JPH05504363A - ２―アミノアクリドンを用いての炭水化物の分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２−アミノアクリドンを用いての炭水化物の分析発明の分野 本発明は、炭水化物の分析に関する。

背景 複合糖質の炭水化物成分が、多くの重要な生物学的工程に関与していることは明 らかになっている（文献１９−２１）、結果として、それらの化学構造に対する 相当の研究が存在している。この研究の多くは、精製技法、たとえば高性能液体 クロマトグラフィー（ｈ。

ｐ、１．ｃ、）及び他のクロマトグラフィ一方法に依存して来た。

続く構造分析は、従来の誘導体化及び分解方法、質量分析法（ｍ。

ｓ、）及び核磁気共鳴の組合せにより行なわれて来た（文献２２−２５）、これ らは強力な方法であるが、ある限界が存在する。ある分析のために必要とされる 材料の量は、多くの特定の生物学的源がら利用できる材料の量に比較して、比較 的多い、さらに、これらの方法のために必要とされる装！は高価であり、そして 実験室でのそれらの使用を制限するであろう、相当の専門的且つ技術的な支持を 必要とする。

それらの欠点のいくつかを克服するために、何人かの研究者は複合オリゴ垢を分 解するために特定のグリコンダーセを用い、そして種々のクロマトグラフィー及 び電気泳動技法により分解生成物を分離した後、それらの構造を推定して来た（ 文献１１．２５−３０）。

このタイプの分析は、材料のピコモル量で使用され得る。そのような量の敏感な 検出を可能にするためには、多くの方法が記載されて来ており、ここでサツカリ ド及び糖ペプチドは３Ｈ１発光団又は螢光団によりラベルされ、そして誘導体が クロマトグラフィー又は電気泳動のいづれかにより分離されて来た（文献２．１ １，１２゜１３．２６．２７．３ｌ−３８）。

還元サツカリドが２種の螢光団のいづれか１つにより誘導体化され、そしてその 誘導体が一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離される 新規タイプの方法が記載されている。

記載される２種の螢光団は、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン 酸（ＡＮＴＳ）及び２−アミノアクリドン（２−ＡＡ）であった（文献４．１８ ．３９）。また、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１４４０及びアメリカ特許 第４，８７４，４９２号も参照のこと。

国際公報−０８８／１０４２２は、中でも、炭水化物構造を分析し、又は炭水化 物物質を区別し又は分離するための技法を開示し、これは炭水化物物質を電気泳 動ゲルに適用し、そして異なった物質の特異的移動を引き起こすためにゲルを作 動せしめることを包含する。炭水化物物質は、螢光ラベリング試薬、たとえばア ミノフルオレセインにより予備ラベルされ、その物質に電荷が付与され、それに よって電気泳動分離が可能にされ、そしてゲルの作動後、その物質の可視化が可 能にされる。この場合、可視化は、裸眼によりもたらされるが、しかし増強され た感度が電荷結合装置ｌｌ　（ＣＣＤ）により検分することによって得られる。

本発明は、そのような技法の新規開発に関し、そして螢光ラヘリング試薬として ２−アミノアクリドンの使用に基づかれている。

２次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動は、タンパク質のひしように良好な分解を得るた めに一般的に使用される良く知られた方法である。

そのような技法においては、第１の次元での第１の電気泳動分離に続いて、第２ の縦方向への第２の電気泳動分離が伴う。しかしながら、これまで、炭水化物物 質の効果的な２−Ｄゲル電気泳動を達成することは不可能であった。２−アミノ アクリドンとは異なる螢光団、すなわち８−アミノナフタレン−１，３，６−ト リスルホン酸によりラベルされた炭水化物の二次元的電気泳動分離がアメリカ特 許第４，９７５，１６５号に記載されている。

本発明は、炭水化物＠ＩＪｆをラベルするためへの２−アミノアクリドンの使用 が炭水化物物質の２−Ｄゲル電気泳動を可能にできる発見に一部基づかれている 。

発明の要約 本発明によれば、炭水化物物質を分離し、又は区別するための方法が提供され、 ここでこの方法は、炭水化物物質を２−アミノアクリドンによりラベルし、その ラベルされた物質を電気泳動ゲルに適用し、そして異なったラベルされた物質の 特異的な移動を引き起こすために１又は２次元的にゲルを作動せしめることを含 んで成る。

本発明はまた、２−アミノアクリドンによりラベルされた炭水化物物質を提供す る０本発明のもう１つの観点は、２−アミノアクリドンによる炭水化物物質をラ ベルし、又は２−アミノアクリドンによりラベルされた炭水化物を分離するため の種々のキットである。

Ｎ皿Ω五五 本発明は、次の例により例示的手段により及び添付図面によりさらに記載される であろう。

第１図は、２−アミノアクリドンの構造及び還元糖との反応を例示する。

第２図は、種々の量の２−アミノアクリドンにょるＧａ　Ｉ　−６−８Ｏ３のラ ヘリングの程度を示す、吸光度対２−アミノアクリドンの濃度のグラフである。

個々の点は４種の決定値の平均吸光度を示す、いづれかの価についての標準誤差 は、いづれかの平均の６．１％以下であった。

第３図は、２−アミノアクリドンにより誘導体化されたＧａ　Ｉ　−６−３Ｏ， の検出の感度を示すＣＣＤ像である。

第４図は、ゲルバンド当たりの２−アミノアクリドンラベル化Ｇａｌ　６　ＳＯ ｘの量によるＣＣＤ応答の変動を示す、フルオレセイン対サツカリドの量のグラ フである。

第５Ａ及び５Ｂ図は、２−アミノアクリドンによりラベルされ、そしてｌ・リス −硼酸塩緩衝液系を用いてのＰＡＧＥにより分離された広範囲のサツカリドを示 す２種の螢光電気泳動図のＣＣＤ像である。

第６図は、２−アミノアクリドンによりラベルされ、そして１−リス−ＨＣｌ　 ／　）リス−グリノン緩衝液系を用いてのＰＡＧＥにより分離された唯一・の酸 性サツカリドを示ず螢光電気泳動図のＣ，ＣＤ像である。

第７閲は、人−１−＼ンド及び種々の中性サツカリド誘導体の位置を示す螢光電 気泳動図のＣＣＤ像である。

第８及び９回は、第一次元のためにＩＥＦを用いて得られた２−ＤゲルのＣＣＤ 像である。

第１０及び１１図は、第一次元のために；気泳動を用いて得られたＩＤゲルのＣ ＣＤ像である。

片足ｐｎ（２）附員 ２−アミノアクリドンは炭水化物の還元性末端基と反応し、電気泳動分離を可能 にする高い螢光誘導体を生成する。このラヘリング反応の例は、第１図に提供さ れる。２−アミノアクリドン自体は、電気泳動分離のために時々使用される条件 （たとえばアルカリ性ｐＨ）下で、ラベルされた炭水化物上に電荷を付与しない 。中性炭水化物の誘導体のためには、サツカリド誘導体上に電荷を（＝３与し、 そしてその結果、分離を可能にする成分、たとえば硼酸塩イオンを含むことが必 要である。これは、負に荷電された酸性サンカリド誘導体のためには必要でなく （シかし、それにもかかわらず、それらは一定の硼酸塩含有ンステｌ、において は電気泳動するであろう）、その結果、その技法は中性及び酸性（ノフカリドの 容易な区別を可能にする。

２−アミノアクリドンによりラベルされた炭水化物は、下記式：（式中、Ｒは還 元末端基を有する炭水化物である）により示され得る。

本発明はまた、電荷を付与するように還元されたアミノアクリドンラベル化炭水 化物を提供し、これは電場における移動を可能にする。還元された２−アミノア クリドンラベル１ヒ炭水化物は、下記式：（Ｉ工］ 〔式中、Ｒは還元末端基を有する炭水化物である）により示され得る。

用語″炭水化物”とは、完全な炭水化物及び腹合糖類、たとえば糖タンパク質、 糖脂質、スフィンゴ糖脂質及び同様のものである分子を包含する。

２−アミノアクリドンラベル化炭水化物の使用の中には、２−アミノアクリドン によりラベルされた未知の炭水化物の同定のだめのマーカー４！！準としての使 用が存在する。同様に、既知濃度の２−アミノアクリドンラベル化炭水化物は、 分析のためのサンプルにおける対象の炭水化物の量を定量化するために使用され 得る。

ゲルは好ましくは、１５％〜６０％、好ましくは２０％〜４０％の範囲の濃度を 有する比較的密なポリアクリルアミドゲルを含むが、但し、多くの場合、低いａ 変のケールを使用することが可能であり、又は好ましい。

