JP2005500406A

JP2005500406A - 標的材料の蛍光検出用標識としてのアクリドン誘導体

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Publication number: JP2005500406A
Application number: JP2003502493A
Authority: JP
Inventors: ジョン・アンソニー・スミス; リチャード・マーティン・ウエスト
Original assignee: アマシャムバイオサイエンスユーケイリミテッド
Priority date: 2001-06-04
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2005-01-06
Anticipated expiration: 2022-05-30
Also published as: GB0113435D0; GB0326889D0; JP4583027B2; EP1392776A2; US20120015373A1; CA2754169A1; CA2449201A1; GB2391870B; US20040191792A1; GB2391870A; US20080139788A1; WO2002099424A3; CA2449201C; US8034558B2; WO2002099424A2

Abstract

特徴的な蛍光寿命を有する新規アクリドン色素誘導体が開示されている。また、アクリドン色素を用いた標的生物材料の標識方法および生物学的検定法における標識材料の使用についても開示されている。アクリドン誘導体は構造：
【化１】

[式中、Ｚ^１およびＺ^２は、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ‐もしくはジ‐ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、Ｒ^１は、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、Ｅはスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である]を有する。本発明はまた、異なる蛍光性アクリドン色素誘導体のセットに関するものであり、各色素は異なる蛍光寿命を有するものとし、色素のセットはマルチパラメーター分析に特に有用である。

Description

【０００１】
本発明は、標的材料へ結合し、それを標識するための標識として使用され得る特徴的な蛍光寿命を有する新規アクリドン誘導体に関するものである。本発明のアクリドン誘導体は、蛍光寿命により一つ一つが容易に識別され得るもので、それらはマルチパラメーター適用法で使用され得る。本発明はまた、アクリドン誘導体を利用した検定方法および異なる蛍光アクリドン寿命色素のセットに関するものである。
【０００２】
生物材料の標識および検出に使用される蛍光標識についての関心および要求はますます増大しつつある。蛍光標識は、一般的に安定して、高感度であり、現時点では広い範囲の方法が生体分子の標識に利用可能である。典型的には、蛍光色素の放出スペクトルは、色素独特の特性であり、かかる放出の強度は、その色素で標識された材料の検出で使用される。蛍光標識生体分子の検出および／または濃度測定手段としての蛍光強度の測定に伴う一つの問題は、バックグラウンド蛍光が測定に干渉し得ることである。すなわち、蛍光検出感度の改善を達成するためは、シグナル対ノイズ比を改善することが非常に望ましい。
【０００３】
バックグラウンドノイズの問題を克服する一手段は、米国特許第５２６８４８６号(Waggoner et al.)に開示されている通り、波長の長い色素、例えばシアニン色素Ｃｙ(登録商標)５およびＣｙ７の使用によるものであった。これらの色素は、６００〜８００ｎｍのスペクトル領域の蛍光を発し、その場合、バックグラウンド蛍光はほとんど問題にならない。蛍光測定におけるシグナル対ノイズ比を改善する別の手段は、例えばランタニドキレート、例えばＥｕ^３＋およびＴｂ^３＋に基いた蛍光標識を用いることによる(Selvin et al,米国特許第５６２２８２号)、時間分解蛍光の使用によるものである。時間分解蛍光標識では、蛍光放出の寿命は、典型的にはバックグラウンド蛍光の場合よりも長いため、適切な器具を用いてゲーティングされ得る。
【０００４】
McGown,L.B.et al(Anal.Chem.,(２０００)、７２、５８６５−７３)は、蛍光波長ではなく蛍光寿命が識別する上での特徴となる、マルチパラメーター分析についての一連の種々の色素の使用について報告している。寿命分解を達成するために異なる色素分類による色素を使用した。しかしながら、移動度差異または異なる蛍光シグナル強度については補正が必要とされた。この方法は、一定範囲の蛍光寿命を有するが、全て類似波長で吸収および放出する一連のローダミンに基く蛍光を使用することにより、励起供給源および吸収フィルターを変える必要性を回避したSauer,M et al(J.Fluorescence、(１９９３)、３(３)、１３１−１３９)により詳細に検討されている。
【０００５】
アクリドン発色団は、蛍光性が高く、生物分子の標識および後続の慣用的蛍光放出分光法による検出用に使用されている。例えば、Faller,T.et al(J.Chem.Soc.Comm.,(１９９７)、１５２９−３０)は、アクリドンのスクシンイミジルエステル誘導体の製法および質量分光法による後続分析用のペプチド標識におけるその使用を報告している。米国特許第５４７２５８２号(Jackson)は、混合物中における炭水化物の標識および検出、次いで電気泳動分離についての蛍光標識、２−アミノアクリドンの使用を報告している。
【０００６】
Val'kova,G.et al(Dokl.Akad.Nauk.SSR、(１９７８)、２４０(４)、８８４−７)は、幾つかのアクリドン誘導体の蛍光寿命を測定してきたが、現在までのところ、生物材料の標識および検出に適切な寿命の色素としてのアクリドンの使用に関する報告は為されていないと思われる。したがって、本発明は、アクリドン発色団の修飾による、特徴的な蛍光寿命を有し、生物材料の標識に有用な一連のアクリドン誘導体の製造について記載している。
【０００７】
さらに、本発明のアクリドン誘導体は、共通の骨格構造を有し、マルチパラメーター分析に特に有用である蛍光標識の貴重なセットを提供する。色素セットの各色素において、吸収および放出スペクトルは本質的に同じままであり、色素の蛍光寿命が変化している。すなわち、一般的励起源を使用し、同じ発光波長での蛍光寿命を測定することにより、マルチパラメーター実験で使用される検出器具についての必要条件を単純化することが可能である。本発明の別の利点は、アクリドン色素誘導体の蛍光寿命が一般的に他の蛍光標識および天然蛍光物質、例えばタンパク質およびポリヌクレオチドの寿命より長いことにより、上記色素を利用した検定においてバックグラウンド蛍光との区別が容易に行われ得ることである。
【０００８】
したがって第一の態様において、本発明は、試薬が、式(Ｉ)
【化１】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ‐もしくはジ‐ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｒ^１は、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
で示される色素である、標的材料の標識および寿命検出用試薬の使用に関するものである。
【０００９】
第一態様の第一の実施例において、式(Ｉ)の色素は、
基Ｒ^２およびＲ^３がＺ^１環構造の原子に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５がＺ^２環構造の原子に結合されており、Ｚ^１およびＺ^２が前記の意味であり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５が、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、そしてＲ^１が、水素、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎが前記の意味である、
蛍光色素である。
【００１０】
第一態様の第一の実施例によるアクリドン色素は、蛍光寿命色素としての使用に特に適切である。本発明の明細書において、寿命色素の語は、色素が、励起後にその励起状態のままである時間の平均量として定義される(Lakowicz,J.R.、Principles of Fluorescence Spectroscopy、クルワー・アカデミック／プレナム・パブリッシャーズ、ニューヨーク(１９９９))、測定可能な蛍光寿命を有する色素を意味するものとする。
【００１１】
好ましくは、蛍光色素は、２〜３０ナノ秒、さらに好ましくは、２〜２０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を有する。
【００１２】
第一態様の第二の実施例において、式(Ｉ)の色素は、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２が、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個が少なくとも１個のニトロ基を含む、非蛍光または実質的非蛍光色素である。
【００１３】
この実施例において、好適には、少なくとも１個のニトロ基は、Ｚ^１および／またはＺ^２環構造に直接結合され得る。他の例では、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル基は、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４またはＲ^５位に結合され得、所望によりさらにＺ^１および／またはＺ^２環構造へ直接結合された１個またはそれ以上のニトロ基により置換され得る。
【００１４】
好ましくは、第一および第二実施例において、式(Ｉ)の染料における基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの少なくとも１個は、基−Ｅ−Ｆ(ただし、ＥおよびＦは前記の意味である)である。
【００１５】
好適には、標的結合基Ｆは、反応性または官能性基である。式(Ｉ)による化合物の反応基は、適切な条件下で標的材料の官能基と反応し得、また式(Ｉ)による化合物の官能基は、適切な条件下で標的材料の反応基と反応し得、いずれにしても標的材料が化合物によって標識されるように行なわれる。
【００１６】
好ましくは、Ｆが反応基であるとき、それは、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、カルボジイミド、ヒドラジドおよびホスホルアミダイト(phosphoramidite)から選択される。好ましくは、Ｆが官能基であるとき、それは、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸基から選択される。これらの反応および官能基により、式(Ｉ)の化合物は標的材料と反応し、共有結合し得る。
【００１７】
好適には、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、フェニル、ピリジニル、ナフチル、アントラニル、インデニル、フルオレニル、キノリニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニルおよびベンゾイミダゾリル部分から成る群から選択され得る。追加的１、２縮合または３縮合環系は、当業者には容易に理解できるはずである。好ましくは、Ｚ^１およびＺ^２は、フェニル、ピリジニル、ナフチル、キノリニルおよびインドリル部分から成る群から選択される。特に好ましいＺ^１およびＺ^２は、フェニルおよびナフチル部分である。
【００１８】
好ましくは、式(Ｉ)で示される色素の基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの少なくとも１個は、化合物に親水特性を与える水可溶化基である。可溶化基、例えばスルホネート、スルホン酸および第４級アンモニウムは、式(Ｉ)で示される化合物の芳香族環構造Ｚ^１および／またはＺ^２に直接結合され得る。別法として、可溶化基は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルリンカー鎖により上記芳香族環構造へ結合され得、基−(ＣＨ_２−)_ｎＹ(ここで、Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である)から選択され得る。別の可溶化基は、炭水化物残基、例えば単糖類であり得る。水可溶化成分の例には、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルスルホネート、例えば−(ＣＨ_２)_３−ＳＯ_３ ⁻および−(ＣＨ_２)_４−ＳＯ_３ ⁻がある。しかしながら、式(Ｉ)で示される色素の芳香族環構造に直接結合される１個またはそれ以上のスルホネートまたはスルホン酸基が特に好ましい。水可溶性は、タンパク質標識時に有利であり得る。
【００１９】
適切なスペーサー基Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリンから成る群から選択される１〜６０個の鎖原子を含み得る。例えばスペーサー基は、
-(CHR')_p-
-{(CHR')_q-O-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-NR'-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-(CH=CH)-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-Ar-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-CO-NR'-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-CO-Ar-NR'-(CHR')_r}_s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］
であり得る。
【００２０】
反応基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の具体例およびＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５と反応し得る基の具体例は表１に示されている。別の例では、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、標的材料の反応基と反応する表１の官能基であり得る。
【００２１】
表１：可能な反応性置換基およびそれと反応性を示す部位
【表１】

