JP5875096B2 - 蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、adpの測定方法、adpを生成する酵素の活性測定方法、及び糖転移酵素の活性測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ADPの測定方法、キナーゼ等のADP産生酵素又は糖転移酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法、それを用いた糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性調節剤のスクリーニング方法、及びそれらのための測定キットに関する。
本願は、2013年11月21日に、日本に出願された特願2013−240926号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、2013年11月21日に、日本に出願された特願2013−240926号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
糖転移酵素はグリコシル基を含む供与体(G)から受容体(A)にグリコシル基を転移してG−Aをつくる反応を触媒する酵素の総称である(非特許文献1)。動物では9種類の糖ヌクレオチド(GDP−フコ-ス、GDP−マンノース、UDP−グルコース、UDP−ガラクトース、UDP−グルクロン酸、UDP−キシロース、UDP−N−アセチルグルコサミン、UDP−N−アセチルガラクトサミン、CMP−シアル酸)が主な供与体分子である(非特許文献2)。
これら供与体分子からグリコシル基を転移させる糖転移酵素はそれぞれフコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼと呼ばれている。
GDPはグアノシン5’−ニリン酸、UDPはウリジン5’−ニリン酸、CMPはシチジン5’−一リン酸の略である。受容体分子としては単糖、オリゴ糖、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質等が挙げられる。
これら供与体分子からグリコシル基を転移させる糖転移酵素はそれぞれフコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼと呼ばれている。
GDPはグアノシン5’−ニリン酸、UDPはウリジン5’−ニリン酸、CMPはシチジン5’−一リン酸の略である。受容体分子としては単糖、オリゴ糖、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質等が挙げられる。
生体分子の機能発現に糖鎖が重要な役割を果たしていることが知られており、糖転移酵素の活性異常は、がん、感染症、免疫疾患、炎症、神経疾患などの疾患と関連することが明らかにされている(非特許文献3)。従って、糖転移酵素の活性調節剤(阻害剤又は活性化剤)はこれらの疾患の新たな治療薬となることが期待される。
糖転移酵素の活性調節剤を探索するには糖転移酵素の活性を測定することが必要である。糖転移酵素の活性を測定する方法としては従来、放射性標識や蛍光標識した糖分子を用いてアッセイする方法や、非標識糖分子を用いて反応後にLC−MS(液体クロマトグラフィー質量分析機)等の機器分析により分離定量する方法等が用いられてきた(非特許文献4)。
しかしながら、これらの方法は標識糖供与体の化学合成が必要であったり、測定に特殊な装置(液体シンチレーターやLC−MS)が必要であったりと、簡便にアッセイすることが難しく、殊にマイクロプレートを用いて大量の数のアッセイ(ハイスループットスクリーニング)を行うことは難しかった。
また費用的にもコストのかかる方法であった。
しかしながら、これらの方法は標識糖供与体の化学合成が必要であったり、測定に特殊な装置(液体シンチレーターやLC−MS)が必要であったりと、簡便にアッセイすることが難しく、殊にマイクロプレートを用いて大量の数のアッセイ(ハイスループットスクリーニング)を行うことは難しかった。
また費用的にもコストのかかる方法であった。
一方、糖転移酵素反応で生成したヌクレオチドを市販のアッセイキット(Bellbrook Labs社製Transcreener(登録商標)GDP Assay、同UDP2 Assay、同AMP2/GMP2 Assay)を用いて蛍光偏光法で定量する方法や、酵素カップリング反応によりNADHの吸光度に導いて測定する方法(非特許文献5、6)、又はリン酸を遊離させてマラカイトグリーンの発色で定量する方法(非特許文献7)が知られているが、いずれも検出感度は低い。
また、酵素カップリングによりルシフェラーゼの化学発光に誘導して測定する方法も知られているが(特許文献1)、操作が煩雑であり感度は不明である。
また最近、蛍光標識された糖の転移を、蛍光偏光法を用いて高速にアッセイする方法も報告されたが(非特許文献8)、高分子性の基質にしか用いることはできず、全ての糖転移酵素に応用できる訳ではない。
このように、マイクロプレートを用いてあらゆる糖転移酵素を簡便かつ高感度にアッセイすることは従来の方法では難しく、糖転移酵素活性調節剤のハイスループットスクリーニングは困難なものであった。
また、酵素カップリングによりルシフェラーゼの化学発光に誘導して測定する方法も知られているが(特許文献1)、操作が煩雑であり感度は不明である。
また最近、蛍光標識された糖の転移を、蛍光偏光法を用いて高速にアッセイする方法も報告されたが(非特許文献8)、高分子性の基質にしか用いることはできず、全ての糖転移酵素に応用できる訳ではない。
このように、マイクロプレートを用いてあらゆる糖転移酵素を簡便かつ高感度にアッセイすることは従来の方法では難しく、糖転移酵素活性調節剤のハイスループットスクリーニングは困難なものであった。
一方、キナーゼは、ATP(アデノシン5’−三リン酸)などヌクレオシド三リン酸の末端リン酸基を水以外の化合物に転移し、リン酸化合物を生ずる反応を触媒する酵素の総称であり、EC2.7群のホスホトランスフェラーゼに分類される(非特許文献9)。リン酸化を受ける基質分子としては、糖、有機酸、脂質、タンパク質などが挙げられる。キナーゼは生体内のシグナル伝達に関わる重要な酵素分子でもある。ある種のがん細胞ではキナーゼ活性が亢進していることが知られ、キナーゼの阻害剤はいわゆる分子標的薬としてがんの治療に用いられている。また、キナーゼは炎症や免疫反応、糖尿病などにも関わっていることが知られている。
従ってキナーゼは、がん、炎症、自己免疫疾患、糖尿病等の疾患に対する治療薬開発の恰好の標的分子であり、その新た阻害剤の探索研究が広く行われている(非特許文献10)。
従ってキナーゼは、がん、炎症、自己免疫疾患、糖尿病等の疾患に対する治療薬開発の恰好の標的分子であり、その新た阻害剤の探索研究が広く行われている(非特許文献10)。
キナーゼ活性調節剤(阻害剤又は活性化剤)を探索するには、キナーゼの活性を測定することが必要である。キナーゼ活性の測定方法としては、リン酸化された生成物を定量する方法、ATPの減少量を測定する方法、ATPから生じたADP(アデノシン5’−ニリン酸)を定量する方法、が主な方法として挙げられる。
リン酸化された生成物を定量する方法としては、放射性ATPから生じる放射性生成物を放射能カウントで測定する方法、リン酸化された生成物を薄層クロマトグラフィー(TLC)や高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で定量する方法、リン酸化された生成物を抗体で検出し時間分解蛍光法等により分光学的に定量する方法(例えば、カルナバイオサイエンス社製QSS Assist(商標)TR−FRET アッセイキット)等が挙げられる。
ATPの減少量を測定する方法としては、キナーゼ反応液中の残存ATP量を、ルシフェラーゼを用いて化学発光で定量する方法(例えば、東洋ビーネット社製『細胞の』ATP 測定試薬(商標)が挙げられる。
ATPから生じたADPを定量する方法としては、1)ATPに再変換してルシフェラーゼと反応させ化学発光で定量する方法(例えば、プロメガ社製ADP−Glo(商標)Kinase Assay)、2)抗ADP抗体を用いて時間分解蛍光法または蛍光偏光法により分光学的に定量する方法(例えば、BellBrook Labs社製Transcreener(登録商標) ADP TR−FRET Assay、同Transcreener(登録商標)ADP Assay)、3)ADPにホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生じる過酸化水素にさらに10−アセチル−3,7−ジヒドロキシフェノキサジンとパーオキシダーゼを作用させて蛍光測定する方法(例えば、DiscoveRx社製ADP Hunter(商標)HS Assay)、4)ADPにグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下、G−6−Pデヒドロゲナーゼ)を作用させてNADPH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)を生成させてNADPHの吸光度または蛍光で定量する方法(特許文献2〜3)、5)ADPにグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、NADP、ジアホラーゼ、レサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で定量する方法(特許文献4)が挙げられる。
リン酸化された生成物を定量する方法としては、放射性ATPから生じる放射性生成物を放射能カウントで測定する方法、リン酸化された生成物を薄層クロマトグラフィー(TLC)や高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で定量する方法、リン酸化された生成物を抗体で検出し時間分解蛍光法等により分光学的に定量する方法(例えば、カルナバイオサイエンス社製QSS Assist(商標)TR−FRET アッセイキット)等が挙げられる。
ATPの減少量を測定する方法としては、キナーゼ反応液中の残存ATP量を、ルシフェラーゼを用いて化学発光で定量する方法(例えば、東洋ビーネット社製『細胞の』ATP 測定試薬(商標)が挙げられる。
ATPから生じたADPを定量する方法としては、1)ATPに再変換してルシフェラーゼと反応させ化学発光で定量する方法(例えば、プロメガ社製ADP−Glo(商標)Kinase Assay)、2)抗ADP抗体を用いて時間分解蛍光法または蛍光偏光法により分光学的に定量する方法(例えば、BellBrook Labs社製Transcreener(登録商標) ADP TR−FRET Assay、同Transcreener(登録商標)ADP Assay)、3)ADPにホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生じる過酸化水素にさらに10−アセチル−3,7−ジヒドロキシフェノキサジンとパーオキシダーゼを作用させて蛍光測定する方法(例えば、DiscoveRx社製ADP Hunter(商標)HS Assay)、4)ADPにグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下、G−6−Pデヒドロゲナーゼ)を作用させてNADPH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)を生成させてNADPHの吸光度または蛍光で定量する方法(特許文献2〜3)、5)ADPにグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、NADP、ジアホラーゼ、レサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で定量する方法(特許文献4)が挙げられる。
生化学辞典 第4版、p.931、東京化学同人、2007年
Essentials of Glycobiology、2nd edition、Part I、Chapter 4、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2009年(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1929/)
「きちんとわかる糖鎖工学」、産業技術総合研究所、白日社、2008年
ChemBioChem、Vol.11、No.14、pp.1939-1949、2010年
Anal. Biochem.、Vol.102、No.2、pp.441-449、1980年
Anal. Biochem.、Vol.220、No.1、pp.441-449、1994年
Glycobiology、Vol.21、No.6、pp.727-733、2011年
Angew. Chem. Int. Ed. Vol.50、No.52、pp.12534-12537、2011年
生化学辞典 第4版、p.340、東京化学同人、2007年
「分子標的薬開発への新たなる挑戦 有力な分子標的薬の創薬物語と新薬開発動向から次世代創薬テクノロジーまで」、岡野栄之、岩坪 威、佐谷秀行編、実験医学増刊、Vol.27、No.5、羊土社、2009年
このようにキナーゼの活性を測定する方法として各種の方法が知られているが、操作が煩雑である、特別の装置・施設が必要である、試薬が高価である、感度が十分でない等の理由により、大量のスクリーニングサンプルをアッセイするハイスループットスクリーニングに用いるには難点があった。
また、前記4)のADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼを用いて酵素カップリングによりNADPHに導いてNADPHの吸光度または蛍光で定量する方法は、検出感度が低いことに加え、スクリーニングサンプル化合物に由来する340nm波長付近の紫外・可視部吸収や自家蛍光が測定値に影響を与えるため正確な測定が行えないという問題があった。
また、前記5)のADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、NADP、ジアホラーゼ、レサズリンを作用させて生成物レゾルフィンの蛍光で測定する方法の場合、反応液中にジチオスレイトール(DTT)等の還元剤が含まれると、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで蛍光のバックグランドが上昇するため正確な測定が行えなくなるという問題があった。
還元剤は、化合物の非特異的吸着を抑えるためや、酵素などの試薬の安定化剤としてなど、反応系に加えられる場合が少なくない。
また、前記4)のADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼを用いて酵素カップリングによりNADPHに導いてNADPHの吸光度または蛍光で定量する方法は、検出感度が低いことに加え、スクリーニングサンプル化合物に由来する340nm波長付近の紫外・可視部吸収や自家蛍光が測定値に影響を与えるため正確な測定が行えないという問題があった。
また、前記5)のADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、NADP、ジアホラーゼ、レサズリンを作用させて生成物レゾルフィンの蛍光で測定する方法の場合、反応液中にジチオスレイトール(DTT)等の還元剤が含まれると、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで蛍光のバックグランドが上昇するため正確な測定が行えなくなるという問題があった。
還元剤は、化合物の非特異的吸着を抑えるためや、酵素などの試薬の安定化剤としてなど、反応系に加えられる場合が少なくない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ADPの測定方法、ADPを生成する酵素の活性測定方法、標的酵素の活性を簡便かつ高感度に測定することができる、糖転移酵素の活性測定方法、ADPの測定用キット、ADPを生成する酵素の活性測定キット、及び糖転移酵素活性測定キットを提供する。
本発明者らはレサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定する方法を種々検討した結果、SH試薬及びNADH又はNADPHの存在下、ジアホラーゼ(NAD(P)H脱水素酵素)によりレサズリンをレゾルフィンへと還元することにより生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定可能となることを見出した。
また、本発明者らは糖転移酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法を種々検討した結果、糖転移酵素により生成するGDP、UDP、又はCMPをATP存在下にNDPキナーゼ(ヌクレオシド5’−二リン酸キナーゼ)又はCMPキナーゼ(シトシン5’−一リン酸キナーゼ)と反応させることでADPを生成させ、このADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G−6−Pデヒドロゲナーゼ)、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを用いた酵素カップリングを行わせることにより、ほぼ全ての糖転移酵素の活性を簡便、高感度かつ定量的にマイクロプレートで、蛍光で定量することが可能であること、ADPをこの酵素カップリングにより蛍光定量する方法において反応液中にDTT等の還元剤が存在すると蛍光発色のバックグランドが高くなってADPの正確な定量が困難となるが、酵素カップリング反応の反応液中にSH試薬を共存させるとバックグランドが下がる一方、ADPの酵素カップリング反応自体には影響しないのでADPを精度よく測定できること、このSH試薬存在下のADP蛍光定量法は広範なキナーゼの活性定量に用いることができること、を見出した。
また、本発明者らは糖転移酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法を種々検討した結果、糖転移酵素により生成するGDP、UDP、又はCMPをATP存在下にNDPキナーゼ(ヌクレオシド5’−二リン酸キナーゼ)又はCMPキナーゼ(シトシン5’−一リン酸キナーゼ)と反応させることでADPを生成させ、このADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G−6−Pデヒドロゲナーゼ)、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを用いた酵素カップリングを行わせることにより、ほぼ全ての糖転移酵素の活性を簡便、高感度かつ定量的にマイクロプレートで、蛍光で定量することが可能であること、ADPをこの酵素カップリングにより蛍光定量する方法において反応液中にDTT等の還元剤が存在すると蛍光発色のバックグランドが高くなってADPの正確な定量が困難となるが、酵素カップリング反応の反応液中にSH試薬を共存させるとバックグランドが下がる一方、ADPの酵素カップリング反応自体には影響しないのでADPを精度よく測定できること、このSH試薬存在下のADP蛍光定量法は広範なキナーゼの活性定量に用いることができること、を見出した。
本発明は、かかる発見に基づきさらに検討を重ねて、蛍光又は吸光度の検出方法、糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の簡便かつ高感度な活性測定方法として完成したものである。
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ADPの測定方法、ADPを生成する酵素の活性測定方法、糖転移酵素の活性測定方法、ADPの測定用キット、ADPを生成する酵素の活性測定キット、糖転移酵素の活性測定キットを提供する。
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ADPの測定方法、ADPを生成する酵素の活性測定方法、糖転移酵素の活性測定方法、ADPの測定用キット、ADPを生成する酵素の活性測定キット、糖転移酵素の活性測定キットを提供する。
