO 4 , 0.01 to 1% Triton X- A surfactant such as 100 or a protein such as albumin such as 0.01 to 1% may be added.
  • the reaction temperature of the enzyme coupling reaction in step 2-3 is preferably 20 to 37 ° C., and the reaction time is preferably 10 minutes to 3 hours.
  • reducing agent when the step 2-3 is performed in the presence of the reducing agent, dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol or TCEP is preferable.
  • the reducing agent is preferably added so as to be 1 ⁇ M to 5 mM.
  • the SH reagent is added to the mixed solution for the 2-3 step and the reaction of the 2-3 step is performed.
  • the reaction in the step 2-3 is performed with the reducing agent present in the reaction solution
  • the reduction of resazurin to resorufin proceeds by the action of the reducing agent, and the fluorescence background increases.
  • the SH reagent is a reagent that reacts with a thiol group, and is a compound used for quantification and chemical modification of cysteine residues in proteins.
  • the SH reagent used in the present invention may be any as long as it has reactivity with a reducing agent in the vicinity of a neutral pH range and does not affect the activity of the enzyme used in the enzyme coupling reaction.
  • Examples include ⁇ -halocarbonyl compounds such as iodoacetamide, maleimide derivatives such as N-ethylmaleimide, N-phenylmaleimide, N- (2-chlorophenyl) maleimide, N- (4-carboxy-3-hydroxyphenyl) maleimide ( Maleimide compounds), allyl sulfonic acid derivatives such as methyl vinyl sulfone, and the like, and ⁇ -halocarbonyl compounds such as iodoacetamide and maleimide derivatives (maleimide compounds) such as N-ethylmaleimide are particularly preferable.
  • the SH reagent used in the fluorescence or absorbance detection method of the present invention is preferably a maleimide compound or 2-iodoacetamide represented by the following general formula [1].
  • R 1 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, or a straight chain having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent.
  • R 2 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an optionally substituted linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 linear or branched alkoxy groups, optionally having 1 to 6 carbon atoms, which may have a linear or branched hydroxyalkyl group, or having a substituent.
  • a linear or branched sulfoalkyl group having 1 to 6 carbon atoms is represented.
  • n represents the number of R 2 and is 0 or 1.
  • Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec- Examples include butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, isohexyl group and the like.
  • Examples of the linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an iso-propoxy group, an n-butoxy group, and a tert-butoxy group. Group, n-hexyloxy group and the like.
  • the linear or branched hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 is an alkyl group in which at least one hydrogen atom is substituted with an independently selected hydroxyl group.
  • the alkyl group of the linear or branched hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 .
  • the thing similar to what was illustrated by the alkyl group is mentioned.
  • the linear or branched sulfoalkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 is an alkyl group in which at least one hydrogen atom is substituted with an independently selected sulfo group.
  • Examples of the alkyl group of the linear or branched sulfoalkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 include the linear or branched chain group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 .
  • the thing similar to what was illustrated by the alkyl group is mentioned.
  • Examples of the aryl group having 6 to 10 carbon atoms of R 1 include a phenyl group and a naphthyl group.
  • the halogen atom of R 2 is an element belonging to Group 17 in the periodic table such as F, Cl, Br, and I.
  • the linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 preferably has 1 to 4 carbon atoms, and more preferably has 1 to 3 carbon atoms.
  • the linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 preferably has 1 to 4 carbon atoms, and more preferably has 1 to 3 carbon atoms.
  • the linear or branched hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 preferably has 1 to 4 carbon atoms, and more preferably has 1 to 3 carbon atoms.
  • the linear or branched sulfoalkyl group having 1 to 6 carbon atoms of R 1 and R 2 preferably has 1 to 4 carbon atoms, and more preferably has 1 to 3 carbon atoms.
  • the substituent that the alkyl group, alkoxy group, hydroxyalkyl group, or sulfoalkyl group of R 1 and R 2 may have is a substituent of a hydrogen atom (H) in the hydrocarbon group, Examples of the substituent include a halogen atom, a hydroxyl group, and an amino group.
  • the substituent that the aryl group of R 1 may have is a substituent of a hydrogen atom (H) in the aryl group, and the substituent is linear or branched having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a chain alkyl group, a carboxyl group, a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, and a nitro group.
  • FIG. 1 is an example of a reaction route according to the background suppression method of the present invention, and is a reaction route when measuring the activity of glycosyltransferase.
  • NADH or NADPH, resazurin, and diaphorase are reacted in the presence of a reducing agent as shown in Step 2-3 in FIG. 1, and the fluorescence intensity or absorbance generated by the reaction is reacted.
  • the reaction is performed in the presence of an SH reagent.
  • the reaction in the step 2-3 is carried out with the reducing agent present, the reduction of resazurin to resorufin proceeds by the action of the reducing agent, and the fluorescence background increases.
  • the SH reagent By adding the SH reagent to the mixed solution for step 2-3, it is possible to inactivate the reducing agent and suppress the increase of the fluorescence background.
  • a mixed solution in which a reducing agent is added to a mixed solution of SH reagent, NADH or NADPH, diaphorase, and resazurin (hereinafter referred to as a mixed solution for the second and third steps).
  • SH reagent, NADH or NADPH, diaphorase, and resazurin used for the enzyme coupling reaction for the measurement are added individually. However, it is also possible to add a mixture of some of these in advance.
  • step 2-3 fluorescence emission of resorufin from NADH or NADPH occurs.
  • the SH reagent is added to the mixed solution, an increase in the background signal other than the signal to be detected can be suppressed when the fluorescence emission is quantified.
  • the diaphorase used in Step 2-3 can be any of animal and plant origin, microbial origin, and those prepared by gene recombination techniques, but purified one is preferred.
  • the concentration of each component after the addition is such that the reducing agent is 1 ⁇ M to 5 mM, diaphorase is 0.2 to 20 ⁇ g / ml, NADH or NADPH is 1 to 500 ⁇ M, 10 to 500 ⁇ M, and resazurin is 5 to 250 ⁇ M. preferable.
  • the concentration of the SH reagent is usually preferably 1 ⁇ M to 100 mM, and an amount equivalent to the reducing agent present in the mixed solution for the second and third steps or an amount up to about 20 times that is suitable.
  • the buffer to be used include Tris-hydrochloric acid buffer, Good buffer such as HEPES buffer, and phosphate buffer.
  • the buffer concentration is preferably 10 to 200 mM, and the pH is preferably 7 to 9.
  • salts such as 10 to 200 mM NaCl, 10 to 200 mM KCl, 5 to 40 mM NaF, 1 to 40 mM MgCl 2 , 1 to 20 mM CaCl 2 , 100 to 500 ⁇ M Na 3 VO 4 , 0.01 to 1% Triton X- A surfactant such as 100 or a protein such as albumin such as 0.01 to 1% may be added.
  • the reaction temperature of the enzyme coupling reaction in step 2-3 is preferably 20 to 37 ° C., and the reaction time is preferably 10 minutes to 3 hours.
  • reducing agent when the step 2-3 is performed in the presence of the reducing agent, dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol or TCEP is preferable.
  • the reducing agent is preferably added so as to be 1 ⁇ M to 5 mM.
  • the SH reagent used in the background suppression method of the present invention has reactivity with a reducing agent in the vicinity of a neutral pH range and does not affect the activity of the enzyme used in the enzyme coupling reaction. Either is fine.
  • Examples include ⁇ -halocarbonyl compounds such as iodoacetamide, maleimide derivatives such as N-ethylmaleimide, allylsulfonic acid derivatives such as methylvinylsulfone, and the like.
  • ⁇ -halocarbonyl compounds such as iodoacetamide, N- Maleimide derivatives such as ethylmaleimide are preferred.
  • the SH reagent used in the present invention is preferably a maleimide compound represented by the above general formula [1] or 2-iodoacetamide.
  • FIG. 1 is an example of a reaction route according to the ADP measurement method of the present invention, and is a reaction route in the case of measuring ADP produced by an enzyme reaction of glycosyltransferase.
  • the ADP measurement method of the present invention uses ADP and ADP-dependent hexokinase as glucose. And reacting NAD or NADP and glucose-6-phosphate dehydrogenase with glucose-6-phosphate obtained by the above-mentioned step 2-1.
  • the measurement of ADP is performed, for example, by using a mixed solution of glucose, ADP-dependent hexokinase, G-6-P dehydrogenase, diaphorase, NAD or NADP, and resazurin (hereinafter referred to as the second mixture) used in the enzyme coupling reaction for quantifying ADP.
  • a liquid mixture in which ADP is added to the process liquid mixture is obtained and subjected to an enzyme coupling reaction, whereby ADP is led to the fluorescence emission of resorufin, and this is fluorimetrically determined.
  • glucose, ADP-dependent hexokinase, G-6-P dehydrogenase, diaphorase, NAD or NADP, and resazurin used for the enzyme coupling reaction for the measurement are added individually. However, it is also possible to add a mixture of some of these in advance.
  • the concentration of each component after addition was 0.1 to 10 mM for glucose, 5 to 500 ⁇ g / ml for ADP-dependent hexokinase, 1 to 100 ⁇ g / ml for G-6-P dehydrogenase, and 0.2 to 20 ⁇ g / ml for diaphorase.
  • NAD or NADP is preferably 1 to 500 ⁇ M, 10 to 500 ⁇ M, and resazurin is preferably 5 to 250 ⁇ M.
  • concentration of the SH reagent is usually preferably 1 ⁇ M to 100 mM, and an amount equivalent to the reducing agent present in the mixed solution for the second and third steps or an amount up to about 20 times that is suitable.
  • the buffer to be used include Tris-hydrochloric acid buffer, Good buffer such as HEPES buffer, and phosphate buffer.
  • the buffer concentration is preferably 10 to 200 mM, and the pH is preferably 7 to 9.
  • salts such as 10 to 200 mM NaCl, 10 to 200 mM KCl, 5 to 40 mM NaF, 1 to 40 mM MgCl 2 , 1 to 20 mM CaCl 2 , 100 to 500 ⁇ M Na 3 VO 4 , 0.01 to 1% Triton X- A surfactant such as 100 or a protein such as albumin such as 0.01 to 1% may be added.
  • the reaction temperature of the enzyme coupling reaction in the second step is preferably 20 to 37 ° C., and the reaction time is preferably 10 minutes to 3 hours.
  • reducing agent when the step 2-3 is performed in the presence of the reducing agent, dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol or TCEP is preferable.
  • the reducing agent is preferably added so as to be 1 ⁇ M to 5 mM.
  • the ADP-dependent hexokinase, G-6-P dehydrogenase, and diaphorase used in the second step can be any of animal and plant origin, microbial origin, and those prepared by gene recombination techniques. Is preferred.
  • the SH reagent is added to the second-step mixed solution to cause the second-step reaction.
  • the enzyme coupling reaction in the second step is performed in the presence of the reducing agent, reduction of resazurin to resorufin proceeds by the action of the reducing agent, and the fluorescence background increases.
  • the SH reagent is added to the enzyme coupling mixture in the second step, it is possible to inactivate the reducing agent and suppress an increase in the fluorescence background.
  • the reducing agent when the ADP measurement method of the present invention is carried out in the presence of the reducing agent, dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol or TCEP is suitable.
  • the reducing agent is preferably added so as to be 1 ⁇ M to 5 mM.
  • the SH reagent used in the ADP measurement method of the present invention is reactive with a reducing agent in the vicinity of a neutral pH range and does not affect the activity of the enzyme used in the enzyme coupling reaction. Either is fine.
  • Examples include ⁇ -halocarbonyl compounds such as iodoacetamide, maleimide derivatives such as N-ethylmaleimide, allylsulfonic acid derivatives such as methylvinylsulfone, and the like.
  • ⁇ -halocarbonyl compounds such as iodoacetamide, N- Maleimide derivatives such as ethylmaleimide are preferred.
  • the SH reagent used in the present invention is preferably a maleimide compound represented by the above general formula [1] or 2-iodoacetamide.
  • the ADP measurement method of the present invention can be used as a wide-ranging activity measurement method for enzymes that produce ADP by reaction in addition to ADP.
  • the method for quantifying ADP in the second step of the present invention can be used as a method for measuring a wide range of activities of enzymes such as kinases that produce ADP by reaction. That is, the method for measuring the activity of an enzyme producing ADP according to the present invention comprises converting ADP produced by an enzymatic reaction producing ADP into glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, diaphorase, NADP in the presence of an SH reagent, And resorufin fluorescence generated by the action of resazurin.
  • the method for measuring the activity of an enzyme that produces ADP of the present invention is shown in FIG.
  • a second step consisting of a second step, a second step, a second step, and a second step.
  • an enzyme that generates ADP is allowed to act on a substrate to convert ATP to ADP, and glucose is converted to ADP obtained in the above-mentioned 1-1 step and ADP-dependent hexokinase.
  • a preferred embodiment of the present invention will be described taking a kinase as an example.
  • the kinase to be measured may be any of those extracted from animal and plant tissues and cells, those of microbial origin, and those prepared by gene recombination techniques, but purified ones are preferred.
  • Examples of the kinase include protein kinase A, protein kinase C, calmodulin kinase, and casein kinase.
  • a kinase reaction for measuring enzyme activity is performed by mixing a kinase, a phosphate donor molecule (usually ATP), and a phosphate acceptor molecule (a substrate molecule corresponding to the kinase) in a buffer.
  • the concentration of each of the kinases added is preferably such that the enzyme reaction rate is about 1 to 50%, and the phosphate donor molecule (mainly ATP) is preferably added at 10 to 1000 ⁇ M, and the phosphate acceptor molecule. Is preferably added at 5 to 500 ⁇ M.
  • the buffer used for the kinase reaction include Good buffer such as Tris-HCl buffer and HEPES buffer, and phosphate buffer.
  • the buffer concentration is preferably 10 to 200 mM, and the pH is preferably 7 to 9.
  • salts such as 10 to 200 mM NaCl, 10 to 200 mM KCl, 5 to 40 mM NaF, 1 to 20 mM MgCl 2 , 1 to 20 mM MnCl 2 , 1 to 20 mM CaCl 2 , 100 to 500 ⁇ M Na 3 VO 4
  • a surfactant such as 0.01 to 1% Triton X-100 and a protein such as 0.01 to 1% albumin may be added.
  • the kinase to be measured has a reducing agent requirement, or as an activator (activator) for increasing (activating / activating) the enzyme activity, or non-specificity of the compound at the time of screening
  • a reducing agent such as DTT, 2-mercaptoethanol, or TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)
  • TCEP tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride
  • the addition concentration of DTT, 2-mercaptoethanol or TCEP is preferably in the range of 0.1 to 10 mM, although it depends on the requirement of the reducing agent of the kinase to be measured.
  • the reaction temperature is preferably 20 to 37 ° C., and the reaction time is preferably 10 minutes to 3 hours.
  • the ADP concentration in the reaction solution after the kinase reaction is preferably in the range of 0.1 to 50 ⁇ M, and more preferably in the range of 0.5 to 25 ⁇ M. In the case of a thicker reaction solution, it is preferable to dilute it so that it falls within this range.
  • ADP produced by the kinase reaction is quantified by fluorescence of resorufin by adding glucose, ADP-dependent hexokinase, G-6-P dehydrogenase, diaphorase, NADP, and resazurin for enzyme coupling. These can be added separately, but they are mixed in advance (hereinafter referred to as the enzyme coupling mixture, but the composition is the same as the above-mentioned second step mixture) and added to the reaction mixture after the kinase reaction at once. Is also possible.
  • the final concentrations of these components when added to the reaction solution after the kinase reaction were 0.5 to 5 mM for glucose, 5 to 100 ⁇ g / ml for ADP-dependent hexokinase, and 0.5 to 10 ⁇ g / ml for G-6-P dehydrogenase. It is preferable to prepare such that ml, diaphorase is 0.2 to 20 ⁇ g / ml, 0.5 to 10 ⁇ g / ml, NADP is 20 to 400 ⁇ M, resazurin is 5 to 250 ⁇ M, and 10 to 200 ⁇ M.
