CN100386624C - 一种荧光试剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种荧光试剂的制备方法，以邻位苯甲酸苯胺为合成母体，在浓硫酸作用下，于沸水浴中回流加热2-4小时，生成吖啶酮；吖啶酮与2-溴乙醇在二甲基亚砜溶剂中反应得2-(N-吖啶酮基)-乙醇；2-(N-吖啶酮基)-乙醇与三聚氯氰在二氯甲烷溶液中，于0-5℃搅拌反应16-24小时得目标产物2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪。本发明的荧光试剂激发波长404nm；发射波长440nm；分子的摩尔吸光度增大，水溶性增强，适宜于作为荧光衍生化试剂，用于非荧光样品的荧光检测，可较大地提高样品的检测灵敏度。本发明的荧光试剂可作为一般的荧光试剂使用，更适用于作为高效液相色谱柱前或柱后荧光衍生化试剂。在流动相较宽的浓度范围内，量子效率变化幅度小。

Description

一种荧光试剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种荧光试剂的制备方法，具体地说涉及一种2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪的制备方法。

背景技术

对吖啶酮及其衍生物荧光性质的研究，主要集中在几种常见简单结构衍生物作为衍生化试剂用于生物分子的检测方面，见附表1。由于吖啶酮的特殊结构性质，在已有的报道中，研究主要集中在对其量子性质的讨论方面。如π-电子的跃迁、溶剂性质对吖啶酮衍生物荧光性质的影响等。根据已有报道，现有试剂具有以下缺陷：反应活性较低，衍生速度较慢，衍生产物不稳定，洗脱前后组分荧光量子效率较大检测。2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪与已有的荧光试剂相比，具有更强的紫外吸收，更长的激发和发射波长(激发波长404nm；发射波长440nm)；激发和发射波长显著红移；摩尔吸光系数及量子效率皆大于文献报道的相关荧光试剂。由于在2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪分子中存在N原子介入的大π键，同时乙氧基-4，6-二氯三嗪的协同效应，使其激发和发射波长显著红移，分子的摩尔吸光度增大。此外，由于乙氧基-4，6-二氯三嗪的适宜反应性和稳定性，使其更适宜于作为荧光衍生化试剂，用于非荧光样品的荧光检测，可较大地提高样品的检测灵敏度。这种新型荧光试剂可作为一般的荧光试剂使用，更适用于作为高效液相色谱柱前或柱后荧光衍生化试剂，在流动相较宽的浓度范围内，量子效率变化幅度小。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪的制备方法。

为实现上述目的，本发明的制备方法是：

1)以邻位苯甲酸苯胺为合成母体，在强脱水剂浓硫酸作用下，于沸水浴中回流加热2-4小时，使其发生环化反应，脱去一分子水，生成吖啶酮。其中邻位苯甲酸苯胺与浓硫酸之间的质量比为1∶3-4。

2)以氢氧化钾为催化剂，吖啶酮与2-溴乙醇在二甲基亚砜溶剂中反应得2-(N-吖啶酮基)-乙醇；其中吖啶酮、2-溴乙醇及氢氧化钾之间的质量比为2-3∶3-4∶1；反应温度100℃，反应时间4-6小时；

3)在0-5℃反应温度下，2-(N-吖啶酮基)-乙醇与三聚氯氰在二氯甲烷溶液中作用，2-(N-吖啶酮基)-乙醇与三聚氯氰之间的质量比为2-2.5∶1，搅拌反应16-24小时得目标产物。

本发明经上述步骤制备的目标产物经重结晶纯化即可用于衍生化反应实验。

本发明制备的2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪与已有的荧光试剂相比，具有更强的紫外吸收，更长的激发和发射波长(激发波长404nm；发射波长440nm)；激发和发射波长显著红移；摩尔吸光系数及量子效率皆大于文献报道的相关荧光试剂。由于在2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪分子中存在N原子介入的大π键，同时乙氧基-4，6-二氯三嗪的协同效应，使其激发和发射波长显著红移，分子的摩尔吸光度增大，水溶性增强。此外，由于乙氧基-4，6-二氯三嗪的适宜反应性和稳定性，使其更适宜于作为荧光衍生化试剂，用于非荧光样品的荧光检测，可较大地提高样品的检测灵敏度。本发明的荧光试剂可作为一般的荧光试剂使用，更适用于作为高效液相色谱柱前或柱后荧光衍生化试剂。在流动相较宽的浓度范围内，量子效率变化幅度小。

本发明制备的荧光试剂荧光强度较大，试剂反应活性高，衍生化速度快，衍生产物稳定，荧光量子效率高。

本发明的制备条件要求不苛刻。由于激发和发射波长的显著红移，使检测过程中溶剂组成引起的背景干扰降低。洗脱前后组分检测灵敏度小，产物可以马上用于色谱分析，而且不用进一步还原。