(1)下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬並びにNADH又はNADPHの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定することを特徴とする、蛍光又は吸光度の検出方法。
(式[1]中、R 1 は水素原子、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。)
(2)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(1)に記載の蛍光又は吸光度の検出方法。
(2)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(1)に記載の蛍光又は吸光度の検出方法。
(3)還元剤の共存下に、NADH若しくはNADPH、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応を下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬の存在下で行うことを特徴とする、バックグラウンド抑制方法。
(式[1]中、R 1 は水素原子、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。)
(4)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(3)に記載のバックグラウンド抑制方法。
(4)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(3)に記載のバックグラウンド抑制方法。
(5)グルコースに、ADPおよびADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とするADPの測定方法。
(式[1]中、R 1 は水素原子、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。)
(6)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(5)に記載のADPの測定方法。
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とするADPの測定方法。
(6)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(5)に記載のADPの測定方法。
(7)ATPの存在下、ADPを生成する酵素を基質に作用させてATPをADPに変換させる第1−1工程と、
グルコースに、前記第1−1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とするADPを生成する酵素の活性測定方法。
(式[1]中、R 1 は水素原子、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。)
(8)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(7)に記載のADPを生成する酵素の活性測定方法。
(9)前記ADPを生成する酵素が、キナーゼ、ATPアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−CoAカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である前記(7)又は(8)に記載のADPを生成する酵素の活性測定方法。
グルコースに、前記第1−1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とするADPを生成する酵素の活性測定方法。
(8)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(7)に記載のADPを生成する酵素の活性測定方法。
(9)前記ADPを生成する酵素が、キナーゼ、ATPアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−CoAカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である前記(7)又は(8)に記載のADPを生成する酵素の活性測定方法。
(10)糖転移酵素反応で生じるGDP若しくはUDPをATP存在下にNDPキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるCMPをATP存在下にNMPキナーゼ又はCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる第1工程と、
グルコースに、前記第1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とする糖転移酵素の活性測定方法。
(式[1]中、R 1 は水素原子、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。)
(11)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(10)に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
(12)前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である前記(10)又は(11)に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
グルコースに、前記第1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とする糖転移酵素の活性測定方法。
(11)前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(10)に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
(12)前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である前記(10)又は(11)に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
(13)グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン並びに下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬を含むことを特徴とするADPの測定用キット。
(式[1]中、R 1 は水素原子、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。)
(14)前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(13)に記載のADPの測定用キット。
(14)前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(13)に記載のADPの測定用キット。
(15)グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン並びに下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬を含むことを特徴とするADPを生成する酵素の活性測定キット。
(式[1]中、R 1 は水素原子、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。)
(16)前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(15)に記載のADPを生成する酵素の活性測定キット。
(16)前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(15)に記載のADPを生成する酵素の活性測定キット。
(17)ATP及びNMPキナーゼ、NDPキナーゼ若しくはCMPキナーゼを含む第1液と、
グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン、並びに下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬を含む第2液と、
を含むことを特徴とする糖転移酵素の活性測定キット。
(式[1]中、R 1 は水素原子、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。)
(18)前記第1液がさらに還元剤を含む前記(17)に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
(19)前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(17)又は(18)に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン、並びに下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬を含む第2液と、
を含むことを特徴とする糖転移酵素の活性測定キット。
(18)前記第1液がさらに還元剤を含む前記(17)に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
(19)前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである前記(17)又は(18)に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
本発明によれば、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる。
本発明によれば、糖転移酵素、又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法を提供することができる。
本発明は、マイクロプレートを用いるアッセイに適しているため、本発明によれば、糖転移酵素、又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性調節剤のハイスループットスクリーニングが可能となる。
本発明によれば、糖転移酵素、又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法を提供することができる。
本発明は、マイクロプレートを用いるアッセイに適しているため、本発明によれば、糖転移酵素、又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性調節剤のハイスループットスクリーニングが可能となる。
以下、本発明の好ましい例を説明するが、本発明はこれら例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
<蛍光又は吸光度の検出方法>
以下、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の好ましい形態について、図1を参照しながら説明する。図1は、本発明の蛍光又は吸光度の検出方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の活性測定を行う場合の反応経路である。
図1中、第2−3工程として示すように、本発明の蛍光又は吸光度の検出方法は、SH試薬及びNADH又はNADPHの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する。
<蛍光又は吸光度の検出方法>
以下、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の好ましい形態について、図1を参照しながら説明する。図1は、本発明の蛍光又は吸光度の検出方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の活性測定を行う場合の反応経路である。
図1中、第2−3工程として示すように、本発明の蛍光又は吸光度の検出方法は、SH試薬及びNADH又はNADPHの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する。
蛍光強度又は吸光度の測定は、例えば、SH試薬、NADH又はNADPH、ジアホラーゼ、レサズリンとの混合液(以下、第2−3工程用混合液という)を得て酵素カップリング反応させることで、NADH又はNADPHをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。第2−3工程用混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるSH試薬、NADH又はNADPH、ジアホラーゼ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
第2−3工程で用いられるジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
添加後の各成分の濃度は、ジアホラーゼが0.2〜20μg/ml、NADH又はNADPHが1〜500μM、10〜500μM、レサズリンが5〜250μMとなるように用いることが好ましい。SH試薬の濃度は、通常1μM〜100mMとなるように用いることが好ましく、第2−3工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第2−3工程の酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第2−3工程の酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
第2−3工程用混合液には、SH試薬を添加して第2−3工程の反応を行う。例えば、反応液中に還元剤が存在したまま第2−3工程の反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第2−3工程用混合液にSH試薬が添加されていることで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
SH試薬はチオール基と反応する試薬で、タンパク質中のシステイン残基の定量や化学修飾に用いられる化合物である。1)5,5'−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、2,2'(4,4')−ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、2)p−メルクリ安息香酸(PMB)、p−メルクリベンゼンスルホン酸(PMBS)などのメルカプチド形成剤、3) ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、N−エチルマレイミド(NEM)などのアルキル化剤が挙げられる(生化学辞典 第4版、p.173、東京化学同人、2007年参照)。
本発明で用いるSH試薬としては、中性pH域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド、N−フェニルマレイミド、N−(2−クロロフェニル)マレイミド、N−(4−カルボキシ−3−ヒドロキシフェニル)マレイミド等のマレイミド誘導体(マレイミド化合物)、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体(マレイミド化合物)が好適である。
SH試薬はチオール基と反応する試薬で、タンパク質中のシステイン残基の定量や化学修飾に用いられる化合物である。1)5,5'−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、2,2'(4,4')−ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、2)p−メルクリ安息香酸(PMB)、p−メルクリベンゼンスルホン酸(PMBS)などのメルカプチド形成剤、3) ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、N−エチルマレイミド(NEM)などのアルキル化剤が挙げられる(生化学辞典 第4版、p.173、東京化学同人、2007年参照)。
本発明で用いるSH試薬としては、中性pH域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド、N−フェニルマレイミド、N−(2−クロロフェニル)マレイミド、N−(4−カルボキシ−3−ヒドロキシフェニル)マレイミド等のマレイミド誘導体(マレイミド化合物)、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体(マレイミド化合物)が好適である。
本発明の蛍光又は吸光度の検出方法で用いるSH試薬としては、下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物又は2−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
(式[1]中、
R1は水素原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数6〜10のアリール基を表す。
R2は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。
nはR2の数を表し、0又は1である。)
R1は水素原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数6〜10のアリール基を表す。
R2は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。
nはR2の数を表し、0又は1である。)
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、n−ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、n−プロポキシ基、イソ−プロポキシ基、n−ブトキシ基、tert−ブトキシ基、n−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基は、少なくとも一つの水素原子が独立して選ばれる水酸基で置換されているアルキル基である。R1及びR2の炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基のアルキル基としては、前記R1及びR2の炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基で例示したものと同様のものが挙げられる。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基は、少なくとも一つの水素原子が独立して選ばれるスルホ基で置換されているアルキル基である。R1及びR2の炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基のアルキル基としては、前記R1及びR2の炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基で例示したものと同様のものが挙げられる。
R1の前記炭素数6〜10のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