  • the concentration of the SH reagent is usually preferably 1 ⁇ M to 100 mM, and an amount equivalent to the reducing agent present in the enzyme coupling mixture or an amount up to about 20 times that is suitable.
  • Good buffer such as Tris-HCl buffer and HEPES buffer, phosphate buffer and the like are used.
  • the buffer concentration is preferably 10 to 200 mM, and the pH is preferably 7 to 9.
  • salts such as 10 to 200 mM NaCl, 10 to 200 mM KCl, 5 to 40 mM NaF, 1 to 40 mM MgCl 2 , 1 to 20 mM MnCl 2 , 1 to 20 mM CaCl 2 , 100 to 500 ⁇ M Na 3 VO 4 , 0.01 ⁇ 1% of a surfactant such as Triton X-100 and 0.01 to 1% of a protein such as albumin may be added.
  • the reaction temperature of the enzyme coupling reaction is preferably 20 to 37 ° C., and the reaction time is preferably 10 minutes to 3 hours.
  • reducing agent when the step 2-3 is performed in the presence of the reducing agent, dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol or TCEP is preferable.
  • the reducing agent is preferably added so as to be 1 ⁇ M to 5 mM.
  • the addition of a reducing agent is necessary to exert enzyme activity.
  • the reduction agent promotes the reduction of resazurin to resorufin by the action of the reducing agent.
  • the background becomes higher.
  • the above-described SH reagent is added to the enzyme coupling mixture to inactivate the reducing agent, thereby enabling measurement with suppressed background rise. Any SH reagent can be used for measuring the kinase activity as long as it has reactivity with a reducing agent in the vicinity of neutral pH and does not affect the activity of the enzyme used in the enzyme coupling reaction. .
  • the amount to be added to the enzyme coupling reaction is preferably an amount equivalent to the reducing agent used in the kinase reaction or an amount up to about 20 times that amount.
  • the SH reagent used in the present invention is preferably a maleimide compound represented by the above general formula [1] or 2-iodoacetamide.
  • the ADP quantification method of the present invention can be used to measure the activity of enzymes that produce ADP in addition to kinases.
  • Enzymes that produce ADP in addition to kinases include ATPase, nitrogenase, tetrahydrofolate synthase, acetyl-CoA carboxylase, pyruvate carboxylase, glutathione synthase, and the like.
  • the container used for measuring the activity of an ADP-producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase is not limited as long as the reaction proceeds, but a microplate is preferable. There are various types of microplates such as 96 holes, 384 holes, and 1536 holes, and any of them can be used.
  • ADP-producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase
  • the reaction of ADP-producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase
  • the mixture for the first step is added to the reaction solution to perform the first step reaction.
  • the fluorescence of the product resorufin
  • the fluorescence of resorufin is measured in the same manner with a microplate reader.
  • the excitation wavelength is preferably 530 to 570 nm
  • the fluorescence wavelength is preferably 580 to 610 nm.
  • FIG. 1 is a reaction pathway showing the principle of the method for measuring the activity of glycosyltransferase of the present invention.
  • the method for measuring the activity of a glycosyltransferase of the present invention comprises reacting GDP or UDP produced by a glycosyltransferase reaction with NDP kinase in the presence of ATP, or CMP produced by a glycosyltransferase reaction in the presence of ATP.
  • the glycosyltransferase activity measurement method of the present invention comprises: GDP or UDP generated by glycosyltransferase reaction is reacted with NDP kinase in the presence of ATP, or CMP generated by glycosyltransferase reaction is reacted with NMP kinase or CMP kinase in the presence of ATP, thereby generating GDP, UDP, or CMP.
  • the glycosyltransferase to be measured can be any animal or plant-derived, microorganism-derived, living organism-derived, or prepared by gene recombination techniques, but is preferably purified.
  • the glycosyltransferase to be measured consists of fucosyltransferase, mannosyltransferase, glucosyltransferase, galactosyltransferase, glucuronosyltransferase, xylosyltransferase, N-acetylglucosaminyltransferase, N-acetylgalactosaminyltransferase, and sialyltransferase At least one selected from the group is preferred.
  • NDP kinase, CMP kinase, ADP-dependent hexokinase, G-6-P dehydrogenase and diaphorase used in the first and second steps are of animal or plant origin, microbial origin, or prepared by gene recombination technology Any of these can be used, but purified ones are preferred.
  • First step When the nucleotide generated from the sugar donor molecule in the transglycosylation reaction is GDP or UDP, NDP kinase is allowed to act on the reaction solution after the transglycosylation reaction in the presence of ATP to generate GDP or UDP, respectively GTP, or While converting to UTP, ADP is quantitatively produced.
  • the nucleotide generated from the sugar donor molecule in the transglycosylation reaction is CMP
  • CMP kinase is allowed to act on the reaction solution after the transglycosylation reaction in the presence of ATP to convert CMP into CDP and quantitatively produce ADP.
  • Second step Fluorescence development of fluorescent resorufin by the enzyme coupling reaction using glucose, ADP-dependent hexokinase, G-6-P dehydrogenase, diaphorase, NADP or NAD, and resazurin This is quantified by fluorescence.
  • the glycosyltransferase for measuring the enzyme activity is carried out by mixing a glycosyltransferase, a sugar donor molecule, and a sugar acceptor molecule in a buffer solution.
  • the glycosyltransferase is preferably added at a concentration that results in an enzyme reaction rate of about 1 to 50%
  • the sugar donor molecule is preferably added at 10 to 500 ⁇ M
  • the sugar acceptor molecule is added at 10 to 5000 ⁇ M. It is preferable.
  • Examples of the buffer used for the transglycosylation reaction include Good buffer such as Tris-hydrochloric acid buffer and HEPES buffer, and phosphate buffer.
  • the buffer concentration is preferably 10 to 200 mM, and the pH is preferably 6 to 9.
  • salts such as 10 to 200 mM NaCl, 10 to 200 mM KCl, 5 to 40 mM NaF, 1 to 40 mM MgCl 2 , 1 to 20 mM MnCl 2 , 1 to 20 mM CaCl 2 , 100 to 500 ⁇ M Na 3 VO 4 , 0.01 ⁇ 1% of a surfactant such as Triton X-100 and 0.01 to 1% of a protein such as albumin may be added.
  • a surfactant such as Triton X-100 and 0.01 to 1% of a protein such as albumin
  • the reaction temperature is preferably 20 to 37 ° C., and the reaction time is preferably 10 minutes to 3 hours.
  • the free nucleotide concentration in the reaction solution after the transglycosylation reaction is preferably in the range of 0.1 to 100 ⁇ M, more preferably in the range of 0.5 to 50 ⁇ M. In the case of a reaction solution having a concentration higher than 100 ⁇ M, it is preferable to dilute it so that it falls within this range.
  • NDP kinase is an enzyme that phosphorylates GDP or UDP to convert to GTP or UTP, respectively, and generates ADP in an equimolar amount with GTP or UTP in the presence of ATP.
  • CMP kinase is an enzyme that phosphorylates CMP to convert it into CDP in the presence of ATP and generates ADP in an equimolar amount with CDP.
  • any enzyme that phosphorylates CMP in the presence of ATP to convert it into CDP and generates an equimolar amount of ADP with CDP can be used as CMP kinase.
  • NMP kinase nucleoside 5′- An enzyme referred to as “monophosphate kinase” also has the enzyme activity and can be used as CMP kinase.
  • ATP and NDP kinase or CMP kinase added in the first step may be added alone or as a mixed solution. In any case, it is preferable to add ATP so that its concentration is at least twice the molar concentration and within about 1 mM of the free nucleotide present in the transglycosylation reaction solution.
  • NDP kinase or CMP kinase is preferably added in an amount of 0.2 to 20 ⁇ g / ml.
  • the buffer used for the addition include Tris-hydrochloric acid buffer, Good buffer such as HEPES buffer, and phosphate buffer.
  • the buffer concentration is preferably 10 to 200 mM, and the pH is preferably 7 to 9.
  • salts such as 10 to 200 mM NaCl, 10 to 200 mM KCl, 5 to 40 mM NaF, 1 to 40 mM MgCl 2 , 1 to 20 mM CaCl 2 , 100 to 500 ⁇ M Na 3 VO 4 , 0.01 to 1% Triton X- A surfactant such as 100 or a protein such as albumin such as 0.01 to 1% may be added.
  • the reaction temperature is preferably 20 to 37 ° C., and the reaction time is preferably 10 minutes to 3 hours.
  • the enzyme activity of CMP kinase is increased by the addition of a reducing agent, when CMP kinase is used in the first step, it is preferable to add the reducing agent at the same time to generate ADP in the presence of the reducing agent.
  • the kinase to be measured has a reducing agent requirement, it serves as an activator (activator) for increasing the enzyme activity (activation / activation) or the compound at the time of screening.
  • a reducing agent as a stabilizer for reagents such as enzymes and react.
  • dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol or TCEP is preferred.
  • the addition amount is preferably 1 ⁇ M to 5 mM, more preferably 0.1 to 5 mM.
  • glucose, ADP-dependent hexokinase, G-6-P dehydrogenase, diaphorase, NADP, and resazurin are added to the reaction solution obtained in the first step to cause an enzyme coupling reaction, so that ADP is resorufin.
  • an enzyme coupling reaction so that ADP is resorufin.
  • Glucose, ADP-dependent hexokinase, G-6-P dehydrogenase, diaphorase, NADP or NAD, and resazurin which are used in the enzyme coupling reaction for quantifying ADP, can be added alone, but they are mixed in advance. In addition (hereinafter referred to as the second step mixture), it can be added at once.
  • the concentration of each component after addition was 0.1 to 10 mM for glucose, 5 to 500 ⁇ g / ml for ADP-dependent hexokinase, 1 to 100 ⁇ g / ml for G-6-P dehydrogenase, and 0.2 to 20 ⁇ g / ml for diaphorase.
  • the NADP is preferably 10 to 500 ⁇ M and the resazurin is preferably 5 to 250 ⁇ M.
  • the concentration of the SH reagent is usually preferably 1 ⁇ M to 100 mM, and an amount equivalent to the reducing agent present in the enzyme coupling mixture or an amount up to about 20 times that is suitable.
  • the buffer to be used examples include Tris-hydrochloric acid buffer, Good buffer such as HEPES buffer, and phosphate buffer.
  • the buffer concentration is preferably 10 to 200 mM, and the pH is preferably 7 to 9.
  • salts such as 10 to 200 mM NaCl, 10 to 200 mM KCl, 5 to 40 mM NaF, 1 to 40 mM MgCl 2 , 1 to 20 mM CaCl 2 , 100 to 500 ⁇ M Na 3 VO 4 , 0.01 to 1% Triton X- A surfactant such as 100 or a protein such as albumin such as 0.01 to 1% may be added.
  • the reaction temperature of the enzyme coupling reaction in the second step is preferably 20 to 37 ° C., and the reaction time is preferably 10 minutes to 3 hours.
  • the reducing agent when the step 2-3 is performed in the presence of the reducing agent dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol or TCEP is preferable.
  • the reducing agent is preferably added so as to be 1 ⁇ M to 5 mM.
  • SH reagent is a reagent that reacts with a thiol group, and is a compound used for quantification and chemical modification of cysteine residues in proteins.
  • the SH reagent used in the present invention may be any as long as it has reactivity with a reducing agent in the vicinity of a neutral pH range and does not affect the activity of the enzyme used in the enzyme coupling reaction.
  • examples include ⁇ -halocarbonyl compounds such as iodoacetamide, maleimide derivatives such as N-ethylmaleimide, allylsulfonic acid derivatives such as methylvinylsulfone, and the like.
  • ⁇ -halocarbonyl compounds such as iodoacetamide, N- Maleimide derivatives such as ethylmaleimide are preferred.
  • the SH reagent used in the present invention is preferably a maleimide compound represented by the above general formula [1] or 2-iodoacetamide.
  • the amount to be added to the enzyme coupling reaction in the second step is preferably an amount equivalent to the reducing agent used in the reaction in the first step or an amount up to about 20 times the amount.
  • the reaction in the first step and the second step can be performed simultaneously. What can be done simultaneously is when measuring GDP or UDP. When measuring CMP, it is necessary to add a reducing agent and inactivate it, so it is not preferable to perform the first step and the second step simultaneously.
  • ⁇ Screening method for enzyme activity regulator> In order to screen for an ADP-producing enzyme activity regulator such as glycosyltransferase or kinase using the enzyme activity measurement method of the present invention described above, a test compound is preferably added to each well using a microplate. In the presence of the test compound and in the absence of the control group, the reaction of an ADP-producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase is performed, and then the enzyme coupling reaction is performed as described above to measure fluorescence. The activity of an ADP producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase is quantified.
  • the activity-regulating action of the test compound on the ADP-producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase can be determined. Also, know whether the test compound affected the enzyme coupling reaction by allowing only the enzyme coupling reaction to be performed in the presence of the test compound without performing the reaction of an ADP-producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase. It is possible to confirm whether the activity of the test compound acts on an ADP-producing enzyme such as glycosyltransferase or kinase.
  • the fluorescence generated by the enzyme coupling reaction according to the present invention has an excitation wavelength of around 540 nm and a fluorescence wavelength of around 590 nm, in the case of such a wavelength range, it is difficult to be affected by ultraviolet / visible region absorption or autofluorescence of the test compound. There are advantages.
  • a screening method for a glycosyltransferase activity regulator which is an embodiment of a method for screening an enzyme activity regulator,
  • a glycosyltransferase reaction step of conducting a glycosyltransferase reaction in the presence or absence of a test compound By reacting GDP or UDP produced by the glycosyltransferase reaction with NDP kinase in the presence of ATP, or by reacting CMP produced by the glycosyltransferase reaction with CMP kinase in the presence of ATP, GDP, UDP, or CMP A first step of generating ADP according to the amount;
  • the first step is to react CMP produced by a glycosyltransferase reaction with CMP kinase in the presence of ATP and a reducing agent.
  • it is a step of generating ADP according to the amount of GDP, UDP, or CMP
  • the second step is preferably a step of quantifying with fluorescence by an enzyme coupling reaction in the presence of an SH reagent.
  • a screening method for a glycosyltransferase activity regulator which is an embodiment of a screening method for an enzyme activity regulator, is that the glycosyltransferase is fucosyltransferase, mannosyltransferase, glucosyltransferase, galactosyltransferase, glucuronosyltransferase, xylosyltransferase.
  • N-acetylglucosaminyltransferase, N-acetylgalactosaminyltransferase, and sialyltransferase are preferred.
  • An embodiment of a screening method for an enzyme activity regulator is a screening method for an enzyme activity regulator that produces ADP.
  • ADP generated by an enzymatic reaction that generates ADP is measured by fluorescence of resorufin generated by the action of glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, diaphorase, NADP, and resazurin in the presence of an SH reagent,
  • the activity-regulating action of the test compound on the enzyme that produces ADP is determined by comparing the activity depending on the presence or absence of the test compound.
  • One embodiment of the method for screening an enzyme activity regulator is a method for screening an enzyme activity regulator that produces ADP, wherein the enzyme producing ADP is a kinase, ATPase, nitrogenase, tetrahydrofolate synthase, acetyl-CoA carboxylase , Pyruvate carboxylase, and glutathione synthase.
  • the enzyme producing ADP is a kinase, ATPase, nitrogenase, tetrahydrofolate synthase, acetyl-CoA carboxylase , Pyruvate carboxylase, and glutathione synthase.
  • the SH reagent is preferably N-ethylmaleimide or iodoacetamide.
  • the present invention provides a kit for measuring ADP comprising glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, diaphorase, NAD and / or NADP, resazurin and SH reagent.