本发明制备和荧光试剂可以作为荧光、紫外衍生试剂用于色谱分析中，能极大的提高检测灵敏度和改善分离，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪对16种脂肪胺进行柱前衍生荧光检测色谱图，图中峰值序号分别代表：1.甲胺；2.乙胺；3.二甲胺；4.正丙胺；5.正丁胺；6.3-甲基-异丁胺；7.正戊胺；8.正己胺；9.正庚胺、10.正辛胺；11.正壬胺；12.正癸胺；13.正十一胺；14.正十二胺；15.正十三胺；16.正十四胺。

具体实施方式

500mL烧瓶中加入46g的邻位苯甲酸苯胺和100mL浓硫酸，在沸水浴中加热中加热4小时，然后倒入1升的烧杯中，注意使反应液沿器壁流下，减少溶液的溅出。煮沸5min后，将黄色沉淀滤出，滤集固体物用水充分洗涤，粗品吖啶酮在空气中晾干。

在500ml的圆底烧瓶中加入上述吖啶酮30g，二甲亚砜150mL，开动电磁搅拌并加热，在20分钟内将10g氢氧化钾分批加入，溶液温度保持100℃下加热回流搅拌30分钟，将40g的2-溴乙醇在1小时内加入，温度继续保持100℃下继续加热回流搅拌反应2.5小时，溶液逐渐转变为暗褐色。将烧瓶内混合物冷却至室温，反应完毕后，用旋转蒸发仪在油浴加热的条件下将溶剂蒸出，残余物用水洗三次，晾干后用苯加热至沸腾萃取，冷却后析出黄色絮状固体，抽滤后再用苯重结晶两次，得黄色针状晶体2-(N-吖啶酮基)-乙醇。

将10g三聚氯氰溶解在100ml二氯甲烷中，倒入500ml的三颈烧瓶中，在电磁搅拌和冰盐浴的条件下，将上述25g 2-(N-吖啶酮基)-乙醇溶解在40ml的二氯甲烷中保持0～5℃电磁搅拌16小时，慢慢将反应液温度升至室温保持10小时，反应完毕，用旋转蒸发仪将溶剂蒸出，得到黄色固体样品。再用苯中重结晶，产品为黄色针状晶体。

试剂操作条件及效果：

2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪溶液：准确称取38.7mg2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪加入10mL容量瓶中，用无水乙腈稀释至刻度，浓度为1.0×10^-2mol/L。

硼酸盐缓冲溶液：准确称取19.08g硼砂，用盐酸调节pH＝9.0，定容在250mL容量瓶中，浓度为0.2mol/L，其它不同pH的硼酸盐缓冲溶液用此溶液调节。

16种脂肪胺溶液：准确称取一定量的16种脂肪胺置入10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，总浓度为1.0×10^-3mol/L。

衍生化过程：

取脂肪胺标准品混合液(总浓度约为1×10^-3mol/L)100μL，室温下加入等体积的硼酸缓冲液(0.2mol/L，pH为9.0)，然后加入等体积的2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪溶液(1.0×10^-2mol/L)，50℃水浴加热反应0.5小时，取10μL稀释至200μL，进样5μL。按如下色谱分离条件进行实验，结果见图1。

色谱分离条件：

流动相A：20％(乙腈/水，v/v)，流动相B：乙腈；梯度条件：0min＝100％A，20min＝60％A，70min＝0％A；流速：1mL/min；柱温：室温；衍生物的荧光激发和发射波长为λex/λem＝404/440nm；色谱柱250×4.6mm(i.d)Hypersil BDS C18(大连依利特科学仪器有限公司)。

附表1

相关文献研究的化合物结构及标题

Claims (5)

1.一种荧光试剂的制备方法，其主要步骤是：

a)以邻位苯甲酸苯胺为合成母体，在浓硫酸作用下，于沸水浴中回流加热2-4小时，滤出沉淀，水洗，产物吖啶酮在空气中晾干；其中邻位苯甲酸苯胺与浓硫酸之间的质量比为1∶3-4；

b)以氢氧化钾为催化剂，步骤a)制备的吖啶酮与2-溴乙醇在二甲基亚砜溶剂中反应得2-(N-吖啶酮基)-乙醇；其中吖啶酮、2-溴乙醇及氢氧化钾之间的质量比为2-3∶3-4∶1；反应温度100℃，反应时间4-6小时；却至室温，蒸出溶剂，残余物水洗，晾干后用苯加热至沸腾萃取，冷却后析出固体2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪；

c)步骤b)制备的固体2-(N-吖啶酮基)-乙醇与三聚氯氰在二氯甲烷溶液中，0-5℃搅拌反应16-24小时，蒸出溶剂，得目标产物2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪；其中固体2-(N-吖啶酮基)-乙醇与三聚氯氰之间的质量比为2-2.5∶1。

2.权利要求1的方法，其特征在于，步骤b)制得的2-(N-吖啶酮基)-乙醇用苯重结晶，再进行步骤c)。

3.权利要求1的方法，其特征在于，步骤c)中0-5℃反应后，将反应液升至室温保持10小时，再蒸出溶剂。

4.权利要求1的方法，其特征在于，步骤c)得到的目标产物2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪用苯重结晶。

5.权利要求1制备的2-(N-吖啶酮)-乙氧基-4，6-二氯三嗪用作液相色谱衍生化试剂。

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