R2の前記ハロゲン原子は、F,Cl, Br, I等の周期表において第17族に属する元素である。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、n−プロポキシ基、イソ−プロポキシ基、n−ブトキシ基、tert−ブトキシ基、n−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基は、少なくとも一つの水素原子が独立して選ばれる水酸基で置換されているアルキル基である。R1及びR2の炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基のアルキル基としては、前記R1及びR2の炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基で例示したものと同様のものが挙げられる。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基は、少なくとも一つの水素原子が独立して選ばれるスルホ基で置換されているアルキル基である。R1及びR2の炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基のアルキル基としては、前記R1及びR2の炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基で例示したものと同様のものが挙げられる。
R1の前記炭素数6〜10のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
R2の前記ハロゲン原子は、F,Cl, Br, I等の周期表において第17族に属する元素である。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、炭素数1〜4が好ましく、炭素数1〜3がより好ましい。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、炭素数1〜4が好ましく、炭素数1〜3がより好ましい。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基としては、炭素数1〜4が好ましく、炭素数1〜3がより好ましい。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基としては、炭素数1〜4が好ましく、炭素数1〜3がより好ましい。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、炭素数1〜4が好ましく、炭素数1〜3がより好ましい。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基としては、炭素数1〜4が好ましく、炭素数1〜3がより好ましい。
R1及びR2の前記炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基としては、炭素数1〜4が好ましく、炭素数1〜3がより好ましい。
R1及びR2のアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、又はスルホアルキル基が有していてもよい置換基は、炭化水素基中の水素原子(H)を置換しているものであり、置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基等が挙げられる。
R1のアリール基が有していてもよい置換基は、アリール基中の水素原子(H)を置換しているものであり、置換基としては、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、カルボキシル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
R1のアリール基が有していてもよい置換基は、アリール基中の水素原子(H)を置換しているものであり、置換基としては、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、カルボキシル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
<バックグラウンド抑制方法>
以下、本発明のバックグラウンド抑制方法の好ましい形態について、図1を参照しながら説明する。図1は、本発明のバックグラウンド抑制方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の活性測定を行う場合の反応経路である。
本発明のバックグラウンド抑制方法は、還元剤の共存下に、図1中の第2−3工程として示すような、NADH若しくはNADPH、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて、当該反応により生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応をSH試薬の存在下で行うものである。
以下、本発明のバックグラウンド抑制方法の好ましい形態について、図1を参照しながら説明する。図1は、本発明のバックグラウンド抑制方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の活性測定を行う場合の反応経路である。
本発明のバックグラウンド抑制方法は、還元剤の共存下に、図1中の第2−3工程として示すような、NADH若しくはNADPH、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて、当該反応により生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応をSH試薬の存在下で行うものである。
還元剤が存在したまま第2−3工程の反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第2−3工程用混合液にSH試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
バックグラウンド抑制する対象の反応系としては、例えば、SH試薬、NADH又はNADPH、ジアホラーゼ、レサズリンとの混合液(以下、第2−3工程用混合液という)に還元剤が添加された混合液が挙げられる。第2−3工程用混合液に還元剤が添加された混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるSH試薬、NADH又はNADPH、ジアホラーゼ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
当該混合液中で、第2−3工程として示す反応を進めることで、NADH又はNADPHをレゾルフィンの蛍光発光が生じる。ここで当該混合液にSH試薬が添加されているので、前記蛍光発光を定量する際、検出対象とすべきシグナル以外のバックグラウンドのシグナルの上昇を抑えることができる。
当該混合液中で、第2−3工程として示す反応を進めることで、NADH又はNADPHをレゾルフィンの蛍光発光が生じる。ここで当該混合液にSH試薬が添加されているので、前記蛍光発光を定量する際、検出対象とすべきシグナル以外のバックグラウンドのシグナルの上昇を抑えることができる。
第2−3工程で用いられるジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
添加後の各成分の濃度は、還元剤が1μM〜5mM、ジアホラーゼが0.2〜20μg/ml、NADH又はNADPHが1〜500μM、10〜500μM、レサズリンが5〜250μMとなるように用いることが好ましい。SH試薬の濃度は、通常1μM〜100mMとなるように用いることが好ましく、第2−3工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第2−3工程の酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第2−3工程の酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
本発明のバックグラウンド抑制方法で用いるSH試薬としては、中性pH域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
本発明で用いるSH試薬としては、上記一般式[1]で表されるマレイミド化合物又は2−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
<ADPの測定方法>
以下、本発明のADPの測定方法の好ましい形態について、図1を参照しながら説明する。図1は、本発明のADPの測定方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の酵素反応により生成されたADPの測定を行う場合の反応経路である。
図1中、第2−1工程、第2−2工程、及び第2−3工程からなる第2工程として示すように、本発明のADPの測定方法は、グルコースに、ADPおよびADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、SH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、を有する。
以下、本発明のADPの測定方法の好ましい形態について、図1を参照しながら説明する。図1は、本発明のADPの測定方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の酵素反応により生成されたADPの測定を行う場合の反応経路である。
図1中、第2−1工程、第2−2工程、及び第2−3工程からなる第2工程として示すように、本発明のADPの測定方法は、グルコースに、ADPおよびADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、SH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、を有する。
ADPの測定は、例えば、ADPを定量するための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD若しくはNADP、及びレサズリンとの混合液(以下、第2工程用混合液という)にADPが添加された混合液を得て、酵素カップリング反応させることで、ADPをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。第2工程用混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD若しくはNADP、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
添加後の各成分の濃度は、グルコースが0.1〜10mM、ADP依存性ヘキソキナーゼが5〜500μg/ml、G−6−Pデヒドロゲナーゼが1〜100μg/ml、ジアホラーゼが0.2〜20μg/ml、NAD又はNADPが1〜500μM、10〜500μM、レサズリンが5〜250μMとなるように用いることが好ましい。SH試薬の濃度は、通常1μM〜100mMとなるように用いることが好ましく、第2−3工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第2工程の酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
添加後の各成分の濃度は、グルコースが0.1〜10mM、ADP依存性ヘキソキナーゼが5〜500μg/ml、G−6−Pデヒドロゲナーゼが1〜100μg/ml、ジアホラーゼが0.2〜20μg/ml、NAD又はNADPが1〜500μM、10〜500μM、レサズリンが5〜250μMとなるように用いることが好ましい。SH試薬の濃度は、通常1μM〜100mMとなるように用いることが好ましく、第2−3工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第2工程の酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
また、第2工程で用いられるADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
本発明のADPの測定方法では、第2工程用混合液にSH試薬を添加して第2工程の反応を行わせる。例えば、還元剤が存在したまま第2工程の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第2工程の酵素カップリング用混合液にSH試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
還元剤存在下で本発明のADPの測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
還元剤存在下で本発明のADPの測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
本発明のADPの測定方法で用いるSH試薬としては、中性pH域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
本発明で用いるSH試薬としては、上記一般式[1]で表されるマレイミド化合物又は2−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
本発明のADPの測定方法は、ADPの他、ADPを反応で生成する酵素の広範囲な活性測定方法としても用いることが可能である。
<ADPを生成する酵素の活性測定方法>
一方、本発明の上記第2工程のADPの定量方法はキナーゼなどADPを反応で生成する酵素の広範な活性測定法としても用いることが可能である。
即ち、本発明のADPを生成する酵素の活性測定方法は、ADPを生成する酵素反応で生じるADPをSH試薬存在下にグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で測定する。
本発明のADPを生成する酵素の活性測定方法は、図1中、第1−1工程、並びに第2−1工程、第2−2工程及び第2−3工程からなる第2工程として示すように、
ATPの存在下、ADPを生成する酵素を基質に作用させてATPをADPに変換させる第1−1工程と、グルコースに、前記第1−1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、SH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、を有する。
以下、本発明の好ましい実施形態について、キナーゼを例に説明する。
一方、本発明の上記第2工程のADPの定量方法はキナーゼなどADPを反応で生成する酵素の広範な活性測定法としても用いることが可能である。
即ち、本発明のADPを生成する酵素の活性測定方法は、ADPを生成する酵素反応で生じるADPをSH試薬存在下にグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で測定する。
本発明のADPを生成する酵素の活性測定方法は、図1中、第1−1工程、並びに第2−1工程、第2−2工程及び第2−3工程からなる第2工程として示すように、
ATPの存在下、ADPを生成する酵素を基質に作用させてATPをADPに変換させる第1−1工程と、グルコースに、前記第1−1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、SH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、を有する。
以下、本発明の好ましい実施形態について、キナーゼを例に説明する。
測定対象とするキナーゼは、動植物組織や細胞から抽出したもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも良いが、精製したものが好ましい。
前記キナーゼとしては、例えばプロテインキナーゼA、プロテインキナーゼC、カルモジュリンキナーゼ、カゼインキナーゼ等が挙げられる。
本発明において、酵素活性を測定しようとするキナーゼ反応は、キナーゼ、リン酸ドナー分子(通常はATP)およびリン酸アクセプター分子(キナーゼに応じた基質分子)を緩衝液中で混合して行う。それぞれの添加濃度は、キナーゼは酵素反応率が1〜50%程度となる濃度で添加するのが好ましく、リン酸ドナー分子(主としてATP)は10〜1000μMで添加するのが好ましく、リン酸アクセプター分子は5〜500μMで添加することが好ましい。キナーゼ反応に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mMが好ましく、pHは7〜9が好ましい。添加物として必要に応じ、10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜20mM MgCl2、1〜20mM MnCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
前記キナーゼとしては、例えばプロテインキナーゼA、プロテインキナーゼC、カルモジュリンキナーゼ、カゼインキナーゼ等が挙げられる。
本発明において、酵素活性を測定しようとするキナーゼ反応は、キナーゼ、リン酸ドナー分子(通常はATP)およびリン酸アクセプター分子(キナーゼに応じた基質分子)を緩衝液中で混合して行う。それぞれの添加濃度は、キナーゼは酵素反応率が1〜50%程度となる濃度で添加するのが好ましく、リン酸ドナー分子(主としてATP)は10〜1000μMで添加するのが好ましく、リン酸アクセプター分子は5〜500μMで添加することが好ましい。キナーゼ反応に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mMが好ましく、pHは7〜9が好ましい。添加物として必要に応じ、10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜20mM MgCl2、1〜20mM MnCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
また、測定しようとするキナーゼに還元剤要求性がある場合や、酵素活性を上昇させる(活性化・賦活化させる)ための活性化剤(賦活化剤)として、或いはスクリーニング時の化合物の非特異的吸着を抑えるため、酵素などの試薬の安定化剤として、DTT、2−メルカプトエタノール、又はTCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)等の還元剤を添加して反応させるのが好ましい。DTT、2−メルカプトエタノール又はTCEPの添加濃度は、測定しようとするキナーゼの還元剤要求性等にもよるが、0.1〜10mMの範囲内が好ましい。反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。キナーゼ反応後の反応液中のADP濃度は0.1〜50μMの範囲にあることが好ましく、0.5〜25μMの範囲にあることがより好ましい。これより濃い反応液の場合は希釈してこの範囲に収まるようにすることが好ましい。
キナーゼ反応で生成したADPはグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを加えて酵素カップリングングさせることでレゾルフィンの蛍光で定量する。これらは別々に添加することも可能だが、予め混合して(以下、酵素カップリング用混合液というが、組成は前述第2工程用混合液と同じ)キナーゼ反応後の反応液に一度に加えることも可能である。
キナーゼ反応後の反応液に添加する際のこれら成分の終濃度は、グルコースが0.5〜5mM、ADP依存性ヘキソキナーゼが5〜100μg/ml、G−6−Pデヒドロゲナーゼが0.5〜10μg/ml、ジアホラーゼが0.2〜20μg/ml、0.5〜10μg/ml、NADPが20〜400μM、レサズリンが5〜250μM、10〜200μMとなるように調製することが好ましい。SH試薬の濃度は、通常1μM〜100mMとなるように用いることが好ましく、酵素カップリング用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
添加に用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液等が用いられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM MnCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