  • the ADP measurement kit of the present invention ADP in a sample can be easily measured.
  • the ADP measurement kit may contain a reducing agent.
  • Examples of the reducing agent used in the ADP measurement method of the present invention in the presence of the reducing agent include dithiothreitol (DTT) and 2-mercaptoethanol. Or TCEP is preferred.
  • the present invention provides a kit for measuring the activity of an enzyme that produces ADP containing glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, diaphorase, NAD and / or NADP, resazurin and SH reagent.
  • the SH reagent contained in the enzyme activity measurement kit for producing ADP of the present invention is the same as that described in the enzyme activity measurement method for producing ADP, description thereof is omitted.
  • the enzyme activity measuring kit for producing ADP of the present invention the activity of the enzyme for producing ADP can be easily measured.
  • the enzyme activity measurement kit for producing ADP may contain a reducing agent.
  • a reducing agent As the reducing agent in the method for measuring the activity of the enzyme for producing ADP in the presence of a reducing agent, Threitol (DTT), 2-mercaptoethanol or TCEP is preferred.
  • the present invention comprises a first solution containing ATP and NMP kinase, NDP kinase or CMP kinase, glucose, ADP-dependent hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, diaphorase, NAD and / or NADP, resazurin, and SH reagent. And a second liquid containing the transferase activity measurement kit.
  • the first solution preferably further contains a reducing agent.
  • a reducing agent for example, since the enzyme activity of certain enzymes such as CMP kinase is increased by the addition of a reducing agent, the enzyme activity of CMP kinase can be increased by the first liquid further containing a reducing agent.
  • the transferase activity measurement kit of the present invention contains the SH reagent in the second liquid, the reducing agent can be inactivated, the reduction from resazurin to resorufin can be suppressed, and the fluorescence can be suppressed. The rise of the background can be suppressed.
  • the SH reagent contained in the glycosyltransferase activity measurement kit of the present invention includes the same reagent as that described in the glycosyltransferase activity measurement method, the description thereof is omitted.
  • the activity of glycosyltransferase can be easily measured.
  • Example 1 Calibration curves for GDP and UDP using the method of the present invention
  • a calibration curve for GDP and UDP was prepared using the reactions of the first step and the second step according to the present invention.
  • Materials include GDP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 078-04741), UDP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 212-00861), ATP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 18-16911), NDP kinase derived from baker's yeast (Sigma-Aldrich catalog number N0379), glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a calibration curve for CMP using the method of the present invention A calibration curve for CMP was prepared using the reactions of the first step and the second step according to the present invention.
  • materials CMP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 034-05361), CMP kinase (human CMPK1, Prospec, catalog number PKA-002), DTT (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 040-29223), N-ethylmaleimide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 054-02061) was used.
  • CMP was dissolved in buffer F (100 mM Tris-HCl (pH 9), 13.5 mM MgCl 2 , 150 mM KCl, 0.1% Triton X-100) to prepare a 0-40 ⁇ M solution.
  • the enzyme coupling mixture was prepared with the following composition. Since CMP kinase has a reducing agent requirement, DTT was used as the reducing agent in the first step, and N-ethylmaleimide was used as the SH reagent in the second step for inactivation.
  • Liquid mixture E for the second step Glucose 2 mM ADP-dependent hexokinase 2 U / ml (38 ⁇ g / ml)
  • Example 2 With the same operation as in Example 1, the CMP solution was subjected to the reaction in the first step and the second step using the above mixed solution, and fluorescence measurement was performed to obtain a calibration curve for CMP. The results are shown in FIG. The fluorescence intensity corresponding to the CMP concentration was observed, and it was confirmed that CMP can be quantified by the method of the present invention.
  • Example 3 Time-dependent change in fluorescence development Using 40 ⁇ M GDP or UDP, the reaction was carried out in the same manner as in Example 1, and then the plate was taken out with the passage of time only in the second step to measure fluorescence. Further, the reaction was performed in the same manner as in Example 2 using 40 ⁇ M CMP, and the plate was taken out with time only during the reaction in the second step, and fluorescence measurement was performed. The results are shown in FIG. Thus, in the case of quantifying GDP or UDP, the reaction in the second step is completed within 25 minutes, and thereafter the fluorescence value is kept stable until at least 120 minutes. In the case of quantifying CDP, the reaction in the second step.
  • Example 4 Measurement of glycosyltransferase activity (1) The activity of fucosyltransferase as a glycosyltransferase was measured by the method of the present invention. Human FUT7 (R & D Systems catalog number 6409-GT) was used as the fucosyltransferase, and GDP-fucose (Yamasa Shoyu catalog number 7229) and fetuin (derived from fetal bovine serum, catalog number F3004 from Sigma-Aldrich) were used as substrates.
  • Human FUT7 R & D Systems catalog number 6409-GT
  • GDP-fucose Yamasa Shoyu catalog number 7229
  • fetuin derived from fetal bovine serum, catalog number F3004 from Sigma-Aldrich
  • Example 5 Measurement of glycosyltransferase activity (2) The activity of galactosyltransferase as a glycosyltransferase was measured by the method of the present invention. Human B4GalT1 (R & D Systems catalog number 3609-GT) as galactosyltransferase, UDP-galactose (MP Biomedicals catalog number 195905) and N-acetyl-D-glucosamine (catalog number 013-112181) as substrates Using.
  • Human B4GalT1 R & D Systems catalog number 3609-GT
  • UDP-galactose MP Biomedicals catalog number 195905
  • N-acetyl-D-glucosamine catalog number 013-112181
  • Example 6 Measurement of glycosyltransferase activity (3) The activity of sialyltransferase as a glycosyltransferase was measured by the method of the present invention.
  • Human ST6Gal1 R & D Systems catalog number 5924-GT
  • CMP-sialic acid Calbiochem catalog number 233264
  • N-acetyl-D-lactosamine Sigma Aldrich catalog number A7791
  • Example 7 Measurement of glycosyltransferase inhibitory activity The enzyme inhibitory activity of gallic acid against human FUT7 was measured by the method of the present invention.
  • Gallic acid is a compound with reported inhibitory activity against human FUT7 (see Arch. Biochem. Biophys., Vol. 425, No. 1, pp. 51-57, 2004).
  • the reaction of FUT7 concentration in the transglycosylation reaction solution of 1 ⁇ g / ml
  • the inhibitory effect of gallic acid on FUT7 was examined.
  • the inhibition rate of each concentration of gallic acid with respect to FUT7 was calculated with the group containing no gallic acid as the inhibition rate 0% control and the group not containing FUT7 as the inhibition rate 100% control.
  • the same operation was performed using 50 ⁇ M GDP instead of 100 ⁇ M GDP-fucose, and the influence of gallic acid on the enzyme coupling itself was examined.
  • a part of the reaction solution after the FUT7 enzyme reaction was used to quantify the amount of GDP produced by HPLC analysis, and the inhibitory activity by the HPLC method was also determined.
  • HPLC conditions were as follows: Column: YMC-Triart C18 (manufactured by YMC, granule system 5 ⁇ m, diameter 4.6 mm ⁇ length 150 mm), eluent: 50 mM KH 2 PO 4 -K 2 HPO 4 (10: 1), Flow rate: 1 ml / min, detection: UV 260 nm.
  • the measurement results are shown in FIG. It was found that the inhibitory activity of gallic acid measured by the method of the present invention coincided with the inhibitory activity measured by HPLC (IC50 value of about 10 ⁇ M). Furthermore, gallic acid did not inhibit the enzyme coupling reaction itself, and it was confirmed that the inhibitory activity measured by enzyme coupling was due to the inhibition of FUT7. Arch. Biochem.
  • Glycosyltransferase activity measurement kit (1) An activity measurement kit for fucosyltransferase, mannosyltransferase, glucosyltransferase, galactosyltransferase, glucuronosyltransferase, xylosyltransferase, N-acetylglucosaminyltransferase, or N-acetylgalactosaminyltransferase was prepared with the following composition.
  • First step mixture ATP 200 ⁇ M NDP kinase 2 ⁇ g / ml Buffer composition 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2
  • Glycosyltransferase activity measurement kit (2) An activity measurement kit for sialyltransferase was prepared with the following composition.
  • First step mixture ATP 200 ⁇ M CMPK1 3 ⁇ g / ml DTT 4mM Buffer composition 100 mM Tris-HCl (pH 9), 13.5 mM MgCl 2 , 150 mM KCl, 0.1% Triton X-100
  • ADP calibration curve ADP (Oriental Yeast Industry Catalog No. 45120,000) by the method of the present invention was dissolved in buffer C (100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 ) to prepare a 0 to 37.5 ⁇ M solution. did.
  • the enzyme coupling mixture was prepared with the following composition. When N-ethylmaleimide was added, 20 mM was added to the enzyme coupling mixture.
  • Enzyme coupling mixture composition D-glucose 2 mM ADP-dependent hexokinase 2 U / ml (38 ⁇ g / ml) G-6-P dehydrogenase 2 U / ml (2.6 ⁇ g / ml) Diaphorase 2 U / ml (1.1 ⁇ g / ml) NADP 200 ⁇ M Resazurin 100 ⁇ M N-ethylmaleimide 20 mM or additive-free buffer composition C
  • Example 11 Examination of stability of fluorescent color development by enzyme coupling of ADP The reaction was carried out in the same manner as in Example 10 using 25 ⁇ M ADP. However, during the enzyme coupling reaction, the microplate was taken out over time and fluorescence measurement was performed. The results are shown in FIG. From this, it was found that the enzyme coupling reaction for ADP determination was completed in 10 to 20 minutes, and the fluorescence value was stable for 2 hours thereafter.
  • Example 12 Calibration curve of ADP in the presence of reducing agent DTT A calibration curve of ADP in the presence of DTT was measured in the same manner as in Example 10. The results are shown in FIG. The background of fluorescence increases due to the presence of DTT. However, when 20 mM N-ethylmaleimide (NEM) is mixed in advance with the enzyme coupling mixture, the increase in background is suppressed and the quantitativeness of ADP is improved.
  • NEM N-ethylmaleimide
  • Example 13 Calibration curve of ADP in the presence of iodoacetamide
  • the calibration curve of ADP was measured in the same manner as in Example 12 except that 8 mM iodoacetamide (IAA) was used instead of 20 mM N-ethylmaleimide. .
  • the results are shown in FIG.
  • the S / B ratio was 3.7 when 2 mM DTT was present, but it was improved approximately 5 times to 18.6 when 8 mM iodoacetamide was used. From this, it was confirmed that the specificity of the measurement was improved by mixing iodoacetamide in advance with the enzyme coupling mixture.
  • CMPK1 CMP kinase 1, Prospec catalog number pKa-002-b
  • CMPK1 DTT dependency of CMPK1 was first examined.
  • a 1.5 ml microcentrifuge tube 10 ⁇ l of 400 ⁇ M ATP, 80 ⁇ M CMP (buffer composition is 100 mM Tris-HCl (pH 9), 13.5 mM MgCl 2 , 150 mM KCl, 0.1% Triton X-100) and 5 ⁇ l of 0 to 8 mM DTT aqueous solution and 5 ⁇ l of 4 ⁇ g / ml CMPK1 (buffer composition: 100 mM Tris-HCl (pH 9), 13.5 mM MgCl 2 , 150 mM KCL, 0.1% Triton X-100) were added and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • CMPK1 enzyme activity of CMPK1 in the presence of DTT was measured by the method of the present invention.
  • FIG. 14 shows the measurement result of the S / B ratio when the CMPK1 concentration is 3 ⁇ g / ml.
  • the S / B ratio was 3-4, whereas when assayed in the presence of N-ethylmaleimide, the S / B ratio was 13-14.
  • FIG. 15 shows the concentration-dependent quantification result of CMPK1 in the presence of N-ethylmaleimide at a fluorescence measurement time of 60 minutes. Kinase activity according to the CMPK1 enzyme concentration was confirmed.
  • kinase activity measurement kit A kinase activity measurement kit was prepared with the following composition.
  • kinase activity measurement kit composition D-glucose 2 mM ADP-dependent hexokinase 2 U / ml (38 ⁇ g / ml) G-6-P dehydrogenase 2 U / ml (2.6 ⁇ g / ml) Diaphorase 2 U / ml (1.1 ⁇ g / ml) NADP 200 ⁇ M Resazurin 100 ⁇ M N-ethylmaleimide 20 mM Buffer composition 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2
  • Example 17 Measurement of ATPase activity ATPase activity contaminating commercially available kinases was measured by the method of the present invention.
  • Example 18 Screening for Glycosyltransferase (Galactosyltransferase) Inhibitors
  • a LOPAC1280 (trademark) library made by Sigma-Aldrich made up of 1280 kinds of known physiologically active substances was used as a compound library.
  • each compound (dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 1 mM) in the LOPAC1280 TM library was dissolved in 320 compounds per plate, using a micro dispenser (Echo 555 manufactured by Labcyte), 50 nl. Dispensed one by one.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • control wells with a reaction rate of 0% were wells to which 20 ⁇ M UDP was not added.
  • the inhibition rate was calculated according to the following equation, with the fluorescence quantification value of the control wells having a reaction rate of 100% and 0% and the fluorescence quantification value of the well containing the library compound as a, b and c, respectively.
  • FIGS. 18A to 18C The measurement results of 1280 library compounds are shown in FIGS. 18A to 18C.
  • 24 compounds showed an inhibition rate of 50% or more (FIG. 18A).
  • the number of compounds inhibited by 50% or more was 10 (FIG. 18B).
  • the net inhibition rate of the B4GalT1 response can be estimated.
  • the number of compounds whose difference was 50% or more was 12 (FIG. 18C).
  • 12 compounds that inhibit human galactosyltransferase B4GalT1 can be obtained from the LOPAC1280 TM library, indicating that the present invention is useful as a high-throughput screening method.
  • the well unit price in the conventional screening method is about 100 yen per well, whereas the well unit price in the screening method of the present invention is as low as 2 to 8 yen per well. Therefore, it was confirmed that the screening method of the present invention is very excellent in terms of cost.
  • Example 19 Determination of ADP in the presence of maleimides or iodoacetamide ADP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 019-25091) was dissolved in pure water to a concentration of 10 mM, and 5 M sodium hydroxide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) A pH 7 ADP solution was prepared according to catalog number 196-05375). DTT (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 040-29223) was prepared with pure water to a concentration of 1M to prepare a DTT solution.
  • a 10 mM ADP solution, a 10 mM ATP solution (Promega V915B), and a 1M DTT solution were diluted with buffer solution 1 (40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM MgCl 2 , 0.01% BSA) and described in Table 1 below. Solutions 1 to 6 having the following composition were prepared.
  • maleimide (Wako Pure Chemical Industries, Catalog No. 133-13111), N-ethylmaleimide (Wako Pure Chemical Industries, Catalog No. 058-02061), and iodoacetamide (IAA) (Wako Pure Chemical Industries, Catalog No. 095) -02151) were prepared in dimethyl sulfoxide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. catalog number 041-29351) at a concentration of 800 mM, respectively.
  • N- (2-sulfoethyl) maleimide (Catalog No. SC-207907 from Santa Cruz) was prepared in pure water at a concentration of 250 mM.
  • the liquid mixture for enzyme coupling was prepared so that it might become the composition of following Table 2, respectively.
  • SH reagent was used in the enzyme coupling mixture, each was added to 40 mM.
  • Example 20 Determination of ADP in the presence of the reducing agent DTT, 2-mercaptoethanol, or TCEP
  • DTT reducing agent
  • 2-mercaptoethanol reducing agent
  • TCEP TCEP
  • ADP, ATP, and each reducing agent are dissolved in a buffer solution (40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM MgCl 2 , 0.01% BSA), and each reducing agent 6 mM, ADP 0 ⁇ M or 20 ⁇ M solution (ADP 0 ⁇ M and ATP 100 ⁇ M, or ADP 20 ⁇ M and ATP 80 ⁇ M) were prepared.
