JP2000507444A - 細胞工学および代謝工学のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的に、本明細書中で循環的配列組換えと呼ばれるプロセスによる新たな代謝経路の進化およびバイオプロセスの増強に関する。循環的配列組換えは、個々の遺伝子、プラスミド全体またはウイルス、多重遺伝子クラスター、またはゲノム全体でさえも「進化」させるために、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復サイクルを行うことを必要とする。このような技術は、代謝工学の従来の方法に必要とされる広範囲な分析および計算を必要としない。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞工学および代謝工学のための方法および組成物 本願は、1996年3月25日に出願された米国特許出願第08/621,859号、1996年3月 25日に出願された同第08/621,430号、1995年4月18日に出願された同第08/425,68 4号、および1996年5月20日に出願された同第08/650,400号の一部継続出願である 。これらの明細書は、すべての目的のためにそれらの全体が本明細書中に参考と して援用される。 発明の背景 代謝工学は、古典的遺伝学と遺伝子操作技術の両方の使用による中間代謝の操 作である。細胞工学は、一般的に、細胞特性の改変を言及する、より包括的な用 語である。Cameronら（Applied Biochem．Biotech．38:105-140(1993))は、この タイプの工学を説明するための等価な用語（工業微生物学およびバイオプロセス 工学において最もよく使用される「代謝工学」、環境微生物学において最もよく 使用される「インビトロ進化」または「特異的進化(directede volution)」、日 本人研究者により最もよく使用される「分子交配」、細菌、動物、および植物細 胞の改変を説明するために使用される「細胞工学」、「合理的株開発（rational strain development）」、ならびに「代謝経路進化」を含む）の概要を提供す る。本願において、用語「代謝工学」および「細胞工学」は、明瞭化のために優 先的に使用される；用語「進化」遺伝子は、以下に記載のように使用される。 代謝工学は、２つの基本的なカテゴリーに分けられ得る：代謝産物の流れを変 えるための宿主生物に内因的な遺伝子の改変および外来遺伝子の生物への導入。 このような導入は、改変された細胞特性（宿主細胞により通常作られない既知化 合物の合成、新規化合物（例えば、ポリマー、抗生物質など）の生成、および新 規の栄養供給源を利用する能力を含むが、これらに限定されない）を導く新規の 代謝経路を生じ得る。代謝工学の特定の適用は、特製品および新規化学 物質（抗生物質を含む）の生成、増殖および産物形成のために使用される基質の 範囲の拡大、毒性化学物質分解のための生物における新規異化活性の生成、なら びに塩および他の環境因子に対する耐性のような細胞特性の改変を含み得る。 Bailey(Science 252:1668-1674(1991))は、株の改良のための異種遺伝子の補 充(recruitment)への代謝工学の適用を記載し、このような導入が、後にさらな る反応を受け得る新規化合物を生じ得るか、あるいは異種タンパク質の発現が、 タンパク質のタンパク質分解、不適当なフォールディング、不適当な修飾、また は不適切な細胞内位置、または必要とされる基質への接近の欠如を生じ得ること を予告している。Baileyは、宿主への最小の不安(perturbation)を有する所望の 遺伝子変化の注意深い配置を推奨している。 Liao(Curr.Opin.Biotech．4:211-216(1993))は、代謝経路の数学的モデリング および解析を概説し、多くの場合において、酵素の速度論的パラメーターは利用 不可能であるか、または不正確であることを指摘している。 Stephanopoulosら（Trends.Biotechnol．11:392-396(1993)）は、細胞系の生 産性を改善するか、または重要な分岐点での制御構造は、流れの変化を阻止する ように進化している点で困難であるので、一次代謝経路を通る流れの徹底的な変 化をもたらす試みを記載している。彼らは、これらの代謝節(node)の同定および 特徴付けは、合理的(rational)代謝工学に欠くことができないと結論付けている 。同様に、Stephanopoulos(Curr.Opin.Biotech．5:196-200(1994))は、代謝工学 において「律速段階」を改変するよりむしろ、生体反応ネットワークの制御構造 を系統的に解明する必要があると結論付けている。 本発明は、一般に、本明細書中で循環的配列組換えと呼ばれるプロセスによる 新規代謝経路の進化およびバイオプロセシングの増強に関する。循環的配列組換 えは、個々の遺伝子、プラスミド全体またはウイルス、多重遺伝子クラスター、 またはゲノム全体でさえも「進化」させるために、組換えおよびスクリー−ニン グまたは選択の反復サイクルを行うことを必要とする(Stemmer，Bio/Technology 13:549-553(1995))。このような技術は、代謝工学の従来の方法に必要とされる 広範囲な分析および計算を必要としない。循環的配列組換えは、伝 統的な対様式(pairwise)組換え事象とは対照的に、最小数の選択サイクルで多数 の変異の組換えを可能にする。 