キナーゼ反応後の反応液に添加する際のこれら成分の終濃度は、グルコースが0.5〜5mM、ADP依存性ヘキソキナーゼが5〜100μg/ml、G−6−Pデヒドロゲナーゼが0.5〜10μg/ml、ジアホラーゼが0.2〜20μg/ml、0.5〜10μg/ml、NADPが20〜400μM、レサズリンが5〜250μM、10〜200μMとなるように調製することが好ましい。SH試薬の濃度は、通常1μM〜100mMとなるように用いることが好ましく、酵素カップリング用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
添加に用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液等が用いられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM MnCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
多くのキナーゼで酵素活性の発揮には還元剤の添加が必要だが、還元剤が存在したままADP定量の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。
本発明では、酵素カップリング用混合液に上記したSH試薬を添加することで、還元剤を不活化させ、バックグランドの上昇を抑えた測定を可能としている。キナーゼ活性の測定で用いるSH試薬としては、中性pH域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物やN−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が挙げられる。酵素カップリング反応に添加する量としては、キナーゼ反応に用いた還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
本発明では、酵素カップリング用混合液に上記したSH試薬を添加することで、還元剤を不活化させ、バックグランドの上昇を抑えた測定を可能としている。キナーゼ活性の測定で用いるSH試薬としては、中性pH域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物やN−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が挙げられる。酵素カップリング反応に添加する量としては、キナーゼ反応に用いた還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
本発明で用いるSH試薬としては、上記一般式[1]で表されるマレイミド化合物又は2−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
本発明のADP定量法はキナーゼ以外にも、ADPを産生する酵素の活性測定に用いることができる。キナーゼ以外にADPを産生する酵素としては、ATPアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−CoAカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルタチオンシンターゼ等が挙げられる。
糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性測定に用いる容器としては反応が進行するものであれば制限はないが、マイクロプレートが好適である。マイクロプレートとしては96穴、384穴、1536穴等の種類があるが、何れも用いられる。
マイクロプレートを用いてまず糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の反応を行い、その反応液に対し、糖転移酵素の場合は第1工程用混合液を添加して第1工程の反応を行い、次に第2工程用混合液を添加して第2工程の反応を行わせた後、マイクロプレートリーダーで生成物(レゾルフィン)の蛍光を測定する。
キナーゼの場合は、キナーゼ反応液に酵素カップリング用混合液を添加して反応を行わせた後、マイクロプレートリーダーで同様にレゾルフィンの蛍光を測定する。レゾルフィンを蛍光測定する際の励起波長は530〜570nm、蛍光波長は580〜610nmが好ましい。
本発明の方法でADPを蛍光発色させる反応は、反応温度25℃の場合、30分でほぼ終了し、その後約2時間は蛍光値が安定に保たれるため、蛍光測定時に反応を停止させる操作は特に必要ない。
マイクロプレートを用いてまず糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の反応を行い、その反応液に対し、糖転移酵素の場合は第1工程用混合液を添加して第1工程の反応を行い、次に第2工程用混合液を添加して第2工程の反応を行わせた後、マイクロプレートリーダーで生成物(レゾルフィン)の蛍光を測定する。
キナーゼの場合は、キナーゼ反応液に酵素カップリング用混合液を添加して反応を行わせた後、マイクロプレートリーダーで同様にレゾルフィンの蛍光を測定する。レゾルフィンを蛍光測定する際の励起波長は530〜570nm、蛍光波長は580〜610nmが好ましい。
本発明の方法でADPを蛍光発色させる反応は、反応温度25℃の場合、30分でほぼ終了し、その後約2時間は蛍光値が安定に保たれるため、蛍光測定時に反応を停止させる操作は特に必要ない。
<糖転移酵素の活性測定方法>
以下、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の好ましい形態について、図1を参照しながら説明する。図1は、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の原理を表す反応経路である。
図1に示すように、本発明の糖転移酵素の活性測定方法は、糖転移酵素反応で生じるGDP若しくはUDPをATP存在下にNDPキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるCMPをATP存在下にCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる第1工程と、前記ADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを用いて酵素カップリング反応により蛍光で定量する第2工程と、
を有する。
すなわち、本発明の糖転移酵素の活性測定方法は、
糖転移酵素反応で生じるGDP若しくはUDPをATP存在下にNDPキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるCMPをATP存在下にNMPキナーゼ又はCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる第1工程と、
グルコースに、前記第1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、SH試薬存在下、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、を有する。
以下、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の好ましい形態について、図1を参照しながら説明する。図1は、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の原理を表す反応経路である。
図1に示すように、本発明の糖転移酵素の活性測定方法は、糖転移酵素反応で生じるGDP若しくはUDPをATP存在下にNDPキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるCMPをATP存在下にCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる第1工程と、前記ADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを用いて酵素カップリング反応により蛍光で定量する第2工程と、
を有する。
すなわち、本発明の糖転移酵素の活性測定方法は、
糖転移酵素反応で生じるGDP若しくはUDPをATP存在下にNDPキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるCMPをATP存在下にNMPキナーゼ又はCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる第1工程と、
グルコースに、前記第1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、SH試薬存在下、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、を有する。
測定対象の糖転移酵素は、動植物由来のもの、微生物由来のもの、生体由来のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
測定対象の糖転移酵素は、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
測定対象の糖転移酵素は、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
また、第1工程及び第2工程で用いられるNDPキナーゼ、CMPキナーゼ、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
糖転移酵素の働きでGDP−フコース、GDP−マンノース、UDP−グルコース、UDP−ガラクトース、UDP−グルクロン酸、UDP−キシロース、UDP−N−アセチルグルコサミン、UDP−N−アセチルガラクトサミン、CMP−シアル酸等の糖供与体分子から糖(それぞれ、フコース、マンノース、グルコース、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、シアル酸)が糖受容体分子に転移すると、糖供与体分子からヌクレオチド(GDP、UDP、CMP)が遊離する。
本発明は、このGDP、UDP、又はCMPを、酵素カップリング反応を用いて蛍光で定量することで糖転移酵素活性を測定するものである。
本発明は、このGDP、UDP、又はCMPを、酵素カップリング反応を用いて蛍光で定量することで糖転移酵素活性を測定するものである。
従来、GDP、UDP、又はCMPの高感度かつ簡便な定量は困難であったが、本発明では、次の2つの工程から成る酵素カップリング反応によりGDP、UDP、又はCMPの高感度かつ簡便な測定を可能にした。
第1工程:糖転移反応で糖供与体分子から生じるヌクレオチドがGDP又はUDPである場合は、糖転移反応後の反応液にATP存在下NDPキナーゼを作用させてGDP又はUDPを、それぞれGTP、又はUTPに変換するとともに、定量的にADPを産生させる。糖転移反応で糖供与体分子から生じるヌクレオチドがCMPである場合は、糖転移反応後の反応液にATP存在下CMPキナーゼを作用させてCMPをCDPに変換するとともに定量的にADPを産生させる。
第2工程:第1工程で生じたADPを、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP又はNAD、及びレサズリンを用いた酵素カップリング反応により蛍光性のレゾルフィンの蛍光発色へと導き、これを蛍光で定量する。
本発明において、酵素活性を測定しようとする糖転移反応は、糖転移酵素、糖供与体分子、及び糖受容体分子を緩衝液中で混合することで行わせる。糖転移酵素は、酵素反応率が1〜50%程度となる濃度で添加することが好ましく、糖供与体分子は10〜500μMで添加することが好ましく、糖受容体分子は10〜5000μMで添加することが好ましい。
糖転移反応に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは6〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM MnCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。糖転移反応後の反応液中の遊離ヌクレオチド濃度は0.1〜100μMの範囲にあることが好ましく、0.5〜50μMの範囲にあることがより好ましい。100μMより濃い反応液の場合は、希釈してこの範囲に収まるようにすることが好ましい。
反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。糖転移反応後の反応液中の遊離ヌクレオチド濃度は0.1〜100μMの範囲にあることが好ましく、0.5〜50μMの範囲にあることがより好ましい。100μMより濃い反応液の場合は、希釈してこの範囲に収まるようにすることが好ましい。
糖転移反応の結果、糖供与体分子から遊離したヌクレオチド(GDP、UDP、CMP)を定量するため、第1工程では、糖転移反応後の反応液にATP、及びNDPキナーゼ又はCMPキナーゼを添加してリン酸交換反応を行わせてADPを生成させる。
NDPキナーゼはATP存在下、GDP、又はUDPをリン酸化してそれぞれGTP、又はUTPに変換するとともにGTP、又はUTPと等モル量のADPを生成する酵素である。
CMPキナーゼはATP存在下、CMPをリン酸化してCDPに変換するとともにCDPと等モル量のADPを生成する酵素である。本発明において、ATP存在下にCMPをリン酸化してCDPに変換するとともにCDPと等モル量のADPを生成する酵素であればCMPキナーゼとして用いることができ、例えば、NMPキナーゼ(ヌクレオシド5’−一リン酸キナーゼ)と称されている酵素も当該酵素活性を持つので、CMPキナーゼとして用いることができる。
NDPキナーゼはATP存在下、GDP、又はUDPをリン酸化してそれぞれGTP、又はUTPに変換するとともにGTP、又はUTPと等モル量のADPを生成する酵素である。
CMPキナーゼはATP存在下、CMPをリン酸化してCDPに変換するとともにCDPと等モル量のADPを生成する酵素である。本発明において、ATP存在下にCMPをリン酸化してCDPに変換するとともにCDPと等モル量のADPを生成する酵素であればCMPキナーゼとして用いることができ、例えば、NMPキナーゼ(ヌクレオシド5’−一リン酸キナーゼ)と称されている酵素も当該酵素活性を持つので、CMPキナーゼとして用いることができる。
第1工程で添加するATPと、NDPキナーゼ又はCMPキナーゼとは、それぞれ単独で添加しても良く、あるいは混合液として添加しても良い。何れの場合もATPは糖転移反応液に存在する遊離ヌクレオチドよりも2倍モル濃度以上かつ1mM程度以内の濃度となるように添加することが好ましい。
NDPキナーゼ又はCMPキナーゼは0.2〜20μg/mlの添加量が好ましい。これらの添加に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。なお、CMPキナーゼは還元剤の添加により酵素活性が上昇することから、第1工程でCMPキナーゼを用いる場合は還元剤を同時に添加し、還元剤の存在下、ADPを生成させることが好ましい。なお、測定しようとするキナーゼに還元剤要求性がある場合以外にも、酵素活性を上昇させる(活性化・賦活化させる)ための活性化剤(賦活化剤)として、或いはスクリーニング時の化合物の非特異的吸着を抑えるため、酵素などの試薬の安定化剤として、還元剤を添加して反応させるのが好ましい。還元剤としてはジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。添加量は1μM〜5mMが好ましく、0.1〜5mMがより好ましい。
NDPキナーゼ又はCMPキナーゼは0.2〜20μg/mlの添加量が好ましい。これらの添加に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。なお、CMPキナーゼは還元剤の添加により酵素活性が上昇することから、第1工程でCMPキナーゼを用いる場合は還元剤を同時に添加し、還元剤の存在下、ADPを生成させることが好ましい。なお、測定しようとするキナーゼに還元剤要求性がある場合以外にも、酵素活性を上昇させる(活性化・賦活化させる)ための活性化剤(賦活化剤)として、或いはスクリーニング時の化合物の非特異的吸着を抑えるため、酵素などの試薬の安定化剤として、還元剤を添加して反応させるのが好ましい。還元剤としてはジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。添加量は1μM〜5mMが好ましく、0.1〜5mMがより好ましい。
第2工程では、第1工程で得られた反応液に、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを加えて酵素カップリング反応させることで、ADPをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。ADPを定量するための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、G−6−Pデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP又はNAD、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらを混合しておいて(以下、第2工程用混合液という)、一度に加えることも可能である。
添加後の各成分の濃度は、グルコースが0.1〜10mM、ADP依存性ヘキソキナーゼが5〜500μg/ml、G−6−Pデヒドロゲナーゼが1〜100μg/ml、ジアホラーゼが0.2〜20μg/ml、NADPが10〜500μM、レサズリンが5〜250μMとなるように用いることが好ましい。SH試薬の濃度は、通常1μM〜100mMとなるように用いることが好ましく、酵素カップリング用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第2工程の酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
添加後の各成分の濃度は、グルコースが0.1〜10mM、ADP依存性ヘキソキナーゼが5〜500μg/ml、G−6−Pデヒドロゲナーゼが1〜100μg/ml、ジアホラーゼが0.2〜20μg/ml、NADPが10〜500μM、レサズリンが5〜250μMとなるように用いることが好ましい。SH試薬の濃度は、通常1μM〜100mMとなるように用いることが好ましく、酵素カップリング用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は10〜200mM、pHは7〜9が好ましい。添加物として10〜200mM NaCl、10〜200mM KCl、5〜40mM NaF、1〜40mM MgCl2、1〜20mM CaCl2、100〜500μM Na3VO4等の塩類、0.01〜1%のTritonX−100等の界面活性剤、0.01〜1%のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第2工程の酵素カップリング反応の反応温度は20〜37℃が好ましく、反応時間は10分〜3時間が好ましい。
還元剤存在下で第2−3工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。還元剤は1μM〜5mMとなるよう添加されることが好ましい。
また、第1工程で還元剤を添加した場合は、第2工程用混合液にSH試薬を添加して第2工程の反応を行わせることが好ましい。還元剤が存在したまま第2工程の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第2工程の酵素カップリング用混合液にSH試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
SH試薬はチオール基と反応する試薬で、タンパク質中のシステイン残基の定量や化学修飾に用いられる化合物である。1)5,5'−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、2,2'(4,4')−ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、2)p−メルクリ安息香酸(PMB)、p−メルクリベンゼンスルホン酸(PMBS)などのメルカプチド形成剤、3) ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、N−エチルマレイミド(NEM)などのアルキル化剤が挙げられる(生化学辞典 第4版、p.173、東京化学同人、2007年参照)。