  • the mixture solution for enzyme coupling was the same as in Example 19, and maleimides (maleimide, N-ethylmaleimide) or IAA was added at a concentration of 40 mM.
  • the present invention can measure with high sensitivity the fluorescence intensity or absorbance produced by the reduction of resazurin to resorufin, it can be widely used in the fields of chemistry, medicine, biochemistry, and the like.

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Abstract

本発明の蛍光又は吸光度の検出方法は、ＳＨ試薬及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定することを特徴とする。本発明のＡＤＰの測定方法は、グルコースに、ＡＤＰおよびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる第２－１工程と、前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させる第２－２工程と、ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、を有することを特徴とする。

Description

蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ＡＤＰの測定方法、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法、及び糖転移酵素の活性測定方法
　本発明は、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ＡＤＰの測定方法、キナーゼ等のＡＤＰ産生酵素又は糖転移酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法、それを用いた糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性調節剤のスクリーニング方法、及びそれらのための測定キットに関する。
　本願は、２０１３年１１月２１日に、日本に出願された特願２０１３－２４０９２６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　糖転移酵素はグリコシル基を含む供与体（Ｇ）から受容体（Ａ）にグリコシル基を転移してＧ－Ａをつくる反応を触媒する酵素の総称である（非特許文献１）。動物では９種類の糖ヌクレオチド（ＧＤＰ－フコ-ス、ＧＤＰ－マンノース、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルクロン酸、ＵＤＰ－キシロース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ－シアル酸）が主な供与体分子である（非特許文献２）。
これら供与体分子からグリコシル基を転移させる糖転移酵素はそれぞれフコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼと呼ばれている。
　ＧＤＰはグアノシン５’－ニリン酸、ＵＤＰはウリジン５’－ニリン酸、ＣＭＰはシチジン５’－一リン酸の略である。受容体分子としては単糖、オリゴ糖、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質等が挙げられる。
　生体分子の機能発現に糖鎖が重要な役割を果たしていることが知られており、糖転移酵素の活性異常は、がん、感染症、免疫疾患、炎症、神経疾患などの疾患と関連することが明らかにされている（非特許文献３）。従って、糖転移酵素の活性調節剤（阻害剤又は活性化剤）はこれらの疾患の新たな治療薬となることが期待される。
　糖転移酵素の活性調節剤を探索するには糖転移酵素の活性を測定することが必要である。糖転移酵素の活性を測定する方法としては従来、放射性標識や蛍光標識した糖分子を用いてアッセイする方法や、非標識糖分子を用いて反応後にＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析機）等の機器分析により分離定量する方法等が用いられてきた（非特許文献４）。
しかしながら、これらの方法は標識糖供与体の化学合成が必要であったり、測定に特殊な装置（液体シンチレーターやＬＣ－ＭＳ）が必要であったりと、簡便にアッセイすることが難しく、殊にマイクロプレートを用いて大量の数のアッセイ（ハイスループットスクリーニング）を行うことは難しかった。
また費用的にもコストのかかる方法であった。
一方、糖転移酵素反応で生成したヌクレオチドを市販のアッセイキット（Ｂｅｌｌｂｒｏｏｋ　Ｌａｂｓ社製Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＧＤＰ　Ａｓｓａｙ、同ＵＤＰ２　Ａｓｓａｙ、同ＡＭＰ２／ＧＭＰ２　Ａｓｓａｙ）を用いて蛍光偏光法で定量する方法や、酵素カップリング反応によりＮＡＤＨの吸光度に導いて測定する方法（非特許文献５、６）、又はリン酸を遊離させてマラカイトグリーンの発色で定量する方法（非特許文献７）が知られているが、いずれも検出感度は低い。
また、酵素カップリングによりルシフェラーゼの化学発光に誘導して測定する方法も知られているが（特許文献１）、操作が煩雑であり感度は不明である。
また最近、蛍光標識された糖の転移を、蛍光偏光法を用いて高速にアッセイする方法も報告されたが（非特許文献８）、高分子性の基質にしか用いることはできず、全ての糖転移酵素に応用できる訳ではない。
このように、マイクロプレートを用いてあらゆる糖転移酵素を簡便かつ高感度にアッセイすることは従来の方法では難しく、糖転移酵素活性調節剤のハイスループットスクリーニングは困難なものであった。
一方、キナーゼは、ＡＴＰ（アデノシン５’－三リン酸）などヌクレオシド三リン酸の末端リン酸基を水以外の化合物に転移し、リン酸化合物を生ずる反応を触媒する酵素の総称であり、ＥＣ２．７群のホスホトランスフェラーゼに分類される（非特許文献９）。リン酸化を受ける基質分子としては、糖、有機酸、脂質、タンパク質などが挙げられる。キナーゼは生体内のシグナル伝達に関わる重要な酵素分子でもある。ある種のがん細胞ではキナーゼ活性が亢進していることが知られ、キナーゼの阻害剤はいわゆる分子標的薬としてがんの治療に用いられている。また、キナーゼは炎症や免疫反応、糖尿病などにも関わっていることが知られている。
従ってキナーゼは、がん、炎症、自己免疫疾患、糖尿病等の疾患に対する治療薬開発の恰好の標的分子であり、その新た阻害剤の探索研究が広く行われている（非特許文献１０）。
キナーゼ活性調節剤（阻害剤又は活性化剤）を探索するには、キナーゼの活性を測定することが必要である。キナーゼ活性の測定方法としては、リン酸化された生成物を定量する方法、ＡＴＰの減少量を測定する方法、ＡＴＰから生じたＡＤＰ（アデノシン５’－ニリン酸）を定量する方法、が主な方法として挙げられる。
リン酸化された生成物を定量する方法としては、放射性ＡＴＰから生じる放射性生成物を放射能カウントで測定する方法、リン酸化された生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量する方法、リン酸化された生成物を抗体で検出し時間分解蛍光法等により分光学的に定量する方法（例えば、カルナバイオサイエンス社製ＱＳＳ　Ａｓｓｉｓｔ（商標）ＴＲ－ＦＲＥＴ　アッセイキット）等が挙げられる。
ＡＴＰの減少量を測定する方法としては、キナーゼ反応液中の残存ＡＴＰ量を、ルシフェラーゼを用いて化学発光で定量する方法（例えば、東洋ビーネット社製『細胞の』ＡＴＰ 測定試薬（商標）が挙げられる。
ＡＴＰから生じたＡＤＰを定量する方法としては、１）ＡＴＰに再変換してルシフェラーゼと反応させ化学発光で定量する方法（例えば、プロメガ社製ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｎａｓｅ　Ａｓｓａｙ）、２）抗ＡＤＰ抗体を用いて時間分解蛍光法または蛍光偏光法により分光学的に定量する方法（例えば、ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ Ｌａｂｓ社製Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標） ＡＤＰ　ＴＲ－ＦＲＥＴ　Ａｓｓａｙ、同Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＤＰ　Ａｓｓａｙ）、３）ＡＤＰにホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生じる過酸化水素にさらに１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジンとパーオキシダーゼを作用させて蛍光測定する方法（例えば、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社製ＡＤＰ　Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ＨＳ　Ａｓｓａｙ）、４）ＡＤＰにグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ）を作用させてＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を生成させてＮＡＤＰＨの吸光度または蛍光で定量する方法（特許文献２～３）、５）ＡＤＰにグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ、ジアホラーゼ、レサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で定量する方法（特許文献４）が挙げられる。
特開２００５－４６０２９号公報 特開平９－２３４０９８号公報 特開２０１１－１０３８２５号公報 米国第特許７３３８７７５号公報明細書
生化学辞典　第４版、p.931、東京化学同人、2007年 Essentials of Glycobiology、2nd edition、Part I、Chapter 4、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2009年（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1929/） 「きちんとわかる糖鎖工学」、産業技術総合研究所、白日社、2008年 ChemBioChem、Vol.11、No.14、pp.1939-1949、2010年 Anal. Biochem.、Vol.102、No.2、pp.441-449、1980年 Anal. Biochem.、Vol.220、No.1、pp.441-449、1994年 Glycobiology、Vol.21、No.6、pp.727-733、2011年 Angew. Chem. Int. Ed. Vol.50、No.52、pp.12534-12537、2011年 生化学辞典　第４版、p.340、東京化学同人、2007年 「分子標的薬開発への新たなる挑戦　有力な分子標的薬の創薬物語と新薬開発動向から次世代創薬テクノロジーまで」、岡野栄之、岩坪 威、佐谷秀行編、実験医学増刊、Vol.27、No.5、羊土社、2009年
このようにキナーゼの活性を測定する方法として各種の方法が知られているが、操作が煩雑である、特別の装置・施設が必要である、試薬が高価である、感度が十分でない等の理由により、大量のスクリーニングサンプルをアッセイするハイスループットスクリーニングに用いるには難点があった。
また、前記４）のＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼを用いて酵素カップリングによりＮＡＤＰＨに導いてＮＡＤＰＨの吸光度または蛍光で定量する方法は、検出感度が低いことに加え、スクリーニングサンプル化合物に由来する３４０ｎｍ波長付近の紫外・可視部吸収や自家蛍光が測定値に影響を与えるため正確な測定が行えないという問題があった。
また、前記５）のＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ、ジアホラーゼ、レサズリンを作用させて生成物レゾルフィンの蛍光で測定する方法の場合、反応液中にジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤が含まれると、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで蛍光のバックグランドが上昇するため正確な測定が行えなくなるという問題があった。
還元剤は、化合物の非特異的吸着を抑えるためや、酵素などの試薬の安定化剤としてなど、反応系に加えられる場合が少なくない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ＡＤＰの測定方法、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法、標的酵素の活性を簡便かつ高感度に測定することができる、糖転移酵素の活性測定方法、ＡＤＰの測定用キット、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット、及び糖転移酵素活性測定キットを提供する。
本発明者らはレサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定する方法を種々検討した結果、ＳＨ試薬及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱水素酵素）によりレサズリンをレゾルフィンへと還元することにより生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定可能となることを見出した。
また、本発明者らは糖転移酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法を種々検討した結果、糖転移酵素により生成するＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼ（ヌクレオシド５’－二リン酸キナーゼ）又はＣＭＰキナーゼ（シトシン５’－一リン酸キナーゼ）と反応させることでＡＤＰを生成させ、このＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ）、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを用いた酵素カップリングを行わせることにより、ほぼ全ての糖転移酵素の活性を簡便、高感度かつ定量的にマイクロプレートで、蛍光で定量することが可能であること、ＡＤＰをこの酵素カップリングにより蛍光定量する方法において反応液中にＤＴＴ等の還元剤が存在すると蛍光発色のバックグランドが高くなってＡＤＰの正確な定量が困難となるが、酵素カップリング反応の反応液中にＳＨ試薬を共存させるとバックグランドが下がる一方、ＡＤＰの酵素カップリング反応自体には影響しないのでＡＤＰを精度よく測定できること、このＳＨ試薬存在下のＡＤＰ蛍光定量法は広範なキナーゼの活性定量に用いることができること、を見出した。
本発明は、かかる発見に基づきさらに検討を重ねて、蛍光又は吸光度の検出方法、糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の簡便かつ高感度な活性測定方法として完成したものである。
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ＡＤＰの測定方法、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法、糖転移酵素の活性測定方法、ＡＤＰの測定用キット、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット、糖転移酵素の活性測定キットを提供する。
（１）ＳＨ試薬及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定することを特徴とする、蛍光又は吸光度の検出方法。
（２）前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである前記（１）に記載の蛍光又は吸光度の検出方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式［１］中、
　Ｒ１は水素原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数６～１０のアリール基を表す。
　Ｒ２は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。
　ｎはＲ２の数を表し、０又は１である。）
（３）還元剤の共存下に、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応をＳＨ試薬の存在下で行うことを特徴とする、バックグラウンド抑制方法。
（４）前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである前記（３）に記載のバックグラウンド抑制方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
（５）グルコースに、ＡＤＰおよびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、
　前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、
　ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、
　を有することを特徴とするＡＤＰの測定方法。
（６）　前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである前記（５）に記載のＡＤＰの測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
（７）前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである前記（５）又は（６）に記載のＡＤＰの測定方法。
（８）ＡＴＰの存在下、ＡＤＰを生成する酵素を基質に作用させてＡＴＰをＡＤＰに変換させる第１－１工程と、
　グルコースに、前記第１－１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、
　前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、
　ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、
　を有することを特徴とするＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
（９）前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである前記（８）に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
（１０）前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである前記（８）又は（９）に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
（１１）前記ＡＤＰを生成する酵素が、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である前記（８）～（１０）のいずれか一つに記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
（１２）糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＮＭＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、
　グルコースに、前記第１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、
　前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、
　ＳＨ試薬存在下、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、
　を有することを特徴とする糖転移酵素の活性測定方法。
（１３）前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである前記（１２）に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
（１４）前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである前記（１２）又は（１３）に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
（１５）前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である前記（１２）～（１４）のいずれか一つに記載の糖転移酵素の活性測定方法。
（１６）グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン及びＳＨ試薬を含むことを特徴とするＡＤＰの測定用キット。
（１７）前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである前記（１６）に記載のＡＤＰの測定用キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
（１８）前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである前記（１６）又は（１７）に記載のＡＤＰの測定用キット。
（１９）グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン並びにＳＨ試薬を含むことを特徴とするＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
（２０）前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で示されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである前記（１９）に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
（２１）前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである前記（２０）に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
（２２）ＡＴＰ及びＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ若しくはＣＭＰキナーゼを含む第１液と、
　グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン、並びにＳＨ試薬を含む第２液と、
　を含むことを特徴とする糖転移酵素の活性測定キット。
（２３）前記第１液がさらに還元剤を含む前記（２２）に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
（２４）前記ＳＨ試薬が下記一般式［１］で示されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである前記（２２）又は（２３）に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
（２５）前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである前記（２４）に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
　本発明によれば、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる。
　本発明によれば、糖転移酵素、又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法を提供することができる。
本発明は、マイクロプレートを用いるアッセイに適しているため、本発明によれば、糖転移酵素、又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性調節剤のハイスループットスクリーニングが可能となる。