【００２２】
利用可能なアミノおよびヒドロキシル官能基による標的材料の標識に特に有用である好ましい反応基には、以下のものが含まれる：
【化２】

(式中、ｎは０または１〜１０の整数である)
【００２３】
アリールは、６〜１０個の炭素原子を含む１個または２個の縮合芳香族環を含む芳香族置換基、例えばフェニルまたはナフチルであり、アリールは、所望により、そして独立して１個またはそれ以上の置換基、例えばハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝状鎖アルキル基、アラルキルおよびＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシおよびｎ−ブトキシにより置換されていてもよい。
【００２４】
ヘテロアリールは、Ｎ、ＯおよびＳから選択され得る少なくとも１個および３個以下のヘテロ原子を含む単環式または二環式５〜１０員芳香族環系であり、所望により、そして独立して１個またはそれ以上の置換基、例えばハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝状鎖アルキル基、アラルキルおよびＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシおよびｎ−ブトキシにより置換されていてもよい。
【００２５】
アラルキルは、アリールまたはヘテロアリール基により置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルキル基である。
【００２６】
ハロゲンおよびハロ基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される。
【００２７】
第一態様の第一実施例による色素の実例は以下の通りである：
ｉ)Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート、
ii)Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート、
iii)Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサノエート、
iv)Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート。
【００２８】
本発明による色素は、様々な標的生物材料を標識し、それによって蛍光特性を与えるのに使用され得る。すなわち、第２の態様では、標的生物材料の標識方法であって、
ｉ）標的生物材料を含む液体に、式(Ｉ)
【化３】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、Ｚ^１およびＺ^２は前記の意味であり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｒ^１は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎは前記の意味である］
の色素を加え、そして
ii）標的を標識するのに適切な条件下、色素と標的生物材料をインキュベーションする
工程を含む方法が提供される。
【００２９】
好適には、基Ｒ^１〜Ｒ^５の少なくとも１個が電荷、例えば第４級アミノを含む本発明の蛍光色素は、荷電した生物分子、例えばＤＮＡおよびＲＮＡに非共有結合するのに使用され得る。別法として、基Ｒ^１〜Ｒ^５の少なくとも１個が非荷電基、例えば長鎖アルキルまたはアリール基である本発明の蛍光色素は、非荷電生物分子、例えば生物脂質、並びに無傷の細胞膜、膜フラグメントおよび細胞に結合するのに使用され得る。
【００３０】
好ましい実施例において、式(Ｉ)の色素における基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの少なくとも１個は、基−Ｅ−Ｆ(ただし、ＥおよびＦは前記の意味である)である。この実施例において、蛍光色素は、標的生物材料を共有結合標識するのに使用され得る。標的結合基は、標的材料の官能基と反応するための反応基であり得る。別法として、標的結合基は、標的生物材料における反応基と反応させるための官能基であり得る。本方法では、標的材料および色素間に共有結合を形成させる条件下で標的生物材料と一定量の本発明色素をインキュベーションする。標的は、標的生物材料の官能または反応基と共有結合し得る上記の反応性または官能性基を含む基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの少なくとも１個を有する一定量の本発明化合物とインキュベーションされ得る。
【００３１】
適切な標的生物材料には、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されたヌクレオチド、および１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されたオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、ホルモン、細胞、細胞膜および毒素から成る群が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３２】
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの少なくとも１個に標的結合基を有する本発明による蛍光色素は、試料中における被検体の存在または量を測定する検定方法で使用され得る。すなわち、本発明の第三の態様では、試料中における被検体の検定方法であって、
ｉ)被検体の少なくとも一部分を特異的結合パートナーと結合させるのに適切な条件下、被検体を被検体に特異的な結合パートナーと接触させることにより、複合体を形成させ、そして被検体および特異的結合パートナーのうちの一方を、式（Ｉ）
【化４】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、Ｚ^１およびＺ^２は前記の意味であり、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
基Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、そして
基Ｒ^１が基−Ｅ−Ｆではないとき、それは、水素、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｙおよびｎは前記の意味である］
の蛍光色素で標識し、
ii)標識複合体から放出された蛍光を測定し、および
iii)放出された蛍光と試料中における被検体の存在または量との相互関係を明らかにする
工程を含む方法が提供される。
【００３３】
好適には、工程ii)は、試料の蛍光強度または蛍光寿命、好ましくは蛍光寿命の測定により遂行され得る。
【００３４】
一実施例において、検定方法は、試料中の被検体を測定する直接検定法である。所望により、既知または推定阻害剤化合物は反応混合物に含まれ得る。
【００３５】
第二または別の態様において、本検定法は、被検体とトレーサーとを特異的に結合させ得る結合パートナー上の限られた数の結合部位について被検体含有試料を蛍光トレーサーと競合させる競合検定法であり得る。好適には、トレーサーは、標識が式(Ｉ)の蛍光色素である、標識被検体または標識被検体類似体である。試料中における被検体の量(または濃度)を増すと、特異的結合パートナーに結合される蛍光標識被検体または蛍光標識被検体類似体の量は減少する。蛍光シグナルを測定し、標準曲線からの補間法により被検体濃度が得られる。
【００３６】
さらに別の実施例において、結合検定法は２段階フォーマットを使用し得、その場合、第一成分(所望により不溶性支持体にカップリングされ得る)を第二成分に結合させて特異的結合複合体を形成させ、次いでそれを第三成分に結合させる。このフォーマットでは、第三成分は、第二成分または特異的結合複合体に特異的に結合し得る。第二または第三成分のどちらかは、本発明蛍光色素により標識され得る。例としては、特異的結合対の一成分、例えば第一抗体を表面、例えばマルチウェルプレートのウェルへコーティングする「サンドイッチ」検定法がある。第一抗体への抗原の結合後、蛍光標識第二抗体を検定混合物に加えることにより、抗原‐第一抗体複合体と結合させ得る。蛍光シグナルを測定し、標準曲線からの補間法により抗原の濃度が得られる。
【００３７】
被検体‐特異的結合パートナー対の例には、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質または補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質があるが、これらに限定されるわけではない。互いについて特異的結合親和力を有する分子であれば全て使用され得るものと解釈すべきであり、したがって、本発明の蛍光色素は、特異的結合対の一成分を標識するのに使用され得、次いで他の成分への結合の検出で使用され得る。
【００３８】
第一態様の第一実施例による蛍光色素は、混合物中における様々な成分間における検出および識別を含む適用法で使用され得る。すなわち、第四の態様において、本発明は、２種またはそれ以上の異なる本発明蛍光色素のセットであって、色素セットの各色素が、式(Ｉ)
【化５】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、Ｚ^１およびＺ^２は前記の意味であり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｒ^１は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、そしてＦは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
を有し、セットの各色素が、セットの残りの色素の寿命と比べて明確に異なる蛍光寿命を有するものであるセットを提供する。
【００３９】
好ましくは、色素セットの各色素において、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆ(ここでＥおよびＦは前記の意味である)である。
【００４０】
好ましくは、本発明による蛍光色素セットは４種の異なる色素を含み、セットの各色素は異なる蛍光寿命を有している。
【００４１】
好ましくは、セットにおける蛍光色素の各々は、２〜３０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を有する。さらに好ましくはセットにおける蛍光色素は２〜２０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を有する。
【００４２】
色素セットにおける異なる色素間の識別を行うため、かかる２色素の蛍光放出寿命の差異は、好ましくは寿命が短い方の色素の値の少なくとも１５％である。
【００４３】
色素セットは、色素セットの異なる蛍光色素を複数の異なる一次成分に共有結合させる検出方法で使用され得、その場合各一次成分は異なる二次成分について特異的であることにより、二次成分の混合物中から複数の二次成分の各々を同定し得る。本方法では、本発明の第四態様による蛍光色素セットの異なる色素を、セットの各色素が、セットの残りの色素の蛍光寿命と比べて、異なる蛍光寿命を有する多成分混合物中の異なる一次成分に共有結合させ、色素標識一次成分の各々の少なくとも一部分をその各二次成分に結合させ得る条件下、二次成分を含む調製物に色素標識一次成分を加え、そして標識一次成分‐二次成分複合体の各々の蛍光寿命を測定することにより結合二次成分の存在または量を測定する。
【００４４】
必要な場合、未反応一次成分があれば、例えば洗浄することによりそれらを調製物から除去するかまたは分離することによって、被検体についての干渉が阻止され得る。
【００４５】
好ましくは、単一励起波長を用いることにより、混合物中の２種またはそれ以上の材料からの蛍光を励起させ得、その場合、各蛍光は異なる特徴的な蛍光寿命を有するものとする。
【００４６】
本発明による蛍光色素セットは、蛍光一次成分の生成が可能な系であればいずれにおいても使用され得る。例えば、本発明による適切な反応性蛍光色素を、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントにコンジュゲートさせ、次いで生成したコンジュゲートをＤＮＡまたはＲＮＡの相補的標的鎖に結合させ得る。検出され得る一次成分‐二次成分複合体の他の例には抗体／抗原およびビオチン／ストレプトアビジンがある。
【００４７】
本発明による蛍光色素セットはまた、ＤＮＡフラグメントの蛍光寿命識別に基いた蛍光ＤＮＡ配列決定で有利に使用され得る。簡単に述べると、色素セットの各々はプライマーにカップリングされ得る。様々なプライマーが利用可能であり、例えばｐＵＣ／Ｍ１３、λｇｔ１０、λｇｔ１１などからのプライマーがある(Sambrook et al.、Molecular Cloning、A Laboratory Manual 第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(１９８９)参照)。ＤＮＡ配列を、配列決定すべきＤＮＡフラグメントへ結合されたプライマー配列を有する適切なベクターへクローン化する。ＤＮＡ鋳型とのハイブリダイゼーション後、相補鎖のポリメラーゼ酵素指定合成が行われる。異なる２',３'−ジデオキシヌクレオチドターミネーターを異なる各配列決定反応で使用することにより、連鎖伸長反応の塩基特異的終結が達成される。生成したＤＮＡフラグメントのセットを電気泳動により分離し、標識フラグメントの蛍光寿命を検出することにより終結ヌクレオチド(およびすなわちＤＮＡ配列)が決定される。ＤＮＡ配列決定はまた、本発明蛍光色素により共有結合標識されたジデオキシヌクレオチドターミネーターを用いて遂行され得る。
【００４８】
第一態様の第二実施例による非蛍光または実質的非蛍光色素は、酵素基質として使用され得、酵素との反応時、蛍光生成物を生じる。
【００４９】
細菌性ニトロレダクターゼは、下記反応スキーム１に示されている一般的反応を触媒することが示された。
【化６】