本発明で用いるSH試薬としては、中性pH域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
SH試薬はチオール基と反応する試薬で、タンパク質中のシステイン残基の定量や化学修飾に用いられる化合物である。1)5,5'−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、2,2'(4,4')−ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、2)p−メルクリ安息香酸(PMB)、p−メルクリベンゼンスルホン酸(PMBS)などのメルカプチド形成剤、3) ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、N−エチルマレイミド(NEM)などのアルキル化剤が挙げられる(生化学辞典 第4版、p.173、東京化学同人、2007年参照)。
本発明で用いるSH試薬としては、中性pH域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、N−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
本発明で用いるSH試薬としては、上記一般式[1]で表されるマレイミド化合物又は2−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
第2工程の酵素カップリング反応に添加する量としては、第1工程の反応に用いた還元剤と等価となる量もしくはその20倍程度までの量が好適である。
第1工程と第2工程の反応は、同時に行わせることもできる。同時に行わせることができるのは、GDPまたはUDPを測定する場合である。CMPを測定する場合は、還元剤の添加とその不活化の操作が必要となるので、第1工程と第2工程を同時に行わせるのは好ましくない。
第1工程と第2工程の反応は、同時に行わせることもできる。同時に行わせることができるのは、GDPまたはUDPを測定する場合である。CMPを測定する場合は、還元剤の添加とその不活化の操作が必要となるので、第1工程と第2工程を同時に行わせるのは好ましくない。
<酵素活性調節剤のスクリーニング方法>
上述した本発明の酵素の活性測定方法を用いて、糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性調節剤をスクリーニングするには、好適にはマイクロプレートを用いて各ウェルに被験化合物を添加し、被験化合物の存在下、及び対照群として非存在下に、糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の反応を行った後、上記したように酵素カップリング反応を行わせて蛍光測定することで糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性を定量する。
得られた糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性を被被験化合物の有無により比較することで、被験化合物の糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素に対する活性調節作用を求めることができる。
また、糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の反応を行わずに、被験化合物存在下に酵素カップリング反応のみを行わせることで、被験化合物が酵素カップリング反応に影響したかどうかを知ることができ、被験化合物の活性が糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素に作用したものであるかを確認することができる。
本発明に係る酵素カップリング反応で生じる蛍光は、励起波長が540nm付近、蛍光波長が590nm付近であるため、係る波長域の場合、被験化合物の紫外・可視部吸収や自家蛍光の影響を受けにくい利点がある。
上述した本発明の酵素の活性測定方法を用いて、糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性調節剤をスクリーニングするには、好適にはマイクロプレートを用いて各ウェルに被験化合物を添加し、被験化合物の存在下、及び対照群として非存在下に、糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の反応を行った後、上記したように酵素カップリング反応を行わせて蛍光測定することで糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性を定量する。
得られた糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の活性を被被験化合物の有無により比較することで、被験化合物の糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素に対する活性調節作用を求めることができる。
また、糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素の反応を行わずに、被験化合物存在下に酵素カップリング反応のみを行わせることで、被験化合物が酵素カップリング反応に影響したかどうかを知ることができ、被験化合物の活性が糖転移酵素又はキナーゼ等のADP産生酵素に作用したものであるかを確認することができる。
本発明に係る酵素カップリング反応で生じる蛍光は、励起波長が540nm付近、蛍光波長が590nm付近であるため、係る波長域の場合、被験化合物の紫外・可視部吸収や自家蛍光の影響を受けにくい利点がある。
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、
被験化合物存在下または非存在下に糖転移酵素反応を行う糖転移酵素反応工程と、
前記糖転移酵素反応で生じるGDP若しくはUDPをATP存在下にNDPキナーゼと反応させる、又は前記糖転移酵素反応で生じるCMPをATP存在下にCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる第1工程と、
前記ADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを用いて酵素カップリング反応により蛍光で定量する第2工程と、
前記被験化合物の有無による糖転移酵素の活性を比較することで前記被験化合物の糖転移酵素に対する活性調節作用を求める比較工程と、
を有する。
被験化合物存在下または非存在下に糖転移酵素反応を行う糖転移酵素反応工程と、
前記糖転移酵素反応で生じるGDP若しくはUDPをATP存在下にNDPキナーゼと反応させる、又は前記糖転移酵素反応で生じるCMPをATP存在下にCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる第1工程と、
前記ADPをグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを用いて酵素カップリング反応により蛍光で定量する第2工程と、
前記被験化合物の有無による糖転移酵素の活性を比較することで前記被験化合物の糖転移酵素に対する活性調節作用を求める比較工程と、
を有する。
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、前記第1工程は、糖転移酵素反応で生じるCMPをATP及び還元剤存在下にCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる工程であり、前記第2工程は、SH試薬の存在下、酵素カップリング反応により蛍光で定量する工程であることが好ましい。
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか一種であることが好ましい。
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるADPを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、
ADPを生成する酵素反応を被験化合物存在下または非存在下で行った後、
ADPを生成する酵素反応で生じるADPをSH試薬存在下にグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で測定し、
被験化合物の有無による活性を比較することで被験化合物のADPを生成する酵素に対する活性調節作用を求める。
ADPを生成する酵素反応を被験化合物存在下または非存在下で行った後、
ADPを生成する酵素反応で生じるADPをSH試薬存在下にグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NADP、及びレサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で測定し、
被験化合物の有無による活性を比較することで被験化合物のADPを生成する酵素に対する活性調節作用を求める。
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるADPを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、前記ADPを生成する酵素が、キナーゼ、ATPアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−CoAカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか一種であることが好ましい。
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるADPを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、前記SH試薬がN−エチルマレイミド又はヨードアセトアミドであることが好ましい。
<ADPの測定用キット>
本発明は、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン及びSH試薬を含むADPの測定用キットを提供する。
本発明は、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン及びSH試薬を含むADPの測定用キットを提供する。
本発明のADPの測定用キットに含まれるSH試薬としては、上記ADPの測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
本発明のADPの測定用キットによれば、試料中のADPを簡便に測定することができる。
前記ADPの測定用キットは、還元剤を含有していてもよく、還元剤存在下で本発明のADPの測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。
前記ADPの測定用キットは、還元剤を含有していてもよく、還元剤存在下で本発明のADPの測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。
<ADPを生成する酵素の活性測定キット>
本発明は、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン並びにSH試薬を含むADPを生成する酵素の活性測定キットを提供する。
本発明は、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン並びにSH試薬を含むADPを生成する酵素の活性測定キットを提供する。
本発明のADPを生成する酵素の活性測定キットに含まれるSH試薬としては、上記ADPを生成する酵素の活性測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
本発明のADPを生成する酵素の活性測定キットによれば、ADPを生成する酵素の活性を簡便に測定することができる。
前記ADPを生成する酵素の活性測定キットは、還元剤を含有していてもよく、還元剤存在下で本発明のADPを生成する酵素の活性の測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。
前記ADPを生成する酵素の活性測定キットは、還元剤を含有していてもよく、還元剤存在下で本発明のADPを生成する酵素の活性の測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール又はTCEPが好適である。
<糖転移酵素の活性測定キット>
本発明は、ATP及びNMPキナーゼ、NDPキナーゼ若しくはCMPキナーゼを含む第1液と、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン、並びにSH試薬を含む第2液と、を含む転移酵素の活性測定キットを提供する。
本発明は、ATP及びNMPキナーゼ、NDPキナーゼ若しくはCMPキナーゼを含む第1液と、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、NAD及び/又はNADP、レサズリン、並びにSH試薬を含む第2液と、を含む転移酵素の活性測定キットを提供する。
一実施形態として、本発明の糖転移酵素の活性測定キットは、前記第1液がさらに還元剤を含むことが好ましい。
例えば、CMPキナーゼ等のある種の酵素は還元剤の添加により酵素活性が上昇することから、前記第1液がさらに還元剤を含むことにより、CMPキナーゼの酵素活性を上昇させることができる。尚且つ、本発明の転移酵素の活性測定キットは、前記第2液にSH試薬を含んでいるため、還元剤を不活化することができ、レサズリンからレゾルフィンへの還元を抑えることができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
例えば、CMPキナーゼ等のある種の酵素は還元剤の添加により酵素活性が上昇することから、前記第1液がさらに還元剤を含むことにより、CMPキナーゼの酵素活性を上昇させることができる。尚且つ、本発明の転移酵素の活性測定キットは、前記第2液にSH試薬を含んでいるため、還元剤を不活化することができ、レサズリンからレゾルフィンへの還元を抑えることができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
本発明の糖転移酵素の活性測定キットに含まれるSH試薬としては、上記糖転移酵素の活性測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
本発明の糖転移酵素の活性測定キットによれば、糖転移酵素の活性を簡便に測定することができる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例1]
本発明の方法を用いたGDP、UDPの検量線
本発明に係る第1工程、第2工程の反応を用いてGDP、UDPの検量線を作成した。
材料として、GDP(和光純薬工業社カタログ番号078−04741)、UDP(和光純薬工業社カタログ番号212−00861)、ATP(和光純薬工業社カタログ番号18−16911)、パン酵母由来NDPキナーゼ(Sigma−Aldrich社カタログ番号N0379)、グルコース(和光純薬工業社カタログ番号045−31162)、ADP依存性ヘキソキナーゼ(旭化成ファーマ社カタログ番号T−93、Thermococcus litoralis由来)、G−6−Pデヒドロゲナーゼ(オリエンタル酵母工業社カタログ番号46857003)、ジアホラーゼ(ユニチカ社カタログ番号B1D111)、NADP(オリエンタル酵母工業社カタログ番号44290000)、レサズリン(和光純薬工業社カタログ番号191−07581)を用いた。GDP、UDPは緩衝液C(100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2)に溶解して0〜50μM溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。
本発明の方法を用いたGDP、UDPの検量線
本発明に係る第1工程、第2工程の反応を用いてGDP、UDPの検量線を作成した。
材料として、GDP(和光純薬工業社カタログ番号078−04741)、UDP(和光純薬工業社カタログ番号212−00861)、ATP(和光純薬工業社カタログ番号18−16911)、パン酵母由来NDPキナーゼ(Sigma−Aldrich社カタログ番号N0379)、グルコース(和光純薬工業社カタログ番号045−31162)、ADP依存性ヘキソキナーゼ(旭化成ファーマ社カタログ番号T−93、Thermococcus litoralis由来)、G−6−Pデヒドロゲナーゼ(オリエンタル酵母工業社カタログ番号46857003)、ジアホラーゼ(ユニチカ社カタログ番号B1D111)、NADP(オリエンタル酵母工業社カタログ番号44290000)、レサズリン(和光純薬工業社カタログ番号191−07581)を用いた。GDP、UDPは緩衝液C(100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2)に溶解して0〜50μM溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。
第1工程用混合液A
ATP 200μM
NDPキナーゼ 2μg/ml
緩衝液組成 C
第2工程用混合液B
グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2U/ml(2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2U/ml(1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
緩衝液組成 C
ATP 200μM
NDPキナーゼ 2μg/ml
緩衝液組成 C
第2工程用混合液B
グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2U/ml(2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2U/ml(1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
緩衝液組成 C
384穴マイクロプレート(少容量、非結合タイプ、Greiner社カタログ番号784900)に4μlの0〜50μM GDP又はUDP溶液と、4μlの第1工程用混合液Aを添加し、25℃にて1時間インキュベートした。これに8μlの第2工程用混合液Bを添加し、25℃にて1時間インキュベートした。
これをBMG Labtech社製プレートリーダーPHERAstarを用いて励起波長540nm、蛍光波長590nmにて蛍光測定した。結果を図2に示す。これより、GDP、UDPとも濃度に応じた蛍光強度が確認され、両ヌクレオチドを本発明の方法で定量できることが確認された。
これをBMG Labtech社製プレートリーダーPHERAstarを用いて励起波長540nm、蛍光波長590nmにて蛍光測定した。結果を図2に示す。これより、GDP、UDPとも濃度に応じた蛍光強度が確認され、両ヌクレオチドを本発明の方法で定量できることが確認された。
[実施例2]
本発明の方法を用いたCMPの検量線
本発明に係る第1工程、第2工程の反応を用いてCMPの検量線を作成した。
材料として、CMP(和光純薬工業社カタログ番号034−05361)、CMPキナーゼ(ヒトCMPK1、Prospec社カタログ番号PKA−002)、DTT(和光純薬工業社カタログ番号040−29223)、N−エチルマレイミド(和光純薬工業社カタログ番号054−02061)を用いた。CMPは緩衝液F(100mM Tris−HCl (pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1%Triton X−100)に溶解して0〜40μM溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。