本発明の方法の原理を表す反応経路である。 実施例におけるＧＤＰとＵＤＰの検量線である。 実施例におけるＣＭＰの検量線である。 実施例におけるＧＤＰ、ＵＤＰ、ＣＭＰを測定した場合の蛍光発色の安定性を示したグラフである。 実施例におけるフコシルトランスフェラーゼ（ヒトＦＵＴ７）の活性を測定した結果である。 実施例におけるガラクトシルトランスフェラーゼ（ヒトＢ４ＧａｌＴ１）の活性を測定した結果である。 実施例におけるシアリルトランスフェラーゼ（ヒトＳＴ６Ｇａｌ１）の活性を測定した結果である。 実施例における没食子酸 (ｇａｌｌｉｃ　ａｃｉｄ) のヒトＦＵＴ７に対する阻害活性を測定した結果である。ＨＰＬＣを用いて測定した場合と比較して示した。 実施例におけるＡＤＰの検量線である。酵素カップリング反応時にＮ－エチルマレイミドを存在させた場合と存在させなかった場合とを比較して示した。 実施例におけるＡＤＰを定量した場合の蛍光発色の安定性を示したグラフである。 実施例における２ｍＭ　ＤＴＴを含有させたＡＤＰ溶液の検量線である。酵素カップリング反応液にＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を存在させた場合と存在させなかった場合とを比較して示した。 ＤＴＴ含有／非含有のＡＤＰの検量線測定において、酵素カップリング反応液にヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を存在させた場合と存在させなかった場合を比較した実施例の結果である。 実施例におけるヒトＣＭＰ　ｋｉｎａｓｅ　１（ＣＭＰＫ１）の活性のＤＴＴ依存性を表す結果である。 実施例における２ｍＭ　ＤＴＴ存在下でのＣＭＰＫ１の酵素活性の測定をＮ－エチルマレイミドを存在させて酵素カップリング反応をさせた場合と存在させずに測定した場合とを比較して示した結果である。 実施例におけるヒトＣＭＰＫ１のキナーゼ活性を測定した結果である。。 実施例におけるＡｐ５Ａ（Ｐ１，Ｐ５－Ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－５'）ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ） のＣＭＰＫ１に対する阻害活性の測定結果である。ＨＰＬＣを用いて測定した場合と比較して示した。 ＨＰＬＣで市販キナーゼ（ＵＭＰキナーゼ：ＵＭＰＫ）に夾雑するＡＴＰアーゼ活性を測定した結果である。 実施例における市販キナーゼ（ＵＭＰキナーゼ：ＵＭＰＫ）に夾雑するＡＴＰアーゼ活性を測定した結果である。ＨＰＬＣで測定した結果と比較して示した。 実施例における市販化合物ライブラリー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＬＯＰＡＣ１２８０（商標））を用いてガラクトシルトランスフェラーゼ（ヒトＢ４ＧａｌＴ１）阻害剤をスクリーニングした結果である。化合物は１０μＭでアッセイした。Ｂ４ＧａｌＴ１反応に対する阻害率測定結果を図１８Ａに表した。各グラフとも横軸は１２８０個の化合物を表す。 実施例における市販化合物ライブラリー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＬＯＰＡＣ１２８０（商標））を用いてガラクトシルトランスフェラーゼ（ヒトＢ４ＧａｌＴ１）阻害剤をスクリーニングした結果である。化合物は１０μＭでアッセイした。本アッセイ系自体への阻害作用測定結果を図１８Ｂに表した。各グラフとも横軸は１２８０個の化合物を表す。 実施例における市販化合物ライブラリー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＬＯＰＡＣ１２８０（商標））を用いてガラクトシルトランスフェラーゼ（ヒトＢ４ＧａｌＴ１）阻害剤をスクリーニングした結果である。化合物は１０μＭでアッセイした。前者阻害率から後者阻害率を差し引いた正味のＢ４ＧａｌＴ１阻害活性と考えられる阻害率を図１８Ｃに表した。各グラフとも横軸は１２８０個の化合物を表す。 実施例におけるマレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの定量の結果である。 実施例におけるマレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの定量の結果である。 実施例におけるマレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの定量の結果である。 実施例における還元剤ＤＴＴ、２―メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ存在下のＡＤＰの定量の結果である。 実施例における還元剤ＤＴＴ、２―メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ存在下のＡＤＰの定量の結果である。 実施例における還元剤ＤＴＴ、２―メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ存在下のＡＤＰの定量の結果である。
以下、本発明の好ましい例を説明するが、本発明はこれら例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
＜蛍光又は吸光度の検出方法＞
　以下、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の好ましい形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明の蛍光又は吸光度の検出方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の活性測定を行う場合の反応経路である。
　図１中、第２－３工程として示すように、本発明の蛍光又は吸光度の検出方法は、ＳＨ試薬及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する。
蛍光強度又は吸光度の測定は、例えば、ＳＨ試薬、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ジアホラーゼ、レサズリンとの混合液（以下、第２－３工程用混合液という）を得て酵素カップリング反応させることで、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。第２－３工程用混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるＳＨ試薬、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ジアホラーゼ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
　第２－３工程で用いられるジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
　添加後の各成分の濃度は、ジアホラーゼが０．２～２０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが１～５００μＭ、１０～５００μＭ、レサズリンが５～２５０μＭとなるように用いることが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ～１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、第２－３工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０～２００ｍＭ、ｐＨは７～９が好ましい。添加物として１０～２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～２００ｍＭ　ＫＣｌ、５～４０ｍＭ　ＮａＦ、１～４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００～５００μＭ　Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１～１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、０．０１～１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第２－３工程の酵素カップリング反応の反応温度は２０～３７℃が好ましく、反応時間は１０分～３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２－３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ～５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
第２－３工程用混合液には、ＳＨ試薬を添加して第２－３工程の反応を行う。例えば、反応液中に還元剤が存在したまま第２－３工程の反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第２－３工程用混合液にＳＨ試薬が添加されていることで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
ＳＨ試薬はチオール基と反応する試薬で、タンパク質中のシステイン残基の定量や化学修飾に用いられる化合物である。１）５，５'－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、２，２'(４，４')－ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、２）ｐ－メルクリ安息香酸（ＰＭＢ）、ｐ－メルクリベンゼンスルホン酸（ＰＭＢＳ）などのメルカプチド形成剤、３） ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）などのアルキル化剤が挙げられる（生化学辞典 第４版、ｐ．１７３、東京化学同人、２００７年参照）。
本発明で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－フェニルマレイミド、Ｎ－（２－クロロフェニル）マレイミド、Ｎ－(４－カルボキシ－３－ヒドロキシフェニル)マレイミド等のマレイミド誘導体（マレイミド化合物）、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体（マレイミド化合物）が好適である。
　本発明の蛍光又は吸光度の検出方法で用いるＳＨ試薬としては、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　（式［１］中、
　Ｒ１は水素原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数６～１０のアリール基を表す。
　Ｒ２は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。
　ｎはＲ２の数を表し、０又は１である。）
　Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１～６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。
　Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
　Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基は、少なくとも一つの水素原子が独立して選ばれる水酸基で置換されているアルキル基である。Ｒ１及びＲ２の炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基のアルキル基としては、前記Ｒ１及びＲ２の炭素数１～６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基で例示したものと同様のものが挙げられる。
　Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基は、少なくとも一つの水素原子が独立して選ばれるスルホ基で置換されているアルキル基である。Ｒ１及びＲ２の炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基のアルキル基としては、前記Ｒ１及びＲ２の炭素数１～６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基で例示したものと同様のものが挙げられる。
　Ｒ１の前記炭素数６～１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
　Ｒ２の前記ハロゲン原子は、Ｆ，Ｃｌ, Ｂｒ, Ｉ等の周期表において第１７族に属する元素である。
　Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１～６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、炭素数１～４が好ましく、炭素数１～３がより好ましい。
　Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、炭素数１～４が好ましく、炭素数１～３がより好ましい。
　Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基としては、炭素数１～４が好ましく、炭素数１～３がより好ましい。
　Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基としては、炭素数１～４が好ましく、炭素数１～３がより好ましい。
　Ｒ１及びＲ２のアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、又はスルホアルキル基が有していてもよい置換基は、炭化水素基中の水素原子（Ｈ）を置換しているものであり、置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基等が挙げられる。
　Ｒ１のアリール基が有していてもよい置換基は、アリール基中の水素原子（Ｈ）を置換しているものであり、置換基としては、炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、カルボキシル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
＜バックグラウンド抑制方法＞
　以下、本発明のバックグラウンド抑制方法の好ましい形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明のバックグラウンド抑制方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の活性測定を行う場合の反応経路である。
　本発明のバックグラウンド抑制方法は、還元剤の共存下に、図１中の第２－３工程として示すような、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて、当該反応により生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応をＳＨ試薬の存在下で行うものである。
　還元剤が存在したまま第２－３工程の反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第２－３工程用混合液にＳＨ試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
　バックグラウンド抑制する対象の反応系としては、例えば、ＳＨ試薬、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ジアホラーゼ、レサズリンとの混合液（以下、第２－３工程用混合液という）に還元剤が添加された混合液が挙げられる。第２－３工程用混合液に還元剤が添加された混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるＳＨ試薬、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ジアホラーゼ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
当該混合液中で、第２－３工程として示す反応を進めることで、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをレゾルフィンの蛍光発光が生じる。ここで当該混合液にＳＨ試薬が添加されているので、前記蛍光発光を定量する際、検出対象とすべきシグナル以外のバックグラウンドのシグナルの上昇を抑えることができる。
第２－３工程で用いられるジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
添加後の各成分の濃度は、還元剤が１μＭ～５ｍＭ、ジアホラーゼが０．２～２０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが１～５００μＭ、１０～５００μＭ、レサズリンが５～２５０μＭとなるように用いることが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ～１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、第２－３工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０～２００ｍＭ、ｐＨは７～９が好ましい。添加物として１０～２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～２００ｍＭ　ＫＣｌ、５～４０ｍＭ　ＮａＦ、１～４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００～５００μＭ　Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１～１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、０．０１～１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第２－３工程の酵素カップリング反応の反応温度は２０～３７℃が好ましく、反応時間は１０分～３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２－３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ～５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
本発明のバックグラウンド抑制方法で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
　本発明で用いるＳＨ試薬としては、上記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドであることが好ましい。
＜ＡＤＰの測定方法＞
　以下、本発明のＡＤＰの測定方法の好ましい形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明のＡＤＰの測定方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の酵素反応により生成されたＡＤＰの測定を行う場合の反応経路である。
　図１中、第２－１工程、第２－２工程、及び第２－３工程からなる第２工程として示すように、本発明のＡＤＰの測定方法は、グルコースに、ＡＤＰおよびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、を有する。
　ＡＤＰの測定は、例えば、ＡＤＰを定量するための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ、及びレサズリンとの混合液（以下、第２工程用混合液という）にＡＤＰが添加された混合液を得て、酵素カップリング反応させることで、ＡＤＰをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。第２工程用混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
添加後の各成分の濃度は、グルコースが０．１～１０ｍＭ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼが５～５００μｇ／ｍｌ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼが１～１００μｇ／ｍｌ、ジアホラーゼが０．２～２０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰが１～５００μＭ、１０～５００μＭ、レサズリンが５～２５０μＭとなるように用いることが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ～１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、第２－３工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０～２００ｍＭ、ｐＨは７～９が好ましい。添加物として１０～２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～２００ｍＭ　ＫＣｌ、５～４０ｍＭ　ＮａＦ、１～４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００～５００μＭ　Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１～１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、０．０１～１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第２工程の酵素カップリング反応の反応温度は２０～３７℃が好ましく、反応時間は１０分～３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２－３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ～５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
また、第２工程で用いられるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
本発明のＡＤＰの測定方法では、第２工程用混合液にＳＨ試薬を添加して第２工程の反応を行わせる。例えば、還元剤が存在したまま第２工程の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第２工程の酵素カップリング用混合液にＳＨ試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
還元剤存在下で本発明のＡＤＰの測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ～５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
本発明のＡＤＰの測定方法で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
　本発明で用いるＳＨ試薬としては、上記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドであることが好ましい。
　本発明のＡＤＰの測定方法は、ＡＤＰの他、ＡＤＰを反応で生成する酵素の広範囲な活性測定方法としても用いることが可能である。
＜ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法＞
　一方、本発明の上記第２工程のＡＤＰの定量方法はキナーゼなどＡＤＰを反応で生成する酵素の広範な活性測定法としても用いることが可能である。
　即ち、本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法は、ＡＤＰを生成する酵素反応で生じるＡＤＰをＳＨ試薬存在下にグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で測定する。
　本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法は、図１中、第１－１工程、並びに第２－１工程、第２－２工程及び第２－３工程からなる第２工程として示すように、
　ＡＴＰの存在下、ＡＤＰを生成する酵素を基質に作用させてＡＴＰをＡＤＰに変換させる第１－１工程と、グルコースに、前記第１－１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、を有する。
以下、本発明の好ましい実施形態について、キナーゼを例に説明する。
測定対象とするキナーゼは、動植物組織や細胞から抽出したもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも良いが、精製したものが好ましい。
前記キナーゼとしては、例えばプロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、カルモジュリンキナーゼ、カゼインキナーゼ等が挙げられる。
本発明において、酵素活性を測定しようとするキナーゼ反応は、キナーゼ、リン酸ドナー分子（通常はＡＴＰ）およびリン酸アクセプター分子（キナーゼに応じた基質分子）を緩衝液中で混合して行う。それぞれの添加濃度は、キナーゼは酵素反応率が１～５０％程度となる濃度で添加するのが好ましく、リン酸ドナー分子（主としてＡＴＰ）は１０～１０００μＭで添加するのが好ましく、リン酸アクセプター分子は５～５００μＭで添加することが好ましい。キナーゼ反応に用いる緩衝液としては、トリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液濃度は１０～２００ｍＭが好ましく、ｐＨは７～９が好ましい。添加物として必要に応じ、１０～２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～２００ｍＭ　ＫＣｌ、５～４０ｍＭ　ＮａＦ、１～２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００～５００μＭ　Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１～１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、０．０１～１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