ゲルは均等な濃度のものであり、又はグラジェユ７トゲルの形でのものであり得 る。

ゲルは好ましくは、たとえばＮ、Ｎ’メチレンビスアクリルアミド（ビス）によ り架橋される。

１つの現在好ましいゲルは、０．６７％ｗ　／　ｖのビスを含む２０％ｗ　／　 ｖのポリアクリルアミドを含んで成る。

良好な解像度及び感度のためには、ゲルは、たとえばＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓにより 出版された、Ｂ、Ｄ、Ｎａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｄ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄによる本”Ｇ ｅｔ　Ｅｌｅ−ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　：　Ａ　 Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ”　に記載されるような、タンパク賓及 びＤＮＡフラグメントによる作動のために知られている技法を用いる積み重ね緩 衝システム（又、移動界面電気泳動、多相ゾーン電気泳動及び他の名称としても 知られている）を用いて作動され得る。しかしながら、積み重ね緩衝システムを 使用することは必須ではなく、そして良好な結果が連続緩衝システムにより得ら れる。

電気泳動はまた、便利には、硼酸塩イオンを含むが、しかしドデシル硫酸ナトリ ウム（ＳＤＳ）は削除されている、文献１に記載される不運ａｔ電気泳動緩衝シ ステム用いて実施され得る。

２種の特に適切な電気泳動緩衝システムは次のものである：文献２に記載される ような連続トリス−硼酸塩緩衝システム；及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）が削除されている、Ｌａｅｎｕａｌｉ　（文献３）により記載されるような不 連続トリス−ＨＣｌ／ｌリス−グリシン緩衝システム。

ゲルを作動した後、ラベルされた炭水化物物質は、適切な波長の光、たとえば紫 外線により照射される場合、多くの場合に裸眼により可視化され得るが、但し、 より良好な解像度及び感度は、ＣＣＤによる像化により得られる。

ＣＣＤは、放される光の敏感な検出を可能にする半導体像化装置である。ＣＣＤ 及びそれらの使用は、アメリカ特許第４，８７４．４９２号及び第４，８５２． １３７号に記載される。

適切な励起に基づいて、２−アミノアクリドンは、還元サツカリドとの反応の前 及び後の両者で、黄色の発光及び高い量子収量を伴って、強く螢光を発する。そ の発光は、ＣＣＤによる検出のために十分に適切であり、そしてそれは、スペク トルの赤端で最高の感度及び量子効率及びスペクトルの前端で最低の感度及び量 子効率を有する。ＣＣＤの使用はまた、ひじょうにすばやく、容易に定量化され た結果を付与する利点を有する。良好な定量結果は、その広い直線力学範囲によ りＣＣＤにより容易に利用できる。さらに、ＣＣＤは、それが作動されている間 、ゲルを観察するために使用され得る。

遅いスキャン読取りで操作する、冷却されたＣＣＤを使用することが好ましい、 適切なＣＣＤシステムの１つの例は、ＡｓｔｒｏｍｅｄＬｉｍｉｔｅｄ、　Ｃａ ｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｌｌｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍにより製造されるＣＣＤ　 ３２００Ｉｍａｇｉｎｇ　５ｙｓｔｅ−である、ＣＣＤは、好ましくは少なくと も一２５°Ｃはとに冷却され、そして感度はさらに一６０℃はどに冷却すること によって有意に高められる。典型的な操作温度は、−４０℃〜−１２０℃の範囲 である。

２−アミノアクリドンラへリング試薬は、必要なら、結合された生物分子から放 した後、炭水化！ｌ！ｌ！！物質上の部位に結合され得る。他方、生物分子は、 ２−アミノアクリドンラベリング試薬の導入を可能にするために既知手段で変性 され得る。

炭水化物物質は、還元剤、たとえばナトリウムシアノホーロ水素化物の存在下で 、前記物質を２−アミノアクリドンと共にインキュベートすることによって、２ −アミノアクリドンによりラベルされ得る。そのナトリウムシアノホーロ水素化 物は好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）における溶液で存在する。

良好なラベリングのためには、酢酸１５体積部〜ＤＭＳ０　８５体積部を含む混 合物に溶液での２−アミノアクリドンを添加することが有用である。

電気泳動を受ける物質の移動速度は、物質の大きさく分子量）及び構造により異 なる。従って、本発明は、炭水化物Ｔｈ質の大きさ及び形状に対する情報を得る ために使用され得、そして既知の対照のためのそれらの結果と比較することによ って、未知の炭水化物物質を特徴づけることが一部又は十分に可能であり得る。

本発明の１つの使用は、未知の炭水化物をグリコシダーゼの使用により小さなフ ラグメントに切断し、そしてその得られたフラグメントを同定することによって 、ＰＣＴ出＠ＷＯ３８／１０４２２に記載されるように、炭水化物構造を明確に することである。同様に、炭水化物構造を明確にするためには、グリコノルトラ ンスフェラーゼ、炭水化物エステラーゼ又はエピメラーゼを使用することが有用 である。

実験においては、多くの一糖類及びオリゴｗ８類が、２−アミノアクリドンによ りそれらの還元末端基で誘導体化された。得られる螢光化合物は、上記の２種の 特に適切な緩衝システムを用いてのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離 された。これらの１つ、すなわちトリス−硼酸塩緩衝液は試験される螢光サツカ リド誘導体のずへての電気泳動を可能にし、そして種々の位置異性体、アノマー 及びエピマーが分離され得る。不連続トリス−ＨＣｌ／Ｉ−リス−グリシン緩衝 液から成る他のシステムは、酸性サンヵリドの電気泳動を可能にするが、しかし 中性サツカリドの電気泳動は可能にしない。

従って、酸性及び中性サツカリドは、明確に区別され得る。螢光ラヘリング方法 は、実質的に定量的であり、そして０．６３ピコモルはどが、ゲルがＵ■光によ り照射される場合、写真に検出され得る。

ゲルが電荷結合装置上に基づくイメージングシステムを用いて観察される場合、 ０．２ピコモルなどが検出された。

本発明によれば、２−Ｄゲル電気泳動により還元炭水化物物質を分離し、又は区 別する方法が提供され、ここで前記方法は、２−アミノアクリドンとの反応によ り還元炭水化物物質を螢光ラベルし、そしてそのラベルされた炭水化物物質を二 次元的に電気泳動分離にゆだねることを含んで成る。

本発明の１つの好ましい方法においては、２−Ｄ分離のために使用される場合、 ２−アミノアクリドン（２−ＡＡ）によりラベルされた酸性還元炭水化物が、第 １次元において、ポリアクリルアミドゲルにおける等電点電気泳動（ＩＥＦ）に ゆだねられ、続いて第二次元において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ ＧＥ）にゆだねられる。

この２−Ｄ電気泳動技法においては、酸性還元サンヵリドは、荷電されたそれら の還元末端基での螢光団２−ＡＡとの反応により誘導体化される。荷電される場 合、この螢光団は、その誘導体に正の電荷を付与する。正の電荷の量は、溶液の ｐＨに依存し、そして誘導体化反応において生成される第２７ミノ基又は２−Ａ Ａ環の窒素基のいづれか、又はそれらの両者のプロトン化がら生しる。（これら の２つの基の正確なｐＫの知識は、この方法の原理又は実施を理解することにお いては重要ではない。）従って、酸性（但し、中性ではない）す、カリドの誘導 体は両性イオンであり、そして適切なｐｕ範囲を有する両性電解質を含むシステ ムにおいてＩＥＦによる分析のために適切である。

ＩＥＦは、便利には、高い割合で、２．５〜４の範囲のｐＨを有する両性電解質 を用いての低濃度ポリアクリルアミドゲルロッドで実施される。電気泳動の後、 ゲルロッドをそれらの管から押し出し、そして二次元ポリアクリルアミドスラブ ゲル（好ましくは２ｏ％Ｗ／Ｖ）の上部に直接的に配置する。

その二次元分離は、便利には、前記の２−ＡＡ誘導体化還元サツカリドのための 一次元方法に類似する。

第一次元ＩＥＦ−ゲルは、二次元ゲル上に端と端を合して配置した後、アガロー スにより、正しい場所にシールされ、そしてＮｅｖｉｌｌｅ（文献１）により記 載される（但し、ＳＤＳを削除している）不連続緩衝システムでの垂直スラブＰ ＡＧＥにより電気泳動した。そのシステムは、２−ＡＡ誘導体が負に荷電され、 そして螢光を発するアルカリ性ｐｌ（で作動する。Ｎｅｖｉｌｌｅ緩衝システム は、２−アミノアクリドンラベル化炭水化物の一次元電気泳動分離について前に 記載された緩衝システムのいづれとも異なることが注目されるべきである。その 分離は、サツカリド誘導体の有効サイズ、実効電荷、構造及び硼酸塩イオンとの 相互作用に依存する。