従って、代謝工学および細胞工学は、多くの遺伝子産物と調節機構の相互作用 の特定の問題を提起し得るので、循環的配列組換え(RSR)技術は、これらのいず れかまたは全てにおける変異間の組換えを提供する特定の利点を提供し、それに より、結果が、増大した代謝産物の収量、酵素もしくは代謝経路全体の変化した 触媒活性もしくは基質特異性、または細胞の環境に対する変化した反応のいずれ にしても、異なる変異の組み合わせが所望の結果に影響し得る挙動を調べる非常 に迅速な方法を提供する。 発明の要旨 本発明の１つの局面は、細胞の生体触媒活性を進化させる方法であって、以下 の工程： （ａ）目的の反応を触媒する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子由来の少 なくとも第１のDNAセグメントと第２のDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝 子のライブラリーを生成する工程であって、これらのセグメントは少なくとも２ つのヌクレオチドにおいて互いに異なる、工程； （ｂ）野生型形態の遺伝子と比較して、細胞による目的の反応を触媒する増強 した能力を付与するライブラリーから、少なくとも１つの組換え遺伝子をスクリ ーニングする工程； （ｃ）少なくとも１つの組換え遺伝子由来のセグメントと、少なくとも１つの 遺伝子由来の、第１および第２のセグメントと同一かまたは異なるさらなるDNA セグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらなるライブラリーを生成する工程 ； （ｄ）以前の組換え遺伝子と比較して、細胞における目的の反応を触媒する増 強した能力を付与する組換え遺伝子のさらなるライブラリーから、少なくとも１ つのさらなる組換え遺伝子をスクリーニングする工程； （ｅ）必要であれば、さらなる組換え遺伝子が、細胞による目的の反応を触媒 する増強した能力の所望のレベルを付与するまで、（ｃ）および（ｄ）を繰 り返す工程、を包含する。 本発明の別の局面は、目的の反応を触媒する能力を付与する遺伝子を進化させ る方法であって、この方法は以下の工程： （１）目的の反応を触媒する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子由来の少 なくとも第１のDNAセグメントと第２のDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝 子のライブラリーを生成する工程であって、これらのセグメントは少なくとも２ つのヌクレオチドにおいて互いに異なる、工程； （２）野生型形態の前記遺伝子と比較して、目的の反応を触媒する増強した能 力を付与するライブラリーから少なくとも１つの遺伝子をスクリーニングする工 程； （３）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 少なくとも１つの遺伝子由来の、第１のセグメントおよび第２のセグメントと同 一かまたは異なるさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらな るライブラリーを生成する工程； （４）少なくとも１つのさらなる組換え遺伝子を、以前の組換え遺伝子と比較 して、目的の反応を触媒する増強した能力を付与する組換え遺伝子のさらなるラ イブラリーからスクリーニングする工程； （５）必要であれば、さらなる組換え遺伝子が、目的の反応を触媒する増強し た能力の所望のレベルを付与するまで、（３）および（４）を繰り返す工程、を 包含する。 本発明のさらなる局面は、細胞において新しい生物触媒活性を生じる方法であ り、この方法は以下の工程： （１）目的の第２の反応に関連する第１の反応を触媒する能力を付与する少な くとも１つの遺伝子由来の少なくとも第１のDNAセグメントと第２のDNAセグメン トとを組換えて、組換え遺伝子のライブラリーを生成する工程であって、これら のセグメントは少なくとも２つのヌクレオチドにおいて互いに異なる、工程； （２）野生型形態の前記遺伝子と比較して、目的の第２の反応を触媒する新た な能力を付与するライブラリーから少なくとも１つの遺伝子をスクリーニン グする工程； （３）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 少なくとも１つの遺伝子由来の、第１のセグメントおよび第２のセグメントと同 一かまたは異なるさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらな るライブラリーを生成する工程； （４）少なくとも１つのさらなる組換え遺伝子を、以前の組換え遺伝子と比較 して、前記細胞内で目的の第２の反応を触媒する最適化された能力を付与する組 換え遺伝子のさらなるライブラリーからスクリーニングする工程； （５）必要であれば、さらなる組換え遺伝子が、前記細胞内で目的の第２の反 応を触媒する所望のレベルの増強された能力を付与するまで、（３）および（４ ）を繰り返す工程、を包含する。 本発明の別の局面は細胞の改変形態であり、ここで、改変は、循環的配列組換 えにより進化させられた代謝経路を含む。 