反応スキーム１
この場合、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下、有機分子上の１個またはそれ以上のニトロ基は、ヒドロキシルアミン(−ＮＨＯＨ)基に還元され得、それに続いてアミン(−ＮＨ_２)基に変換され得る。
【００５０】
すなわち、本発明の第五態様では、式(Ｉ)：
【化７】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素の蛍光を増加させる方法であって、少なくとも一ニトロ基の−ＮＨＯＨまたは−ＮＨ_２への還元を特徴とする方法が提供される。
【００５１】
好ましくは、還元による蛍光生成物の蛍光寿命は、２〜３０ナノ秒の範囲である。
【００５２】
好適には、還元はニトロレダクターゼにより行われる。これは、ニトロレダクターゼの作用による式(Ｉ)の化合物におけるニトロ基の−ＮＨＯＨまたは−ＮＨ_２基への酵素変換により達成され得る。色素の構造によって、ニトロレダクターゼ反応生成物からの蛍光放出は、典型的には２〜３０ナノ秒の範囲の寿命を有し得る。さらに、反応生成物の蛍光寿命特性は、ニトロレダクターゼとの反応に関与するニトロ基(複数も可)を保持しながらも、追加置換基による適用に合うよう改変され得る。すなわち、複合系における他の蛍光体との使用に適合し得る蛍光リポーターが提供され得る。
【００５３】
本発明の第六態様では、組成物におけるニトロレダクターゼ酵素活性の検出方法であって
ｉ)ニトロレダクターゼ活性を高める条件下、組成物を式(Ｉ)：
【化８】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と混合し、そして
ii)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度である、蛍光の増加を測定する
ことを含む方法が提供される。
【００５４】
好適には、段階(ii)の測定は、色素の蛍光強度および／または蛍光寿命の測定であり得る。
【００５５】
第六態様の一実施例において、組成物は細胞または細胞抽出物を含む。原則として、いかなるタイプの細胞、すなわち原核生物または真核生物細胞(細菌、哺乳類、および植物細胞を含む)でも使用され得る。適切な場合、細胞抽出物は、蛍光測定前に、当業者に公知の標準方法を用いて細胞から調製され得る(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９)。
【００５６】
ニトロレダクターゼ活性についての典型的条件は、ＮＡＤＨおよびＦＭＮの存在下約３７℃での適切な培地中における組成物および色素のインキュベーションを含む。
【００５７】
本発明の第七態様では、
ｉ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させ、
ii)成分間の結合を促す条件下、特異的結合対の第２成分を加え、ただし、その第２成分はニトロレダクターゼ酵素で標識されているものとし、
iii)式(Ｉ)
【化９】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素を加え、そして
iv)結合したニトロレダクターゼ活性の尺度として蛍光の増加を測定することにより、第１成分への第２成分の結合を検出する
ことを含む検定方法が提供される。
【００５８】
第七態様の好ましい実施例において、特異的結合対は、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質から成る群から選択される。
【００５９】
簡単に述べると、抗体結合検出についてのインビトロ検定法は、以下の要領で設定され得る。興味の対象である抗原に特異的な抗体を、酵素活性ニトロレダクターゼにそれを共有結合させることにより標識し得る。次いで、標識抗体を、結合に適した条件下、抗原含有試験試料中へ導入し得る。洗浄により未結合抗体を全て除去後、ニトロレダクターゼ活性を促す条件下、少なくとも１個のニトロ基を有する式(Ｉ)の化合物を含む基質と試料をインキュベーションし、蛍光の増加を測定することにより、結合抗体の量を検出する。検出された蛍光の量は、抗原に結合したニトロレダクターゼ標識抗体の量に比例する。
【００６０】
ハイブリダイゼーションによる核酸結合の検出についてのインビトロ検定法では、標的およびプローブ核酸対の一方を膜または表面への結合により固定する。対の第二構成員をニトロレダクターゼで標識し、ハイブリダイゼーション条件下で固定された核酸とインキュベーションする。未結合の標識核酸を洗い流し、ニトロレダクターゼ活性に適切な条件下、少なくとも１個のニトロ基を有する式(Ｉ)の化合物と膜または表面をインキュベーションすることにより、結合した標識核酸の量を測定する。蛍光の増加量は、結合標識ＤＮＡの量の尺度を与える。
【００６１】
酵素、例えばニトロレダクターゼを他の生体分子、例えばタンパク質および核酸にカップリングさせる方法は公知である(Bioconjugate Techniques、アカデミック・プレス(１９９６))。カップリングは、直接的手段により、例えば適切な二官能性架橋剤(例、Ｎ−[γ−マレイミドプロピオン酸]ヒドラジン、ピアス)を用いて酵素および結合パートナーを共有結合させることにより達成され得る。別法として、カップリングは、間接的手段により、例えば化学反応性ビオチン誘導体(例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド‐ビオチン、ピアス)を用いて酵素および結合パートナーを別々にビオチニル化し、それに続いてストレプトアビジン架橋性分子を通じて分子をカップリングすることにより達成され得る。
【００６２】
細胞に基く検定法は、高スループットスクリーニング(ＨＴＳ)で使用されるインビトロ生化学検定法に比べてますます魅力あるものとなっている。これは、細胞に基く検定法が最小限の操作ですむためであり、リードアウトは、通常の生理学的状況をより忠実に模倣する生物学的コンテクストで調べられ得る。かかるインビボ検定法は、細胞プロセスを測定する能力およびその出力の測定手段を必要とする。例えば、若干の遺伝子の転写パターンにおける変化は、例えば、アゴニストとその細胞表面受容体との相互作用によりまたは内部細胞事象、例えばＤＮＡ損傷により誘発された細胞シグナルにより誘導され得る。転写で誘導された変化は、特異的活性化シグナルに応答性であることが知られているプロモーター領域にリポーター遺伝子を融合させることにより同定され得る。
【００６３】
蛍光に基く酵素‐基質系では、蛍光の増加はリポーター遺伝子の発現活性化の尺度を与える。
【００６４】
したがって、本発明の第八の態様では、
ｉ)ニトロレダクターゼをコード化する配列に機能し得るように結合された発現制御配列を含む核酸分子によりトランスフェクションされた宿主細胞を、式(Ｉ)：
【化１０】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と接触させ、
ii)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度として蛍光の増加を測定する
ことを含む検定方法が提供される。
【００６５】
第八態様の一実施例において、検定方法は、その遺伝子発現に対する効果が測定される試験剤の存在下で実施される。
【００６６】
哺乳類細胞におけるリポーター遺伝子としての様々な酵素遺伝子の使用方法は公知である(概説については、Naylor L.H.、Biochemical Pharmacology、(１９９９)、５８、７４９−７５７参照)。リポーター遺伝子は、他の細胞タンパク質の存在下で遺伝子産物が測定可能であるように選択され、宿主細胞における遺伝子発現の変化に対して応答性である選択された調節配列の制御下で細胞へ導入される。典型的調節配列は、ホルモン応答性のもの、第二メッセンジャーおよび他の細胞制御およびシグナル伝達因子を包含する。例えば、７貫膜受容体に結合するアゴニストは、ｃＡＭＰ応答性エレメント、ＮＦ−ＡＴ、ＳＲＥおよびＡＰ１を含むプロモーターエレメントを調節することが知られている。ＭＡＰキナーゼ活性化は、ＦｏｓおよびＪｕｎ転写に至るＳＲＥの調節をまねく。ＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ修復酵素および腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３の転写活性化に至る。適切な調節配列の選択により、リポーター遺伝子を用いて、試験下にある選択された調節配列を伴う細胞プロセスに対する添加薬剤の効果が検定され得る。
【００６７】
リポーター遺伝子として使用するため、ニトロレダクターゼ遺伝子を、公知方法により、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の使用によるｃＤＮＡライブラリーからの増幅により単離し得る(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(１９８９)、１４.５−１４.２０頁)。一旦単離すると、ニトロレダクターゼ遺伝子を、試験下にある遺伝子調節配列と連係的にそしてその制御下で哺乳類プロモーターとの使用に適したベクター(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(１９８９)、１６.５６−１６.５７頁)へ挿入し得る。次いで、ニトロレダクターゼリポーターおよび関連調節配列を含むベクターを、公知技術を用いたトランスフェクションにより、例えばＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウムの使用により(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(１９８９)、１６.３０−１６.４６頁)、宿主細胞へ導入させ得る。他の適切な技術も当業者にはよく知られている。
【００６８】
第八態様の別の実施例において、式(Ｉ)(ただし、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む)の色素は細胞透過性である。この実施例において、好ましくは、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は、細胞膜透過性基を含む。膜透過性化合物は、親水性基を遮蔽してより疎水性の高い化合物を与えることにより生成され得る。遮蔽基は、細胞内で基質から開裂されて、細胞内誘導された基質を生成するように設計され得る。基質は膜透過性誘導体よりも親水性が高いため、細胞で捕えられる。適切な細胞膜透過性基は、内在性哺乳類細胞内エステラーゼにより容易に開裂されるアセトキシメチルエステル(Jansen,A.B.A.およびRussell,T.J.、J.Chem.Soc.、(１９６５)、２１２７−２１３２およびDaehne W et al.、J.Med.Chem.、(１９７０)１３、６９７−６１２)およびピバロイルエステル(Madhu et al.、J.Ocul.Pharmacol.Ther.、(１９９８)、１４(５)、３８９−３９９)から選択され得るが、他の適切な基も当業者により認められている。
【００６９】
典型的には、試験下の調節配列を介した細胞応答を活性化する試験剤の活性を検定するため、ニトロレダクターゼリポーターによりトランスフェクションされた細胞を、試験剤とインキュベーションし、次いで、式(Ｉ)(上記色素における基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む)の色素を加えると、上記化合物は細胞透過性にされる。蛍光を呈する形態に基質を変換するのに要求される適切な期間後、細胞からの蛍光を、選択された色素に適切な発光波長で測定する。蛍光の測定は、蛍光顕微鏡(例、ＬＳＭ４１０、ツァイス)、マイクロプレート読取り装置(例、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ４０００、パーキン・エルマー)、ＣＣＤイメージングシステム(例、ＬＥＡＤシーカー(登録商標)、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック)およびフローサイトメーター(例、ＦＡＣＳカリバー、ベクトン・ディッキンソン)を含む一連の検出器具の使用により容易に達成され得る。
【００７０】
測定された蛍光を、試験剤に暴露されていない対照細胞からの蛍光と比較し、調節配列を通じて調節された遺伝子発現に対する試験剤の効果があるとすれば、それを試験細胞における特徴的な蛍光の検出により測定する。適当な場合、細胞抽出物は慣用的方法を用いて調製され得る。
【００７１】
ニトロレダクターゼ酵素を発現させるのに適した手段には、発現プラスミドまたは他の発現構築物がある。上記発現構築物の製造方法は、当業者にはよく知られている。
【００７２】
本発明の第九態様では、式(Ｉ)：
【化１１】

(Ｉ)
［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、そして
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、そして
基Ｒ^１が基−Ｅ−Ｆではないとき、それは、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であり、
ただし、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は水可溶化基であるものとする］
で示される色素が提供される。
【００７３】
好ましくは、標的結合基Ｆは、標的材料上の官能基と反応するための反応基、または標的材料上の反応基と反応するための官能基を含む。好ましい反応基は、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ‐スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホルアミダイトから選択され得る。好ましい官能基は、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸基から選択され得る。
【００７４】
好ましくは、スペーサー基Ｅは、
-(CHR')_p-
-{(CHR')_q-O-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-NR'-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-(CH=CH)-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-Ar-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-CO-NR'-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-CO-Ar-NR'-(CHR')_r}_s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］
から選択される。
【００７５】
式(Ｉ)の色素は、公表された方法(Albert,A.およびRitchie,B.、Org.Syntheses(１９４２)、２２、５、また米国特許第３０２１３３４号参照)にしたがって、対応するジフェニルアミン−２−カルボン酸から製造され得る。好適には、ジフェニルアミン−２−カルボン酸は、酸性脱水剤、例えばオキシ塩化リンまたは濃硫酸の存在下で加熱され得る。ジフェニルアミン−２−カルボン酸誘導体は、２−ハロ安息香酸と適切な一次アミノベンゼン(アミノ基に対し非置換オルト位置に少なくとも１個のアリール環を有する)との反応により製造され得、この反応は、触媒性銅金属／塩の存在下で行われ得る(Ullmann,F.、Chem.Ber.(１９０３)、３６、２３８２；また英国特許第６４９１９７号参照)。好適には、溶媒、例えば１−ブタノールまたは１−ペンタノール中、塩基、例えばアルカリ金属炭酸塩の存在下、２−ハロ安息香酸をアミノベンゼンと加熱する。触媒量の銅金属粉または銅塩、例えば無水酢酸銅もまた通常は含まれるが、これが要求されない場合もある。
【００７６】
本発明のある種の色素は、当業者に公知の方法による他の色素への変換についての中間体として有用であり得ることは容易に理解できるはずである。本発明色素は、本明細書で開示されている方法により合成され得る。特定用途を有する化合物の誘導体は、適切な前駆体を選択するか、または既知方法により生成された化合物を、様々な位置に官能基を含むよう修飾することにより製造される。例として、本発明の色素は、本発明による色素を製造するためのある種の反応基を含むように修飾され得るか、または荷電または極性基を付加することにより、極性または非極性溶媒または材料中における化合物の溶解度を高め得る。変換の例として、エステルはカルボン酸に変換され得るか、またはアミド誘導体に変換され得る。基Ｒ^１〜Ｒ^５は、本発明色素が異なる寿命特性を有するように選択され得、それによって、単一試料中の種々の化合物の存在および量を若干の検出された蛍光発光の波長および寿命に基いて識別し得るマルチパラメーター分析で使用され得る若干の関連色素が提供される。本発明の色素は、Ｒ基の適切な選択により標識すべき材料を含む水性、他の極性または非極性媒質において可溶性にされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
以下の実施例および図面を通してさらに本発明を説明する。
【図１】図１は、本発明による４種のアクリドン色素の吸光度スペクトル(１Ａ)および放出スペクトル(１Ｂ)を示す。
【００７８】
【図２】図２は、以下の本発明による４種のアクリドン色素の蛍光寿命減衰プロットを示す：
【表２】

【図３】図３は、以下のタンパク質コンジュゲートの寿命減衰プロットを示す：コンジュゲート１＝６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸‐ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)コンジュゲート；コンジュゲート２＝６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサン酸‐ウサギ血清アルブミンコンジュゲート。
【図４】図４は、実施例１６に記載された抗ＢＳＡ抗体による免疫沈降後の寿命減衰プロットである。
【図５】図５は、実施例１７に記載された４種のアクリドン色素標識ＤＮＡフラグメントの毛管電気泳動における蛍光寿命検出を説明している。
【図６】図６は、実施例１９に記載された２種の異なるアクリドン色素で標識し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで共電気泳動にかけたＢＳＡコンジュゲートの混合物の寿命検出を示す。
【００７９】
Ｃｙ(登録商標)は、アマーシャム・ファルマシア・バイオテックＵＫリミテッドの登録商標である。
【実施例】
【００８０】
実施例
１．Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
【化１２】