この技法を用いれば、単一の２−Ｄゲル上での生物学的複合サンプル、すなわち ヒト尿の分析が可能であることが見出された。このサンプルは、ゲルを通して広 く広がる螢光スポットのパターンを与えた。ヒト尿から得られる螢光スポットの パターンは、第一次元での分離を決定するパラメーターが第二次元での分離を決 定するパラメーターに関係しないことを示唆する。

その方法は、単純な一次元方法により解決され得ない還元ザノカリドの混合物の サンプルの浪、速な分析に使用され得る。

本発明の２−１〕電気泳動のもう１つの方法においては、第一・次元電気泳動は 、酸性ゲル緩衝／ステムにおいて行なわれ、続いて、第二次元電気法１１は−、 アルカＩＪ性ｐｉで、硼酸塩イオンを含む連続緩衝システムにおいて行な才つれ る。

本発明のもう１・つの方法乙こおいては、第一・次元電気泳動は、アルカリ性ｐ Ｈで作動する不連続システム（但し、硼酸塩イオンを自まない）を用いて行なわ れ、続いて、第二次元電気泳動ば一般的に、上記の好ましい方法のようにして（ 但し、硼酸塩イオンを含む）行なわれる。他方、硼酸塩イオンは１、第一次元分 離においては使用されるが、しかし第二次元分離においては使用され得ない。

本発明はまた、炭水化物の２−アミノアクリドンラベリングを実施するためのキ ットも包含する。炭水化物の２−アミノアクリドンラベリングのためのそれらの キットは、２−アミノアクリドンラベル化炭水化物の電気泳動分離及び／又は２ −アミノアクリドンによりラベルされた炭水化物物質の同定を提供するためにさ らに使用され得る。そのキットは、炭水化物の２−アミノアクリドンラへリング を実施するために必要とされる試薬の収集を提供する。適切なキットは、２−ア ミノアクリドンラベリングの実験室での便利な実施を可能にする。キットは、１ 又は複数の特定の炭水化物物質を同定するために試験を行なうための試薬を含む 、キットは、炭水化物同定対照、２−アミノアクリドン、取扱説明書、サンプル 容器、ポリアクリルアミドゲル試薬及びＩＥＦ試薬を包含する。より完全なキッ トは、−又は二次元電気泳動を行なうための装置、たとえばゲル装ｆｃｃＤ、コ ンピューター、電気泳動バンドパターンの分析のためのソフトウェア−及び同様 のものを包含する。キットにおける試薬は好ましくは、前もって測定された量で 供給される。キットはまた、炭水化物物質の２−アミノアクリドンラベリング及 び／又は２−アミノアクリドンラベル化炭水化物物質の電気泳動分離を行なうた めの取扱説明書も包含する。

例 次の例は、本発明を例示するものであって、限定するものではない。

１、−次元電気泳動 利」１及でＡ４ 捧−料 サツカリド（第１表を参照のこと）を、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 （Ｐｏｏ−１ｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、　Ｕ、に、）又はＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、（Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｗ、　Ｄｏｒｓｅｔ。

１１、に、）から得た。複合オリゴサツカリド４２及び４３（第１表を参照のこ と）を、Ｂｉｏｃａｒｂ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｒｕｓｓｅｌ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈ ｅ＋＋１ｃａｌｓ、　Ｃｈｅｓ−ｔｅｒ、　Ｕ、に、）から得、そして２−アミ ノアクリドンをＬａｍｂｄａ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｇｒａｚ、　Ａｕ５ｔｒｉａ）か ら得た。ナトリウムシアンホーロ水素化物（ＮａＣＮＢＨ，）を、Ａｌｄｒｉｃ ｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、がら得た。

）二りえんヱス」」３りゆ劣る′　−サツカリドの憬　ヒ４ｙ！準の誘導体化の ためには、１ｍＭ又は０．５＋ｗＭのサツカリド水溶液５又は１０μｍを、遠心 分離真空原発器（ＣＶＥ）を用いて、マイクロ遠心分離管中で凍結乾燥せしめた 。氷酢酸／ＤＭＳ○（３：１７、ｖ／ｖ）中、２−アミノアクリドンの０．１Ｍ 溶液５μｌ及び１．０Ｍの水性Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈｘ溶ｉ！５μｌを添加し、 その混合物を３７°Ｃ”ｉ？１５時間インキエヘートシ、ＣＶＥ中で約４０’＋ ４４時間、凍結乾燥せしめ、そして十分な６Ｍの原溶液に溶解し、その結果、そ の１．０μｍはサッカリド２０ｐモルを含んだ。その反応は第１図に示される。

ラベルされたサツカリドは−７０’Ｃで貯蔵された。最適なラベリングのために 必要とされる２−アミノアクリドンの濃度を、Ｉｏｎモルの３種の試験サツカリ ド、すなわちガラクトース−６−スルフェート、ガラクトシルラクトース及びマ ルトペンタオースを一緒に標準の条件を用いて、但し広範囲の濃度の２−アミノ アクリドンにより誘導体化することによって決定した。誘導体化された及びフリ ーの個々のサッカリド５０ｐモルを、ゲルレーン当たりに負荷した。サンプルを トリス／硼酸塩緩衝システムを用いて電気泳動せしめ、ゲルを、ＵＶ光（３６０ ｎｍ）により照射される場合、写真を取り、そして反応の程度を前記のようにフ ィルムネガのデンシトメトリー法により決定した（文献４）。別の実験において 、グルコースを１！（以する手段で分析した。

量久床勤 通常１．０μＩは２．０μｌのサンプルを、ｏ、６７％ｗ　／　ｖのＮ、Ｎ’　 −メチレンビスアクリルアミドを含む２０％ｗ　／　ｖポリアクリルアミドゲル において電気泳動した。Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチレンジアミン及び 過Ｐ−ｆａアンモニウムの最終濃度は、それぞれ０．　１％ｖ　／　ｖ及び０． 　１％ｗ　／　ｖであった。Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎ−ｔｉｆｉｃ　ＩｎｓＬ ｒｕｓｅｎｔｓ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　Ｕｎｄｅｒ　Ｌｙ＋ｍｅ、　５ｔａｆｆ ｏｒｄｓｈｉｒｅ、　ＩＪ、に、）ＳＥ６００垂直スラブゲル電気泳動装！を、 ８Ｃ１の長さのガラスプレートにより使用した。Ｐｙｒｅｘガラスを、ゲルがＣ ＣＤシステムにより観察される場合に使用した。ゲル寸法は、１４０＋ｉｓｉの 幅×ｏ、５■の厚さであった。サンプルのウェルは２１Ｉ１１の幅であった。２ つの電気泳動緩衝システムを使用し：１つは連続的であり、Ｏ，ＬＭのトリス− 硼酸塩緩衝液ｐ）１８．３を含み（文献２　）　（Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｚｍａ塩基 、ＳｉｇＩａ）の最終濃度は０．１Ｍであり、そのｐＨを約２２°Ｃで硼酸によ り調節した）：他はＳＤＳを含まない、Ｌａｅｆｆｉｌｗｌｉ（文献３）により 記載される不連続トリス−ＨＣｌ／ｌリス−グリシン緩衝システム及び６５ｎｍ の長さの分解ゲルであった。両者の場合、ゲルは、＋７°Ｃで分析物を取り囲む ことによって冷却された。トリス−硼酸塩システムにおいては、サンプルはまず 、１００Ｖで３０分間、次に２００■で３０分間及び最後に、５００■で約９０ 分間、電気泳動された。トリス−ＨＣｌ／トリスーグリシンシステムのためには 、使用される電圧は５０Ｖで３０分間、１００Ｖで３０分間、２００■で約６０ 分間及び５００■で約６０分間、であった。その電圧はすべて一定に保持された 。ブロモフェノールブルーを、マーカーとし、て使用し、そして電気泳動を、そ れがゲルのアノード端から１０１の位置に達した時に停止せしめたｌ気泳動の後 、サンプルのウェルを水によりすすぎ、注射器及び細い針を用いて、そこに残存 する過剰の２−アミノアクリドンを除去した。