本発明のさらなる局面は、遺伝子産物の発現を最適化する方法であり、この方 法は以下の工程： （１）遺伝子産物を産生する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子由来の少 なくとも第１のDNAセグメントと第２のDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝 子のライブラリーを生成する工程であって、これらのセグメントは少なくとも２ つのヌクレオチドにおいて互いに異なる、工程； （２）少なくとも１つの組換え遺伝子を、野生型形態の前記遺伝子と比較して 、遺伝子産物の最適化された発現を付与するライブラリーからスクリーニングす る工程； （３）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 少なくとも１つの遺伝子由来の、第１のセグメントおよび第２のセグメントと同 一かまたは異なるさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらな るライブラリーを生成する工程； （４）少なくとも１つのさらなる組換え遺伝子を、以前の組換え遺伝子と比較 して、遺伝子産物を発現する最適化された能力を付与する組換え遺伝子のさらな るライブラリーからスクリーニングする工程； （５）必要であれば、さらなる組換え遺伝子が、遺伝子産物を発現する最適化 された能力の所望のレベルを付与するまで、（３）および（４）を繰り返す工程 、を包含する。 本発明のさらなる局面は、目的の化合物Ａのバイオセンサーを進化させる方法 であって、この方法は以下の工程： （１）関連化合物Ｂを検出する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子由来の 少なくとも第１のDNAセグメントと第２のDNAセグメントとを組換えて、組換え遺 伝子のライブラリーを生成する工程であって、これらのセグメントは少なくとも ２つのヌクレオチドにおいて互いに異なる、工程； （２）野生型形態の遺伝子と比較して、化合物Ａを検出する最適化された能力 を付与するライブラリーから、少なくとも１つの組換え遺伝子をスクリーニング する工程； （３）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 少なくとも１つの遺伝子由来の、第１のセグメントおよび第２のセグメントと同 一かまたは異なるさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらな るライブラリーを生成する工程； （４）少なくとも１つのさらなる組換え遺伝子を、以前の組換え遺伝子と比較 して、化合物Ａを検出する最適化された能力を付与する組換え遺伝子のさらなる ライブラリーからスクリーニングする工程； （５）必要であれば、さらなる組換え遺伝子が、化合物Ａを検出する最適化さ れた能力の所望のレベルを付与するまで、（３）および（４）を繰り返す工程、 を包含する。 図面の簡単な説明 図１は、インビトロ循環的配列組換えの概要を示す図である。 特定の実施態様の説明 本発明は、循環的配列組換えの技術を介する、代謝経路およびバイオプロセス 経路を進化させるための多くのストラテジーを提供する。１つのストラテジ ーは、１つの種において栄養供給源として目的の特定の基質を使用する能力を付 与する遺伝子を進化させて、その種におけるその基質のより効率的な使用、また は第２の種におけるその基質の匹敵するもしくはより効率的な使用のいずれかを 付与することを含む。別のストラテジーは、１種以上の生物において目的の化合 物を解毒する能力を付与する遺伝子を進化させることを含む。別のストラテジー は、起源宿主または新たな宿主のいずれかにおいて、化合物Ｂを生合成または分 解する能力について、化合物Ｂに関連する化合物Ａの生合成または分解のための 酵素または代謝経路を進化させることにより、新たな代謝経路を進化させること を含む。さらなるストラテジーは、特定の代謝産物または遺伝子産物のより効率 的な発現または最適化された発現のために、遺伝子または代謝経路を進化させる ことを含む。さらなるストラテジーは、所望の異種産物の発現のために宿主／ベ クター系を進化させることを含む。これらのストラテジーは、多段階経路におけ る全ての遺伝子、１つまたはいくつかの遺伝子、異なる生物由来の遺伝子、ある いは遺伝子の１つ以上のフラグメントを使用することを含み得る。 一般的に、ストラテジーは、異種細胞における機能の維持あるいは同種細胞ま たは異種細胞における機能の改善を可能にするために、遺伝子あるいはそのセグ メントの進化を含む。進化は、一般的に、循環的配列組換えと呼ばれる工程によ りもたらされる。循環的配列組換えは、以下にさらに詳細に記載されるように、 多くの異なるフォーマットおよびフォーマットの順列（permutation）において 達成され得る。これらのフォーマットは、いくつかの共通の原理を共有する。循 環的配列組換えは、分子の多様性を生じさせるために（すなわち、互いに実質的 な配列同一性を示すが、変異の存在で異なる核酸分子ファミリーの作製）、連続 サイクルの組換えを必要とする。それぞれの組換えサイクルの後に、所望の特徴 を有する分子についての少なくとも１サイクルのスクリーニングまたは選択が行 われる。１ラウンドで選択された分子は、次のラウンドで多様性を生じるための 出発物質を形成する。任意の所定のサイクルにおいて、組換えはインビボまたは インビトロで生じ得る。さらに、組換えから生じた多様性は、組換えのための基 質または組換え産物のいずれかに、変異誘発の以前 の方法（例えば、誤り易い（error-prone）PCRまたはカセット変異誘発、細菌ミ ューテーター株の継代、化学変異原での処理）を適用することにより、任意のサ イクルで増大され得る。I ．