１.１Ｏ−エチル−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
９−(１０Ｈ)−アクリドン(４.８８ｇ、２５ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水メチルスルホキシド(２５ｍｌ)と混合し、攪拌を実施した。５分後、生成した黄色スラリーをカリウム・ｔｅｒｔ−ブトキシド(３.３７ｇ、３０ｍｍｏｌ)で処理し、固体が全て溶解するまで攪拌を続行した。次いで、エチル・６−ブロモヘキサノエート(６.７ｇ、３０ｍｍｏｌ)を加え、生成した溶液を３日間窒素下で攪拌した。この期間の最後に、反応混合物を水(１０００ｍｌ)中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機溶液を０.５ＭのＨＣｌ水溶液、次いで水により洗浄した後、乾燥(ＭｇＳＯ_４)し、濾過し、真空下で濃縮した。
【００８１】
１：１酢酸エチル／へキサンで磨砕することにより、粗生成物を未反応アクリドンから分離した。未溶解のまま残存したアクリドンを濾過した。濾液を０.５ＭのＨＣｌ水溶液で２回洗浄した後、乾燥(ＭｇＳＯ_４)し、濾過し、真空下で濃縮した。酸で洗浄することによりＯ−アルキル化アクリジン副産物の大部分を除去した。次いで、残さをフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカ、３０〜５０％酢酸エチル／へキサン)にかけ、５.９ｇ(７０％)のＯ−エチル−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートを得た。この物質を最後にエタノール(２０ｍｌ)から再結晶化して、分析的に純粋な物質５.１４ｇを得た。λ_max (EtOH) = 404, 387, 254nm; δ_H (300MHz, CD₃OD) 1.23 (3H, t), 1.60 (2H, m), 1.73 (2H, m), 1.92 (2H, m), 2.37 (2H, t), 4.11 (2H, q), 4.50 (2H, app.t) 7.34 (2H, m), 7.77 (2H, m), 7.84 (2H, m) and 8.46 (2H, m). マススペクトル: (ES+) 338 (M+H), 360 (M+Na)。
【００８２】
１.２６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
Ｏ−エチル−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(３.４０ｇ、１０ｍｍｏｌ)を、酢酸(４０ｍｌ)および１.０ＭのＨＣｌ水溶液(１０ｍｌ)と混合した。ＴＬＣがカルボン酸への完全な変換を示すまで(ＲＰＣ_１８、メタノール、９０：水、１０。Ｒ_ｆ＝０.８)、生成した溶液を３時間還流下加熱した。溶液を真空下濃縮し、次いで黄色固体が得られるまでアセトニトリルと共に蒸発させた。これをジエチルエーテルで磨砕し、高度真空下五酸化リンで乾燥し、６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(３.０７ｇ、９８％)を得た。λ_max (EtOH) = 404, 384, 256nm. δ_H (300MHz, CD₃OD) 1.62 (2H, m), 1.75 (2H, m), 1.95 (2H, m), 2.36 (2H, t), 4.53 (2H, app.t), 7.35 (2H, m), 7.79 (2H, m), 7.86 (2H, m) and 8.46 (2H, m). マススペクトル: (ES+) 310 (M+H), 332 (M+Na). 融点 = 167℃。
【００８３】
１.３Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(３０９ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)およびＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＳＴＵ；３０１ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(５ｍｌ)に溶かした。生成した溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１８３μｌ、１.０５ｍｍｏｌ)を加えた。２時間後、溶媒を真空下蒸発させた。残さをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、０〜１０％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製し、淡黄色粉末(３３０ｍｇ、８１％)としてＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートを得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.63-1.83 (6H, m), 2.74 (2H, t), 2.83 (4H, s), 4.47 (2H, app.t), 7.30-7.38 (2H, m), 7.81-7.84 (4H, m) and 8.34-8.38 (2H, m). マススペクトル: (ES+) 407 (M+H), 429 (M+Na). 正確な質量:(M+H) =C₂₃H₂₃N₂O₅ , 理論値 407.1607. 実測値 407.1597 (-2.4ppm)。
【００８４】
２．Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
【化１３】

２.１Ｏ−エチル−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートおよびＯ−エチル−６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
Ｏ−エチル−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(４.２２ｇ、１２.５ｍｍｏｌ)を、攪拌しながらエタノール(１５０ｍｌ)に溶かした。生成した溶液に、ベンジルトリメチルアンモニウムトリブロミド(９.７５ｇ、２５ｍｍｏｌ)を加えた。混合物を窒素下で４日間攪拌した。次いで、溶媒を真空下濃縮し、残さを水(１０００ｍｌ)および酢酸エチル(３００ｍｌ)間に分配した。有機層を集め、さらなる水および希チオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで乾燥(ＭｇＳＯ_４)し、濾過し、真空下で濃縮した。
【００８５】
粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカ、０〜５％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製した。まずＯ−エチル−６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート、次いでＯ−エチル−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートが溶離した。各々の純粋なフラクションをプールし、別々に濃縮した。
【００８６】
Ｏ−エチル−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートをエタノールから再結晶化した。収率：2.77g (53%). λ_max (EtOH) = 412, 392, 300, 278, 256nm. δ_H (300MHz, CD₃OD) 1.22 (3H, t), 1.58 (2H, m), 1.74 (2H, m), 1.91 (2H, m), 2.37 (2H, t), 4.10 (2H, q), 4.49 (2H, app.t), 7.36 (1H, m), 7.72 (1H, d), 7.78 (1H, d), 7.82-7.92 (2H, m), 8.42 (1H, dd) および8.52 (1H, dd). マススペクトル: (ES+) 416 および 418 (M+H), 438 および440 (M+Na)。
【００８７】
Ｏ−エチル−６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートをクロロホルム／エタノールから再結晶化した。収率：2.06g (33%). δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.15 (3H, t), 1.50-1.80 (6H, m), 2.31 (2H, t), 4.04 (2H, q), 4.43 (2H, app.t), 7.81 (2H, d), 7.95 (2H, dd) および 8.34 (2H, d)。
【００８８】
２.２６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
Ｏ−エチル−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(２.５ｇ、６ｍｍｏｌ)を酢酸(３０ｍｌ)に溶かした。この溶液に１.０ＭのＨＣｌ水溶液(１０ｍｌ)を加えた。混合物を還流下で３.５時間加熱した。逆相クロマトグラフィー分析(Ｃ_１８)(メタノール：水、９０：１０)は、Ｒ_ｆ＝０.３およびＲ_ｆ＝０.５５での２スポットを示した。次いで、溶液を真空下蒸発させ、次いで、黄色固体が得られるまでアセトニトリルと共に蒸発させた。これをジエチルエーテルで磨砕し、高度真空下五酸化リンで乾燥して、６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(２.２７ｇ、９７％)を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.50-1.65 (4H, m), 1.70-1.81 (2H, m), 2.25 (2H, t), 4.46 (2H, app.t), 7.32-7.40 (1H, m), 7.78-7.98 (4H, m) および 8.31-8.41 (2H, m). λ_max (EtOH) = 414, 397, 256nm. 融点= 213℃。
【００８９】
２.３Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(３８８ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)およびＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＳＴＵ；３０１ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(５ｍｌ)に溶かした。生成した溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１８３μｌ、１.０５ｍｍｏｌ)を加えた。２時間後、溶媒を真空下蒸発させた。残さをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、０〜１０％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製し、Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(３３０ｍｇ、８７％)を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.5-1.8 (6H, m), 2.73 (2H, t), 2.80 (4H, s), 4.47 (2H, app.t), 7.32-7.42 (1H, m), 7.78-7.83 (3H, m), 7.94 (1H, dd), 8.35 (1H, d) および 8.41 (1H, d). マススペクトル: (ES+) 485+487 (M+H), 507/509 (M+Na). 正確な質量: (M+H) =C₂₃H₂₂BrN₂O₅ , 理論値 485.0712. 実測値 485.0689 (-4.8ppm)。
【００９０】
３. Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
【化１４】

３.１６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
Ｏ−エチル−６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(２.０ｇ、４.０４ｍｍｏｌ)を酢酸(３０ｍｌ)に溶かした。この溶液に１.０ＭのＨＣｌ水溶液(１０ｍｌ)を加えた。混合物を還流下で４時間加熱した。逆相クロマトグラフィー分析(Ｃ_１８)(メタノール：水、９０：１０)は、Ｒ_ｆ＝０.２およびＲ_ｆ＝０.４での２スポットを示した。溶液を周囲温度に放冷すると、生成物が綿毛状黄色針晶として結晶化した。氷浴中で最終冷却後、固体を真空濾過により集め、冷酢酸水溶液、次いでジエチルエーテルで洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥して、６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(１.８０ｇ、９７％)を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.50-1.80 (6H, m), 2.25 (2H, t), 4.40 (2H, app.t), 7.78 (2H, d), 7.92 (2H, dd) および 8.3 (2H, d)。
【００９１】
３.２Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(４６７ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)およびＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＳＴＵ；３０１ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(５ｍｌ)に溶かした。生成した溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１８３μｌ、１.０５ｍｍｏｌ)を加えた。一晩放置後、溶媒を真空下蒸発させた。残さをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、１０％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製し、Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２,７−ジブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(５１０ｍｇ、９１％)を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.5-1.8 (6H, m), 2.72 (2H, t), 2.83 (4H, s), 4.44 (2H, app.t), 7.82 (2H, d), 7.95 (2H, dd)および 8.36 (2H, d). マススペクトル: (ES+) 563+565+567 (M+H), 585+587+589 (M+Na). 正確な質量: (M+Na) =C₂₃H₂₀Br₂N₂O₅Naの理論値 584.9637. 実測値 584.9608 (-4.9ppm)。
【００９２】
４. Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサノエート
【化１５】