写真臭ヒーｈ、ｚ二ｊ二店− ゲルをそれらのカセットから除き、そしてそれらが３０２ｎｍ（Ｔｒａｎｓｉｌ ｌｕａ＋１ｎａｔｏｒ　７Ｍ４０．　Ｌｌ、Ｖ、Ｐ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　 Ｕ、に、）又はデンシトメーター測定のためには、３６０　ｎｍ（ＴＦ　３５Ｌ 　Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎ−ｔｉｆｉｃ、　Ｈａｔｆｉｅｌｄ 、　ＵＪ、）のいづれかの最大波長を有するＵＶ先光ボックス上位置を決定され た後、写真を取った。−ｒａｔｔｅｎ　８ゼラチンフイルター（Ｋｏｄａｋ）　 、ｆ　４．　５の絞り及び５０秒（特にことわらない瞑り）の露出時間及びネガ 及びポジ像の両者を付与するポラロイド型５５フイルム（＋５Ｏ５０）が使用さ れた。

４以：ン（火ｐ−スを囲火ビ５ガ螢−光２ラヘリン１２−アミノアクリドンを、 標準条件を用いて、反応前当たり１．９ｎモル〜５２ｎモルの範囲の種々の量の グルコースと反応せしめ、ここで前記側々の管は０．５μＣｉの１４ｃグルコー スを含んだ。反応の後、９０μｍの水を個々の管に添加し、そして個々の混合物 の１、Ｏｕｌを、シリカゲルＴＬＣプレート　（Ｐｏｌｙｃｌｒａｍ　５ＩＬＧ 　：　２０ｃｍ　Ｘ　２０　ｃｍ　；　Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）に適用 し、そしてブタン−１−オール／エタノール／水（体積により５：３：２）の溶 液中でクロマトグラフィー処理した。そのクロマトグラムを、Ｃｒｏｎｅｘ　４ 　Ｘ−線フィルム（ＤｕＰｏｎｔ）を用いてオートラジオグラフ処理した。既知 量の未変化ｌ′Ｃ−グルコースを、対照としてクロマトグラフィー処理した。

冷却　れたＣＣＤを用いてのゲルイメージングゲルは、実質的に前記（文献４） のように約２４５”Ｋに冷却されたＣＣＤを用いてのＡｓｔｒｏａ＋ｅｄ（Ｃａ 簿ｂｒｉｄｇｅ、　Ｕ、に、）　２２００１ｓ＋ａｇｉｎｇＳｙｓ　ｔｅｍｓを 用いてそれらの電気泳動カセット（パイレフクスガラス）から電気的に除去され ていない像であった。そのゲルを、２００ａｕｓＸ０．５ｍｆｆ１の出ロスリン トを有する繊維−オブチ、クス光ガイドを通して１００Ｗのタングステン−ハロ ゲンランプから照射した。そのゲルのアノード端を光ガイドに隣接せしめ、そし て整合せしめ、その結果、照射光はゲルの面に向けられた。励起光を、３ｍｍの 厚さの５ｃｈｏｔｔ　Ｂ　Ｇ　３フイルター（Ｓｃｈｏｔｔ　Ｇｌａｓｗｅｒｋ ｓ＋　Ｍａｉｎｚ、　Ｇｅｒｖａｎｙ）を用いて濾過した。放される光は、５３ ０ｎａ＋の最大の透過率を有する干渉フィルター（Ｏｓｅｇａ　０ｐｔｉｃａ１ ．　Ｂｒａｔｔｅｂｏｒｏ、　Ｖｅｒ＋ｗｏｎｔ）を通して検出された。ゲルは 、２秒、１０秒又は６０秒のいづれか観察され、そして像は、照射光の強さのむ らな点を補整するために電気的に処理された。ゲルにおけるサツカリドハンドの 螢光を、個々のバンドをおおう定義された長放形領域における絵素当たりの位置 合せされた分子７分の平均数を決定し、そして同しゲルレーンにおける類似する 隣接したブランク領域上で測定されるゲルバックグラウンドを引き算することに よって測定した。

桔−果 ２−アミノアクリドンによるサツカリドの憬２−アミノアクリドンの濃度が変え られる場合、Ｇａｌ−６−３Ｏｚの誘導体化の程度の変動を、第２図に図示する 。最大の誘導体化のためには、添加された溶液において少なくとも６０ｍＭの２ −アミノアクリドンの濃度が必要とされ、そして１００ｍＭが標準条件のために 使用された。グルコース、ガラクトース−６Ｓ０３及びガラクトツルラクトース は、類似する応答曲線を示すが、但し、個々のサツカリドの最大平均螢光度は、 すべて４種のサツカリドの最大の平均の１２％まで変化した。

標準条件下で２−アミノアクリドンにより誘導体化された＋４０−グルコースの 割合を、反応生成物のＴＬＣ分析のオートラジオグラフィーの眼による観察によ り決定した。反応前当たり１．９〜５２ｎモルのグルコースの試験される範囲で のすべてのサンプルのために、実質的にすべての”Ｃ−グルコースを誘導体化し 、そして未反応グルコースの移動度よりも有意に高い移動度を存するスポットと して現われた。

検■及互亙１丘折■乏工 それぞれ１０ｎモルの３種の試験サツカリド、すなわちマルトペンタオース、ガ ラクトツルラクトース及びガラクトース−６−スルフェートを含む標準反応混合 物の一連の希釈溶液を製造し、そしてサンプルをトリス−硼酸塩緩衝システム中 で電気泳動した。ゲルがＵ■先光ボックス上照射される場合（３０２ｎｍの最大 発光波長）、０．６３ｐモルはどが、単一ハンドで写真的に検出され得た。最適 悪魔を、１００秒の照射時間を用いて得た。より長い照射時間は、パックグラン ド螢光がいづれかの上昇されるサツカリドハンドの螢光をマスクするので、いづ れの追加の悪魔上昇も引き起こさなかった。写真システムは、ヒトの眼に類似す る悪魔のものであった。

第３図は、トリス−硼酸塩緩衝システムを用いて電気泳動され、そして冷却され たＣＣＤイメージングシステムを用いて観察される、２−アミノアクリドンによ るＧａｌ　６　ＳＯｚ誘導体の一連の希釈されたサンプルを示す。図における数 字は、類似する負荷を有するレーンの対を含み、そしてレーンは次の通りである ：レーン１．０、ｓｐモ／ｚレーア２．０．４ｐモル；ｔｚ−７３．０．２ｐモ ル；レーン４．０．１ｐモル；レーン５、サンプル緩衝液のみ。０．　２ｐモル などが検出された。