循環的配列組換えのためのフォーマット 時々DNAシャッフリングまたは分子交配として言及される循環的配列組換えの ためのいくつかのフォーマットおよび例は、同時継続出願である1996年3月25日 に出願された米国特許出願第08/621,430号；1995年２月17日に出願されたPCT/US 95/02126；および1996年３月25日に出願された出願第08/621,859号；1994年2月1 7日に出願された出願第08/198,431号；Stemmer，Science 270:1510（1995）;Ste mmerら、Gene 164:49-53(1995)；Stemmer，Bio/Technology 13:549-553(1995)； Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．91:10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370:389-391(1994)；Crameriら、Nature Medicine 2(1):1-3(1996)；Crameriら 、Nature Biotechnology 14:315-319(1996)において、本発明者らおよび共同研 究者により記載されている。これらのそれぞれは、全ての目的のためにその全体 が参考として援用される。（１）インビトロフォーマット インビトロでの循環的配列組換えのための１つのフォーマットを図１に示す。 組換えのための最初の基質は、関連配列のプールである。図１、パネルＡの×は 、配列が異なる場所を示す。配列はDNAまたはRNAであり得、そして組換えまたは 再アセンブリされる遺伝子またはDNAフラグメントのサイズに依存した種々の長 さであり得る。好ましくは、配列は50〜100kbである。 関連基質のプールは、図１、パネルＢに示されるように、通常ランダムに、約 ５bp〜約５kb以上のフラグメントにフラグメント化され得る。好ましくはランダ ムフラグメントのサイズは約10bp〜1000bpであり、より好ましくはDNAフラグメ ントのサイズは約20bp〜500bpである。基質は、多くの異なる方法（例えば、DNA seIもしくはRNAse消化、ランダム剪断(shearing)、または制限酵素消化）で消化 され得る。特定の長さまたは配列の核酸フラグメントの濃度は、しばしば、 総核酸の0.1重量％または１重量％未満である。混合物中の異なる特異的な核酸 フラグメントの数は、通常少なくとも約100、500、または1000である。 核酸フラグメントの混合集団を、約80℃〜100℃まで、より好ましくは90℃〜9 6℃まで加熱することにより変性し、一本鎖核酸フラグメントを形成させ、次い で再アニールする。次いで、他の一本鎖核酸フラグメントと配列同一性の領域を 有する一本鎖核酸フラグメントは、20℃〜75℃、好ましくは40℃〜65℃まで冷却 することにより再アニールされ得る。再生は、ポリエチレングリコール（「PEG 」）または塩の添加により促進され得る。塩濃度は、好ましくは０mM〜600mMで あり、より好ましくは塩濃度は10mM〜100mMである。塩は、(NH₄)₂SO₄、KCl、ま たはNaClのような塩であり得る。PEGの濃度は、好ましくは０％〜20％、より好 ましくは５％〜10％である。再アニールするフラグメントは、図１、パネルＣに 示されるように、異なる基質に由来し得る。 アニールした核酸フラグメントは、核酸ポリメラーゼ（例えば、TaqまたはKle now）およびdNTP（すなわち、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP）の存在下でイン キュベートされる。配列同一性の領域が大きい場合、Taqまたは他の高温ポリメ ラーゼが、45〜65℃のアニーリング温度で使用され得る。同一性の領域が小さい 場合、Klenowまたは他の低温ポリメラーゼが、20〜30℃のアニーリング温度で使 用され得る。ポリメラーゼは、アニーリングする前に、アニーリングと同時に、 またはアニーリング後に、ランダム核酸フラグメントに添加され得る。 ポリメラーゼの存在下でのランダム核酸フラグメントの変性、再生、およびイ ンキュベーションのサイクルは、時々、インビトロでの核酸の「シャッフリング 」として言及される。このサイクルは、所望の回数で繰り返される。好ましくは 、サイクルは２〜100回繰り返され、より好ましくは配列は10〜40回繰り返され る。得られた核酸は、図１、パネルＤに示されるように、約50bp〜約100bp、好 ましくは500bp〜50kbの二本鎖ポリヌクレオチドのファミリーである。この集団 は、実質的な配列同一性を示すが、またいくつかの位置で異なる出発基質の変異 型を表す。この集団は、出発基質より多くの数を有する。組換えから生じたフラ グメントの集団は、好ましくは最初にPCRにより増幅され、次いで適切なベクタ ーにクローニングされ、そして連結混合物が宿主細胞を形質転換す るために使用される。 インビトロシャッフリングのバリエーションにおいて、組換え基質のサブ配列 (subsequence)は、実質的な画分（代表的には、不完全に伸長した増幅産物の少 なくとも20％以上）を生成する条件下で、完全長配列を増幅することにより生成 され得る。不完全に伸長した増幅産物を含む増幅産物は変性され、そして少なく とも１つのさらなるサイクルの再アニーリングおよび増幅に供される。このバリ エーション（ここで、少なくとも１サイクルの再アニーリングおよび増幅が、不 完全に伸長した産物のうちの実質的な画分を提供する）は、「スタッタリング(s tuttering)」と呼ばれる。後の増幅回において、不完全に伸長した産物は、異な る配列関連テンプレート種とアニールし、そして伸長をプライムする。 