４.１４−カルボキシアクリドン
２,２'−イミノジ安息香酸(５.２７ｇ、２０.５ｍｍｏｌ)をオキシ塩化リン(２０ｍｌ)と混合した。生成した淡黄色スラリーを加熱沸騰させた。スラリーは最初明黄色になり、次いで溶解すると深紅溶液を生じ、メニスカスでは強い黄色であった。還流温度で２時間後、過剰の溶媒を真空下蒸発させて薄黒い油状物を得た。これを氷でクエンチングし、次いで２.０ＭのＨＣｌ水溶液(２５ｍｌ)で希釈し、生成した薄黒い溶液を再加熱し、沸騰させた。２０分後、固体が沈澱し、混合物は強い粘稠性となった。次いで、さらに２０ｍｌの水を加えて有効な攪拌を行った。１.５時間後、混合物を周囲温度に放冷した。黄色固体を真空濾過により集め、水、次いでアセトンで十分に洗浄し、真空下乾燥して、４−カルボキシアクリドン(４.６１ｇ、９４％)を得た。λ_max (EtOH) = 408, 390, 256nm. δ_H (300MHz, DMSO-d₆) 7.24-7.33 (2H, m), 7.67-7.76 (2H, m), 8.17 (1H, d), 8.38 (1H, dd), 8.47 (1H, dd)および 11.9 (広いs, 部分交換). マススペクトル: (ES+) 240 (M+H), 262 (M+Na). 融点 >300℃。
【００９３】
４.２６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサン酸
４−カルボキシアクリドン(２.１５ｇ、９ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(１５ｍｌ)およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１.６ｍｌ、９.２ｍｍｏｌ)と混合し、窒素下攪拌して、濃黄色溶液を得た。これに、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(３.５ｇ、９ｍｍｏｌ)を加え、攪拌を２時間続行した。この間、粘稠性黄色沈澱が形成された。次いで、６−アミノヘキサン酸(１.４５ｇ、１１ｍｍｏｌ)を加え、攪拌を一晩続行した。逆相クロマトグラフィー分析(Ｃ_１８)(メタノール：水、８０：２０)は、Ｒ_ｆ＝０.７５およびＲ_ｆ＝０.５５での２スポットを示した。次いで、反応混合物を０.２５ＭのＨＣｌ水溶液(２００ｍｌ)中に注ぎ、沈澱した生成物を真空濾過により集め、さらなる希ＨＣｌおよび水で洗浄した。まだ湿っている固体をエタノール／水から再結晶化させ、真空下五酸化リンで乾燥して、６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサン酸(１.９７ｇ、６２％)を得た。λ_max (EtOH) = 408, 390, 256nm. δ_H (300MHz, DMSO-d₆) 1.35-1.65 (6H, m), 2.24 (2H, t), 3.40 (2H, t), 7.26-7.39 (2H, m), 7.74-7.77 (2H, m), 8.21-8.28 (2H, m), 8.44 (2H, app.d), 9.00 (1H, 広い t, アミド), 12.02 (広い s, D₂0 交換)および 12.49 (広い s, D₂0 交換). マススペクトル: MALDI-TOF, m/z =353.15, C₂₀H₂₁N₂O₄についてのM = 353.15。融点 = 218℃。
【００９４】
４.３Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサノエート
６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサン酸(３５２ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)およびＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＳＴＵ；３０１ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(５ｍｌ)に溶かした。生成した溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１８３μｌ、１.０５ｍｍｏｌ)を加えた。一晩放置後、溶媒を真空下蒸発させた。残さをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、１０〜１００％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製し、Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサノエート(４１０ｍｇ、９１％)を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.44-1.75 (6H, m), 2.71 (2H, t), 2.79 (4H, s), 3.38 (2H, t), 7.27-7.39 (2H, m), 7.75 (2H, app.d), 8.21-8.28 (2H, m), 8.44 (1H, app.d), 9.00 (1H, 広い t, アミド) および12.47 (広い s, D₂O 交換). マススペクトル: (ES+) 450 (M+H), 472 (M+Na). 正確な質量: (M+H) =C₂₄H₂₄N₃O₆の理論値 450.1665. 実測値 450.1671 (+1.3ppm)。
【００９５】
５. ２−カルボキシメチル−７−クロロ−９−オキソ−９,１０−アクリジン
【化１６】

５.１Ｎ−(４−カルボキシメチルフェニル)−４−クロロ−２−カルボキシアニリン
１００ｍｌ丸底フラスコに、２,５−ジクロロ安息香酸(１.９ｇ、１０ｍｍｏｌ)、４−アミノフェニル酢酸(１.５ｇ、１０ｍｍｏｌ)、無水炭酸ナトリウム(３.２ｇ、２６ｍｍｏｌ)、活性化銅金属粉(０.２５ｇ、４ｍｍｏｌ)および１−ブタノール(５０ｍｌ)を加えた。フラスコには、マグネチックスターラー棒、水冷却器、シリカゲルガード管を取りつけ、還流下で４８時間加熱した。ＴＬＣ(ＲＰＣ_１８、水、２０：メタノール、８０)は、Ｒ_ｆ０.５５でゆっくりと移動している成分の形成を示した。溶媒を減圧下で除去し、高度真空下で最終乾燥した。残さを５０ｍｌの水に溶かし、加熱沸騰させ、次いで炭を加え、混合物をセライトで濾過し、さらなる２５ｍｌの温水で洗浄した。この溶液を氷浴中で１０℃に冷却し、次いで濃ＨＣｌ水溶液によりｐＨ〜２に酸性化した。分離した油状物をクロロホルムへ抽出し、溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発により除去すると、粘着性固体が残存した。水／酢酸からの再結晶化により、標記化合物(１.０７ｇ、３５％)を得た。δ_H (300MHz, DMSO-d₆) 3.54 (2H, s), 7.15-7.27 (5H, m), 7.39 (1H, dd) 7.81 (1H, d), 9.54 (1H, 広い s)および12.0-13.5 (2H, 広い). マススペクトル (ES-) 304 (M-H). λ_max (EtOH) = 292, 364nm。
【００９６】
５.２２−カルボキシメチル−７−クロロ−９−オキソ−９,１０−アクリジン
２５ｍｌ丸底フラスコに、ジフェニルアミン(５００ｍｇ、１.６４ｍｍｏｌ)およびオキシ塩化リン(５ｍｌ)を加えた。フラスコには、マグネチックスターラー棒、水冷却器、シリカゲルガード管を取りつけ、還流下で１時間加熱した。過剰のオキシ塩化リンを真空下暗褐色混合物から除去し、次いで、少量の氷、次いで２.０ＭのＨＣｌ水溶液(１０ｍｌ)を加えた。混合物を１時間１００℃に加熱し、放冷した後、濃縮乾固し、真空下五酸化リンで乾燥した。残さを１０％ｖ／ｖの水／メタノールに溶かし、ＴＬＣによりモニターしながらＳｅｐＰａｋＲＰＣ_１８(１０ｇ)カラムで溶離した。蛍光含有フラクションを合わせ、濃縮乾固し、真空下五酸化リンで乾燥した。
【００９７】
次いで、この半精製物質を、分取ＨＰＬＣ(ＲＰＣ。水→メタノール勾配)によりさらに精製した。純粋なフラクションを合わせ、濃縮して、淡黄色固体(１９ｍｇ、４％)として２−カルボキシメチル−７−クロロ−９−オキソ−９,１０−アクリジンを得た。δ_H (300MHz, DMSO-d₆) 3.72 (2H, s), 7.50 (1H, m), 7.58 (1H, m), 7.65 (1H, m), 7.75 (1H, m), 8.10 (1H, m), 8.14 (1H, m) および 11.9 + 12.4 (2x 広い s). マススペクトル: (ES-) 286+288 (M-H), 242+244 (M-H-CO₂). λ_max (EtOH) = 260, 390, 408nm。
【００９８】
６. Ｎ−(スクシニル)−２−アミノ−１０Ｈ−アクリジン−９−オン
【化１７】

２−アミノ−１０Ｈ−アクリジン−９−オン(１００ｍｇ、０.４８ｍＭ)、無水コハク酸(５０ｍｇ、０.５Ｍｍ)、ジイソプロピルエチルアミン(９０μｌ)および乾燥ＤＭＦ(１ｍｌ)を一晩一緒に攪拌した。ＴＬＣ(Ｃ−１８逆相プレート、水：メタノール１：１)は、出発物質(波長の長いＵＶ光線下で緑色蛍光)が全て速く移動するスポットに変換されたことを示しており、これは波長の長いＵＶ光線下では青色蛍光を示した。溶媒を回転蒸発により除去し、残さをジクロロメタンに溶かし、フラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカ、０〜１０％メタノール／ジクロロメタン)により精製した。各々の純粋なフラクションをプールし、濃縮乾固して、Ｎ−(スクシニル)−２−アミノ−１０Ｈ−アクリジン−９−オン、１４７ｍｇ(９８％)を得た。λ_max (H₂O) = 399nm. δ_H (300MHz, d₆-DMSO) 2.05 (4H, m), 6.82 (1H, t), 7.15 (2H, m), 7.28 (1H, t), 7.53 (1H, d), 7.81(1H, d), 8.09(1H,s). マススペクトル: (ES+) 311. M.Pt >300℃。
【００９９】
７. ２−ニトロアクリドン−７−スルホン酸
【化１８】

７.１２−カルボキシ−４−ニトロジフェニルアミン
２−クロロ−５−ニトロ安息香酸(１５ｇ、７５ｍｍｏｌ)を１−ブタノール(１００ｍｌ)と混合し、攪拌した。生成した混合物に、アニリン(１５ｍｌ、１５.３ｇ、１６５ｍｍｏｌ)およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(２８.８ｍｌ、２１.３ｇ、１６５ｍｍｏｌ)を加えた。生成した薄黄色溶液を還流下で４日間加熱し、その間に色は濃い黄色に変わった。TLC (RPC₁₈, メタノール, 80:水, 20. R_f = 0.75, 黄色: R_f 2-クロロ-5-ニトロ安息香酸 = 0.85)。
【０１００】
溶媒を真空下可能な限り蒸発させた。残留油状物を水と磨砕し、ＨＣｌ水溶液で酸性化してｐＨを２〜４に維持した。最終的に黄色固体が分離した。これを真空濾過により集め、過剰の水により十分洗浄し、１５分間にわたって吸引乾燥させた。粗生成物を酢酸(１５０ｍｌ)と混合し、次いで加熱沸騰させ、生成した混合物を攪拌しながらゆっくりと周囲温度に放冷することにより精製した。こうして得られた明黄色固体を真空濾過により集め、酢酸、次いで過剰のジエチルエーテルで洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥して、２−カルボキシ−４−ニトロジフェニルアミン(１２.０２ｇ、６２％)を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 7.14 (1H, d), 7.24-7.52 (5H, m), 8.18 (1H, dd), 8.72 (1H, d) および10.38 (1H, 広い s)。
【０１０１】
７.２２−ニトロアクリドン
２−カルボキシ−４−ニトロジフェニルアミン(５.１６ｇ、２０ｍｍｏｌ)を、オキシ塩化リン(２０ｍｌ)と混合した。生成した黄色スラリーを３時間還流下で加熱すると、その間、固体が溶解して薄黒い(メニスカスでは強い黄色)溶液が得られた。次いで、過剰のオキシ塩化リンを真空下蒸発させた。生成した油状物を氷で注意深くクエンチングした後、１.０ＭのＨＣｌ水溶液(１００ｍｌ)を加えた。次いで、混合物を加熱沸騰させ、そこに酢酸(２０ｍｌ以下)をゆっくりと冷却器に添加して、非混和性油状物の分散を促した。１時間沸騰を続けると、黄色スラリーが生成した。後続の冷却後、この固体を真空濾過により集め、過剰の水、次いでアセトンおよび最後にジエチルエーテルで洗浄した後、真空下五酸化リンで乾燥して、２−ニトロアクリドン(４.６６ｇ、９７％)を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 7.39 (1H, app.t), 7.60 (1H, d), 7.68 (1H, d), 7.84 (1H, app.t), 8.25 (1H, d), 8.48 (1H, dd), 8.98 (1H, d) および 12 38 (1H, 広いs)。
【０１０２】
７.３２−ニトロアクリドン−７−スルホン酸
２−ニトロアクリドン(２５ｍｇ)を、発煙硫酸(〜２０％ＳＯ_３不含有、２.５ｍｌ)と混合して、帯赤色溶液を得た。これを１００℃で９０分間加熱して、帯黄色溶液を得た。冷却後、混合物を氷(〜１５ｇ)中へ滴下クエンチングした。６ｍｌの濃ＨＣｌを加え、混合物を放置して生成物を沈澱させた。生成した淡黄色固体を真空濾過により集め、少量の４.０ＭのＨＣｌ水溶液で洗浄し、次いで水に再溶解して、清潔なフラスコ中へ濾過した。水を真空下蒸発させると、黄色‐褐色固体として２−ニトロアクリドン−７−スルホン酸が残存した。ＴＬＣ酸(RPC₁₈, メタノール, 80: 水, 20. R_f = 0.8, 黄色. マススペクトル: (ES+) 321 (M+H); 正確な質量: (M+H) = C₁₃H₉N₂O₆S の理論値321.0181. 実測値 321.0187 (1.8ppm)。
【０１０３】
８. Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−アセトアミド)−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
【化１９】