標準条件を用いて２−アミノアクリドンによりラベルされた種々の量のＣａｌ　 ６　ＳＯ３に対するＣＣＤイメージングシステムの応答が第４図に示される。第 ４図においては、個々の点は、個々の４種の決定値についての平均及び標準誤差 を示す。螢光単位は次の通りである一位宜合セされた平均正味光子／１０秒／Ｃ ＣＤ絵素／サン力リドバンド。二重対数プロットを用いて、データのすべてを便 利に包含した。その範囲は、ゲルバンド当たり３２モル〜２００分析されるサツ カリド 略された弐　通常の名称 １　２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−Ｇａｌ　２−デオキシガラクトース２　６−ｄｅｏｘ ｙ−Ｄ−Ｇａｌ　Ｌ−フコース３　２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−Ｇｌｃ　２−デオキシ グルコース４　６−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−Ｇｌｃ　６−デオキシグルコース７　Ｄ− Ｍａｎ　マンノース 第１表（続き） 分析されるサツカリド 略された弐　通常の名称 ８　３−０−ｍｅｔｈｙｌ−＋ｒ−Ｄ−Ｇａｌ　３−０−メチルグルコース１１ 　α−Ｄ−Ｇａｌ−（１−４）−Ｄ−Ｇａｌ　ガラクトシルガラクトース１２　 β−Ｄ−Ｇａｌ−（１−６）　−Ｄ−Ｇａｌ　ガラクトビオースラクトース１３ 　β−Ｄ−Ｇａｌ−（１−４）　α−Ｄ−Ｇｌｃ１４　α−Ｄ−Ｇａｌ−（１− ６）−Ｄ−Ｇｌｃ　メリビオース１５　β−〇−Ｇａｌ−（１−４）　−Ｄ−Ｋ ａｎ　ガラクトシルマンノース１６　α−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−４）−Ｄ−Ｇｌｃ 　フルドース１７　β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−４）　−Ｄ−Ｇｌｃ　セリオビオー ス１８　α−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−３）−Ｄ−Ｇｌｃ　ニゲロース１９　β−Ｄ− Ｇｌｃ−（１−３）　−Ｄ−Ｇｌｃ　ラミナリビオース２０　α−Ｄ−Ｇｌｃ− （１−６）−Ｄ−Ｇｌｃ　イソマルトース２１　β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−６）　 −Ｄ−Ｇｌｃ　ゲンチオビオース２２　α−Ｄ−Ｍａｎ−（１−３）−Ｄ−Ｍａ ｎ　マンノビオース第１表（続き） 分析されるサツカリド 略された弐　通常の名称 ３３　β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−４）−Ｄ−ＧＩｃＮａｃ　ジアセチルキトビオー ス３７　Ｄ−ＧｌｃＮａｃ６ＳＯ３Ｎ−アセチルグルコースアミン−６−スルフ ェート ３８　Ｄ−ＣＩｃＡ　グルクロン酸 ３９　Ｎｅｕ５ＧＩ　Ｎ−グルコリルノイラミン酸４０　Ｎｅｕ５Ａｃ　Ｎ−ア セチルノイラミン酸ト１スー　−システム１Δｉλ氷妨分星第５Ａ及び５Ｂ図に おいては、２−アミノアクリドンよりラベルされた種々のモノ−及びオリゴサツ カリドの、トリス−硼酸塩緩衝システムを用いてゲルから製造された螢光電気泳 動図のＣＣＤ図が示される。ゲルは、個々の像セクションのために３０秒間観察 された。ゲルのサンプル試験は、第１表に示される個々のサツカリドの数に対応 する。ラベルされたレーン“Ｗ”は対照であり、そしてラベル化反応においてサ ツカリドを含まなかった。矢印は、人工ハンドの位置を示す、それぞれ２０ｐモ ルの分析されるサツカリドが、薄黄色ハンドとして眼に見えた。薄青色バンドが また、すべてのサンプルに存在し、それは第５Ａ及び５Ｂ［ｌ及び第７回に示さ れる位置での水ブランクを包含する。これらのハンドは、ゲルがＵ■光水ボック ス上観察される場合、黄色のサツカリドハンドから眼により容易に区別でき、そ して試験されたすべての中性サツカリドよりも早く移動した。これらのハンドの 多くは、反応混合物の大きな割合が第７図に示されるゲルにおいて分析されたの で、第５図におけるよりも第７図において眼に見える。薄黄色ハンドが、電気泳 動のｐＨで荷電されていない未反応２−アミノアクリドンのために個々のゲルレ ーンのカソードで生した。このほとんどは、両ＣＣＤイメージングの前及び写真 のためにゲルカセットを分解する前、サンプルウェルをすすぐことによって除去 された。後者の場合、ゲルに拡散したすべての螢光団は、上部１〜２１１＋１の 切断により除去された。

第７図は、人工ハンド及び種々の中性サツカリド誘導体の位１を示す螢光電気泳 動図のＣＣＤ像である。ゲルは６０秒間、観察された０個々のレーン１．２及び ３は、サツカリドを含まない標準反応混合物の部分を含む０反応混合物を１００ μｍの６Ｍ＝尿素に溶解し、そしてレーンは次の通りである：レーン１．０．５ μｍ；レーン２．１．　０μｍ：レーン３．２．０μｌ、　Ａ、　Ｂ、Ｃ及びＤ でラベルされた矢印は、ＵＶ光水ボックス上観察される場合、青色に現われる主 要の人工ハンドの位Ｉを示す、残るレーンは、４種の中性還元サツカリドを示す ：レーン４．３−０−メチルグルコース；レーン５、マンノース；レーン６、グ ルコース；レーン７、ガラクトース、１００モルの個々のサツカリド誘導体を５ ００μｌの６Ｍ−尿素に溶解し、そして２０ｐモル（１μｌ）をレーン当たりに 負荷した。ラベルされたサツカリドの移動度は、個々のサツカリド分子の大きさ に一部依存するが、しかしまた、種々の分子構造により強く影響された。従って 、サツカリドの大きさの効果は、グルコース、及び重合の程度の上昇と共に移動 度の低下を示すすべてのその直鎖のｃｔｌ−４結合オリゴマー、すなわちマルト −スルマルトヘプタオース（第５Ａ図、レーン１６、及び第５Ｂ図、レーン２３ ，２７゜２９．３０及び３１）の移動度を試験することから見出され得る。

しかしながら、多くの場合、移動度の大きな差異が種々の位置異性体間に見出さ れ得る。たとえば、ガラクトース及びグルコースの対応する２及び６デオキシ誘 導体は十分に分離され、そしてグルコースの６種のダイマーが３対のアノマー、 ニゲロース及びラミナクビオース（１−３結合）、マルトース及びセルロビオー ス（１−４結合）、及びイソマルトース及びゲンチオビオース（１−６結合）に 十分に分離された。さらに、個々の対におけるその対応するアノマーは、低い移 動度差異を有し、そしてこれはまた、マルトトリオース及びセルロトリオースの 場合でもあった。アノマーの対応する対が試験されるすべての場合、β−結合分 子は、それらがα−結合されるよりもわずかに高い移動度を有した。

他の低い構造差異は、比較的高い移動度差異に導びき、たとえばエピマーガラク トース、グルコース及びマンノースはお互いから分離され、そしてＮ−アセチル ガラクトースアミン及びＮ−アセチルグルコースアミンが広く分離された。３− ヒドロキシルを通してのグルコースの結合が３−〇−メチルグルコース、ニゲロ ース及びラミナリボースにより示されるような関連する分子に比較して、移動度 の著しい低下を導びくことか注目された。Ｎ−アセチル化された化合物、Ｎ−ア セチルラクトースアミン、ジアセチルキトビオース及びトリアセチルキトビオー スはまた、類似する大きさの他のサツカリドに比較して、有意に遅められた。

トリス−硼酸塩緩衝システムにおける酸性サツカリドの電気泳動移動度はまた、 小さな構造差異により影響され；たとえばガラクトース−６−スルフェート及び グルコース−６−スルフェートが分離された。一般的に、それらは中性サツカリ ドよりも高い移動度を有した。カルボキシル基を含む３種のモノサツカリド、た とえばグルクロン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン 酸はそれぞれ、３種の別々のバンドを示した。この現象の理由は現在知られてい ない、それは、Ｎ−アセチルノイラミンラクトース又はシアリル化された複合オ リゴサツカリド４２及び４３（第１表を参照のこと）に関しては見出されなかっ た。

トリス−ＨＣｌ　トリス−グリシン　システムにおける４１Ｓ〜゛トリス−ＨＣ ｌ／）リス−グリノン緩衝システムで電気泳動される場合、中性サツカリドは検 出されなかった。しかしながら、すべての酸性サツカリドの２−アミノアクリド ン誘導体は、第６図に示されるようにゲル中に電気泳動され（ここで、それは２ −アミノアクリドンによりラベルされた唯一の酸性サツカリドを示す螢光電気泳 動図のＣＣＤ像であり）、そしてトリス−ＨＣｌ／ｌ−リス−グリノン緩衝シス テムを用いてＰＡＧＥにより分離された。約２０Ｐモルの個々のサツカリド誘導 体が示される。ゲルは、個々の像セクションのために３０秒間、観察された１個 々のゲルレーンの数字は、第１表に示される個々のサツカリドの数字に対応する 。ラベルされたレーン“Ｗ”は対照であり、そしてラベル化反応においてサツカ リドを含まない。矢印は、人工バンド位置を示す。

グルクロン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン酸（但 し、Ｎ−アセチルノイラミンラクトースは包含しない）は、他のサツカリドより も薄い３種のハンドとして現われた。

ＵＶ光水ボックス上観察される場合、青色の螢光を有する非サツカリドバンドは 、ＨｚＯを含むサンプルのすべてに存在した。これらのバンドは、サツカリドハ ンドの前方に移動した（第６図を参照のＰＡＣ；Ｅ、すなわちポリアクリルアミ ドゲル電気泳動は、天然において荷電されているオリゴサツカリドの分離のため に（文献５゜６．７．８）及びまた、硼酸塩イオン複合体として荷電されていな いオリゴサツカリドの分離のために（文献２，９．１０）これまで使用されて来 た。ＰＡＣ；Ｅがそのような誘導体の分析のために、たった２つの最近の報告（ 文献４．１８．１７）に使用されているが、螢光団による還元サツカリドの共有 ラベリングのための多くの方法が、これまで記載されて来た。