さらなるバリエーションにおいて、少なくとも１サイクルの増幅は、関連配列 および異なる長さの重複一本鎖DNAフラグメントの回収を用いて行われ得る。各 フラグメントはハイブリダイズし、そして収集物から第２のフラグメントのポリ ヌクレオチド鎖伸長をプライムし、従って配列組換えポリヌクレオチドを形成し 得る。さらなるバリエーションにおいて、種々の長さの一本鎖DNAフラグメント は、第１のDNAテンプレート上でVent DNAポリメラーゼにより単一プライマーか ら生成され得る。一本鎖DNAフラグメントは、ウラシル含有環状一本鎖DNAからな る第２のKunkel型テンプレートのプライマーとして使用される。これは、第１の テンプレートの第２のテンプレートへの複合置換をもたらす（Levichkinら、Mol .Biology 29:572-577(1995)を参照のこと）。 遺伝子クラスター（例えば、ポリケチド合成（または任意の類似代謝反応を触 媒する任意の多酵素経路）に関与する遺伝子クラスター）は、それらがDNA相同 性を欠いていても、循環的配列組換えにより組換えられ得る。相同性は、PCRプ ライマーとして合成オリゴヌクレオチドを使用して導入され得る。増幅される遺 伝子の特定の配列に加えて、ある型の酵素（例えば、ポリケチド合成におけるア シルキャリアタンパク質）を増幅するために使用される全てのプライマーは、遺 伝子の5'側に20〜40塩基のさらなる配列（配列Ａ）および遺伝子の3'側に異なる 20〜40塩基配列（配列Ｂ）を含むように合成される。隣接遺伝子（こ の場合、ケトシンターゼ）は、配列Ｂの相補鎖（配列Ｂ'）を含む5'プライマー および異なる20〜40塩基配列（Ｃ）を含む３'プライマーを用いて増幅される。 同様に、次の隣接遺伝子（ケトレダクターゼ）のプライマーは、配列Ｃ'（Ｃに 相補的）およびＤを含む。５つの異なるポリケチド遺伝子クラスターがシャッフ ルされる場合、５つ全てのアシルキャリアタンパク質は、PCR増幅の後に配列Ａ およびＢに隣接される。このように、小さな領域の相同性が導入され、遺伝子ク ラスターを部位特異的組換えカセットにさせる。個々の遺伝子の最初の増幅後、 次いで、増幅された遺伝子は混合され、そしてプライマーレス(primerless)PCR に供され得る。５つ全てのアシルキャリアタンパク質遺伝子３'末端の配列Ｂは 、５つ全てのケトレダクターゼ遺伝子５'末端の配列Ｂ'とアニールし、そしてDN A合成をプライムし得る。このように、クラスター内の遺伝子の全ての可能な組 み合わせが得られ得る。オリゴヌクレオチドは、このような組換えが、上記の循 環的配列組換えのために十分な配列相同性なしに得られることを可能にする。機 能の相同性のみが、機能的遺伝子クラスターを生成するために必要とされる。 本方法はまた、任意の他のマルチサブユニット(multi-subunit)酵素の順列を 調べるのに有用である。サブユニットが新たな方法で組み合わされる場合に新た な機能を示す、複数のポリペプチドからなるこのような酵素の例は、ジオキシゲ ナーゼである。ビフェニルおよびトルエンジオキシゲナーゼの４つのタンパク質 サブユニット間の特異的組換えは、トリクロロエチレンに対する増大した活性を 有する機能的ジオキシゲナーゼを生成した（Furukawaら、J.Bacteriol．176:212 1-2123(1994)）。２つのジオキシゲナーゼ由来のサブユニットの組み合わせはま た、上記のジオキシゲナーゼのカセットシャッフリング、続いてトリクロロエチ レン分解についての選択により生成され得た。 いくつかのポリケチドシンターゼにおいて、アシルキャリアタンパク質、ケト シンターゼ、ケトレダクターゼなどの別々の機能は単一のポリペプチドに存在す る。これらの場合において、単一のポリペプチド内のドメインは、十分な相同性 が天然に存在しなくても、全遺伝子について上記のように相同性の領域を導入す ることによりシャッフルされ得る。この場合、連続オープンリーディ ングフレームの維持の拘束により、さらなる隣接配列をこのドメインに導入する ことが可能でなくてもよい。その代りに、シャッフルされるべき遺伝子の１つに よりコードされる第１のドメインの３'末端、および共にシャッフルされるべき 他の全ての遺伝子によりコードされる第２のドメインの５'末端に相同なオリゴ ヌクレオチドのグループが合成される。これは全てのドメインで繰り返され、従 って、タンパク質ドメイン間の組換えを可能にする配列を提供するが、一方それ らの順番を維持する。 カセットベース(cassette-based)組換え法は、１つ以上の遺伝子について遺伝 子フラグメント（DNase、物理的剪断、DNAスタッタリングなどにより生成される ）を含むことにより循環的配列組換えと組み合わされ得る。従って、（例えば、 ポリケチド合成のための）クラスター内の全遺伝子の異なる組み合わせに加えて 、個々の遺伝子が同時にシャッフリングされ得（例えば、全てのアシルキャリア タンパク質遺伝子もまた、フラグメント化DNAとして提供され得る）、これは配 列空間のより完全な調査を可能にする。（２）インビボフォーマット （ａ）プラスミド−プラスミド組換え 組換えの最初の基質は、遺伝子の改変体形態を含むポリヌクレオチドの収集物 である。改変体形態は、通常、基質間の相同組換えを可能にするのに十分な実質 的な配列同一性を互いに示す。ポリヌクレオチド間の多様性は、天然であり得る か（例えば、対立遺伝子または種改変体）、誘導され得るか（例えば、誤り易い PCRまたは誤りがちな循環的配列組換え）、またはインビトロ組換えの結果であ り得る。多様性はまた、選択的(alternative)コドン使用頻度での、天然タンパ ク質をコードする遺伝子の再合成から生じ得る。