８.１Ｏ−エチル−６−(２−ニトロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
２−ニトロアクリドン(２.４ｇ；１０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水メチルスルホキシド(２５ｍｌ)と攪拌した。５分後、水素化ナトリウム(油中６０％分散、４８０ｍｇ；１２ｍｍｏｌ)を黄色溶液に加えた。攪拌を９０分間続行し、その間に溶液は赤紫色になった。エチル・６−ブロモヘキサノエート(２.６７ｍｌ、１２ｍｍｏｌ)を加え、攪拌を一晩続行した。反応混合物を水(３００ｍｌ)中に注ぎ、黄色沈澱物を濾過により集め、水で洗浄し、真空下乾燥した。固体をジクロロメタンに溶かし、無水硫酸マグネシウムを溶液に加えた。濾過後、溶液を濃縮乾固すると、黄色‐褐色固体が残存した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、０〜５％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製して、１.１９ｇ(５０％)のＯ−エチル−６−(２−ニトロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートを得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.2(3H, t), 1.7(6H, m), 2.3(2H, t), 4.05(2H, q), 4.55(2H, m), 7.45(1H, m), 7.92(2H, d), 8.03(1H, d), 8.35(1H, d), 8.50(1H, dd), 9.03(1H, d)。
【０１０４】
８.２Ｏ−エチル−６−(２−アミノ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
Ｏ−エチル−６−(２−ニトロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(１.９１ｇ、５.０ｍｍｏｌ)および蟻酸アンモニウム(１.５８ｇ；２５ｍｍｏｌ)をエタノール(１００ｍｌ)に溶かして、黄色溶液を得た。溶液を窒素下で攪拌し、触媒量の５％パラジウム・炭素を加えた。攪拌を５時間続行した。次いで、溶液をセライトで濾過し、溶媒を回転蒸発により除去した。残さをジクロロメタンに溶かし、水で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発により除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、４〜６％メタノール／ジクロロメタン)により精製して、１.６６ｇ(９４％)のＯ−エチル−６−(２−アミノ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートを得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.15(3H, t), 1.6(6H, m), 2.35(2H, t), 4.05(2H, dd), 4.4(2H, t), 5.3(2H, s), 7.2(2H, m), 7.6(4H, m), 8.3(1H, d)。
【０１０５】
８.３６−(２−アミノ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
Ｏ−エチル−６−(２−アミノ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(３５０ｍｇ；１.０ｍｍｏｌ)を酢酸(５ｍｌ)および１.０Ｍの塩酸(２ｍｌ)に溶かし、４時間還流した。溶媒を回転蒸発により除去し、残さを酢酸に溶かし、濃縮乾固し、溶媒としてアセトニトリルを用いてこの過程を２回反復した。残さを真空下乾燥し、３７０ｍｇの６−(２−アミノ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸を得た。
【０１０６】
８.４６−(２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
６−(２−アミノ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(３７０ｍｇ；１.１４ｍｍｏｌ)を無水ピリジン(１０ｍｌ)および無水酢酸(１００μｌ)、次いでジイソプロピルエチルアミン(３５０μｌ)に溶かした。混合物を３時間攪拌した。溶液を真空下濃縮乾固し、ゴム状残さをジクロロメタンに溶かした。溶液を１.０Ｍ塩酸、次いでブラインで洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発により除去すると、粘着性固体が残存した。エーテルと磨砕して固体を得、これを真空下乾燥して、３６０ｍｇ(８６％)の６−(２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸を得た。
【０１０７】
８.５Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
６−(２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(３６０ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)およびＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(３５０ｍｇ、１.０ｍｍｏｌ)を、無水ジメチルホルムアミド(５ｍｌ)に溶かし、ジイソプロピルエチルアミン(１８３μｌ)を加えた。黄色溶液を１時間窒素下で攪拌した。溶媒を真空下蒸発により除去すると、褐色ゴム状物が残存した。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、１０％メタノール／酢酸エチル)により精製し、３３０ｍｇ(５０％)のＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートを得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.8(6H, m), 2.1(3H, s), 2.9(6H, m), 4.5(2H, m), 7.3(1H, m), 7.8(3H, m), 8.05(1H, d), 8.35(1H, d), 8.6(1H, s), 10.2(1H, s). 正確な質量. (M+H)=C₂₅H₂₆N₃O₆, 理論値 464.1822. 実測値 464.1798 (5.1ppm)。
【０１０８】
９. Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
【化２０】

９.１６−(２−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
Ｏ−エチル−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(２.０ｇ、６.０ｍｍｏｌ)を、濃硫酸(１０ｍｌ)に溶かし、溶液を２０時間１２０℃に加熱した。混合物を放冷し、〜５０ｇの砕氷に加えた。沈澱物を遠心分離により集め、３.０Ｍの塩酸により洗浄し、真空下五酸化リンにより乾燥して、２.１ｇ(９０％)の６−(２−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.7(6H, m), 2.26(2H, t ), 4.5( 2H, t), 7.37(1H, m), 7.9( 5H, m), 8.37(1H,d), 8.58(1H, d). マススペクトル: (ES+) (M+H) 390。
【０１０９】
９.２Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
６−(２−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸(１００ｍｇ；０.２５ｍｍｏｌ)を無水ジメチルホルムアミド(３ｍｌ)に溶かし、回転蒸発装置で濃縮乾固した。この過程を反復して痕跡量の水を除去した。Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(９０ｍｇ；０.３ｍｍｏｌ)を加え、混合物を無水ジメチルホルムアミド(２ｍｌ)およびジイソプロピルエチルアミン(９０μｌ)に溶かした。黄色溶液を窒素下で６０分間攪拌したところ、ＴＬＣ(ＲＰ_１８５０：５０水：メタノール)は、出発物質が全てゆっくりと移動する成分に変換されたことを示した。溶媒を回転蒸発装置により除去し、高度真空下で最終乾燥した。この物質についてそれ以上精製する試みは行わなかった。
【０１１０】
１０. ６−(２−ブロモ−７−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
【化２１】

Ｏ−エチル−６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(２.０８ｇ、５.０ｍｍｏｌ)を、濃硫酸(１０ｍｌ)に溶かし、溶液を２０時間１２０℃に加熱した。混合物を放冷し、〜５０ｇの砕氷に加えた。沈澱物を遠心分離により集め、３.０Ｍの塩酸により洗浄し、真空下五酸化リンの存在により乾燥して、２.２ｇ(９４％)の６−(２−ブロモ−７−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.7(6H, m), 2.25(2H, t), 4.5(2H, m ), 7.9(4H, m), 8.42 (1H, d), 8.57(1H, d). マススペクトル (ES＋) (M＋H) 468, 470。
【０１１１】
１１. Ｎ−(マレイミド)エチル−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサンアミド
【化２２】

１１.１Ｎ−(アミノエチル)マレイミド塩酸塩
Ｎ−ブトキシカルボニル−２−(アミノエチル)マレイミド(２００ｍｇ；０.８３ｍｍｏｌ)を窒素下でジオキサン(４ｍｌ)中の４Ｍの塩酸と攪拌した。数分後白色沈澱物が形成し始めた。攪拌を４０分間続行し、次いで溶媒を回転蒸発により除去した。生成した白色固体を真空下乾燥し、１８０ｍｇ(１００％)のＮ−(アミノエチル)マレイミド塩酸塩を得た。δ_H (200MHz, CD₃OD) 1.38(2H, s), 3.14(2H, t), 3.81(2H, t), 6.90(2H, s)。
【０１１２】
１１.２Ｎ−(マレイミド)エチル−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサンアミド
Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(１０２ｍｇ；０.２５ｍｍｏｌ)を、無水ジメチルホルムアミド(８００μｌ)に溶かし、ジイソプロピルエチルアミン(５３μｌ)を加えた。Ｎ−(アミノエチル)マレイミド塩酸塩(５３ｍｇ；０.３０ｍｍｏｌ)を黄色溶液に加え、一晩放置した。溶媒を回転蒸発により除去し、残さをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、２％メタノール／ジクロロメタン)により精製した。回転蒸発により溶媒を除去後、残存している黄色油状物はゆっくりと結晶化した。ジエチルエーテルとの磨砕により結晶化を完了させた。この物質を、分取ＴＬＣ(シリカ、５％メタノール／ジクロロメタン)によりさらに精製し、１０％メタノール／ジクロロメタンで必要とされる物質を抽出した。溶媒を真空下除去し、残さをエーテルと磨砕して、６５ｍｇ(６０％)のＮ−(マレイミド)エチル−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサンアミドを得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.7(6H, m), 2.02(2H, t), 3.2(2H, dd), 3.45(2H, t), 4.45(2H, t), 7.01(2H, s), 7.35(2H, m), 7.85(5H, m), 8.36(2H, d).マススペクトル (ES+) (M+H) 432。
【０１１３】
１２. Ｎ−(マレイミド)エチル−６−(２−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサンアミド
【化２３】

Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(２−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(９０ｍｇ；０.１５ｍｍｏｌ)を、無水ジメチルホルムアミド(１.０ｍｌ)に溶かし、ジイソプロピルエチルアミン(５２μｌ)を加えた。Ｎ−(アミノエチル)マレイミド塩酸塩(５２ｍｇ；０.３０ｍｍｏｌ)を黄色溶液に加え、一晩放置した。溶媒を回転蒸発により除去し、残さをＨＰＬＣ(ＶｙｄａｃＲＰ_１８セミ分取カラム、３０分間にわたって水〜２５％アセトニトリルの勾配(両方とも０.１％トリフルオロ酢酸含有)、４００ｎｍで検出)により精製し、Ｎ−(マレイミド)エチル−６−(２−スルホ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサンアミドを得た。
【０１１４】
１３. ６−(２−フルオロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
【化２４】

１３.１Ｎ−(４−フルオロフェニル)アントラニル酸
４−フルオロアニリン(１.８６ｇ；２０ｍｍｏｌ)、２−クロロ安息香酸(１.５６ｇ；１０ｍｍｏｌ)、エチレングリコール(５ｍｌ)および無水炭酸ナトリウム(１.１ｇ；１０ｍｍｏｌ)を、反応容器に入れ、泡立ちが止まるまで攪拌した。２ｍｌの水に溶かした塩化第二銅(１００ｍｇ；０.７５ｍｍｏｌ)を反応混合物に加え、次いで６時間１２５℃に加熱した。反応物を放冷し、水(３０ｍｌ)および炭を加えた。混合物を濾過し、次いで濃塩酸によりｐＨ２に酸性化した。沈澱物を濾過により集め、水で洗浄し、次いで１Ｍの水酸化ナトリウム溶液に再溶解した。酢酸を加えることにより物質を再沈澱させ、これを濾過し、酢酸水溶液、次いで水により洗浄し、最後に真空下五酸化リンにより乾燥して、８６２ｍｇ(３７％)のＮ−(４−フルオロフェニル)アントラニル酸を得た。
【０１１５】
１３.２２−フルオロアクリドン
Ｎ−(４−フルオロフェニル)アントラニル酸(０.７０ｇ；３ｍｍｏｌ)およびオキシ塩化リン(３ｍｌ)を一緒に攪拌し、３.５時間１１５℃に加熱し、次いで放冷した。反応混合物を氷上に置き、小片の氷を加え、塩化水素の放出を伴う激しい反応を行わせた。反応が静まったとき、水(１５ｍｌ)を加え、混合物を２時間沸騰させた。冷却すると、固体が沈澱した。これを濾過し、濾液が無色になるまで水で洗浄した。沈澱物をさらに冷メタノール、次いでジエチルエーテルで洗浄し、真空下乾燥して、３８３ｍｇ(５９％)の２−フルオロアクリドンを得た。
【０１１６】
１３.３Ｏ−エチル−６−(２−フルオロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
２−フルオロアクリドン(２１３ｍｇ；１.０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水ＤＭＦ(３ｍｌ)に溶かした。油に分散させた水素化ナトリウム(４５ｍｇ；１.１ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を攪拌した。６−ブロモ酢酸エチル(２５０μｌ)を加え、混合物を一晩７０℃で攪拌した。溶媒を回転蒸発により除去し、黄色残さをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、４％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製し、２３０ｍｇ(６５％)のＯ−エチル−６−(２−フルオロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートを得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.20(3H, t), 1.65(6H, m), 2.35(2H, t), 4.05(2H, dd), 4.45(2H, t), 7.35(1H, m), 7.9(5H, m), 8.35(1H, d). マススペクトル (ES+) (M+H) 356.1。
【０１１７】
１３.４６−(２−フルオロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
Ｏ−エチル−６−(２−フルオロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(７１ｍｇ；０.２ｍｍｏｌ)をエタノール(２ｍｌ)に溶かし、１.０Ｍの水酸化ナトリウム溶液(０.４ｍｌ)を加え、混合物を９０分間９０℃に加熱した。混合物を冷却し、水(６ｍｌ)を加えると、黄色沈澱が生じた。混合物を氷上で冷却し、濃塩酸で酸性化すると、さらなる物質が沈澱した。沈澱物を濾過し、水、次いでエタノールで洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、４７ｍｇ(７２％)の６−(２−フルオロ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.68(6H, m), 2.25(2H, t ), 4.48(2H, t), 7.36(1H, m), 7.85(5H, m), 8.34(1H, d)。λ_max(ab) 251nm (ε=45,500/M^-1cm^-1); 401nm (ε=7980/M^-1cm^-1); 421nm (ε=7980/M^-1cm^-1). (PBS 緩衝液). λ_max(em) 434nm (PBS 緩衝液)。
【０１１８】
１４. ６−(２−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
【化２５】