本発明の研究においては、試験される高い螢光性の２−アミノアクリドンサツカ リド誘導体のすべてが、硼酸塩イオンを含む緩和システムにおいて電気泳動され 得る、ＰＡＧＥの新規方法が記載されて来た。２−アミノアクリドン自体は、電 気泳動システムのゲルのｐＨで、ラベルされたサツカリド上に電荷を付与しなか った。従って、中性サツカリドの誘導体は、負に荷電された酸性サツカリド誘導 体に比較して、硼酸塩イオンを含まない電気泳動緩衝液において移動しなかった 、結果として、その方法は、中性及び酸性サツカリドの容易な区別を可能にした 。

本発明の方法は、実施するのに単純で且つ比較的早く、そして安価な市販の試薬 を使用する０反応条件は、芳香族第一アミン、すなわちアミノナフタレン−１− ３−６−１−リスルホン酸（ＡＮＴＳ）による還元サツカリドの定量誘導体化の ためにこれまで使用されて来た条件に基づかれ、そして選択された条件は、２− アミノアクリドンのための定量誘導体化を与えた。

前記方法は、冷却されたＣＣＤと共に写真技術又は電子イメージングのいづれか を用いて高い感度を示す。後者のシステムは約３倍より感度が高く、そして光源 の力を高めることにより、フィルターを螢光団の励起及び発光スペクトルに、よ り正確に組合すことにより、より低温に冷却されたＣＣＤカメラを用いることに より、及び広い口径のレンズを用いることにより、その感度を高めるだめの相当 の可能性が存在する。しかしながら、実際、検出の感度は、サンプルウェル中に 負荷され得る反応混合物の割合により制限され得る。

記載されるシステムを用いる場合、この体積は１０μｌである０反応混合物材料 を溶解するために必要とされる６Ｍ−尿素サンプル溶液の最少体積は５０μｍで あるので、利用できるサツカリド誘導体のたった１１５が負荷され得る。しかし ながら、反応体の体積を１μｌに低めることにより、負荷される割合をほとんど ５倍に高めることが可能である。

検出の感度の第２の制限は、第５．６及び７図においてラベルされる人工ハンド から発生する。それらのハンドは、中性サツカリドを検出する場合、はとんど重 要なものではなく、ここですべての前記サツカリドはハンドＢ、Ｃ及びＤよりも 低い移動度を有しく第７図を参照のこと）、そして第４ハンド（ハンドＡ、第７ 図）は薄く、そして少数のみの中性サツカリドと同時に存在する。酸性サツカリ ド誘導体の１つ（Ｇｌｃ−６５Ｏ１）は、主要な人工バンド（ハンドＣ１第７図 ）の移動度と同一の移動度を存する。しかしながら、すべての酸性サツカリド誘 導体は他の非硼酸塩緩衝システムにおいて検出可能であり、ここで主要な人工バ ンドは酸性サツカリド誘導体のいづれよりも高い移動度を有する小さな問題を有 する（第６図を参照のこと）。

本明細書に記載される還元サツカリドの２−アミノアクリドン基礎のＰＡＧＥ分 析は、原則として、ＡＮＴＳが使用され、そして前で報告された分析に類似する （文献４）。ＡＮＴＳは、電気泳動緩衝液に硼酸塩イオンを用いないで高い解像 度を存する単一のゲルにおいて、試験されるすべての還元サツカリドの可視化を 可能にした。

その螢光サン力リドバンドは、２−アミノアクリドンを用いて得られるバンドよ りも、ＡＮＴＳシステムにおいては、相当に鋭く、そしてＡ　Ｎ　Ｔ　Ｓ　誘導 体の電気泳動移動度は、個々の分子の大きさにより強く影響された。従って、グ ルコースのすべてのｃｒｌ−４結合直鎖ポリマー、たとえばマルトース〜Ｃａ　 Ｄ　Ｇｌｃ　（１４））ｚｓα−Ｄ−Ｇｌｃは、単一のゲルにおいて分離された 。しかしながら、中性及び酸性サツカリド誘導体は、ＡＮＴＳ分子によりすべて 負に荷電された。従って、それらは、２−アミノアクリドンによりラベルされた ものとは異なって、２種のグループの分子として電気泳動的には容易に区別され 得なかった。後者の試薬の誘導体の電気泳動移動度はサツカリドの大きさにより ほとんど影響されないが、しかしサツカリドの構造によっては、より強く影響さ れる。

多くの分離が、ＡＮＴＳではなく、２−アミノアクリドンにより得られた。たと えば、ガラクトース及びマンノース誘導体は分離され、そしてグルコースの種々 の位置異性体ダイマー及びトリマーの移動度のより大きな差異が示された。中性 及び酸性糖の明確な差別化は、２−アミノアクリドンの特に有用な性質であり得 る。

本明細書に記載される２−アミノアクリドン基材の方法の分析性質は、ＡＮＴＳ 方法の補充方法であろうと思われる。高い感度及び２速な定量化を同時に可能に しながら、インビトロでゲルを観察するために冷却されたＣＣＤイメージングシ ステムを用いることの単純化は、天然に存在する複合炭水化物の酵素分析のため に有用であ玉二吹部−二拳Ｉ孟」じ（虹軌 ２−アミノアクリドンによる還元サツカリドの誘導体化を、例■におけるように して実質的に行なった０等電点電気泳動は、小さな均等な内腔ガラスの毛管（約 ０．８−のｉ、ｄ、）　（Ｖｉｔｒｅｓ、４４．７μｍ、マークされた体積、Ｃ ａ５ｌａｂ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕ、に、）中で行なわれた。ＩＥＦゲルは ６５ｎ−の長さであり、そして溶液は次のものから製造されたニ アクリルアミド（３０％ｗ／ｖ）Ｎ、Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミド（０ ，８％ｗ／ｖ）　ｏ、４ｍ１両性電解賞　ＬＫ８　２．５−４　０．０７５霞１ 両性電解質Ｐｈａｒａｓｃｉａ　３−１０　０．　０２５ｍ１Ｎｏｎｉｄｅｔ　 Ｐ　４０　／　Ｈｚ　Ｏｉ液（１：　９．ｖ／ｖ）　０．０５ｍｌ過ｔａアンモ ニウム溶液（１０％ｗ／　Ｖ　）　０．　０２ａ＋ＩＴＥＭＥＤ　０．００２ｍ １ ガス抜きされた水　２．０１ 陽極液を、ガス抜きされた水２５０ｍ１に４硫＃０．３７５ａ＋１を希釈するこ とによって製造した。陰極液を、ガス抜きされた水２５０１にＩＯＭのＮ　ａ　 ＯＨ原液０．５ｍｌを希釈することによって製造された２０ｍＭのＮａＯＨであ った。

ＩＥＦゲルを、両性電解質溶液（Ｐｈａｒａｓｃｉａ　ｐＨ範囲３〜１ｏ（５％ ｖ／ｖ））約３０μＩにより被覆した。サンプルを６Ｍ−尿素に溶解し、そして ゲル管における両性電解を溶液下で重ねた。通常、０６５〜２μが負荷された。

空気バブルはそのシステムにおいては生じなかったことが確かめられた。６Ｍ− 尿素中、ブロモフェノールプル溶液をまた、マーカーとして作用せしめるために 負荷した。

サツカリド誘導体を、１００■で３０分間及び次に、１００ＯＶで６０分間、電 気泳動せしめた。電気泳動の後期段階において、黄色に変わるブロモフェノール プルが固定ハンドとして現われた。

ゲルを、軽い水圧によりそれらの管から除去し、そして第２の垂直スラブゲルの 上部に配置した。２つのゲルを、個々の第二次元ゲル上の端と端を接して配置し た。

星二次ユ 第二次元は、寸法７０ａｒｓ　（Ｈ）　Ｘ　１４０ｍｍ　（Ｗ）　Ｘｏ、７５ｍ ｍ（Ｔ）を有する均質濃度（２０％Ｗ　／　Ｖ　）のポリアクリルアミドゲルで あった。！ｌｌクシステム、Ｎｅｗｉｌｌｅ（文献１）の緩衝システムに基づか れた。ゲル溶液は、２０％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド、０．６７％ビス、０．１ ％ｗ　／　ｖ過硫酸アンモニウム、０．０１％ｖ／ｖ　ＴＥＭＥＤ、０．４２Ｍ のトリスＨＣＩＩＩｋ衝液（ｐｉ（９，１８）を含んだ、陽性液は０．４２Ｍの トリスＭＣＩ緩衝液（ｐＨ９，１８）であり、そして陰性液は０．０４１Ｍのト リス塩基、０．０４Ｍの硼酸（ｐＨ８，６４）であった。

ＩＥＦ−ゲルを、使用される電気泳動システム（文献１）のための積み重ねゲル 緩衝液、すなわち０．０５４Ｍのトリス塩基、０．０２７ＭのＨ，Ｓｏ、溶液（ ｐｌ（６，１’）により緩衝化された約３−の１．０％ｗ　／　ｖアガロース溶 液により適切な位置で密封した。