また、測定しようとするキナーゼに還元剤要求性がある場合や、酵素活性を上昇させる（活性化・賦活化させる）ための活性化剤（賦活化剤）として、或いはスクリーニング時の化合物の非特異的吸着を抑えるため、酵素などの試薬の安定化剤として、ＤＴＴ、２－メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ（トリス(２－カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩）等の還元剤を添加して反応させるのが好ましい。ＤＴＴ、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰの添加濃度は、測定しようとするキナーゼの還元剤要求性等にもよるが、０．１～１０ｍＭの範囲内が好ましい。反応温度は２０～３７℃が好ましく、反応時間は１０分～３時間が好ましい。キナーゼ反応後の反応液中のＡＤＰ濃度は０．１～５０μＭの範囲にあることが好ましく、０．５～２５μＭの範囲にあることがより好ましい。これより濃い反応液の場合は希釈してこの範囲に収まるようにすることが好ましい。
　キナーゼ反応で生成したＡＤＰはグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを加えて酵素カップリングングさせることでレゾルフィンの蛍光で定量する。これらは別々に添加することも可能だが、予め混合して（以下、酵素カップリング用混合液というが、組成は前述第２工程用混合液と同じ）キナーゼ反応後の反応液に一度に加えることも可能である。
キナーゼ反応後の反応液に添加する際のこれら成分の終濃度は、グルコースが０．５～５ｍＭ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼが５～１００μｇ／ｍｌ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼが０．５～１０μｇ／ｍｌ、ジアホラーゼが０．２～２０μｇ／ｍｌ、０．５～１０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤＰが２０～４００μＭ、レサズリンが５～２５０μＭ、１０～２００μＭとなるように調製することが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ～１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、酵素カップリング用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
添加に用いる緩衝液としてはトリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液等が用いられる。緩衝液濃度は１０～２００ｍＭ、ｐＨは７～９が好ましい。添加物として１０～２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～２００ｍＭ　ＫＣｌ、５～４０ｍＭ　ＮａＦ、１～４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００～５００μＭ　Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１～１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、０．０１～１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。酵素カップリング反応の反応温度は２０～３７℃が好ましく、反応時間は１０分～３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２－３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ～５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
多くのキナーゼで酵素活性の発揮には還元剤の添加が必要だが、還元剤が存在したままＡＤＰ定量の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。
本発明では、酵素カップリング用混合液に上記したＳＨ試薬を添加することで、還元剤を不活化させ、バックグランドの上昇を抑えた測定を可能としている。キナーゼ活性の測定で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物やＮ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が挙げられる。酵素カップリング反応に添加する量としては、キナーゼ反応に用いた還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
　本発明で用いるＳＨ試薬としては、上記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドであることが好ましい。
　本発明のＡＤＰ定量法はキナーゼ以外にも、ＡＤＰを産生する酵素の活性測定に用いることができる。キナーゼ以外にＡＤＰを産生する酵素としては、ＡＴＰアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルタチオンシンターゼ等が挙げられる。
糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性測定に用いる容器としては反応が進行するものであれば制限はないが、マイクロプレートが好適である。マイクロプレートとしては９６穴、３８４穴、１５３６穴等の種類があるが、何れも用いられる。
マイクロプレートを用いてまず糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の反応を行い、その反応液に対し、糖転移酵素の場合は第１工程用混合液を添加して第１工程の反応を行い、次に第２工程用混合液を添加して第２工程の反応を行わせた後、マイクロプレートリーダーで生成物（レゾルフィン）の蛍光を測定する。
キナーゼの場合は、キナーゼ反応液に酵素カップリング用混合液を添加して反応を行わせた後、マイクロプレートリーダーで同様にレゾルフィンの蛍光を測定する。レゾルフィンを蛍光測定する際の励起波長は５３０～５７０ｎｍ、蛍光波長は５８０～６１０ｎｍが好ましい。
本発明の方法でＡＤＰを蛍光発色させる反応は、反応温度２５℃の場合、３０分でほぼ終了し、その後約２時間は蛍光値が安定に保たれるため、蛍光測定時に反応を停止させる操作は特に必要ない。
＜糖転移酵素の活性測定方法＞
以下、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の好ましい形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の原理を表す反応経路である。
図１に示すように、本発明の糖転移酵素の活性測定方法は、糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、前記ＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを用いて酵素カップリング反応により蛍光で定量する第２工程と、
を有する。
　すなわち、本発明の糖転移酵素の活性測定方法は、
　糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＮＭＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、
　グルコースに、前記第１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、ＳＨ試薬存在下、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、を有する。
　測定対象の糖転移酵素は、動植物由来のもの、微生物由来のもの、生体由来のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
　測定対象の糖転移酵素は、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
また、第１工程及び第２工程で用いられるＮＤＰキナーゼ、ＣＭＰキナーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
糖転移酵素の働きでＧＤＰ－フコース、ＧＤＰ－マンノース、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルクロン酸、ＵＤＰ－キシロース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ－シアル酸等の糖供与体分子から糖（それぞれ、フコース、マンノース、グルコース、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸）が糖受容体分子に転移すると、糖供与体分子からヌクレオチド（ＧＤＰ、ＵＤＰ、ＣＭＰ）が遊離する。
本発明は、このＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰを、酵素カップリング反応を用いて蛍光で定量することで糖転移酵素活性を測定するものである。
従来、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの高感度かつ簡便な定量は困難であったが、本発明では、次の２つの工程から成る酵素カップリング反応によりＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの高感度かつ簡便な測定を可能にした。
第１工程：糖転移反応で糖供与体分子から生じるヌクレオチドがＧＤＰ又はＵＤＰである場合は、糖転移反応後の反応液にＡＴＰ存在下ＮＤＰキナーゼを作用させてＧＤＰ又はＵＤＰを、それぞれＧＴＰ、又はＵＴＰに変換するとともに、定量的にＡＤＰを産生させる。糖転移反応で糖供与体分子から生じるヌクレオチドがＣＭＰである場合は、糖転移反応後の反応液にＡＴＰ存在下ＣＭＰキナーゼを作用させてＣＭＰをＣＤＰに変換するとともに定量的にＡＤＰを産生させる。
第２工程：第１工程で生じたＡＤＰを、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ又はＮＡＤ、及びレサズリンを用いた酵素カップリング反応により蛍光性のレゾルフィンの蛍光発色へと導き、これを蛍光で定量する。
　本発明において、酵素活性を測定しようとする糖転移反応は、糖転移酵素、糖供与体分子、及び糖受容体分子を緩衝液中で混合することで行わせる。糖転移酵素は、酵素反応率が１～５０％程度となる濃度で添加することが好ましく、糖供与体分子は１０～５００μＭで添加することが好ましく、糖受容体分子は１０～５０００μＭで添加することが好ましい。
糖転移反応に用いる緩衝液としては、トリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０～２００ｍＭ、ｐＨは６～９が好ましい。添加物として１０～２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～２００ｍＭ　ＫＣｌ、５～４０ｍＭ　ＮａＦ、１～４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００～５００μＭ　Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１～１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、０．０１～１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
反応温度は２０～３７℃が好ましく、反応時間は１０分～３時間が好ましい。糖転移反応後の反応液中の遊離ヌクレオチド濃度は０．１～１００μＭの範囲にあることが好ましく、０．５～５０μＭの範囲にあることがより好ましい。１００μＭより濃い反応液の場合は、希釈してこの範囲に収まるようにすることが好ましい。
　糖転移反応の結果、糖供与体分子から遊離したヌクレオチド（ＧＤＰ、ＵＤＰ、ＣＭＰ）を定量するため、第１工程では、糖転移反応後の反応液にＡＴＰ、及びＮＤＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼを添加してリン酸交換反応を行わせてＡＤＰを生成させる。
ＮＤＰキナーゼはＡＴＰ存在下、ＧＤＰ、又はＵＤＰをリン酸化してそれぞれＧＴＰ、又はＵＴＰに変換するとともにＧＴＰ、又はＵＴＰと等モル量のＡＤＰを生成する酵素である。
ＣＭＰキナーゼはＡＴＰ存在下、ＣＭＰをリン酸化してＣＤＰに変換するとともにＣＤＰと等モル量のＡＤＰを生成する酵素である。本発明において、ＡＴＰ存在下にＣＭＰをリン酸化してＣＤＰに変換するとともにＣＤＰと等モル量のＡＤＰを生成する酵素であればＣＭＰキナーゼとして用いることができ、例えば、ＮＭＰキナーゼ（ヌクレオシド５’－一リン酸キナーゼ）と称されている酵素も当該酵素活性を持つので、ＣＭＰキナーゼとして用いることができる。
第１工程で添加するＡＴＰと、ＮＤＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼとは、それぞれ単独で添加しても良く、あるいは混合液として添加しても良い。何れの場合もＡＴＰは糖転移反応液に存在する遊離ヌクレオチドよりも２倍モル濃度以上かつ１ｍＭ程度以内の濃度となるように添加することが好ましい。
ＮＤＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼは０．２～２０μｇ／ｍｌの添加量が好ましい。これらの添加に用いる緩衝液としては、トリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０～２００ｍＭ、ｐＨは７～９が好ましい。添加物として１０～２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～２００ｍＭ　ＫＣｌ、５～４０ｍＭ　ＮａＦ、１～４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００～５００μＭ Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１～１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、０．０１～１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
反応温度は２０～３７℃が好ましく、反応時間は１０分～３時間が好ましい。なお、ＣＭＰキナーゼは還元剤の添加により酵素活性が上昇することから、第１工程でＣＭＰキナーゼを用いる場合は還元剤を同時に添加し、還元剤の存在下、ＡＤＰを生成させることが好ましい。なお、測定しようとするキナーゼに還元剤要求性がある場合以外にも、酵素活性を上昇させる（活性化・賦活化させる）ための活性化剤（賦活化剤）として、或いはスクリーニング時の化合物の非特異的吸着を抑えるため、酵素などの試薬の安定化剤として、還元剤を添加して反応させるのが好ましい。還元剤としてはジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。添加量は１μＭ～５ｍＭが好ましく、０．１～５ｍＭがより好ましい。
第２工程では、第１工程で得られた反応液に、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを加えて酵素カップリング反応させることで、ＡＤＰをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。ＡＤＰを定量するための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ又はＮＡＤ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらを混合しておいて（以下、第２工程用混合液という）、一度に加えることも可能である。
添加後の各成分の濃度は、グルコースが０．１～１０ｍＭ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼが５～５００μｇ／ｍｌ、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼが１～１００μｇ／ｍｌ、ジアホラーゼが０．２～２０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤＰが１０～５００μＭ、レサズリンが５～２５０μＭとなるように用いることが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ～１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、酵素カップリング用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０～２００ｍＭ、ｐＨは７～９が好ましい。添加物として１０～２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～２００ｍＭ　ＫＣｌ、５～４０ｍＭ　ＮａＦ、１～４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１～２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００～５００μＭ　Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１～１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、０．０１～１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第２工程の酵素カップリング反応の反応温度は２０～３７℃が好ましく、反応時間は１０分～３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２－３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ～５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
また、第１工程で還元剤を添加した場合は、第２工程用混合液にＳＨ試薬を添加して第２工程の反応を行わせることが好ましい。還元剤が存在したまま第２工程の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第２工程の酵素カップリング用混合液にＳＨ試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
ＳＨ試薬はチオール基と反応する試薬で、タンパク質中のシステイン残基の定量や化学修飾に用いられる化合物である。１）５，５'－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、２，２'(４，４')－ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、２）ｐ－メルクリ安息香酸（ＰＭＢ）、ｐ－メルクリベンゼンスルホン酸（ＰＭＢＳ）などのメルカプチド形成剤、３） ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）などのアルキル化剤が挙げられる（生化学辞典 第４版、ｐ．１７３、東京化学同人、２００７年参照）。
本発明で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
　本発明で用いるＳＨ試薬としては、上記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドであることが好ましい。
第２工程の酵素カップリング反応に添加する量としては、第１工程の反応に用いた還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
第１工程と第２工程の反応は、同時に行わせることもできる。同時に行わせることができるのは、ＧＤＰまたはＵＤＰを測定する場合である。ＣＭＰを測定する場合は、還元剤の添加とその不活化の操作が必要となるので、第１工程と第２工程を同時に行わせるのは好ましくない。
＜酵素活性調節剤のスクリーニング方法＞
　上述した本発明の酵素の活性測定方法を用いて、糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性調節剤をスクリーニングするには、好適にはマイクロプレートを用いて各ウェルに被験化合物を添加し、被験化合物の存在下、及び対照群として非存在下に、糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の反応を行った後、上記したように酵素カップリング反応を行わせて蛍光測定することで糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性を定量する。
得られた糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性を被被験化合物の有無により比較することで、被験化合物の糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素に対する活性調節作用を求めることができる。
また、糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の反応を行わずに、被験化合物存在下に酵素カップリング反応のみを行わせることで、被験化合物が酵素カップリング反応に影響したかどうかを知ることができ、被験化合物の活性が糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素に作用したものであるかを確認することができる。
本発明に係る酵素カップリング反応で生じる蛍光は、励起波長が５４０ｎｍ付近、蛍光波長が５９０ｎｍ付近であるため、係る波長域の場合、被験化合物の紫外・可視部吸収や自家蛍光の影響を受けにくい利点がある。
　酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、
　被験化合物存在下または非存在下に糖転移酵素反応を行う糖転移酵素反応工程と、
前記糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は前記糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、
前記ＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを用いて酵素カップリング反応により蛍光で定量する第２工程と、
前記被験化合物の有無による糖転移酵素の活性を比較することで前記被験化合物の糖転移酵素に対する活性調節作用を求める比較工程と、
を有する。
　酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、前記第１工程は、糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ及び還元剤存在下にＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる工程であり、前記第２工程は、ＳＨ試薬の存在下、酵素カップリング反応により蛍光で定量する工程であることが好ましい。
　酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか一種であることが好ましい。
　酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるＡＤＰを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、
ＡＤＰを生成する酵素反応を被験化合物存在下または非存在下で行った後、
ＡＤＰを生成する酵素反応で生じるＡＤＰをＳＨ試薬存在下にグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で測定し、
被験化合物の有無による活性を比較することで被験化合物のＡＤＰを生成する酵素に対する活性調節作用を求める。
　酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるＡＤＰを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、前記ＡＤＰを生成する酵素が、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか一種であることが好ましい。
　酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるＡＤＰを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、前記ＳＨ試薬がＮ－エチルマレイミド又はヨードアセトアミドであることが好ましい。
＜ＡＤＰの測定用キット＞
　本発明は、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン及びＳＨ試薬を含むＡＤＰの測定用キットを提供する。
　本発明のＡＤＰの測定用キットに含まれるＳＨ試薬としては、上記ＡＤＰの測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
　本発明のＡＤＰの測定用キットによれば、試料中のＡＤＰを簡便に測定することができる。
　前記ＡＤＰの測定用キットは、還元剤を含有していてもよく、還元剤存在下で本発明のＡＤＰの測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。
＜ＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット＞
　本発明は、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン並びにＳＨ試薬を含むＡＤＰを生成する酵素の活性測定キットを提供する。
　本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キットに含まれるＳＨ試薬としては、上記ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
　本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キットによれば、ＡＤＰを生成する酵素の活性を簡便に測定することができる。