CMPキナーゼは還元剤要求性があるため第1工程では還元剤としてDTTを用い、第2工程ではその不活化のためSH試薬としてN−エチルマレイミドを用いた。
本発明の方法を用いたCMPの検量線
本発明に係る第1工程、第2工程の反応を用いてCMPの検量線を作成した。
材料として、CMP(和光純薬工業社カタログ番号034−05361)、CMPキナーゼ(ヒトCMPK1、Prospec社カタログ番号PKA−002)、DTT(和光純薬工業社カタログ番号040−29223)、N−エチルマレイミド(和光純薬工業社カタログ番号054−02061)を用いた。CMPは緩衝液F(100mM Tris−HCl (pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1%Triton X−100)に溶解して0〜40μM溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。
CMPキナーゼは還元剤要求性があるため第1工程では還元剤としてDTTを用い、第2工程ではその不活化のためSH試薬としてN−エチルマレイミドを用いた。
第1工程用混合液D
ATP 200μM
CMPK1 3μg/ml
DTT 4mM
緩衝液組成 F
第2工程用混合液E
グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2U/ml (2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2U/ml (1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
N−エチルマレイミド 20mM
緩衝液組成 C
ATP 200μM
CMPK1 3μg/ml
DTT 4mM
緩衝液組成 F
第2工程用混合液E
グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2U/ml (2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2U/ml (1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
N−エチルマレイミド 20mM
緩衝液組成 C
実施例1と同様の操作でCMP溶液について上記の混合液を用いて第1工程と第2工程の反応を行い、蛍光測定を行ってCMPの検量線を得た。結果を図3に示す。CMP濃度に応じた蛍光強度が観測され、CMPを本発明の方法で定量できることが確認された。
[実施例3]
蛍光発色の経時変化
40μMのGDP又はUDPを用い、実施例1と同様に反応を行った後、第2工程の反応時のみ経時的にプレートを取り出し蛍光測定を行った。また、40μMのCMPを用い、実施例2と同様に反応を行い、第2工程の反応時のみ経時的にプレートを取り出し、蛍光測定を行った。結果を図4に示す。これより、GDP又はUDPの定量の場合、第2工程の反応は25分以内に終了し、以後少なくとも120分まで蛍光値は安定に保たれること、CDPの定量の場合は第2工程の反応は25分でほぼ終了し、60分以降少なくとも120分まで蛍光値はほとんど変化しないことが分かった。
従って、GDP又はUDP定量の場合は第2工程開始後25分〜120分に、CMP定量の場合は同60分〜120分に蛍光を測定することで安定した測定結果が得られることが分かった。
蛍光発色の経時変化
40μMのGDP又はUDPを用い、実施例1と同様に反応を行った後、第2工程の反応時のみ経時的にプレートを取り出し蛍光測定を行った。また、40μMのCMPを用い、実施例2と同様に反応を行い、第2工程の反応時のみ経時的にプレートを取り出し、蛍光測定を行った。結果を図4に示す。これより、GDP又はUDPの定量の場合、第2工程の反応は25分以内に終了し、以後少なくとも120分まで蛍光値は安定に保たれること、CDPの定量の場合は第2工程の反応は25分でほぼ終了し、60分以降少なくとも120分まで蛍光値はほとんど変化しないことが分かった。
従って、GDP又はUDP定量の場合は第2工程開始後25分〜120分に、CMP定量の場合は同60分〜120分に蛍光を測定することで安定した測定結果が得られることが分かった。
[実施例4]
糖転移酵素活性の測定(1)
糖転移酵素としてフコシルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。フコシルトランスフェラーゼとしてヒトFUT7(R&D Systems社カタログ番号6409−GT)、基質としてGDP−フコース(ヤマサ醤油社カタログ番号7229)とフェツイン(ウシ胎児血清由来、Sigma−Aldrich社カタログ番号F3004)を用いた。
384穴マイクロプレートに2.5μlの100μM GDP−フコース、6mg/mlフェツインと、2.5μlの0〜4μg/ml FUT7を添加し(緩衝液は50mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、10mM MnCl2、0.1%Triton X−100)、プレートシール(アズワン社カタログ番号1−6774−01)で蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。室温に放冷後、これに5μlの第1工程用混合液Aを添加し、25℃で1時間インキュベートした。これに10μlの第2工程用混合液Bを添加し、25℃で30分間インキュベートした。これを実施例1と同様に蛍光測定した。結果を図5に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認された。
糖転移酵素活性の測定(1)
糖転移酵素としてフコシルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。フコシルトランスフェラーゼとしてヒトFUT7(R&D Systems社カタログ番号6409−GT)、基質としてGDP−フコース(ヤマサ醤油社カタログ番号7229)とフェツイン(ウシ胎児血清由来、Sigma−Aldrich社カタログ番号F3004)を用いた。
384穴マイクロプレートに2.5μlの100μM GDP−フコース、6mg/mlフェツインと、2.5μlの0〜4μg/ml FUT7を添加し(緩衝液は50mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、10mM MnCl2、0.1%Triton X−100)、プレートシール(アズワン社カタログ番号1−6774−01)で蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。室温に放冷後、これに5μlの第1工程用混合液Aを添加し、25℃で1時間インキュベートした。これに10μlの第2工程用混合液Bを添加し、25℃で30分間インキュベートした。これを実施例1と同様に蛍光測定した。結果を図5に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認された。
[実施例5]
糖転移酵素活性の測定(2)
糖転移酵素としてガラクトシルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。
ガラクトシルトランスフェラーゼとしてヒトB4GalT1(R&D Systems社カタログ番号3609−GT)、基質としてUDP−ガラクトース(MP Biomedicals社カタログ番号195905)とN−アセチル−D−グルコサミン(和光純薬工業社カタログ番号013−12181)を用いた。384穴マイクロプレートに2.5μlの100μM UDP−ガラクトース、10mM N−アセチル−D−グルコサミンと、2.5μlの0〜0.3μg/mlB4GalT1を添加し(緩衝液は50mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、10mM MnCl2、0.1% TritonX−100)、プレートシールで蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。
室温に放冷後、これに5μlの第1工程用混合液Aと10μlの第2工程用混合液Bの混合液15μlを添加し、25℃で1時間インキュベートした。これを実施例1と同様に蛍光測定した。結果を図6に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認され、第1工程と第2工程を同時に行わせる測定が可能であることが示された。
糖転移酵素活性の測定(2)
糖転移酵素としてガラクトシルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。
ガラクトシルトランスフェラーゼとしてヒトB4GalT1(R&D Systems社カタログ番号3609−GT)、基質としてUDP−ガラクトース(MP Biomedicals社カタログ番号195905)とN−アセチル−D−グルコサミン(和光純薬工業社カタログ番号013−12181)を用いた。384穴マイクロプレートに2.5μlの100μM UDP−ガラクトース、10mM N−アセチル−D−グルコサミンと、2.5μlの0〜0.3μg/mlB4GalT1を添加し(緩衝液は50mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、10mM MnCl2、0.1% TritonX−100)、プレートシールで蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。
室温に放冷後、これに5μlの第1工程用混合液Aと10μlの第2工程用混合液Bの混合液15μlを添加し、25℃で1時間インキュベートした。これを実施例1と同様に蛍光測定した。結果を図6に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認され、第1工程と第2工程を同時に行わせる測定が可能であることが示された。
[実施例6]
糖転移酵素活性の測定(3)
糖転移酵素としてシアリルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。シアリルトランスフェラーゼとしてヒトST6Gal1(R&D Systems社カタログ番号5924−GT)、基質としてCMP−シアル酸(Calbiochem社カタログ番号233264)とN−アセチル−D−ラクトサミン(Sigma Aldrich社カタログ番号A7791)を用いた。
384穴マイクロプレートに2.5μlの100μM CMP−シアル酸、500μM N−アセチル−D−ラクトサミンと、2.5μlの0〜10μg/ml ST6Gal1を添加し(緩衝液は25mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2、5mM MnCl2、150mM NaCl、0.1% TritonX−100)、プレートシールで蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。室温に放冷後、これに5μlの第1工程用混合液Dを添加し、プレートシールで蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。室温に放冷後、これに10μlの第2工程用混合液Eを添加し、25℃で1時間インキュベートした。これを実施例1と同様に蛍光測定した。結果を図7に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認された。
糖転移酵素活性の測定(3)
糖転移酵素としてシアリルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。シアリルトランスフェラーゼとしてヒトST6Gal1(R&D Systems社カタログ番号5924−GT)、基質としてCMP−シアル酸(Calbiochem社カタログ番号233264)とN−アセチル−D−ラクトサミン(Sigma Aldrich社カタログ番号A7791)を用いた。
384穴マイクロプレートに2.5μlの100μM CMP−シアル酸、500μM N−アセチル−D−ラクトサミンと、2.5μlの0〜10μg/ml ST6Gal1を添加し(緩衝液は25mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2、5mM MnCl2、150mM NaCl、0.1% TritonX−100)、プレートシールで蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。室温に放冷後、これに5μlの第1工程用混合液Dを添加し、プレートシールで蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。室温に放冷後、これに10μlの第2工程用混合液Eを添加し、25℃で1時間インキュベートした。これを実施例1と同様に蛍光測定した。結果を図7に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認された。
[実施例7]
糖転移酵素阻害活性の測定
没食子酸 (gallic acid) のヒトFUT7に対する酵素阻害活性を本発明の方法で測定した。没食子酸は、ヒトFUT7に対する阻害活性が報告された化合物である(Arch.Biochem.Biophys.,Vol.425,No.1,pp.51−57,2004年参照)。
実施例4で示した方法でFUT7の酵素活性の測定を行う際、没食子酸存在下にFUT7(糖転移反応液中の濃度1μg/ml)の反応を行い、他は実施例4と同様に操作を行って没食子酸のFUT7に対する阻害作用を調べた。没食子酸を含まない群を阻害率0%コントロールとし、FUT7を含まない群を阻害率100%コントロールとして、各濃度の没食子酸のFUT7に対する阻害率を算出した。
また、100μM GDP−フコースの代わりに50μM GDPを用いて同様に操作を行い、酵素カップリング自体への没食子酸の影響も調べた。また、FUT7酵素反応後の反応液の一部を使って、HPLC分析により生成GDP量を定量し、HPLC法による阻害活性も求めた。
HPLCの条件は、カラム:YMC−Triart C18 (ワイエムシー社製、粒系5μm、直径4.6mm×長さ150mm)、溶出液:50mM KH2PO4−K2HPO4(10:1)、流速:1ml/分、検出:UV 260nmとした。これらの測定結果を図8に示す。
本発明の方法で測定した没食子酸の阻害活性とHPLCにより測定した阻害活性とが一致することが分かった(IC50値が約10μM)。さらに、没食子酸は、酵素カップリング反応自体を全く阻害しておらず、酵素カップリングにより測定された阻害活性はFUT7の阻害によるものであることが確かめられた。
また、Arch.Biochem.Biophys.,Vol.425,No.1,pp.51−57,2004年には、ヒトFUT7に対する没食子酸のIC50値が5.4μMと報告されており、実施例7において測定されたIC50値は、上記文献値に近いことが確認された。
以上より、本発明の方法で糖転移酵素阻害活性の正確な測定が可能であることが示された。
糖転移酵素阻害活性の測定
没食子酸 (gallic acid) のヒトFUT7に対する酵素阻害活性を本発明の方法で測定した。没食子酸は、ヒトFUT7に対する阻害活性が報告された化合物である(Arch.Biochem.Biophys.,Vol.425,No.1,pp.51−57,2004年参照)。
実施例4で示した方法でFUT7の酵素活性の測定を行う際、没食子酸存在下にFUT7(糖転移反応液中の濃度1μg/ml)の反応を行い、他は実施例4と同様に操作を行って没食子酸のFUT7に対する阻害作用を調べた。没食子酸を含まない群を阻害率0%コントロールとし、FUT7を含まない群を阻害率100%コントロールとして、各濃度の没食子酸のFUT7に対する阻害率を算出した。
また、100μM GDP−フコースの代わりに50μM GDPを用いて同様に操作を行い、酵素カップリング自体への没食子酸の影響も調べた。また、FUT7酵素反応後の反応液の一部を使って、HPLC分析により生成GDP量を定量し、HPLC法による阻害活性も求めた。
HPLCの条件は、カラム:YMC−Triart C18 (ワイエムシー社製、粒系5μm、直径4.6mm×長さ150mm)、溶出液:50mM KH2PO4−K2HPO4(10:1)、流速:1ml/分、検出:UV 260nmとした。これらの測定結果を図8に示す。
本発明の方法で測定した没食子酸の阻害活性とHPLCにより測定した阻害活性とが一致することが分かった(IC50値が約10μM)。さらに、没食子酸は、酵素カップリング反応自体を全く阻害しておらず、酵素カップリングにより測定された阻害活性はFUT7の阻害によるものであることが確かめられた。
また、Arch.Biochem.Biophys.,Vol.425,No.1,pp.51−57,2004年には、ヒトFUT7に対する没食子酸のIC50値が5.4μMと報告されており、実施例7において測定されたIC50値は、上記文献値に近いことが確認された。
以上より、本発明の方法で糖転移酵素阻害活性の正確な測定が可能であることが示された。
[実施例8]
糖転移酵素活性測定キット(1)
以下の組成で、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、又はN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ用活性測定キットを作製した。
糖転移酵素活性測定キット(1)
以下の組成で、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、又はN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ用活性測定キットを作製した。
第1工程用混合液
ATP 200μM
NDPキナーゼ 2μg/ml
緩衝液組成 100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2
ATP 200μM
NDPキナーゼ 2μg/ml
緩衝液組成 100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2
第2工程用混合液
グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2 U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2 U/ml (2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2 U/ml (1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
緩衝液組成 100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2
グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2 U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2 U/ml (2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2 U/ml (1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
緩衝液組成 100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2
[実施例9]
糖転移酵素活性測定キット(2)
以下の組成で、シアリルトランスフェラーゼ用活性測定キットを作製した。
糖転移酵素活性測定キット(2)
以下の組成で、シアリルトランスフェラーゼ用活性測定キットを作製した。
第1工程用混合液
ATP 200μM
CMPK1 3μg/ml
DTT 4mM