サンプルは、１００■で３０分間、２００ｖで３０分間、及び５００Ｖで６０分 間、電気泳動した。圧力は一定に保持され、そしてゲルは、約＋７°で陽性液を 取り囲むことによって冷却された。

第一次元ゲルからのブロモフェノールプルが、ゲルのアノード端から約５ｍｍに 達した時、電気泳動を停止した。

ゲルをすすぎ、そしてＡｓ　ｔｒｏ観ｅｄ　ＣＣＤ　２２００イメージングシス テムを用いてインビトロで観察し、又はそのカセットから除き、そして例１に記 載されるようにして写真を取った。

典型的な２次元螢光電気泳動図のＣＣＤ像の写真が、第８及び９図に示される。

第８図は、１及び２で示される２つのＩＥＦゲルを示し、そこで実施される第二 次元ゲル上に側面を接して（すなわち端と端を接して）配置される、その図に示 される左側で酸末端を存する個々のゲルは、その図に示されるように下方方向で ある。第二次元ゲルの底は、３で示される。

２つの２−次元ゲルを、ゲル１上に、複合オリゴサツカリド５６／　５１　（Ｂ ｉｏｃａｒｂカタログ番号５６１５１）及びノイラミニダーゼ及びゲル２上、複 合オリゴサツカリドにより、上記のようにして実施された。

第二次元ゲルの上部端に向かっての中央スポットは、オリゴサツカリド５６１５ １のものであり、そしてゲル１におけるスポットはゲル２上のスポットに比較し て小さくされる。ノイラミニダーゼによるオリゴサツカリド５６１５１の消化の 未電荷反応生成物は、ゲル上に見出されない。他のスポットは、未知のものであ り、そしてゲル１におけるスポットはゲル２上、スポットに比較して減じられる 。

第９図は、第８図に類似し、そして左側のゲルは尿及びノイラミニダーゼについ ての結果を示し、そして右側のゲルは尿についての結果を示す、２つのゲルを横 切って走る点線は、写真性人工体である。

追加の実験を、第一次元分離のためにＩＥＦよりもむしろ電気泳動を用いて行な った０次の例は、下記の差異とは異なって、−ｉ的に例２に記載されるような装 置及び方法を用いて行なわれた。

拠立 サンプルを、第一次元のためにｈｐＨ２，７１で作用する酸性ゲル緩衝システム 中で電気泳動した。すべての中性サツカリド誘導体及びいくつかの酸性サツカリ ド誘導体は、このｐＨで正に荷電されるで゛あろう、第二次元は、ｐｏｓ、３で 、硼酸塩イオンを含む連続緩衝システム上に存在した。すべてのサツカリド誘導 体は、このシステムにおいて負に荷電される。

第１０図は、この方法により尿分離のために得られた結果のＣＣＤ像の写真であ る。

Ｎ土 サンプルを、Ｌａｅ−■ｌｉ（文献３）のシステムに基づく緩衝システムにおい て電気泳動し、しかしＳＤＳは、第一次元からは削除された。

これは、アルカリ性ｐＨで操作する不連続システムであり、そして硼酸塩イオン を含まない。第二次元緩衝システムは、Ｎｅｖｉｌｌｅ（文献１）のシステムに 基づかれているが、しかしＳＤＳは削除された。このシステムは硼酸塩イオンを 含む。ゲルパターンは、硼酸塩イオンとサツカリド誘導体との特別な相互作用に 依存する。

第１１Ａ及び第１２Ｂ図は、４０のサツカリド（第１１Ａ図）の複合混合物及び また尿（第１ＩＢ）のために得られた結果のＣＣＤ像の写真である。

本明細書におけるすべての出版物及び特許出願は、本発明が関与する当業者の熱 線のレヘルの示唆である。すべての出版物及び特許出願は、引例により本明細書 に組込まれる。

文−藍 １、　Ｎｅｖ百Ｉｅ、　Ｊｒ、　、　Ｄ、門、　（１９７１）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、　２４６．６３２８−６３３４゜２、　Ｗｅｉｔｚｍａｎ、Ｓ、　５ ｃｏｔｔ、Ｖ、　＆　Ｋｅｅｇｓｔｒａ＋に、　（１９７９）　Ａｎａｌ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ。

９７、４３８−４４９゜ ３、　Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｌｌ、に、　（１’９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎ ｄｏｎ）　２２７．６８０−６８５゜４、　Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｐ、　（１９９０ ）　Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、Ｊ、　２７０．７０５　７１３゜５、　Ｒｉｃｅ、Ｘ、 Ｇ、、　Ｒｏｔｔｉｎｋ、Ｍ、）ｆ、　＆　Ｌｉｎｈａｒｄｔ＋Ｒ，Ｊ、　（１ ９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋。

７、Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、Ｊ、Ｅ、　＆　Ｇａｌｌａｇｈｅｒ　Ｊ、Ｔ、　（１９ ９０）　２６５．７１５−７２４゜８、　ＡＩ４ａｋｉｍ、Ａ、　＆　Ｌｉｎｈ ａｒｄｔ、ｌｉ、Ｊ、　（１９９０）　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｒＬ ２３−２８゜ ９、　Ｆｏｓｔｅｒ、Ａ、Ｂ、　（１９５７）　Ａｄｖａｎ、Ｃａｒｂｏｈｙｄ 、Ｃｈｅｍ、　１２．８１−１１５゜１１、Ｗａｎｇ、Ｗ、Ｔ、、　ＬｅＤｏｎ ｎｅ＋Ｊｒ、、Ｎ、Ｃ，＋　Ａｃｋｅｒｍａｎ、Ｂ、　＆　Ｓｗｅｅｌｅｙ、Ｃ ，Ｃ。

（１９８４）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４１．３６６−３８１゜１２、 ｔｌａｓｅ、Ｓ、、　Ｉｋｅｎａｋａ、Ｔ、　＆　Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ＋Ｙ、 　（１９７９）　Ｊ、旧ｏｃｈｅ１１゜（Ｔｏｋｙｏ）　８５．９８９　９９４ ゜１３、Ｐｒａｋａｓｈ、Ｃ，＆　Ｖｉｊａｙ＋１．Ａ、　（１９８３）　Ａｎ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、　１２８．４１−４６゜ １４、Ｉｎｇｈａｗ、に、　＆　ｂｒｅｗ＋Ｓ、Ａ、　（１９８１）　Ａｎａｌ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２８．４１　４６゜１５、Ｃａｒｓｏｎ、Ｓ、Ｄ、　（ １９７７）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７８．４２８　４３５゜１６、Ｈｏ ｎｄａ、Ｓ、、　Ｉｗａｓｅ＋Ｓ、＋　Ｍａｋｉｎｏ、Ａ、　＆　Ｆｕｊｉｗａ ｒａ、Ｓ、（１９８９）　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｌｍ、１７６、７２　７７゜１７、　Ｊａｃｋｓｏｎ＋Ｐ、＆　Ｗ ｉｌｌｉａｍｓ、Ｇ、Ｒ，（１９８８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｔｅ ｎｔＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＷＯ３８／１０４２２゜１８、　Ｊａｃｋｓ ｏｎ、Ｐ、＆　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｇ、Ｒ，（１９９１）　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ ｏｒｅｓｉｓ　１２＋９４−９６゜ １９、５ｈａｒｏｎ、Ｎ、（１９８４）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９ ．　１９８　２０２゜２０、　Ｆｅ１ｚｉ、Ｔ、＆　Ｃｈｉｌｄｓ、Ｒ，Ａ、（ １９８５）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、１０＋２４−２９゜ ２１、　Ｆｅ１ｚｉ、Ｔ、　Ｃｈｉｌｄｓ、Ｒ，Ａ、（１９８７）　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｊ、　２４５．　１　１１゜２２、ＭｃＮｅｉｌ、門、、Ｄａｒｖｉｌｌ 、Ａ、Ｇ、＋　Ａｍａｎ、Ｐ、、Ｆｒａｎｚｅｎ、Ｌ、Ｅ、＆　Ａｌｂｅｒ−ｓ ｈｅｉｆｆｉ、Ｐ、（１９８２）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　８３． 　３−４５゜２３、　Ｂａｒｋｅｒ、Ｒ，、Ｎｕｎｅｚ、［１，Ａ、、Ｒｏｓｅ ｖｅａｒ、Ｐ、＆　５ｅｒｉａｎｎｉ＋Ａ、Ｓ。