　前記ＡＤＰを生成する酵素の活性測定キットは、還元剤を含有していてもよく、還元剤存在下で本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性の測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。
＜糖転移酵素の活性測定キット＞
　本発明は、ＡＴＰ及びＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ若しくはＣＭＰキナーゼを含む第１液と、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン、並びにＳＨ試薬を含む第２液と、を含む転移酵素の活性測定キットを提供する。
　一実施形態として、本発明の糖転移酵素の活性測定キットは、前記第１液がさらに還元剤を含むことが好ましい。
　例えば、ＣＭＰキナーゼ等のある種の酵素は還元剤の添加により酵素活性が上昇することから、前記第１液がさらに還元剤を含むことにより、ＣＭＰキナーゼの酵素活性を上昇させることができる。尚且つ、本発明の転移酵素の活性測定キットは、前記第２液にＳＨ試薬を含んでいるため、還元剤を不活化することができ、レサズリンからレゾルフィンへの還元を抑えることができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
　本発明の糖転移酵素の活性測定キットに含まれるＳＨ試薬としては、上記糖転移酵素の活性測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
　本発明の糖転移酵素の活性測定キットによれば、糖転移酵素の活性を簡便に測定することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　本発明の方法を用いたＧＤＰ、ＵＤＰの検量線
　本発明に係る第１工程、第２工程の反応を用いてＧＤＰ、ＵＤＰの検量線を作成した。
材料として、ＧＤＰ（和光純薬工業社カタログ番号０７８－０４７４１）、ＵＤＰ（和光純薬工業社カタログ番号２１２－００８６１）、ＡＴＰ（和光純薬工業社カタログ番号１８－１６９１１）、パン酵母由来ＮＤＰキナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ番号Ｎ０３７９）、グルコース（和光純薬工業社カタログ番号０４５－３１１６２）、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（旭化成ファーマ社カタログ番号Ｔ－９３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来）、Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母工業社カタログ番号４６８５７００３）、ジアホラーゼ（ユニチカ社カタログ番号Ｂ１Ｄ１１１）、ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母工業社カタログ番号４４２９００００）、レサズリン（和光純薬工業社カタログ番号１９１－０７５８１）を用いた。ＧＤＰ、ＵＤＰは緩衝液Ｃ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に溶解して０～５０μＭ溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。
第１工程用混合液Ａ
　ＡＴＰ                    　　　 ２００μＭ
　ＮＤＰキナーゼ            　　　 ２μｇ／ｍｌ
　緩衝液組成                　　　　Ｃ
第２工程用混合液Ｂ
グルコース                  　　　 ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ(３８μｇ／ｍｌ)
Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ（２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                ２Ｕ／ｍｌ（１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                         １００μＭ
緩衝液組成                         Ｃ
３８４穴マイクロプレート（少容量、非結合タイプ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社カタログ番号７８４９００）に４μｌの０～５０μＭ　ＧＤＰ又はＵＤＰ溶液と、４μｌの第１工程用混合液Ａを添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。これに８μｌの第２工程用混合液Ｂを添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。
これをＢＭＧ　Ｌａｂｔｅｃｈ社製プレートリーダーＰＨＥＲＡｓｔａｒを用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて蛍光測定した。結果を図２に示す。これより、ＧＤＰ、ＵＤＰとも濃度に応じた蛍光強度が確認され、両ヌクレオチドを本発明の方法で定量できることが確認された。
［実施例２］
　本発明の方法を用いたＣＭＰの検量線
　本発明に係る第１工程、第２工程の反応を用いてＣＭＰの検量線を作成した。
材料として、ＣＭＰ（和光純薬工業社カタログ番号０３４－０５３６１）、ＣＭＰキナーゼ（ヒトＣＭＰＫ１、Ｐｒｏｓｐｅｃ社カタログ番号ＰＫＡ－００２）、ＤＴＴ（和光純薬工業社カタログ番号０４０－２９２２３）、Ｎ－エチルマレイミド（和光純薬工業社カタログ番号０５４－０２０６１）を用いた。ＣＭＰは緩衝液Ｆ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ９）、１３．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）に溶解して０～４０μＭ溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。
ＣＭＰキナーゼは還元剤要求性があるため第１工程では還元剤としてＤＴＴを用い、第２工程ではその不活化のためＳＨ試薬としてＮ－エチルマレイミドを用いた。
第１工程用混合液Ｄ
　ＡＴＰ                           ２００μＭ
　ＣＭＰＫ１                       ３μｇ／ｍｌ
　ＤＴＴ                           ４ｍＭ
　緩衝液組成                　　　 Ｆ
第２工程用混合液Ｅ
グルコース                  　　　 ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ（３８μｇ／ｍｌ)
Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ (２．６μｇ／ｍｌ)
ジアホラーゼ                ２Ｕ／ｍｌ (１．１μｇ／ｍｌ)
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                  　　　　１００μＭ
Ｎ－エチルマレイミド        ２０ｍＭ
緩衝液組成                  　　　　Ｃ
実施例１と同様の操作でＣＭＰ溶液について上記の混合液を用いて第１工程と第２工程の反応を行い、蛍光測定を行ってＣＭＰの検量線を得た。結果を図３に示す。ＣＭＰ濃度に応じた蛍光強度が観測され、ＣＭＰを本発明の方法で定量できることが確認された。
［実施例３］
蛍光発色の経時変化
４０μＭのＧＤＰ又はＵＤＰを用い、実施例１と同様に反応を行った後、第２工程の反応時のみ経時的にプレートを取り出し蛍光測定を行った。また、４０μＭのＣＭＰを用い、実施例２と同様に反応を行い、第２工程の反応時のみ経時的にプレートを取り出し、蛍光測定を行った。結果を図４に示す。これより、ＧＤＰ又はＵＤＰの定量の場合、第２工程の反応は２５分以内に終了し、以後少なくとも１２０分まで蛍光値は安定に保たれること、ＣＤＰの定量の場合は第２工程の反応は２５分でほぼ終了し、６０分以降少なくとも１２０分まで蛍光値はほとんど変化しないことが分かった。
従って、ＧＤＰ又はＵＤＰ定量の場合は第２工程開始後２５分～１２０分に、ＣＭＰ定量の場合は同６０分～１２０分に蛍光を測定することで安定した測定結果が得られることが分かった。
［実施例４］
糖転移酵素活性の測定（１）
　糖転移酵素としてフコシルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。フコシルトランスフェラーゼとしてヒトＦＵＴ７（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号６４０９－ＧＴ）、基質としてＧＤＰ－フコース（ヤマサ醤油社カタログ番号７２２９）とフェツイン（ウシ胎児血清由来、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ番号Ｆ３００４）を用いた。
３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの１００μＭ　ＧＤＰ－フコース、６ｍｇ／ｍｌフェツインと、２．５μｌの０～４μｇ／ｍｌ　ＦＵＴ７を添加し（緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、プレートシール（アズワン社カタログ番号１－６７７４－０１）で蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。室温に放冷後、これに５μｌの第１工程用混合液Ａを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。これに１０μｌの第２工程用混合液Ｂを添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。これを実施例１と同様に蛍光測定した。結果を図５に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認された。
［実施例５］
糖転移酵素活性の測定（２）
　糖転移酵素としてガラクトシルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。
ガラクトシルトランスフェラーゼとしてヒトＢ４ＧａｌＴ１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号３６０９－ＧＴ）、基質としてＵＤＰ－ガラクトース（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社カタログ番号１９５９０５）とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（和光純薬工業社カタログ番号０１３－１２１８１）を用いた。３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの１００μＭ　ＵＤＰ－ガラクトース、１０ｍＭ　Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンと、２．５μｌの０～０．３μｇ／ｍｌＢ４ＧａｌＴ１を添加し（緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、プレートシールで蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。
室温に放冷後、これに５μｌの第１工程用混合液Ａと１０μｌの第２工程用混合液Ｂの混合液１５μｌを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。これを実施例１と同様に蛍光測定した。結果を図６に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認され、第１工程と第２工程を同時に行わせる測定が可能であることが示された。
［実施例６］
　糖転移酵素活性の測定（３）
　糖転移酵素としてシアリルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。シアリルトランスフェラーゼとしてヒトＳＴ６Ｇａｌ１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号５９２４－ＧＴ）、基質としてＣＭＰ－シアル酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社カタログ番号２３３２６４）とＮ－アセチル－Ｄ－ラクトサミン（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ番号Ａ７７９１）を用いた。
３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの１００μＭ　ＣＭＰ－シアル酸、５００μＭ Ｎ－アセチル－Ｄ－ラクトサミンと、２．５μｌの０～１０μｇ／ｍｌ　ＳＴ６Ｇａｌ１を添加し（緩衝液は２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、プレートシールで蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。室温に放冷後、これに５μｌの第１工程用混合液Ｄを添加し、プレートシールで蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。室温に放冷後、これに１０μｌの第２工程用混合液Ｅを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。これを実施例１と同様に蛍光測定した。結果を図７に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認された。
［実施例７］
　糖転移酵素阻害活性の測定
　没食子酸 (ｇａｌｌｉｃ　ａｃｉｄ) のヒトＦＵＴ７に対する酵素阻害活性を本発明の方法で測定した。没食子酸は、ヒトＦＵＴ７に対する阻害活性が報告された化合物である（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．４２５，Ｎｏ．１，ｐｐ．５１－５７，２００４年参照）。
実施例４で示した方法でＦＵＴ７の酵素活性の測定を行う際、没食子酸存在下にＦＵＴ７（糖転移反応液中の濃度１μｇ／ｍｌ）の反応を行い、他は実施例４と同様に操作を行って没食子酸のＦＵＴ７に対する阻害作用を調べた。没食子酸を含まない群を阻害率０％コントロールとし、ＦＵＴ７を含まない群を阻害率１００％コントロールとして、各濃度の没食子酸のＦＵＴ７に対する阻害率を算出した。
また、１００μＭ　ＧＤＰ－フコースの代わりに５０μＭ　ＧＤＰを用いて同様に操作を行い、酵素カップリング自体への没食子酸の影響も調べた。また、ＦＵＴ７酵素反応後の反応液の一部を使って、ＨＰＬＣ分析により生成ＧＤＰ量を定量し、ＨＰＬＣ法による阻害活性も求めた。
ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８ (ワイエムシー社製、粒系５μｍ、直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ)、溶出液：５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４（１０：１）、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ ２６０ｎｍとした。これらの測定結果を図８に示す。
本発明の方法で測定した没食子酸の阻害活性とＨＰＬＣにより測定した阻害活性とが一致することが分かった（ＩＣ５０値が約１０μＭ）。さらに、没食子酸は、酵素カップリング反応自体を全く阻害しておらず、酵素カップリングにより測定された阻害活性はＦＵＴ７の阻害によるものであることが確かめられた。
また、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．４２５，Ｎｏ．１，ｐｐ．５１－５７，２００４年には、ヒトＦＵＴ７に対する没食子酸のＩＣ５０値が５．４μＭと報告されており、実施例７において測定されたＩＣ５０値は、上記文献値に近いことが確認された。
以上より、本発明の方法で糖転移酵素阻害活性の正確な測定が可能であることが示された。
［実施例８］
　糖転移酵素活性測定キット（１）
　以下の組成で、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、又はＮ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ用活性測定キットを作製した。
第１工程用混合液
　ＡＴＰ                           ２００μＭ
　ＮＤＰキナーゼ                   ２μｇ／ｍｌ
　緩衝液組成  　　　　　　　　     １００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２
第２工程用混合液
グルコース                         ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２ Ｕ／ｍｌ（３８μｇ／ｍｌ）
Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ  ２ Ｕ／ｍｌ （２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                ２ Ｕ／ｍｌ （１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                         １００μＭ
緩衝液組成                         １００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２
［実施例９］
　糖転移酵素活性測定キット（２）
　以下の組成で、シアリルトランスフェラーゼ用活性測定キットを作製した。
第１工程用混合液
　ＡＴＰ                           ２００μＭ
　ＣＭＰＫ１                       ３μｇ／ｍｌ
　ＤＴＴ                           ４ｍＭ
　緩衝液組成                　　　 １００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）、１３．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００
第２工程用混合液
グルコース                  　　　 ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ （３８μｇ／ｍｌ）
Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ （２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                ２Ｕ／ｍｌ （１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                         1００μＭ
Ｎ－エチルマレイミド        ２０ｍＭ
緩衝液組成                  　　　 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２
［実施例１０］
　本発明の方法よるＡＤＰの検量線
ＡＤＰ（オリエンタル酵母工業社カタログ番号４５１２００００）を緩衝液Ｃ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に溶解して０～３７．５μＭ溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。Ｎ－エチルマレイミドを添加する場合は、この酵素カップリング用混合液に２０ｍＭで添加した。
酵素カップリング混合液組成
Ｄ－グルコース              ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２ Ｕ／ｍｌ（３８μｇ／ｍｌ）
Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ  ２ Ｕ／ｍｌ（２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                ２ Ｕ／ｍｌ （１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                    ２００μＭ
レサズリン                  １００μＭ
Ｎ－エチルマレイミド        ２０ｍＭまたは無添加
緩衝液組成                  Ｃ
３８４穴マイクロプレート（少容量、非結合タイプ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社カタログ番号７８４９００）に７．５μｌの０～３７．５μＭ　ＡＤＰ溶液（緩衝液組成はＣ）と７．５μｌの酵素カップリング用混合液を添加し、２５℃にて暗所で１時間インキュベートした。
その後、蛍光強度をＢＭＧ　Ｌａｂｔｅｃｈ社製マイクロプレートリーダーＰＨＥＲＡｓｔａｒを用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて測定した。結果を図９に示す。ＡＤＰ濃度依存的な蛍光強度が確認され、ＡＤＰ濃度２５μＭまでは良好な直線性が得られることが分かった。
また、Ｎ－エチルマレイミドが存在しても、蛍光値にほとんど変化は見られなかった。これより、本発明に係るＳＨ試薬存在下の酵素カップリング反応でＡＤＰの蛍光定量が可能であることが示された。
［実施例１１］
　ＡＤＰの酵素カップリングによる蛍光発色の安定性の検討
　２５μＭのＡＤＰを用い、実施例１０と同様に反応を行った。ただし、酵素カップリング反応時、経時的にマイクロプレートを取り出し蛍光測定を行った。結果を図１０に示す。これより、ＡＤＰ定量の酵素カップリング反応は１０～２０分で終了し、その後２時間は、蛍光値は安定であることが分かった。
［実施例１２］
還元剤ＤＴＴ存在下のＡＤＰの検量線
　ＤＴＴ存在下のＡＤＰの検量線を実施例１０と同様に測定した。結果を図１１に示す。ＤＴＴの存在により蛍光のバックグランドが上昇するが、酵素カップリング用混合液に予め２０ｍＭ　Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を混合しておくとバックグランドの上昇が抑えられ、ＡＤＰの定量性が良好になることが確認された。これをアッセイ系の検出感度の特異性の指標であるシグナル／バックグランドのカウントの比率（Ｓ／Ｂ比、この値が大きいほど高感度である）で表わすと、２０μＭのＡＤＰの定量において、ＤＴＴが存在しなければＳ／Ｂ比は５７．４の高い値を示したが、２ｍＭのＤＴＴが存在するとＳ／Ｂ比は４．２と１／１０以下に低下した。しかしながら、２０ｍＭ　Ｎ－エチルマレイミドを添加することでＳ／Ｂ比は３６．７と、未添加に比べ約９倍改善した。
［実施例１３］
　ヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの検量線
　実施例１２において、２０ｍＭ　Ｎ－エチルマレイミドの代わりに８ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いて、他は実施例１２と同様にしてＡＤＰの検量線の測定を行った。結果を図１２に示す。２０μＭのＡＤＰの定量において、Ｓ／Ｂ比は２ｍＭ　ＤＴＴが存在すると３．７であったが、８ｍＭヨードアセトアミドを用いた場合は１８．６と約５倍改善した。これより、酵素カップリング用混合液に予めヨードアセトアミドを混合しておくことで測定の特異性が改善されることが確かめられた。
［実施例１４］
　キナーゼ活性の測定
　還元剤要求性のキナーゼとしてヒトＣＭＰＫ１（ＣＭＰ　ｋｉｎａｓｅ１、Ｐｒｏｓｐｅｃ社カタログ番号ｐＫａ－００２－ｂ）を用い、最初にＣＭＰＫ１のＤＴＴ依存性を調べた。
１．５ｍｌ容マイクロ遠心チューブに１０μｌの４００μＭ　ＡＴＰ、８０μＭ　ＣＭＰ（緩衝液組成は１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）、１３．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）と５μｌの０～８ｍＭ ＤＴＴ水溶液及び５μｌの４μｇ／ｍｌ　ＣＭＰＫ１（緩衝液組成は１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）、１３．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＫＣＬ、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、この反応液１５μｌをＨＰＬＣに注入することで、ＣＭＰＫ１酵素反応で生成したＣＤＰ（シトシン５'－二リン酸）とＡＤＰを定量した。ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８(ワイエムシー社製、粒系５μｍ、直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ)、溶出液：５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４（１０：１）、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ ２６５ ｎｍとした。結果を図１３に示す。
ＣＭＰＫ１の酵素活性はＤＴＴ濃度に依存すること、同モル量のＣＤＰとＡＤＰが生成していることが確認された。これより、１ｍＭ以上のＤＴＴ濃度があればＣＭＰＫ１は十分な活性を示すことが分かった。