組換えが、出発物質より多様な 産物を生じ得る基質間で少なくとも十分な多様性が存在すべきである。少なくと も２つの位置で異なる少なくとも２つの基質が存在しなければならない。しかし 、一般的に、10³〜10⁸メンバーの基質のライブラリーが使用される。多様性の程 度は、組換えられる基質の長さ、および進化される機能の変化の程度に依存する 。0.1〜25％の位置での多様性が代表的である。多様な基質が プラスミドに組み込まれる。プラスミドは、しばしば標準的なクローニングベク ター（例えば、細菌性マルチコピープラスミド）である。しかし、以下に記載さ れるいくつかの方法において、プラスミドは、MOB機能を含む。基質は、同一ま たは異なるプラスミドに組み込まれ得る。しばしば、異なる型の選択マーカーを 有する少なくとも２つの異なる型のプラスミドは、少なくとも２つの型のベクタ ーを含む細胞についての選択を可能にするために使用される。また、異なる型の プラスミドが使用される場合、異なるプラスミドは、細胞内での２つの異なるプ ラスミドの安定な共存を可能にするために２つの異なる不適合性群から生じ得る 。それにもかかわらず、同じ不適合性群由来のプラスミドは、相同組換えが起こ るのに十分な時間の間、同じ細胞内になお共存し得る。 多様な基質を含むプラスミドは、任意の方法（例えば、化学的形質転換、天然 のコンピテンス、エレクトロポレーション、微粒子銃、ファージまたはウイルス 系へのパッケージング）により細胞に最初に導入される。しばしば、プラスミド は、１より多いプラスミドが同じ細胞に侵入する確率を増大するために、（最大 トランスフェクション能について）飽和濃度でまたはその近くで存在する。種々 の基質を含むプラスミドは、同時にまたは複数ラウンドでトランスフェクトされ 得る。例えば、トランスフェクタントは選択および増殖され、次いでプラスミド の第２のアリコートで感染させられる。 プラスミドを細胞に導入すると、組換え遺伝子を生成するための基質間の組換 えが、単に細胞を増殖させることにより、複数の異なるプラスミドを含む細胞内 で起こる。しかし、１つのプラスミドのみを受けた細胞は、組換えに参加し得ず に、そして進化に対するこのようなプラスミド上での基質の潜在的な寄与は、十 分に活用されない（しかし、これらのプラスミドは、変異誘発遺伝子細胞内で増 殖される場合、ある程度まで寄与し得る）。進化の速度は、全ての基質を組換え に参加させることにより増大され得る。これは、トランスフェクトした細胞をエ レクトロポレーションに供することにより達成され得る。エレクトロポレーショ ンの条件は、外因性DNAを細胞に導入するために従来使用されている条件と同一 である（例えば、1,000〜2,500ボルト、400μF、および１〜２mM gap）。これら の条件下で、プラスミドは細胞間で交換され、全ての基質 が組換えに参加することが可能になる。さらに、組換え産物は、互いにまたは最 初の基質とさらなるラウンドの組換えを受け得る。進化の速度はまた、接合性移 入の使用により増大され得る。接合性移入を利用するために、基質はMOB遺伝子 を有するプラスミドにクローニングされ得、そしてtra遺伝子もまた、MOB遺伝子 に対してシスまたはトランスに提供される。接合性移入の効果は、単に培養物を 増殖することにより、プラスミドが細胞間で動くのを可能にし、そして任意の基 質および以前の組換え産物間の組換えが起こるのを可能にする点で、エレクトロ ポレーションと非常に類似している。進化の速度もまた、細胞を融合して、プラ スミドまたは染色体の交換を誘導することより増大され得る。融合は、化学薬品 （例えば、PEG）またはウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザウイルス 赤血球凝集素、HSV-1 gB、およびgD）により誘導され得る。進化の速度はまた、 変異誘発遺伝子宿主細胞（例えば、細菌におけるMut L、S、D、T、H、およびAta xia telangiectasiaヒト細胞株）の使用により増大され得る。 もちろん、細胞が増殖し、組換えが起こる時間は、細胞型で変化するが、一般 的に重要ではない。なぜなら、小さな程度の組換えでさえも、出発物質と比較し て実質的に多様性を増大し得るからである。組換え遺伝子を含むプラスミドを有 する細胞は、所望の機能についてのスクリーニングまたは選択に供される。例え ば、進化される基質が薬物耐性遺伝子を含む場合、薬物耐性について選択する。 スクリーニングまたは選択を生き残った細胞は、１ラウンド以上のスクリーニン グ／選択、続いて組換えに供され得るか、またはさらなるラウンドの組換えに直 接供され得る。 組換えの次ラウンドは、以前のラウンドとは独立して、いくつかの異なるフォ ーマットにより達成され得る。例えば、組換えのさらなるラウンドは、上記のプ ラスミドのエレクトロポレーションまたは接合媒介細胞内移入を単に再開するこ とによりもたらされ得る。あるいは、以前の基質と同一であるかまたは異なる新 鮮な基質が、選択／スクリーニングを生き残った細胞中にトランスフェクトされ 得る。必要に応じて、新たな基質が、異なる選択マーカーを有し、そして／また は最初のプラスミドとは異なる不適合性群由来のプラスミドベクターに含まれる 。さらなる代替物として、選択／スクリーニングを生き残った 細胞は、２つの亜集団にさらに分けられ得、そして１つの亜集団由来のプラスミ ドDNAはもう１つの亜集団にトランスフェクトされ、ここで２つの亜集団由来の プラスミドからの基質はさらなるラウンドの組換えを受ける。