（１９８２）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　８３．　５８−６！１２４ 、　Ｗｈｉｔｅ、Ｃ，Ａ、＆　Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｊ、Ｆ、（１９８６）ｉｎ　Ｃ ａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ａｎａｌｙ−ｓｉｓ＋　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ ｐｐｒｏａｃｈ　（Ｃｈａｐｌｉｎ、Ｍ、Ｆ、＆　Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｊ、Ｆ、。

ｅｄｓ、）、ｐｐ、３７−５４．ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ。

２５、　Ｗｅｌｐｌｙ、Ｊ、に、（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌ、ヱ、５−１０゜２６、　Ｔｏ＊ｉｙａ、Ｎ、Ｋｕｒｏｎｏ＋Ｍ、＋　ｌ５ ｈｉｈａｒａ、Ｈ，Ｔｅｊｉａ＋ａ、Ｓ、、Ｅｎｄｏ＋Ｓ、。

２８、　Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ、Ｊ、Ｂｏｕｇｇｕｌｅｔ、Ｓ、、Ｄｅｂｒａｙ、 Ｊ、Ｐｏｕｒｎｅｔ、Ｂ、、５ｐｉｋ＋Ｇ、＆　５ｔｒｅｃｋｅｒ、Ｇ、（１９ ８６）ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　：　ＡＰｒａｃｔ ｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　（Ｃｈａｐｌｉｎ、Ｍ、Ｆ、＆　Ｋｅｎｎｅｄｙ 、Ｊ、Ｆ、、ｅｄｓ、）。

ｐｐ、１４３　２０４．ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ。

２９、　Ｋｏｂａｔａ、Ａ、（１９７９）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、１００ ．　１−１４゜３０、　Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ、Ａ、Ｌ、Ｔｒｉｍｂｌｅ、Ｒ，Ｂ 、＆　Ｐｌｕｍｓｅｒ、Ｊｒ、、Ｔ、Ｈ，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅ１ ｌｓ　Ｂｉｏｌ、　３２．　１１　１３９゜３１．　Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ、Ｓ 、、Ｈａｒｐａｚ、Ｎ、、Ｌｏｎｇ＋＋ｏｒｅ、Ｇ、Ｃａｒｖｅｒ、Ｊ、Ｐ、、 Ｇｒｅｙ。

Ａ、Ａ、　＆　５ｃｈａｃｈｔｅｒ、Ｈ，（１９８０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ！１．２２５．　４８７６　４８８４゜３２、　Ｈａｓｅ、Ｓ、、Ｉｂｕｋｉ、 Ｔ、　ｉ　Ｉｋｅｎａｋａ、Ｔ、（１９８４）　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（Ｔｏｋ ｙｏ）邸、１９７−２０３゜ ３３、Ｐｏｒｅｔｚ、Ｒ，Ｄ、　＆　Ｐｉｅｃｚｅｎｉｋ、Ｇ、　（１９８１） 　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１５゜１７０−１７６゜ ３４、　Ｄａｓ、０．Ｐ、　＆　）ｌｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｅ、Ｊ、（１９８６） 　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、１５８．　３９０−３９８゜ ３５、　Ｔｏｗｂｉｎ、ｆｌ、Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，Ａ、、Ｂｒ ａｕｎ、Ｄ、Ｇ、＆　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｒ。

Ｇ、（１９８８）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ−、１７３，１−９゜３６、　Ｍａ ｎｅｓｓ、Ｎ、Ｄ、＆　Ｍｏｒｔ、Ａ、Ｊ、（１９８９）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、１７８．　２４８−２５４゜ ３７、　Ｈａｒａ＋Ｓ、、Ｙａａ＋ａｇｕｃｈｉ、門、Ｔａｋｅｍｏｒｉ、Ｙ、 、Ｆｕｒｕｈａｔａ、に、、Ｏｇｕｒａ。

Ｈ，＆　Ｎａｋａｍｕｒａ、門、（１９８９）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ７９．　１６２−１６６゜３８、　ｔｌｏｎｄａ、Ｓ、、Ｉｗａｓｅ、Ｓ７．門 ａｋｉｎｏ、Ａ、＆　Ｆｕｊｉｗａｒａ、Ｓ、（１９８９）　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７６、　７２−７７゜３９、　Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｐ、（１９ ９１）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９６，２３８２４４）。

伺１「詠 前記明細書は、本発明の実施を当業者に可能にするのに十分であると思われる６ 実際、分析化学又は関連する分野において熱線者に明らかである、本発明を実施 するための上記態様の種々の変性は、本発明の請求の範囲内にあるであろう。

ＦｌＧ、ｊ んで、２ ＦＩｏ、　３ Ｗ　１　２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１ ２２ＷＦＩＧ、　５Ａ Ｗ　３５　３６　３７　３８　３９　４０　８　４２　４３　ＷＦＩｏ、　６ ＦＩ６．　７ ＦＩ６．８ ゲル１　ゲル２ 第一次元ゲル ＦＩＧ、１ｉＡ ＦｌＧ、ｉｉＢ 要約書 本発明は、炭水化物混合物を分離し、そして炭水化物の構造を分析することに使 用するために螢光ラベル２−アミノアクリドンの使用を提供する。分鯉のための 炭水化物は、２−アミノアクリドンによりラベルされ、そして続いて電気泳動に よりお互いから分離される。電気泳動は−又は二次元で存在する。電気泳動によ り生成されるハンドは、ＵＶ照射又は光電検出のための電荷結合装置により可視 化され、そして直接的に定量化され得る。炭水化物の２−アミノアクリドンラへ リングはまた、既知の特異性の炭水化物変性酵素により種々の２−アミノアクリ ドンラベル化炭水化物を切断しく又は付加し）、そして続いて−又は二次元電気 泳動により前記炭水化物を分離することによって、炭水化物の構造を分析するた めにも使用され得る。本発明はまた、２−アミノアクリドンラベリング及び電気 泳動を行なうためのキットも提供する。

国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．炭水化物をラベリングするための方法であって、前記炭水化物に２−アミノ アタリドンを添加する段階を含んで成る方法。
2. ２．前記炭水化物が還元剤の存在下でラベルされる請求の範囲第１項記載の方法 。
3. ３．炭水化物の混合物を分離するための方法であって、請求の範囲第１項記載の 方法により前記炭水化物をラベリングし、前記炭水化物を電気泳動によりお互い から分離する段階を含んで成る方法。
4. ４．前記方法が、前記分離された炭水化物を照射により可視化する段階をさらに 含んで成る請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記方法が、前記分離された炭水化物を電荷結合装置により可視化する段階 をさらに含んで成る請求の範囲第３項記載の方法。
6. ６．炭水化物の構造を分析するための方法であって、請求の範囲第１項記載の方 法に従って前記炭水化物をラベリングし、前記炭水化物を炭水化物変性酵素によ り処理し、それによって少なくとも１つの新規炭水化物が形成され、前記炭水化 物を電気泳動により分離する段階を含んで成る方法。
7. ７．前記炭水化物変性酵素が、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ 、炭水化物エステラーゼ及びエピメラーゼから成る群から選択される請求の範囲 第６項記載の方法。
8. ８．前記方法が、前記分離された炭水化物を照射により可視化する段階をさらに 含んで成る請求の範囲第６項記載の方法。
9. ９．前記方法が、前記分離された炭水化物を電荷結合装置により可視化する段階 をさらに含んで成る請求の範囲第６項記載の方法。
10. １０．前記電気泳動が二次元である請求の範囲第３項記載の方法。
11. １１．前記二次元電気泳動の第一次元が等電点電気泳動により分離される請求の 範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記電気泳動の少なくとも１つの次元がアルカリ性ｐＨで硼酸塩イオンを 含む連続緩衝システムにおいて存在する請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．前記電気泳動が二次元である請求の範囲第６項記載の方法。
14. １４．前記電気泳動の少なくとも１つの次元がアルカリ性ｐＨで硼酸塩イオンを 含む連続緩衝システムにおいて存在する請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．前記二次元電気泳動の第一次元が等電点電気泳動により分離される請求の 範囲第１３項記載の方法。
16. １６．２−アミノアタリドンを含んで成る、炭水化物をラベリングし、分離し、 又は構造的に分析するためのキット。
17. １７．炭水化物変性酵素をさらに含んで成る請求の範囲第１６項記載のキット。
18. １８．請求の範囲第１項記載の方法によりラベルされた炭水化物。
19. １９．下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒは炭水化物である〕を有するラベルされた炭水化物。
20. ２０．下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒは炭水化物である〕を有するラベルされた炭水化物。