緩衝液組成 100mM Tris−HCl(pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1% TritonX−100
ATP 200μM
CMPK1 3μg/ml
DTT 4mM
緩衝液組成 100mM Tris−HCl(pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1% TritonX−100
第2工程用混合液
グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2U/ml (38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2U/ml (2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2U/ml (1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
N−エチルマレイミド 20mM
緩衝液組成 100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2
グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2U/ml (38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2U/ml (2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2U/ml (1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
N−エチルマレイミド 20mM
緩衝液組成 100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2
[実施例10]
本発明の方法よるADPの検量線
ADP(オリエンタル酵母工業社カタログ番号45120000)を緩衝液C(100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2)に溶解して0〜37.5μM溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。N−エチルマレイミドを添加する場合は、この酵素カップリング用混合液に20mMで添加した。
本発明の方法よるADPの検量線
ADP(オリエンタル酵母工業社カタログ番号45120000)を緩衝液C(100mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2)に溶解して0〜37.5μM溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。N−エチルマレイミドを添加する場合は、この酵素カップリング用混合液に20mMで添加した。
酵素カップリング混合液組成
D−グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2 U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2 U/ml(2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2 U/ml (1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
N−エチルマレイミド 20mMまたは無添加
緩衝液組成 C
D−グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2 U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2 U/ml(2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2 U/ml (1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
N−エチルマレイミド 20mMまたは無添加
緩衝液組成 C
384穴マイクロプレート(少容量、非結合タイプ、Greiner社カタログ番号784900)に7.5μlの0〜37.5μM ADP溶液(緩衝液組成はC)と7.5μlの酵素カップリング用混合液を添加し、25℃にて暗所で1時間インキュベートした。
その後、蛍光強度をBMG Labtech社製マイクロプレートリーダーPHERAstarを用いて励起波長540nm、蛍光波長590nmにて測定した。結果を図9に示す。ADP濃度依存的な蛍光強度が確認され、ADP濃度25μMまでは良好な直線性が得られることが分かった。
また、N−エチルマレイミドが存在しても、蛍光値にほとんど変化は見られなかった。これより、本発明に係るSH試薬存在下の酵素カップリング反応でADPの蛍光定量が可能であることが示された。
その後、蛍光強度をBMG Labtech社製マイクロプレートリーダーPHERAstarを用いて励起波長540nm、蛍光波長590nmにて測定した。結果を図9に示す。ADP濃度依存的な蛍光強度が確認され、ADP濃度25μMまでは良好な直線性が得られることが分かった。
また、N−エチルマレイミドが存在しても、蛍光値にほとんど変化は見られなかった。これより、本発明に係るSH試薬存在下の酵素カップリング反応でADPの蛍光定量が可能であることが示された。
[実施例11]
ADPの酵素カップリングによる蛍光発色の安定性の検討
25μMのADPを用い、実施例10と同様に反応を行った。ただし、酵素カップリング反応時、経時的にマイクロプレートを取り出し蛍光測定を行った。結果を図10に示す。これより、ADP定量の酵素カップリング反応は10〜20分で終了し、その後2時間は、蛍光値は安定であることが分かった。
ADPの酵素カップリングによる蛍光発色の安定性の検討
25μMのADPを用い、実施例10と同様に反応を行った。ただし、酵素カップリング反応時、経時的にマイクロプレートを取り出し蛍光測定を行った。結果を図10に示す。これより、ADP定量の酵素カップリング反応は10〜20分で終了し、その後2時間は、蛍光値は安定であることが分かった。
[実施例12]
還元剤DTT存在下のADPの検量線
DTT存在下のADPの検量線を実施例10と同様に測定した。結果を図11に示す。DTTの存在により蛍光のバックグランドが上昇するが、酵素カップリング用混合液に予め20mM N−エチルマレイミド(NEM)を混合しておくとバックグランドの上昇が抑えられ、ADPの定量性が良好になることが確認された。これをアッセイ系の検出感度の特異性の指標であるシグナル/バックグランドのカウントの比率(S/B比、この値が大きいほど高感度である)で表わすと、20μMのADPの定量において、DTTが存在しなければS/B比は57.4の高い値を示したが、2mMのDTTが存在するとS/B比は4.2と1/10以下に低下した。しかしながら、20mM N−エチルマレイミドを添加することでS/B比は36.7と、未添加に比べ約9倍改善した。
還元剤DTT存在下のADPの検量線
DTT存在下のADPの検量線を実施例10と同様に測定した。結果を図11に示す。DTTの存在により蛍光のバックグランドが上昇するが、酵素カップリング用混合液に予め20mM N−エチルマレイミド(NEM)を混合しておくとバックグランドの上昇が抑えられ、ADPの定量性が良好になることが確認された。これをアッセイ系の検出感度の特異性の指標であるシグナル/バックグランドのカウントの比率(S/B比、この値が大きいほど高感度である)で表わすと、20μMのADPの定量において、DTTが存在しなければS/B比は57.4の高い値を示したが、2mMのDTTが存在するとS/B比は4.2と1/10以下に低下した。しかしながら、20mM N−エチルマレイミドを添加することでS/B比は36.7と、未添加に比べ約9倍改善した。
[実施例13]
ヨードアセトアミド存在下のADPの検量線
実施例12において、20mM N−エチルマレイミドの代わりに8mMヨードアセトアミド(IAA)を用いて、他は実施例12と同様にしてADPの検量線の測定を行った。結果を図12に示す。20μMのADPの定量において、S/B比は2mM DTTが存在すると3.7であったが、8mMヨードアセトアミドを用いた場合は18.6と約5倍改善した。これより、酵素カップリング用混合液に予めヨードアセトアミドを混合しておくことで測定の特異性が改善されることが確かめられた。
ヨードアセトアミド存在下のADPの検量線
実施例12において、20mM N−エチルマレイミドの代わりに8mMヨードアセトアミド(IAA)を用いて、他は実施例12と同様にしてADPの検量線の測定を行った。結果を図12に示す。20μMのADPの定量において、S/B比は2mM DTTが存在すると3.7であったが、8mMヨードアセトアミドを用いた場合は18.6と約5倍改善した。これより、酵素カップリング用混合液に予めヨードアセトアミドを混合しておくことで測定の特異性が改善されることが確かめられた。
[実施例14]
キナーゼ活性の測定
還元剤要求性のキナーゼとしてヒトCMPK1(CMP kinase1、Prospec社カタログ番号pKa−002−b)を用い、最初にCMPK1のDTT依存性を調べた。
1.5ml容マイクロ遠心チューブに10μlの400μM ATP、80μM CMP(緩衝液組成は100mM Tris−HCl(pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1% TritonX−100)と5μlの0〜8mM DTT水溶液及び5μlの4μg/ml CMPK1(緩衝液組成は100mM Tris−HCl(pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCL、0.1% TritonX−100)を加え、37℃で1時間インキュベートし、この反応液15μlをHPLCに注入することで、CMPK1酵素反応で生成したCDP(シトシン5'−二リン酸)とADPを定量した。HPLCの条件は、カラム:YMC−Triart C18(ワイエムシー社製、粒系5μm、直径4.6mm×長さ150mm)、溶出液:50mM KH2PO4−K2HPO4(10:1)、流速:1ml/分、検出:UV 265 nmとした。結果を図13に示す。
CMPK1の酵素活性はDTT濃度に依存すること、同モル量のCDPとADPが生成していることが確認された。これより、1mM以上のDTT濃度があればCMPK1は十分な活性を示すことが分かった。
キナーゼ活性の測定
還元剤要求性のキナーゼとしてヒトCMPK1(CMP kinase1、Prospec社カタログ番号pKa−002−b)を用い、最初にCMPK1のDTT依存性を調べた。
1.5ml容マイクロ遠心チューブに10μlの400μM ATP、80μM CMP(緩衝液組成は100mM Tris−HCl(pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1% TritonX−100)と5μlの0〜8mM DTT水溶液及び5μlの4μg/ml CMPK1(緩衝液組成は100mM Tris−HCl(pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCL、0.1% TritonX−100)を加え、37℃で1時間インキュベートし、この反応液15μlをHPLCに注入することで、CMPK1酵素反応で生成したCDP(シトシン5'−二リン酸)とADPを定量した。HPLCの条件は、カラム:YMC−Triart C18(ワイエムシー社製、粒系5μm、直径4.6mm×長さ150mm)、溶出液:50mM KH2PO4−K2HPO4(10:1)、流速:1ml/分、検出:UV 265 nmとした。結果を図13に示す。
CMPK1の酵素活性はDTT濃度に依存すること、同モル量のCDPとADPが生成していることが確認された。これより、1mM以上のDTT濃度があればCMPK1は十分な活性を示すことが分かった。
次にDTT存在下でのCMPK1の酵素活性を本発明の方法で測定した。384穴マイクロプレートに2.5μlの0又は40μM CMPと、2.5μlの200μM ATP、0〜3μg/ml CMPK1、4mMDTT(緩衝液組成は100mM Tris−HCl (pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1% Triton X−100)と、を加え、プレートシール(アズワン社カタログ番号1−6774−01)で蓋をして、37℃で1時間インキュベートした。室温に放冷後、これに5μlの酵素カップリング用混合液(組成は実施例10と同じ)を加え、25℃でインキュベートした。インキュベート開始開始後0分、15分、30分、60分、120分の計5回、蛍光測定を行い、実施例12と同様にS/B比を求めた。CMPK1濃度を3μg/mlとした時のS/B比の測定結果を図14に示す。
酵素カップリング反応をN−メチルマレイミドなしで行った場合はS/B比は3〜4であったのに対し、N−エチルマレイミドを存在させてアッセイした場合はS/B比は13〜14となり、SH試薬存在下で酵素カップリングを行わせることでキナーゼ活性の定量性が大きく向上することが示された。
また、蛍光測定時間60分におけるN−エチルマレイミド存在下でのCMPK1の濃度依存性定量結果を図15に示す。CMPK1酵素濃度に応じたキナーゼ活性が確認された。
酵素カップリング反応をN−メチルマレイミドなしで行った場合はS/B比は3〜4であったのに対し、N−エチルマレイミドを存在させてアッセイした場合はS/B比は13〜14となり、SH試薬存在下で酵素カップリングを行わせることでキナーゼ活性の定量性が大きく向上することが示された。
また、蛍光測定時間60分におけるN−エチルマレイミド存在下でのCMPK1の濃度依存性定量結果を図15に示す。CMPK1酵素濃度に応じたキナーゼ活性が確認された。
[実施例15]
キナーゼ阻害活性の測定
Dactiosterium(キイロタマホコリカビ)のCMPキナーゼに対する阻害活性が報告された(J.Biol.Chem.,Vol.265,No.11,pp. 6339−6345,1990年)Ap5A(P1,P5−Di(adenosine−5')pentaphosphate)のCMPK1に対する酵素阻害活性を、本発明の方法で測定した。384穴マイクロプレートに1μlの0〜3mM Ap5A(Sigma−Aldrich社カタログ番号D4022)溶液と2μlの50μM CMPを添加し、これに2μlの200μM ATP、3μg/ml CMPK1、4mM DTTを添加した(緩衝液組成は100mM Tris−HCl(pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1% TritonX−100)。プレートシールで蓋をして37℃で1時間インキュベート後、室温に放冷し、20mM N−エチルマレイミドを含む酵素カップリング用混合液を5μl添加し、25℃で暗所にて60分間インキュベートした後、プレートリーダーで蛍光を測定した。Ap5Aを含まない群を阻害率0%コントロールとし、CMPK1を含まない群を阻害率100%コントロールとして、各濃度のAp5AのCMPK1に対する阻害率を算出した。
また、50μM CMPの代わりに25μM ADPを用いて同様に操作を行い、酵素カップリング自体へのAp5Aの影響も調べた。また、CMPK1のキナーゼ反応後の反応液の一部を使って、実施例14に記載したHPLC分析法によっても生成CDP量を測定し、HPLC法による阻害活性を求めた。これらの結果を図16に示す。
本発明の方法で測定したAp5AのCMPK1に対する阻害活性とHPLC法により測定した阻害活性とが一致することが分かった。さらに、Ap5Aは酵素カップリング反応自体は全く阻害しておらず、酵素カップリングにより測定された阻害活性はCMPK1を阻害したことによるものであることが確かめられた。
以上より、本発明の方法でキナーゼ阻害活性の正確な測定が可能であることが示された。
キナーゼ阻害活性の測定
Dactiosterium(キイロタマホコリカビ)のCMPキナーゼに対する阻害活性が報告された(J.Biol.Chem.,Vol.265,No.11,pp. 6339−6345,1990年)Ap5A(P1,P5−Di(adenosine−5')pentaphosphate)のCMPK1に対する酵素阻害活性を、本発明の方法で測定した。384穴マイクロプレートに1μlの0〜3mM Ap5A(Sigma−Aldrich社カタログ番号D4022)溶液と2μlの50μM CMPを添加し、これに2μlの200μM ATP、3μg/ml CMPK1、4mM DTTを添加した(緩衝液組成は100mM Tris−HCl(pH9)、13.5mM MgCl2、150mM KCl、0.1% TritonX−100)。プレートシールで蓋をして37℃で1時間インキュベート後、室温に放冷し、20mM N−エチルマレイミドを含む酵素カップリング用混合液を5μl添加し、25℃で暗所にて60分間インキュベートした後、プレートリーダーで蛍光を測定した。Ap5Aを含まない群を阻害率0%コントロールとし、CMPK1を含まない群を阻害率100%コントロールとして、各濃度のAp5AのCMPK1に対する阻害率を算出した。
また、50μM CMPの代わりに25μM ADPを用いて同様に操作を行い、酵素カップリング自体へのAp5Aの影響も調べた。また、CMPK1のキナーゼ反応後の反応液の一部を使って、実施例14に記載したHPLC分析法によっても生成CDP量を測定し、HPLC法による阻害活性を求めた。これらの結果を図16に示す。
本発明の方法で測定したAp5AのCMPK1に対する阻害活性とHPLC法により測定した阻害活性とが一致することが分かった。さらに、Ap5Aは酵素カップリング反応自体は全く阻害しておらず、酵素カップリングにより測定された阻害活性はCMPK1を阻害したことによるものであることが確かめられた。
以上より、本発明の方法でキナーゼ阻害活性の正確な測定が可能であることが示された。
[実施例16]
キナーゼ活性測定キット
以下の組成でキナーゼ活性測定キットを作製した。
キナーゼ活性測定キット
以下の組成でキナーゼ活性測定キットを作製した。
キナーゼ活性測定キット組成
D−グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2U/ml(2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2U/ml(1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
N−エチルマレイミド 20mM
緩衝液組成 100mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2
D−グルコース 2mM
ADP依存性ヘキソキナーゼ 2U/ml(38μg/ml)
G−6−Pデヒドロゲナーゼ 2U/ml(2.6μg/ml)
ジアホラーゼ 2U/ml(1.1μg/ml)
NADP 200μM
レサズリン 100μM
N−エチルマレイミド 20mM
緩衝液組成 100mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2
[実施例17]
ATPアーゼ活性の測定
市販キナーゼに夾雑するATPアーゼ活性を本発明の方法で測定した。384穴マイクロプレートに2.5μlの400μM ATPと2.5μlの0〜16μg/mlヒトUMPキナーゼ(Novocib社カタログ番号E−NOV−4)を添加し(緩衝液組成は50mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、50mM NaCl、1 mM DTT、200μM Na3VO4、0.1% TritonX−100)、30℃で1〜2時間インキュベートした。これに実施例16に記載のキット液5μlを添加し、25℃で1時間インキュベートした後、実施例10と同様にプレートリーダーで蛍光を測定した。また、酵素カップリング前の酵素反応液を実施例7で用いたHPLC条件で分析し、ADPを直接HPLCで定量した。これらの結果を図17A及び図17Bに示す。リン酸アクセプターがない状態で市販ヒトUMPキナーゼ(UMPK)はATPアーゼ活性を示しATPからADPを生成すること、このATPアーゼ活性を本発明の方法で定量できること、両者の測定結果は一致することが示された。なお、ヒトUMPキナーゼはタンパク質をリン酸化しないので、自己リン酸化活性はない。ここで示されたATPアーゼ活性は、酵素の精製過程で取り除けなかったATPアーゼが残存したものと考えられる。