　次にＤＴＴ存在下でのＣＭＰＫ１の酵素活性を本発明の方法で測定した。３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの０又は４０μＭ ＣＭＰと、２．５μｌの２００μＭ　ＡＴＰ、０～３μｇ／ｍｌ ＣＭＰＫ１、４ｍＭＤＴＴ（緩衝液組成は１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ (ｐＨ９)、１３．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）と、を加え、プレートシール（アズワン社カタログ番号１－６７７４－０１）で蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。室温に放冷後、これに５μｌの酵素カップリング用混合液（組成は実施例１０と同じ）を加え、２５℃でインキュベートした。インキュベート開始開始後０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の計５回、蛍光測定を行い、実施例１２と同様にＳ／Ｂ比を求めた。ＣＭＰＫ１濃度を３μｇ／ｍｌとした時のＳ／Ｂ比の測定結果を図１４に示す。
酵素カップリング反応をＮ－メチルマレイミドなしで行った場合はＳ／Ｂ比は３～４であったのに対し、Ｎ－エチルマレイミドを存在させてアッセイした場合はＳ／Ｂ比は１３～１４となり、ＳＨ試薬存在下で酵素カップリングを行わせることでキナーゼ活性の定量性が大きく向上することが示された。
また、蛍光測定時間６０分におけるＮ－エチルマレイミド存在下でのＣＭＰＫ１の濃度依存性定量結果を図１５に示す。ＣＭＰＫ１酵素濃度に応じたキナーゼ活性が確認された。
［実施例１５］
キナーゼ阻害活性の測定
　Ｄａｃｔｉｏｓｔｅｒｉｕｍ（キイロタマホコリカビ）のＣＭＰキナーゼに対する阻害活性が報告された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．１１，ｐｐ． ６３３９－６３４５，１９９０年）Ａｐ５Ａ（Ｐ１，Ｐ５－Ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－５'）ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のＣＭＰＫ１に対する酵素阻害活性を、本発明の方法で測定した。３８４穴マイクロプレートに１μｌの０～３ｍＭ　Ａｐ５Ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ番号Ｄ４０２２）溶液と２μｌの５０μＭ　ＣＭＰを添加し、これに２μｌの２００μＭ　ＡＴＰ、３μｇ／ｍｌ　ＣＭＰＫ１、４ｍＭ　ＤＴＴを添加した（緩衝液組成は１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）、１３．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）。プレートシールで蓋をして３７℃で１時間インキュベート後、室温に放冷し、２０ｍＭ　Ｎ－エチルマレイミドを含む酵素カップリング用混合液を５μｌ添加し、２５℃で暗所にて６０分間インキュベートした後、プレートリーダーで蛍光を測定した。Ａｐ５Ａを含まない群を阻害率０％コントロールとし、ＣＭＰＫ１を含まない群を阻害率１００％コントロールとして、各濃度のＡｐ５ＡのＣＭＰＫ１に対する阻害率を算出した。
また、５０μＭ　ＣＭＰの代わりに２５μＭ　ＡＤＰを用いて同様に操作を行い、酵素カップリング自体へのＡｐ５Ａの影響も調べた。また、ＣＭＰＫ１のキナーゼ反応後の反応液の一部を使って、実施例１４に記載したＨＰＬＣ分析法によっても生成ＣＤＰ量を測定し、ＨＰＬＣ法による阻害活性を求めた。これらの結果を図１６に示す。
本発明の方法で測定したＡｐ５ＡのＣＭＰＫ１に対する阻害活性とＨＰＬＣ法により測定した阻害活性とが一致することが分かった。さらに、Ａｐ５Ａは酵素カップリング反応自体は全く阻害しておらず、酵素カップリングにより測定された阻害活性はＣＭＰＫ１を阻害したことによるものであることが確かめられた。
以上より、本発明の方法でキナーゼ阻害活性の正確な測定が可能であることが示された。
［実施例１６］
キナーゼ活性測定キット
　以下の組成でキナーゼ活性測定キットを作製した。
キナーゼ活性測定キット組成
Ｄ－グルコース                     ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  　　　 ２Ｕ／ｍｌ（３８μｇ／ｍｌ）
Ｇ－６－Ｐデヒドロゲナーゼ         ２Ｕ／ｍｌ（２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                       ２Ｕ／ｍｌ（１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                         １００μＭ
Ｎ－エチルマレイミド               ２０ｍＭ
緩衝液組成                         １００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２
［実施例１７］
ＡＴＰアーゼ活性の測定
　市販キナーゼに夾雑するＡＴＰアーゼ活性を本発明の方法で測定した。３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの４００μＭ　ＡＴＰと２．５μｌの０～１６μｇ／ｍｌヒトＵＭＰキナーゼ（Ｎｏｖｏｃｉｂ社カタログ番号Ｅ－ＮＯＶ－４）を添加し（緩衝液組成は５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ ｍＭ　ＤＴＴ、２００μＭ　Ｎａ３ＶＯ４、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、３０℃で１～２時間インキュベートした。これに実施例１６に記載のキット液５μｌを添加し、２５℃で１時間インキュベートした後、実施例１０と同様にプレートリーダーで蛍光を測定した。また、酵素カップリング前の酵素反応液を実施例７で用いたＨＰＬＣ条件で分析し、ＡＤＰを直接ＨＰＬＣで定量した。これらの結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。リン酸アクセプターがない状態で市販ヒトＵＭＰキナーゼ（ＵＭＰＫ）はＡＴＰアーゼ活性を示しＡＴＰからＡＤＰを生成すること、このＡＴＰアーゼ活性を本発明の方法で定量できること、両者の測定結果は一致することが示された。なお、ヒトＵＭＰキナーゼはタンパク質をリン酸化しないので、自己リン酸化活性はない。ここで示されたＡＴＰアーゼ活性は、酵素の精製過程で取り除けなかったＡＴＰアーゼが残存したものと考えられる。
［実施例１８］
　糖転移酵素（ガラクトシルトランスフェラーゼ）阻害剤のスクリーニング
　化合物ライブラリーとして、１２８０種類の既知生理活性物質で構成されるＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーを用いた。３８４穴マイクロプレートにＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーの各化合物（１ｍＭ濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解）をプレート１枚当たり３２０化合物ずつ、微量分注機（Ｌａｂｃｙｔｅ社製Ｅｃｈｏ　５５５）を用いて５０ｎｌずつ分注した。
これに２．５μｌの１０ｍＭ　Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、１００μＭ　ＵＤＰ－ガラクトースと、２．５μｌの０．０５μｇ／ｍｌヒトＢ４ＧａｌＴ１を連続分注機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ　ｃｏｍｂｉ）を用いて添加し（緩衝液は５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ (ｐＨ７．５)、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、０．０２％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、プレートシールで蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした（反応液中のライブラリー化合物濃度は１０μＭ）。
ライブラリー化合物の代わりにＤＭＳＯを添加したウェルを反応率１００％コントロールウェルとし、酵素も加えないウェルを反応率０％のコントロールウェルとした（両コントロールを各プレートに１６ウェルずつ設置）。室温に放冷後、５μｌの第１工程用混合液Ａを加え２５℃で１時間インキュベートした後、１０μｌの第２工程用混合液Ｂの混合液１０μｌを添加し、さらに２５℃で１時間インキュベートし、蛍光を定量した。
一方、上記と同様にライブラリー化合物およびＤＭＳＯをプレートに添加後、基質液と酵素液に代えて２０μＭ ＵＤＰを5μlずつ添加したプレートを作製し、同様に第１工程と第２工程の反応を行わせ、ＵＤＰ定量反応自体への影響を調べた。この場合、反応率０％のコントロールウェルは２０μＭ　ＵＤＰを加えないウェルとした。両アッセイとも、反応率１００％と０％のコントロールウェルの蛍光定量値、ライブラリー化合物が入ったウェルの蛍光定量値をそれぞれａ、ｂ、ｃとして、阻害率を次式により計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
１２８０個のライブラリー化合物の測定結果を図１８Ａ～Ｃに示す。Ｂ４ＧａｌＴ１反応を行った場合は阻害率が５０％以上を示した化合物数は２４個であった（図１８Ａ）。
一方、ＵＤＰ定量アッセイの場合は５０％以上阻害した化合物数は１０個であった（図１８Ｂ）。両アッセイの阻害率の差を計算することで（Ａ－Ｂ）、Ｂ４ＧａｌＴ１反応の正味の阻害率を見積もることができる。その差が５０％以上であった化合物数は１２個であった（図１８Ｃ）。
従ってこのスクリーニングにより、ヒトガラクトシルトランスフェラーゼＢ４ＧａｌＴ１を阻害する化合物をＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーから１２個得ることができ、本発明がハイスループットなスクリーニング法として有用であることが示された。
また、従来のスクリーニング方法におけるウェル単価は、１ウェルあたり約１００円であったのに対し、本発明のスクリーニング方法におけるウェル単価は、１ウェルあたり２～８円と安価である。
従って、本発明のスクリーニング方法は、コスト面においても非常に優れていることが確認された。
［実施例１９］
　マレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの定量
　ＡＤＰ（和光純薬工業社カタログ番号０１９－２５０９１）を１０ｍＭの濃度になるように純水に溶解し、５Ｍの水酸化ナトリウム(和光純薬工業社カタログ番号１９６－０５３７５)でｐＨ７のＡＤＰ溶液を調製した。
ＤＴＴ（和光純薬工業社カタログ番号０４０－２９２２３）を１Ｍの濃度になるように純水で調製し、ＤＴＴ溶液を調製した。
１０ｍＭ　ＡＤＰ溶液、１０ｍＭ　ＡＴＰ溶液（プロメガ社Ｖ９１５Ｂ）、１Ｍ　ＤＴＴ溶液を緩衝液１（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％　ＢＳＡ）で希釈し、下記表１に記載の組成の溶液１～６をそれぞれ調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
ＳＨ試薬として、マレイミド（和光純薬工業社カタログ番号１３３－１３１１１）、Ｎ－エチルマレイミド（和光純薬工業社カタログ番号０５８－０２０６１）、及びヨードアセトアミド（ＩＡＡ）（和光純薬工業社カタログ番号０９５－０２１５１）をジメチルスルホキシド（和光純薬工業社カタログ番号０４１－２９３５１）にそれぞれ８００ｍＭの濃度で調製した。Ｎ－（２－スルホエチル）マレイミド（サンタクルズ社カタログ番号ＳＣ－２０７９０７）は純水に２５０ｍＭの濃度で調製した。
酵素カップリング用混合液を下記表２に記載の組成となるようにそれぞれ調製した。酵素カップリング用混合液中、ＳＨ試薬を用いる場合には、４０ｍＭとなるようにそれぞれ添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
３８４穴マイクロプレート（小容量、非結合タイプ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社カタログ番号７８４９００）に、下記表３に記載のとおり、溶液１～６をそれぞれ５μｌと溶液Ａ～Ｅの酵素カップリング用混合液をそれぞれ５μｌとを添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　その後、前記表３に記載の各溶液についてそれぞれ蛍光強度をＴＥＣＡＮ社製マイクロプレートリーダーＳａｆｉｒｅを用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて測定した。
　上記の実験をそれぞれ2回行い、それぞれ得られた蛍光強度の平均を求めた。結果を図１９Ａ～Ｃに示す。
　ＤＴＴの存在により蛍光のバックグラウンドが上昇するが、酵素カップリング用混合液に予め４０ｍＭマレイミド類（マレイミド、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－（２－スルホエチル）マレイミド）と４０ｍＭＩＡＡを混合しておくとバックグラウンドの上昇が抑えられ、ＡＤＰの定量性が良好になることが確認された。これをアッセイ系の検出感度の特異性の指標であるシグナル／バックグラウンドのカウントの比率（Ｓ／Ｂ比、この値が大きいほど高感度である）で表すと、２０μＭのＡＤＰの定量において、ＤＴＴが存在しなければＳ／Ｂ比は２３．３の高い値を示したが、３ｍＭまたは６ｍＭのＤＴＴが存在するとＳ／Ｂ比はそれぞれ４．０、２．９に低下した。しかしながら、４０ｍＭのマレイミド類（マレイミド、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－（２－スルホエチル）マレイミド）を添加することで、３ｍＭのＤＴＴ添加時にＳ／Ｂ比はそれぞれ２３．６、２３．８、２４．０、６ｍＭのＤＴＴ添加時に２１．７、２２．５、２１．０と改善した。４０ｍＭのＩＡＡを添加することで、３ｍＭのＤＴＴ添加時にＳ／Ｂ比は１８．２、６ｍＭのＤＴＴ添加時に１３．３と改善した。これによりマレイミド類、及びＩＡＡいずれも蛍光のバックグラウンドの抑制効果があり、特にマレイミド類は抑制効果が高いことが示された。
［実施例２０］
還元剤ＤＴＴ、２―メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ存在下のＡＤＰの定量
実施例１９と同様の方法により、還元剤として６ｍＭのＤＴＴ、６ｍＭの２－メルカプトエタノール（和光純薬工業社カタログ番号１３５－０７５２２）、６ｍＭのＴＣＥＰ（和光純薬工業社カタログ番号２０９－１９８６１）を添加してＡＤＰの定量を行った。
ＴＣＥＰは１Ｍの濃度になるように純水に溶解し、５Ｍの水酸化ナトリウム(和光純薬工業社カタログ番号１９６－０５３７５)でｐＨ７に調製し、６ｍＭとなるように希釈して用いた。
ＡＤＰとＡＴＰ、各還元剤を緩衝液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％　ＢＳＡ）に溶解し、各還元剤６ｍＭ、ＡＤＰ０μＭまたは２０μＭ溶液（ＡＤＰ０μＭとＡＴＰ１００μＭ、又はＡＤＰ２０μＭとＡＴＰ８０μＭ）を調製した。酵素カップリング用混合液は実施例１９と同組成のものを使用し、マレイミド類（マレイミド、Ｎ－エチルマレイミド）またはＩＡＡを４０ｍＭの濃度で添加した。
３８４穴マイクロプレート（小容量、非結合タイプ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社カタログ番号７８４９００）に５μｌの還元剤６ｍＭ、ＡＤＰ０μＭ、２０μＭ溶液（ＡＤＰとＡＴＰの合計は１００μＭ、緩衝液は４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２-、０．０１％ ＢＳＡ）と５μｌの酵素カップリング用混合液を添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。
その後、蛍光強度をＴＥＣＡＮ社製マイクロプレートリーダーＳａｆｉｒｅを用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて測定した。
上記の実験をそれぞれ３回行い、それぞれ得られた蛍光強度の平均を求めた。結果を図２０Ａ～Ｃに示す。
２０μＭのＡＤＰの定量において、６ｍＭのＤＴＴ、２－メルカプトエタノール、ＴＣＥＰが存在する場合、ＳＨ試薬を添加しないとＳ／Ｂはそれぞれ１．２、１４．０、３．４であったが、マレイミドを添加するとそれぞれ１６．１、１９．１、１９．４、Ｎ－エチルマレイミドを添加すると１８．２、１９．６、１９．９、ＩＡＡを添加すると９．０、１８．８、１２．１に改善した。これにより、マレイミド類、ＩＡＡによる蛍光のバックグラウンドの抑制効果は、還元剤ＤＴＴ、２－メルカプトエタノール、ＴＣＥＰを添加した場合において有効であり、特にマレイミド類が効果が高いことが示された。
本発明は、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができるので、化学、医薬、生化学分野等に幅広く利用可能である。

Claims (25)

  1. 　ＳＨ試薬及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定することを特徴とする、蛍光又は吸光度の検出方法。
  2. 　前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである請求項１に記載の蛍光又は吸光度の検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式［１］中、
    　Ｒ１は水素原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数６～１０のアリール基を表す。
    　Ｒ２は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。
    　ｎはＲ２の数を表し、０又は１である。）
  3. 　還元剤の共存下に、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応をＳＨ試薬の存在下で行うことを特徴とする、バックグラウンド抑制方法。
  4. 　前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである請求項３に記載のバックグラウンド抑制方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
  5. 　グルコースに、ＡＤＰおよびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、
    　前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、
    　ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、
    　を有することを特徴とするＡＤＰの測定方法。
  6. 　前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである請求項５に記載のＡＤＰの測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
  7. 　前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである請求項５に記載のＡＤＰの測定方法。
  8. 　ＡＴＰの存在下、ＡＤＰを生成する酵素を基質に作用させてＡＴＰをＡＤＰに変換させる第１－１工程と、
    　グルコースに、前記第１－１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、
    　前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、
    　ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、
    　を有することを特徴とするＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
  9. 　前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである請求項８に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
  10. 　前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである請求項８に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
  11. 　前記ＡＤＰを生成する酵素が、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項８に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
  12. 　糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＮＭＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、
    　グルコースに、前記第１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２－１工程と、
    　前記第２－１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２－２工程と、
    　ＳＨ試薬存在下、前記第２－２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２－３工程と、
    　を有することを特徴とする糖転移酵素の活性測定方法。
  13. 　前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである請求項１２に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
  14. 　前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである請求項１２に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
  15. 　前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１２に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
  16. 　グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン及びＳＨ試薬を含むことを特徴とするＡＤＰの測定用キット。
  17. 　前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである請求項１６に記載のＡＤＰの測定用キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
  18. 　前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである請求項１６に記載のＡＤＰの測定用キット。
  19. 　グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン並びにＳＨ試薬を含むことを特徴とするＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
  20. 　前記ＳＨ試薬が、下記一般式［１］で示されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである請求項１９に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
  21. 　前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである請求項２０に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
  22. 　ＡＴＰ及びＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ若しくはＣＭＰキナーゼを含む第１液と、
    　グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン、並びにＳＨ試薬を含む第２液と、
    　を含むことを特徴とする糖転移酵素の活性測定キット。
  23. 　前記第１液がさらに還元剤を含む請求項２２に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
  24. 　前記ＳＨ試薬が下記一般式［１］で示されるマレイミド化合物又は２－ヨードアセトアミドである請求項２２に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式［１］中、Ｒ１、Ｒ２、及びｎは前記と同一の意味を表す。）
  25. 　前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ－エチルマレイミド、マレイミド又はＮ－（２－スルホエチル）マレイミドである請求項２４に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
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