１４.１Ｎ−(４−メトキシフェニル)アントラニル酸
４−メトキシアニリン(１.８６ｇ；２０ｍｍｏｌ)、２−クロロ安息香酸(１.５６ｇ；１０ｍｍｏｌ)、エチレングリコール(５ｍｌ)および無水炭酸ナトリウム(１.１ｇ；１０ｍｍｏｌ)を反応容器に入れ、泡立ちが止まるまで攪拌した。２ｍｌの水に溶かした塩化第二銅(１００ｍｇ；０.７５ｍｍｏｌ)を反応混合物に加え、次いで６時間１２５℃に加熱した。反応物を放冷し、次いで水(３０ｍｌ)および炭を加えた。混合物を濾過し、濃塩酸によりｐＨ２に酸性化した。沈澱物を濾過により集め、水で洗浄し、次いで１Ｍの水酸化ナトリウム溶液に再溶解した。酢酸を加えることにより物質を再沈澱させ、これを濾過し、酢酸水溶液、次いで水により洗浄し、最後に真空下五酸化リンにより乾燥して、１２００ｍｇ(４９％)のＮ−(４−メトキシフェニル)アントラニル酸を得た。マススペクトル(ＥＳ＋) (Ｍ＋Ｈ)２４２。
【０１１９】
１４.２２−メトキシアクリドン
ポリリン酸(５０ｇ)を窒素雰囲気下１６０℃に加熱した。Ｎ−(４−メトキシフェニル)アントラニル酸(４.８９ｇ；２０ｍｍｏｌ)を加え、混合物を１５分間１６０℃で攪拌した。反応物を氷浴中で急速冷却し、水を加えて帯緑黄色沈澱物を得た。これを濾過し、水、次いで希重炭酸ナトリウム溶液および再び水で洗浄した。固体を最後に５０℃で真空下乾燥して、３.６７ｇ(８１％)の２−メトキシアクリドンを得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 3.86(3H, s), 7.23(1H, t), 7.55( 5H, m), 8.22(1H, d), 11.7(1H, s)。
【０１２０】
１４.３Ｏ−エチル−６−(２−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート
２−メトキシアクリドン(２.２５ｇ；１０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水ジメチルホルムアミド(１５ｍｌ)に溶かした。５分後、水素化ナトリウム(油中６０％分散、２５０ｍｇ；１２ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を攪拌した。第２ロットの水素化ナトリウム(２３０ｍｇ)を加え、泡立ちが止まるまで攪拌を続行した。６−ブロモヘキサン酸エチル(２.６７ｍｌ；１５ｍｍｏｌ)を黄色溶液に加え、攪拌を一晩続行した。反応混合物を水(３００ｍｌ)中に注ぎ、混合物をジクロロメタンで抽出した。有機相を１.０Ｍの塩酸(２×１５０ｍｌ)で洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を回転蒸発により除去して黒く色づいた油状物を得た。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、５％エタノール／ジクロロメタン)により精製して黄色油状物を得、ジエチルエーテル／へキサンとの磨砕により結晶化させて０.８３ｇ(２３％)のＯ−エチル−６−(２−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエートを得た。マススペクトル(ＥＳ＋) (Ｍ＋Ｈ)３６７(Ｍ＋Ｎａ)３８９。
【０１２１】
１４.４６−(２−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸
Ｏ−エチル−６−(２−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(３６７ｍｇ；１.０ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶かし、１.０Ｍの水酸化ナトリウム溶液(２.０ｍｌ)を加え、混合物を１時間９０℃に加熱した。混合物を冷却し、水(２０ｍｌ)を加えた。混合物を氷上で冷却し、濃塩酸で酸性化すると、黄色油状物が分離した。油状物はゆっくりと明黄色固体に結晶化した。これを濾過し、水で洗浄し、真空下乾燥して、３２７ｍｇ(９６％)の６−(２−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸を得た。δ_H (200MHz, DMSO-d₆) 1.7(6H, m), 2.25(2H, t), 3.9(3H, s), 4.5(2H, t), 7.31(1H, m), 7.48(1H, dd), 7.82(4H, m), 8.35(1H, d)。λ_max(ab) 255nm (ε=38,100/M^-1cm^-1); 408nm (ε=7150/M^-1cm^-1); 428nm (ε=7150/M^-1cm^-1). (PBS緩衝液). λ_max(em) 467nm. (PBS 緩衝液)。
【０１２２】
１５.蛍光寿命試験
エディンバラ・インスツルメントＦＬ９００ＣＤＴ時間分解Ｔ−ジオメトリー蛍光光度計を用いる時間相関単一光子計数法により蛍光寿命を測定した。水素アークランプを用いて試料を４００ｎｍで励起させた。検出は４５０ｎｍで行なわれた。非線形最小二乗法アルゴリズムを用いたデコンヴォルーションにより、表２に示す結果を得た。図２は、本発明によるある種のアクリドン色素の蛍光寿命を示すプロットである。
【０１２３】
表２：蛍光寿命
【表３】

【０１２４】
１６．タンパク質標識
１６.１６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸‐ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)コンジュゲート(コンジュゲート１)の製造
１０ｍｌのウシ血清アルブミン(０.１Ｍの炭酸緩衝液中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９.３)に、１００μｌのＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(ＤＭＳＯ中１ｍｇ／１００μｌ)を攪拌しながら滴下した。ホイルで包んだバイアル中において周囲温度で１時間緩やかな攪拌を続けた。非コンジュゲート色素を、少なくともＰＢＳを２回交換し、４℃での一晩透析(１２−１４ＫＭＷＣＯ)により除去した。コンジュゲート１を採取し、４℃で貯蔵した。
【０１２５】
１６.２６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサン酸‐ウサギ血清アルブミンコンジュゲート(コンジュゲート２)の製造
１０ｍｌのウサギ血清アルブミン(０.１Ｍの炭酸緩衝液中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９.３)に、１００μｌのＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサノエート(ＤＭＳＯ中１ｍｇ／１００μｌ)を攪拌しながら滴下した。ホイルで包んだバイアル中において周囲温度で１時間緩やかな攪拌を続けた。非コンジュゲート色素を、少なくともＰＢＳを２回交換し、４℃での一晩透析(１２−１４ＫＭＷＣＯ)により除去した。コンジュゲート２を採取し、４℃で貯蔵した。
【０１２６】
１６.３コンジュゲート１および２の蛍光寿命の測定
コンジュゲート１および２の混合物の蛍光寿命をＰＢＳ中で測定した。結果を図３に示す。非線形最小二乗法アルゴリズムを用いたデコンヴォルーションおよび曲線の当てはめにより、表３に示した結果が得られた。
【０１２７】
表３
【表４】

【０１２８】
１６.４免疫沈降検定法
１.５ｍｌの遠心分離管中のＰＢＳ５００μｌに、２００μｌのコンジュゲート１および２００μｌのコンジュゲート２を加えた。混合後、時間相関単一光子計数技術(エディンバラ・アナリティカル・インスツルメンツＦＬ９００ＣＤＴ分光計)による４０５ｎｍでの励起、４５０ｎｍでの放射を用いた蛍光寿命の測定用に４５０μｌをシリカキュベットへ取り出した。遠心管中の４５０μｌに、１００μｌの抗ＢＳＡ抗体を加えた。３７℃で３０分間インキュベーション、次いで４℃で１時間インキュベーション後、管をベンチトップ型遠心分離機で５分間遠心分離にかけた。ペレットを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで０.１ＭのＮａＯＨに再懸濁した。この溶液の蛍光寿命を上記と同様に測定した。結果を図４に示す。非線形最小二乗法アルゴリズムを用いたデコンヴォルーションおよび曲線の当てはめにより、表４に示した結果が得られた。
【０１２９】
表４：免疫沈降検定法についての寿命適合
【表５】

【０１３０】
上記結果は、コンジュゲート１(寿命範囲１３〜１５ナノ秒)の相対パーセントが、抗ＢＳＡ抗体による免疫沈降の結果としてペレットで顕著に増加したことを示す。再懸濁ペレットにおけるコンジュゲート２(寿命範囲４.５〜５ナノ秒)の比率は、初期混合物における比率に対し、相応に低減化されている。免疫沈降方法は完全に有効なわけではないが、蛍光寿命を用いた分析により、放射波長では識別不可能である混合物中の２種類(コンジュゲート１およびコンジュゲート２)の分解が可能となった。
【０１３１】
１７.アクリドン色素標識ＤＮＡフラグメントの毛管電気泳動における蛍光寿命検出
本発明による４種のアクリドン色素、すわなち、
ｉ)６−(２−(アセチルアミノ)−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸、
ii)６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸、
iii)６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸、および
iv)６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサン酸、
の各々による標準技術を用いて、Ｍ１３ＤＮＡプライマーを標識した。各色素のスクシンイミジルエステルを、０.１Ｍの炭酸ｐＨ９.３／ＤＭＦ(最終組成２：１)中においてアミン修飾Ｍ１３前進シーケンシングプライマーにコンジュゲートした。Ｃ１８カラムでのＨＰＬＣによる精製では、重炭酸トリエチルアンモニウム／ＭｅＣＮ溶媒系を使用した。
【０１３２】
市販の多調和(マルチハーモニック)フーリエ変換(ＭＨＦ)蛍光寿命器具(モデル４８５０ＭＨＦ、スペクトロニクス・インスツルメンツ、ロチェスター、ニューヨーク)をベックマンＰ／ＡＣＥ５０００ＣＥシステム(Li,L.et al、J.Chromatogr.B(１９９７)、６９５、８５−９２)にインターフェース接続することにより、リアルタイム蛍光寿命検出を達成した。励起供給源は、４０５ｎｍで２５〜３０ｍＷを供給する連続波紫色ダイオードレーザーであった。４５ｍｍ集束レンズまたは６.３倍顕微鏡対物レンズ(焦点距離２２ｍｍ)を用いて、レーザービームの焦点を毛管の検出ウインドウに絞った。放射シグナルを４０倍顕微鏡対物レンズにより集めた。４３５ｎｍロングパスフィルターを通して光線を選択した。９.４Ｈｚの相互相関周波数を寿命測定で使用すると、１秒当たり９.４位相変調測定値が得られた。次いで、データ分析前に１０連続測定値を平均化することにより、１秒当たり約１寿命測定値を得た。毛管からの散乱光は、寿命干渉をもたらした。
【０１３３】
１００ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８.６中の０.５ｍＭ色素‐標識プライマーの溶液を、１０ｋＶの注入ボルト数で１０秒間ごとに裸の７５μＭ内径毛管へ注入した。分離ボルト数は、１８ｋＶ(２５０Ｖ／ｃｍ)であった。置き換えられるゲルマトリックスは、３.５×ＰＯＰ−６緩衝液中に２％ＰＯＰ−６ゲルを含んでいた。４色素の各々で標識したＭ１３ＤＮＡプライマーの連続注入について図５に示された寿命電気泳動図を得た。黒線は強度であり、点は、非線形最小二乗法分析ソフトウェア(グローバルズ、インコーポレイテッド)を用いた１成分当てはめから再確認された寿命に対応する。結果は、色素標識Ｍ１３プライマーが検出器を通過移動するときに蛍光寿命(点)が蛍光強度ピーク(線)と一致することを示している。
【０１３４】
１８.マルチプレックス蛍光寿命測定
以下の蛍光アクリドン色素誘導体を、メタノール中の１ｍｇ／ｍｌストック溶液として調製した：
ａ)６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸、
ｂ)６−(２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸、および
ｃ)６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサン酸。
【０１３５】
メタノール性ストック溶液を、１２％ポリアクリルアミド混合物中へ希釈し(１／１００)、使い捨てキュベットで直接ポリマー化させた。色素混合物も同様に製造した。ポリアクリルアミドゲル中に単一または混合物の色素を含有する試料の蛍光寿命を、時間相関単一光子計数技術(エディンバラ・アナリティカル・インスツルメンツＦＬ９００ＣＤＴ分光計)により記録した。水素アークランプを用いて、試料を４００ｎｍで励起させ、４５０ｎｍで検出を行った。非線形最小二乗法アルゴリズムを用いたデコンヴォルーションにより、表５に示した結果が得られた。
表５：
【表６】