ATPアーゼ活性の測定
市販キナーゼに夾雑するATPアーゼ活性を本発明の方法で測定した。384穴マイクロプレートに2.5μlの400μM ATPと2.5μlの0〜16μg/mlヒトUMPキナーゼ(Novocib社カタログ番号E−NOV−4)を添加し(緩衝液組成は50mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、50mM NaCl、1 mM DTT、200μM Na3VO4、0.1% TritonX−100)、30℃で1〜2時間インキュベートした。これに実施例16に記載のキット液5μlを添加し、25℃で1時間インキュベートした後、実施例10と同様にプレートリーダーで蛍光を測定した。また、酵素カップリング前の酵素反応液を実施例7で用いたHPLC条件で分析し、ADPを直接HPLCで定量した。これらの結果を図17A及び図17Bに示す。リン酸アクセプターがない状態で市販ヒトUMPキナーゼ(UMPK)はATPアーゼ活性を示しATPからADPを生成すること、このATPアーゼ活性を本発明の方法で定量できること、両者の測定結果は一致することが示された。なお、ヒトUMPキナーゼはタンパク質をリン酸化しないので、自己リン酸化活性はない。ここで示されたATPアーゼ活性は、酵素の精製過程で取り除けなかったATPアーゼが残存したものと考えられる。
[実施例18]
糖転移酵素(ガラクトシルトランスフェラーゼ)阻害剤のスクリーニング
化合物ライブラリーとして、1280種類の既知生理活性物質で構成されるSigma−Aldrich社製LOPAC1280(商標)ライブラリーを用いた。384穴マイクロプレートにLOPAC1280(商標)ライブラリーの各化合物(1mM濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解)をプレート1枚当たり320化合物ずつ、微量分注機(Labcyte社製Echo 555)を用いて50nlずつ分注した。
これに2.5μlの10mM N−アセチル−D−グルコサミン、100μM UDP−ガラクトースと、2.5μlの0.05μg/mlヒトB4GalT1を連続分注機(Thermo Fisher Scientific社製Multidrop combi)を用いて添加し(緩衝液は50mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2、10mM MnCl2、0.02% TritonX−100)、プレートシールで蓋をして、37℃で1時間インキュベートした(反応液中のライブラリー化合物濃度は10μM)。
ライブラリー化合物の代わりにDMSOを添加したウェルを反応率100%コントロールウェルとし、酵素も加えないウェルを反応率0%のコントロールウェルとした(両コントロールを各プレートに16ウェルずつ設置)。室温に放冷後、5μlの第1工程用混合液Aを加え25℃で1時間インキュベートした後、10μlの第2工程用混合液Bの混合液10μlを添加し、さらに25℃で1時間インキュベートし、蛍光を定量した。
一方、上記と同様にライブラリー化合物およびDMSOをプレートに添加後、基質液と酵素液に代えて20μM UDPを5μlずつ添加したプレートを作製し、同様に第1工程と第2工程の反応を行わせ、UDP定量反応自体への影響を調べた。この場合、反応率0%のコントロールウェルは20μM UDPを加えないウェルとした。両アッセイとも、反応率100%と0%のコントロールウェルの蛍光定量値、ライブラリー化合物が入ったウェルの蛍光定量値をそれぞれa、b、cとして、阻害率を次式により計算した。
糖転移酵素(ガラクトシルトランスフェラーゼ)阻害剤のスクリーニング
化合物ライブラリーとして、1280種類の既知生理活性物質で構成されるSigma−Aldrich社製LOPAC1280(商標)ライブラリーを用いた。384穴マイクロプレートにLOPAC1280(商標)ライブラリーの各化合物(1mM濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解)をプレート1枚当たり320化合物ずつ、微量分注機(Labcyte社製Echo 555)を用いて50nlずつ分注した。
これに2.5μlの10mM N−アセチル−D−グルコサミン、100μM UDP−ガラクトースと、2.5μlの0.05μg/mlヒトB4GalT1を連続分注機(Thermo Fisher Scientific社製Multidrop combi)を用いて添加し(緩衝液は50mM Tris−HCl (pH7.5)、5mM MgCl2、10mM MnCl2、0.02% TritonX−100)、プレートシールで蓋をして、37℃で1時間インキュベートした(反応液中のライブラリー化合物濃度は10μM)。
ライブラリー化合物の代わりにDMSOを添加したウェルを反応率100%コントロールウェルとし、酵素も加えないウェルを反応率0%のコントロールウェルとした(両コントロールを各プレートに16ウェルずつ設置)。室温に放冷後、5μlの第1工程用混合液Aを加え25℃で1時間インキュベートした後、10μlの第2工程用混合液Bの混合液10μlを添加し、さらに25℃で1時間インキュベートし、蛍光を定量した。
一方、上記と同様にライブラリー化合物およびDMSOをプレートに添加後、基質液と酵素液に代えて20μM UDPを5μlずつ添加したプレートを作製し、同様に第1工程と第2工程の反応を行わせ、UDP定量反応自体への影響を調べた。この場合、反応率0%のコントロールウェルは20μM UDPを加えないウェルとした。両アッセイとも、反応率100%と0%のコントロールウェルの蛍光定量値、ライブラリー化合物が入ったウェルの蛍光定量値をそれぞれa、b、cとして、阻害率を次式により計算した。
1280個のライブラリー化合物の測定結果を図18A〜Cに示す。B4GalT1反応を行った場合は阻害率が50%以上を示した化合物数は24個であった(図18A)。
一方、UDP定量アッセイの場合は50%以上阻害した化合物数は10個であった(図18B)。両アッセイの阻害率の差を計算することで(A−B)、B4GalT1反応の正味の阻害率を見積もることができる。その差が50%以上であった化合物数は12個であった(図18C)。
従ってこのスクリーニングにより、ヒトガラクトシルトランスフェラーゼB4GalT1を阻害する化合物をLOPAC1280(商標)ライブラリーから12個得ることができ、本発明がハイスループットなスクリーニング法として有用であることが示された。
また、従来のスクリーニング方法におけるウェル単価は、1ウェルあたり約100円であったのに対し、本発明のスクリーニング方法におけるウェル単価は、1ウェルあたり2〜8円と安価である。
従って、本発明のスクリーニング方法は、コスト面においても非常に優れていることが確認された。
一方、UDP定量アッセイの場合は50%以上阻害した化合物数は10個であった(図18B)。両アッセイの阻害率の差を計算することで(A−B)、B4GalT1反応の正味の阻害率を見積もることができる。その差が50%以上であった化合物数は12個であった(図18C)。
従ってこのスクリーニングにより、ヒトガラクトシルトランスフェラーゼB4GalT1を阻害する化合物をLOPAC1280(商標)ライブラリーから12個得ることができ、本発明がハイスループットなスクリーニング法として有用であることが示された。
また、従来のスクリーニング方法におけるウェル単価は、1ウェルあたり約100円であったのに対し、本発明のスクリーニング方法におけるウェル単価は、1ウェルあたり2〜8円と安価である。
従って、本発明のスクリーニング方法は、コスト面においても非常に優れていることが確認された。
[実施例19]
マレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のADPの定量
ADP(和光純薬工業社カタログ番号019−25091)を10mMの濃度になるように純水に溶解し、5Mの水酸化ナトリウム(和光純薬工業社カタログ番号196−05375)でpH7のADP溶液を調製した。
DTT(和光純薬工業社カタログ番号040−29223)を1Mの濃度になるように純水で調製し、DTT溶液を調製した。
10mM ADP溶液、10mM ATP溶液(プロメガ社V915B)、1M DTT溶液を緩衝液1(40mM Tris−HCl(pH7.5)、20mM MgCl2、0.01% BSA)で希釈し、下記表1に記載の組成の溶液1〜6をそれぞれ調製した。
マレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のADPの定量
ADP(和光純薬工業社カタログ番号019−25091)を10mMの濃度になるように純水に溶解し、5Mの水酸化ナトリウム(和光純薬工業社カタログ番号196−05375)でpH7のADP溶液を調製した。
DTT(和光純薬工業社カタログ番号040−29223)を1Mの濃度になるように純水で調製し、DTT溶液を調製した。
10mM ADP溶液、10mM ATP溶液(プロメガ社V915B)、1M DTT溶液を緩衝液1(40mM Tris−HCl(pH7.5)、20mM MgCl2、0.01% BSA)で希釈し、下記表1に記載の組成の溶液1〜6をそれぞれ調製した。
SH試薬として、マレイミド(和光純薬工業社カタログ番号133−13111)、N−エチルマレイミド(和光純薬工業社カタログ番号058−02061)、及びヨードアセトアミド(IAA)(和光純薬工業社カタログ番号095−02151)をジメチルスルホキシド(和光純薬工業社カタログ番号041−29351)にそれぞれ800mMの濃度で調製した。N−(2−スルホエチル)マレイミド(サンタクルズ社カタログ番号SC−207907)は純水に250mMの濃度で調製した。
酵素カップリング用混合液を下記表2に記載の組成となるようにそれぞれ調製した。酵素カップリング用混合液中、SH試薬を用いる場合には、40mMとなるようにそれぞれ添加した。
384穴マイクロプレート(小容量、非結合タイプ、Greiner社カタログ番号784900)に、下記表3に記載のとおり、溶液1〜6をそれぞれ5μlと溶液A〜Eの酵素カップリング用混合液をそれぞれ5μlとを添加し、25℃にて1時間インキュベートした。
その後、前記表3に記載の各溶液についてそれぞれ蛍光強度をTECAN社製マイクロプレートリーダーSafireを用いて励起波長540nm、蛍光波長590nmにて測定した。
上記の実験をそれぞれ2回行い、それぞれ得られた蛍光強度の平均を求めた。結果を図19A〜Cに示す。
上記の実験をそれぞれ2回行い、それぞれ得られた蛍光強度の平均を求めた。結果を図19A〜Cに示す。
DTTの存在により蛍光のバックグラウンドが上昇するが、酵素カップリング用混合液に予め40mMマレイミド類(マレイミド、N−エチルマレイミド、N−(2−スルホエチル)マレイミド)と40mMIAAを混合しておくとバックグラウンドの上昇が抑えられ、ADPの定量性が良好になることが確認された。これをアッセイ系の検出感度の特異性の指標であるシグナル/バックグラウンドのカウントの比率(S/B比、この値が大きいほど高感度である)で表すと、20μMのADPの定量において、DTTが存在しなければS/B比は23.3の高い値を示したが、3mMまたは6mMのDTTが存在するとS/B比はそれぞれ4.0、2.9に低下した。しかしながら、40mMのマレイミド類(マレイミド、N−エチルマレイミド、N−(2−スルホエチル)マレイミド)を添加することで、3mMのDTT添加時にS/B比はそれぞれ23.6、23.8、24.0、6mMのDTT添加時に21.7、22.5、21.0と改善した。40mMのIAAを添加することで、3mMのDTT添加時にS/B比は18.2、6mMのDTT添加時に13.3と改善した。これによりマレイミド類、及びIAAいずれも蛍光のバックグラウンドの抑制効果があり、特にマレイミド類は抑制効果が高いことが示された。
[実施例20]
還元剤DTT、2―メルカプトエタノール、又はTCEP存在下のADPの定量
実施例19と同様の方法により、還元剤として6mMのDTT、6mMの2−メルカプトエタノール(和光純薬工業社カタログ番号135−07522)、6mMのTCEP(和光純薬工業社カタログ番号209−19861)を添加してADPの定量を行った。
TCEPは1Mの濃度になるように純水に溶解し、5Mの水酸化ナトリウム(和光純薬工業社カタログ番号196−05375)でpH7に調製し、6mMとなるように希釈して用いた。
ADPとATP、各還元剤を緩衝液(40mM Tris−HCl(pH7.5)、20mM MgCl2、0.01% BSA)に溶解し、各還元剤6mM、ADP0μMまたは20μM溶液(ADP0μMとATP100μM、又はADP20μMとATP80μM)を調製した。酵素カップリング用混合液は実施例19と同組成のものを使用し、マレイミド類(マレイミド、N−エチルマレイミド)またはIAAを40mMの濃度で添加した。
還元剤DTT、2―メルカプトエタノール、又はTCEP存在下のADPの定量
実施例19と同様の方法により、還元剤として6mMのDTT、6mMの2−メルカプトエタノール(和光純薬工業社カタログ番号135−07522)、6mMのTCEP(和光純薬工業社カタログ番号209−19861)を添加してADPの定量を行った。
TCEPは1Mの濃度になるように純水に溶解し、5Mの水酸化ナトリウム(和光純薬工業社カタログ番号196−05375)でpH7に調製し、6mMとなるように希釈して用いた。
ADPとATP、各還元剤を緩衝液(40mM Tris−HCl(pH7.5)、20mM MgCl2、0.01% BSA)に溶解し、各還元剤6mM、ADP0μMまたは20μM溶液(ADP0μMとATP100μM、又はADP20μMとATP80μM)を調製した。酵素カップリング用混合液は実施例19と同組成のものを使用し、マレイミド類(マレイミド、N−エチルマレイミド)またはIAAを40mMの濃度で添加した。
384穴マイクロプレート(小容量、非結合タイプ、Greiner社カタログ番号784900)に5μlの還元剤6mM、ADP0μM、20μM溶液(ADPとATPの合計は100μM、緩衝液は40mM Tris−HCl(pH7.5)、20mM MgCl2-、0.01% BSA)と5μlの酵素カップリング用混合液を添加し、25℃にて1時間インキュベートした。
その後、蛍光強度をTECAN社製マイクロプレートリーダーSafireを用いて励起波長540nm、蛍光波長590nmにて測定した。
上記の実験をそれぞれ3回行い、それぞれ得られた蛍光強度の平均を求めた。結果を図20A〜Cに示す。
上記の実験をそれぞれ3回行い、それぞれ得られた蛍光強度の平均を求めた。結果を図20A〜Cに示す。
20μMのADPの定量において、6mMのDTT、2−メルカプトエタノール、TCEPが存在する場合、SH試薬を添加しないとS/Bはそれぞれ1.2、14.0、3.4であったが、マレイミドを添加するとそれぞれ16.1、19.1、19.4、N−エチルマレイミドを添加すると18.2、19.6、19.9、IAAを添加すると9.0、18.8、12.1に改善した。これにより、マレイミド類、IAAによる蛍光のバックグラウンドの抑制効果は、還元剤DTT、2−メルカプトエタノール、TCEPを添加した場合において有効であり、特にマレイミド類が効果が高いことが示された。
本発明は、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができるので、化学、医薬、生化学分野等に幅広く利用可能である。
Claims (19)
- 前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである請求項1に記載の蛍光又は吸光度の検出方法。
- 前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである請求項3に記載のバックグラウンド抑制方法。
- グルコースに、ADPおよびADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とするADPの測定方法。
- 前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである請求項5に記載のADPの測定方法。
- ATPの存在下、ADPを生成する酵素を基質に作用させてATPをADPに変換させる第1−1工程と、
グルコースに、前記第1−1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、レサズリンに、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とするADPを生成する酵素の活性測定方法。
- 前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである請求項7に記載のADPを生成する酵素の活性測定方法。
- 前記ADPを生成する酵素が、キナーゼ、ATPアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−CoAカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項7又は8に記載のADPを生成する酵素の活性測定方法。
- 糖転移酵素反応で生じるGDP若しくはUDPをATP存在下にNDPキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるCMPをATP存在下にNMPキナーゼ又はCMPキナーゼと反応させることで、GDP、UDP、又はCMPの量に応じたADPを生成させる第1工程と、
グルコースに、前記第1工程により得られたADP、及びADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-6-リン酸を生成させる第2−1工程と、
前記第2−1工程により得られたグルコース-6-リン酸に、NAD若しくはNADP及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、NADH若しくはNADPHを生成させる第2−2工程と、
下記一般式[1]で表されるマレイミド化合物及び2−ヨードアセトアミドから選ばれるSH試薬存在下、前記第2−2工程により得られたNADH若しくはNADPH及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第2−3工程と、
を有することを特徴とする糖転移酵素の活性測定方法。
- 前記一般式[1]で表されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである請求項10に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
- 前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項10又は11に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
- 前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである請求項13に記載のADPの測定用キット。
- 前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである請求項15に記載のADPを生成する酵素の活性測定キット。
- 前記第1液がさらに還元剤を含む請求項17に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
- 前記一般式[1]で示されるマレイミド化合物が、N−エチルマレイミド、マレイミド又はN−(2−スルホエチル)マレイミドである請求項17又は18に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
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