【０１３６】
結果は、色素をＰＡＧＥで分析すると、多様な寿命成分が記録されることを示している。しかしながら、単一色素の各々の主たる寿命成分は、ＰＡＧＥにおいて色素の混合物では依然として識別され得る。すなわち、存在する寿命成分の事前知識により、多様な蛍光寿命に対する可能性が立証された。
【０１３７】
１９.ＳＤＳＰＡＧＥを用いた種々のアクリドン色素で標識したウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)の共局在性
１９.１６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサン酸‐ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)コンジュゲート(コンジュゲート３)の製造
１ｍｌのＢＳＡ(０.１ＭのＮａＨＣＯ_３溶液中１０.０ｍｇ／ｍｌ)に、Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド)ヘキサノエート(寿命４ナノ秒)の溶液(２５μｌ；ＤＭＳＯ中０.３１２５ｍｇ／ｍｌ)を加えた。生成した混合物を、時々混合しながら室温で３０分間インキュベーションした。ＰＤ１０カラム(アマーシャム・バイオサイエンシーズ)を、１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ；ｐＨ７.４)で平衡させた。色素標識ＢＳＡをカラムに加え、カラムをＰＢＳ(２ｍｌ)で洗浄し、次いで３ｍｌのＰＢＳで溶離した。溶離液を集め、コンジュゲート３を得た。
【０１３８】
１９.２６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサン酸‐ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)コンジュゲート(コンジュゲート４)の製造
１ｍｌのＢＳＡ(０.１ＭのＮａＨＣＯ_３溶液中１０.０ｍｇ／ｍｌ)に、Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル)ヘキサノエート(寿命１４ナノ秒)の溶液(１００μｌのＤＭＳＯ中２ｍｇ)を加えた。生成した混合物を、時々混合しながら室温で３０分間インキュベーションした。ＰＤ１０カラム(アマーシャム・バイオサイエンシーズ)を、１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ；ｐＨ７.４)で平衡させた。色素標識ＢＳＡをカラムに加え、カラムをＰＢＳ(２ｍｌ)で洗浄し、次いで３ｍｌのＰＢＳで溶離した。溶離液を集め、コンジュゲート４を得た。
【０１３９】
１９.３試料製造および電気泳動
上記で製造したコンジュゲート３および４を、１％ｗ／ｖのドデシル硫酸ナトリウム、ブロモフェノール・ブルー(１００ｍｇ／１００ｍｌ)およびジチオトレイトール(１５４ｇ／１００ｍｌ)(アマーシャム・バイオサイエンシーズ)を含む、酢酸によりｐＨ７.５に緩衝させた０.０５Ｍのトリス(２０μｌ)中２：１の割合で一緒に混合した。３分間９５℃に加熱することによりタンパク質試料を還元した。エクセルゲルＳＤＳバファーストリップ(アノードストリップ：０.４５モル／トリス／酢酸ｐＨ６.６、４ｇ／ＬのＳＤＳおよび０.０５ｇ／ＬのオレンジＧ；カソードストリップ：０.０８モル／Ｌのトリス、０.８０モル／Ｌのトリシンおよび６.０ｇ／ＬのＳＤＳ、ｐＨ７.１)によるマルチフォアII平台電気泳動システムを用いて電気泳動を行った。ゲルの走査に要求される９６ウェルマイクロプレート中心と一致する位置に置かれた紙製試料適用ストリップを用いて、デュプリケイト試料を予め形成されたエクセル８−１８ＳＤＳＰＡＧＥ勾配ゲル(アマーシャム・バイオサイエンシーズ)の表面に適用した。分子量マーカーを別々のレーンで移動させ、そこでクーマシー・ブルーを用いてゲルの一部を染色することにより、試料の信頼性をチェックし、分子量をモニターし、寿命走査用にゲルを指向させ得る。電気泳動を一定電流で開始し、８５分間最大ボルト数５００Ｖで、平台温度を１５℃に維持した。走査前、ゲルを少なくとも３０分間２５％メタノール、５％酢酸ｖ／ｖの水溶液に固定した。寿命走査後、ゲルを、２５％メタノール、５％酢酸ｖ／ｖの水溶液中の０.１％クーマシー・ブルーＧ−２５０中で１０〜２０分間染色し、２５％メタノール、５％酢酸ｖ／ｖの水溶液中で脱染色した。
【０１４０】
１９.４走査
固定したゲルを、４０５ｎｍでの単一波長レーザー励起により走査し、電気泳動分離の軸に沿って約２ｍｍ間隔でゲルから試料採取した。ベイズのアルゴリズムを用いてデータを分析することにより、蛍光強度を２ｎｓ(ナノ秒)(ゲルバックグラウンド)、４ｎｓ(４ｎｓアクリドン色素)、６ｎｓ(本来のＢＳＡ寿命)および１４ｎｓ(１４ｎｓアクリドン色素)の蛍光寿命に割当てた。
【０１４１】
図６は、同じゲルレーンで共電気泳動させた４ｎｓ色素標識ＢＳＡおよび１４ｎｓ色素標識ＢＳＡ(２：１の割合で混合)を示す。２つのピークは４ｎｓおよび１４ｎｓで分解され、共に分子量マーカーに対してＢＳＡの位置に対応する。２種類の標識ＢＳＡは共局在しているが、寿命識別強度により区別され得る。分子量マーカーに関して、また電気泳動後染色(６６ｋＤ)により示されたところによると両種類のＢＳＡはゲルにおける同一位置へゲルにより分解される。

Claims

試薬が、式

［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ‐もしくはジ‐ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｒ^１は、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
で示される色素である、標的材料の標識および寿命検出用試薬の使用。
色素が蛍光色素であり、
基Ｒ^２およびＲ^３がＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５がＺ^２環構造に結合されており、Ｚ^１およびＺ^２が前記の意味であり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５が、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、そして
Ｒ^１が、水素、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎが前記の意味である、請求項１記載の使用。
蛍光色素が２〜３０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を有する、請求項２記載の使用。
色素が非蛍光性または実質的に非蛍光性色素であり、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２が、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個が少なくとも１個のニトロ基を含む、請求項１記載の使用。
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ＥおよびＦが前記の意味である、請求項１〜４記載の使用。
標的結合基Ｆが、標的材料における官能基と反応するための反応基、または標的材料における反応基と反応するための官能基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
反応基が、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ‐スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホルアミダイトから選択される、請求項６記載の使用。
官能基が、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸基およびチオリン酸基から選択される、請求項６記載の使用。
スペーサー基Ｅが、
-(CHR')_p-
-{(CHR')_q-O-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-NR'-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-(CH=CH)-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-Ar-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-CO-NR'-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-CO-Ar-NR'-(CHR')_r}_s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］
から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個が基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹを含み、Ｙがスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎが０または１〜６の整数である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
標的生物材料標識方法であって、
ｉ）標的生物材料を含む液体に、式

［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、Ｚ^１およびＺ^２は前記の意味であり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｒ^１は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎは前記の意味である］
の色素を加え、そして
ii）標的を標識するのに適切な条件下、色素と標的生物材料をインキュベーションする
工程を含む方法。
式(Ｉ)の色素における基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ＥおよびＦが前記の意味である、請求項１１記載の方法。
標的生物材料が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されているヌクレオチド、および１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されているオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、ホルモン、細胞、細胞膜および毒素から成る群から選択される、請求項１１または請求項１２記載の方法。
試料中における被検体の検定方法であって、
ｉ)被検体の少なくとも一部分を特異的結合パートナーと結合させるのに適切な条件下、被検体を被検体に特異的な結合パートナーと接触させることにより、複合体を形成させ、そして被検体および特異的結合パートナーのうちの一方を、式

［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、Ｚ^１およびＺ^２は前記の意味であり、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
基Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、そして
基Ｒ^１が基−Ｅ−Ｆではないとき、それは、水素、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｙおよびｎは前記の意味である］
の蛍光色素で標識し、
ii)標識複合体から放出された蛍光を測定し、および
iii)放出された蛍光と試料中における被検体の存在または量との相互関係を明らかにする
工程を含む方法。
被検体‐特異的結合パートナーが、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質または補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質から成る群から選択される、請求項１４記載の方法。
２種またはそれ以上の異なる蛍光色素セットであって、色素セットの各色素が、式

［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、Ｚ^１およびＺ^２は前記の意味であり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｒ^１は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、そしてＦは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
を有し、セットの各色素が、セットの残りの色素の寿命と比べて明確に異なる蛍光寿命を有するものである、セット。
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥおよびＦは前記の意味である、請求項１６記載のセット。
４種の異なる色素を含み、セットの各色素が異なる蛍光寿命を有するものである、請求項１６または請求項１７記載のセット。
セットにおける蛍光色素の各々が、２〜３０ナノ秒の範囲での蛍光寿命を呈する、請求項１６〜１８のいずれかに記載のセット。
上記２色素の蛍光放出寿命の差異が、寿命が短い方の色素の値の少なくとも１５％である、請求項１６〜１９のいずれかに記載のセット。
式

［式中、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素の蛍光を増加させる方法であって、少なくとも一ニトロ基の、−ＮＨＯＨまたは−ＮＨ_２への還元を特徴とする方法。
組成物におけるニトロレダクターゼ酵素活性の検出方法であって、
ｉ)ニトロレダクターゼ活性を高める条件下、組成物を式：

［式中、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と混合し、そして
ii)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度である、蛍光の増加を測定する
ことを含む方法。
ｉ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させ、
ii)成分間の結合を促す条件下、特異的結合対の第２成分を加え、ただし、その第２成分はニトロレダクターゼ酵素で標識されているものとし、
iii)式

［式中、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素を加え、そして
iv)結合したニトロレダクターゼ活性の尺度として蛍光の増加を測定することにより、第１成分への第２成分の結合を検出する
ことを含む検定方法。
特異的結合対が、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質から成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
ｉ)ニトロレダクターゼをコード化する配列に機能し得るように結合された発現制御配列を含む核酸分子によりトランスフェクションされた宿主細胞を、式

［式中、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ^１およびＺ^２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と接触させ、そして
ii)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度として蛍光の増加を測定する
ことを含む検定方法。
遺伝子発現に対するその効果が測定されるべき試験剤の存在下で検定を実施する、請求項２５記載の方法。
式

［式中、
基Ｒ^２およびＲ^３はＺ^１環構造に結合され、基Ｒ^４およびＲ^５はＺ^２環構造に結合されており、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、そして
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１‐Ｃ_６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、そして
基Ｒ^１が基−Ｅ−Ｆではないとき、それは、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ_１‐Ｃ_２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ_２‐)_ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であり、
ただし、基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうち少なくとも１個は水可溶化基であるものとする］
で示される色素。
標的結合基Ｆが、
ｉ)カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホルアミダイトから選択される反応基、または
ii)ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸基から選択される官能基
を含む、請求項２７記載の色素。
スペーサー基Ｅが、
-(CHR')_p-
-{(CHR')_q-O-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-NR'-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-(CH=CH)-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-Ar-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-CO-NR'-(CHR')_r}_s-
-{(CHR')_q-CO-Ar-NR'-(CHR')_r}_s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］
から選択される、請求項２７または請求項２８記載の色素。