最後の２つのオプ ションのいずれかにおいて、進化の速度は、上記のようなDNA抽出、エレクトロ ポレーション、接合、または変異誘発遺伝子細胞を使用することにより増大され 得る。なおさらなるバリエーションにおいて、スクリーニング／選択を生き残っ た細胞由来のDNAが抽出され、そしてインビトロDNAシャッフリングに供され得る 。 組換えの第２のラウンドの後、スクリーニング／選択の第２ラウンドは、好ま しくは増大したストリンジェンシーの条件下で行われる。所望であれば、さらな るラウンドの組換えおよび選択／スクリーニングが、第２ラウンドと同じストラ テジーを用いて行われ得る。連続ラウンドの組換えおよび選択／スクリーニング の連続的なラウンドを用いて、生き残った組換え基質は、所望の表現型の獲得に 向かって進化する。代表的には、循環的組換えのこの方法および他の方法におい て、所望の表現型を獲得した組換えの最終産物は、0.1〜25％の位置で出発基質 とは異なり、そして天然に獲得される変異速度（約１変異/10^-9位置/世代）の（ 例えば、少なくとも10倍、100倍、1000倍、または10,000倍）過剰な大きさの速 度オーダーで進化した（AndersonおよびHuges、Proc．Natl．Acad．Sci．US A93 :906-907(1996)を参照のこと）。「最終産物」は、「シャッフルされた」DNAの 利用のためにより所望される別の宿主に移入され得る。これは、より所望される 宿主が、E.coliのような他の生物に利用可能な分子生物学または遺伝子ツールを 欠くことにより、多くの変異／組換えのサイクルに対して宿主としてあまり効率 的でない状況において特に有利である。 （ｂ）ウイルス−プラスミド組換え プラスミド−プラスミド組換えに使用されるストラテジーはまた、ウイルス− プラスミド組換え；通常、ファージ−プラスミド組換えに使用され得る。しかし 、ウイルスの使用に詳細ないくつかのさらなるコメントが適当である。組換えの ための最初の基質は、プラスミドおよびウイルスベクターの両方にクロ ーニングされる。通常、どの基質がウイルスベクターに挿入されるか、そしてど れがプラスミドに挿入されるかは重要ではないが、通常、ウイルスベクターはプ ラスミドとは異なる基質を含むべきである。上記のように、プラスミド（および ウイルス）は、代表的には選択マーカーを含む。プラスミドおよびウイルスベク ターの両方は、上記のようなトランスフェクションにより細胞に導入され得る。 しかし、より効率的な手順は、細胞をプラスミドでトランスフェクトし、トラン スフェクタントを選択し、そしてこのトランスフェクタントをウイルスで感染さ せることである。多くのウイルスの感染効率は、ほぼ100％の細胞に近づくので 、この経路によりトランスフェクトおよび感染されたほとんどの細胞は、異なる 基質を有するプラスミドおよびウイルスの両方を含む。 相同組換えはプラスミドとウイルスとの間で起こり、組換えプラスミドおよび 組換えウイルスの両方を生成する。いくつかのウイルス（例えば、繊維状ファー ジ）については、細胞内DNAが二本鎖と一本鎖形態の両方で存在する場合、その 両方が組換えに参加し得る。ウイルスが迅速に細胞を殺傷するウイルスでなけれ ば、組換えは、細胞間でプラスミドを移入するためのエレクトロポレーションま たは接合の使用により増大され得る。組換えはまた、１つの細胞由来の子孫ウイ ルスを他の細胞に再感染させることにより、いくつかの型のウイルスについて増 大され得る。いくつかの型のウイルスについて、ウイルス感染細胞は、重感染に 対する耐性を示す。しかし、このような耐性は、高多重度での感染および／また は重感染に対する耐性が低減したウイルスの変異株の使用により克服され得る。 プラスミド含有細胞をウイルスで感染させる結果は、ウイルスの性質に依存す る。いくつかのウイルス（例えば、繊維状ファージ）は、細胞内で安定にプラス ミドと存在し、そして細胞からの子孫ファージを押し出しもする。他のウイルス （例えば、コスミドゲノムを有するλ）は、子孫ビリオンを産生することなくプ ラスミドのように細胞内で安定に存在する。他のウイルス（例えば、Ｔファージ および溶菌λ）は、プラスミドとの組換えを受けるが、最終的に宿主細胞を殺傷 し、そしてプラスミドDNAを破壊する。宿主を殺傷することなく細胞に感染する ウイルスについて、組換えプラスミドおよびウイルスを含む細胞 は、プラスミド−プラスミド組換えと同じアプローチを用いてスクリーニング／ 選択され得る。選択／スクリーニングに生き残った細胞により押し出された子孫 ウイルスはまた回収され、そして後のラウンドの組換えにおける基質として使用 され得る。宿主細胞を殺傷するウイルスについて、組換えから生じた組換え遺伝 子は、子孫ウイルスのみに存在する。スクリーニングまたは選択アッセイが細胞 における組換え遺伝子の発現を必要とする場合、組換え遺伝子は、子孫ウイルス から別のベクター（例えば、プラスミドベクター）に移され、そして選択／スク リーニングが行われる前に細胞に再トランスフェクトされるべきである。 繊維状ファージについて、組換え産物は、組換えに生き残った細胞およびこれ らの細胞から押し出されたファージの両方に存在する。組換え産物の２重の供給 源は、プラスミド−プラスミド組換えと比較して、いつくかのさらなるオプショ ンを提供する。例えば、DNAは、インビトロ組換えのラウンドにおける使用のた めにファージ粒子から単離され得る。あるいは、子孫ファージは、スクリーニン グ／選択の以前のラウンドに生き残った細胞、または組換えのための新鮮な基質 でトランスフェクトされる新鮮な細胞をトランスフェクトまたは感染するために 使用され得る。 （ｃ）ウイルス−ウイルス組換え プラスミド−プラスミド、およびプラスミド−ウイルス組換えについて記載さ れた原理は、２、３の改変と共にウイルス−ウイルス組換えに適用され得る。組 換えのための最初の基質は、ウイルスベクターにクローニングされる。通常、同 じベクターがすべての基質について使用される。好ましくは、ウイルスは、天然 にまたは変異の結果として細胞を死滅させないウイルスである。挿入の後、いく つかのウイルスゲノムは、インビトロでまたはパッケージング細胞株を用いてパ ッケージングされ得る。パッケージングされたウイルスは、高多重度で細胞に感 染するために使用され、その結果、細胞が異なる基質を有する複数のウイルスを 受ける高い確率が存在する。 感染の最初のラウンドの後、後の工程は、前の節で議論された感染の性質に 依存する。例えば、ウイルスがファージミドゲノム（例えば、λコスミドまたは M13、F1、またはFdファージミド）を有する場合、ファージミドは細胞内でプラ スミドのように振る舞い、そして細胞を単に増殖させることにより組換えを受け る。組換えは、細胞内DNAの一本鎖形態間で特に効率的である。組換えは、細胞 のエレクトロポレーションにより増大され得る。 選択／スクリーニングの後、組換え遺伝子を含むコスミドは、生き残った細胞 から（例えば、cos^-溶原宿主細胞の熱誘導により）回収され、インビトロで再パ ッケージングされ、そしてさらなるラウンドの組換えのために高多重度で新鮮な 細胞に感染するために使用され得る。 ウイルスが繊維状ファージである場合、複製形態DNAの組換えは、感染された 細胞の培養物を増殖させることにより起こる。選択／スクリーニングは、このよ うな細胞から押し出されたファージと共に、改善した特性を有する組換え遺伝子 を有するウイルスベクターを含む細胞のコロニーを同定する。後のオプションは 、本質的にプラスミド−ウイルス組換えと同じである。 （ｄ）染色体組換え このフォーマットは、染色体由来基質およびプラスミド由来基質の両方を進化 させるために使用され得る。このフォーマットは、特に、多くの染色体遺伝子が 表現型に寄与するか、または進化されるべき染色体遺伝子の正確な位置が知られ ていない状況において特に有用である。組換えのための最初の基質は、プラスミ ドベクターにクローニングされる。進化されるべき染色体遺伝子が既知の場合、 基質は、高度の配列同一性を示すが、染色体遺伝子とはいくつかの相違を示す配 列のファミリーを構成する。進化されるべき染色体遺伝子が位置されていない場 合、最初の基質は、通常、DNAセグメントの少数のみが進化されるべき遺伝子に 対して配列同一性を示すライブラリーを構成する。プラスミド保持基質と染色体 遺伝子との間の相違は、変異誘発、または染色体を有する細胞のものとは異なる 種からプラスミド保持基質を得ることによりにより誘導され得る。 組換えのための基質を有するプラスミドは、進化されるべき染色体遺伝子（単 数または複数）を有する細胞にトランスフェクトされる。進化は、単に培養物を 増殖させることにより起こり得、そして接合またはエレクトロポレーションによ り細胞間でプラスミドを移入することにより促進され得る。進化は、変異誘発遺 伝子宿主細胞の使用により、または変異誘発遺伝子宿主細胞と進化される非変異 誘発遺伝子宿主細胞の培養物を播種し、そしてエレクトロポレーションまたは接 合によるプラスミドの細胞内移入を誘導させることによりさらに促進され得る。 好ましくは、播種に使用される変異誘発遺伝子宿主細胞は、進化される非変異誘 発遺伝子細胞の純粋な培養物の単離を容易にするネガティブ選択マーカーを含む 。選択／スクリーニングは、所望の機能の獲得に向かって進化した染色体および ／またはプラスミドを有する細胞を同定する。 組換えおよび選択／スクリーニングの引き続くラウンドは、プラスミド−プラ スミド組換えについて記載された様式と同様の様式で進行する。例えば、さらな る組換えは、プラスミドのエレクトロポレーションまたは接合性移入と組み合わ せて、組換えを生き残った細胞を増殖させることによりなされ得る。あるいは、 組換えのためのさらなる基質を有するプラスミドは、生き残った細胞に導入され 得る。好ましくは、このようなプラスミドは、異なる不適合性群由来であり、そ して少なくとも２つの異なるプラスミドを含む細胞についての選択を可能にする 最初のプラスミドとは異なる選択マーカーを有する。さらなる代替物として、プ ラスミドおよび／または染色体DNAは、生き残った細胞の亜集団から単離され、 そして第２の亜集団にトランスフェクトされ得る。染色体DNAは、トランスフェ クション前にプラスミドベクターにクローニングされ得る。 （ｅ）ウイルス−染色体組換え 上記の他の方法と同様に、ウイルスは、通常細胞を死滅させないウイルスであ り、そしてしばしばファージまたはファージミドである。手順は、実質的に、プ ラスミド−染色体組換えと同一である。組換えのための基質は、ベクターにクロ ーニングされる。次いで、基質を含むベクターは、細胞にトランスフェクトされ 得るか、またはインビトロでパッケージングされて感染により細胞に導入され得 る。ウイルスゲノムは、単に培養物を増殖させることにより宿主染色 体と組換えを行う。進化は、エレクトロポレーションによりウイルスゲノムを細 胞内移入させるか、または子孫ビリオンによる細胞の再感染により促進され得る 。スクリーニング／選択は、所望の機能の獲得に向かって進化した染色体および ／またはウイルスゲノムを有する細胞を同定する。 後のラウンドの組換えについていつくかのオプションがある。例えば、ウイル スゲノムは、選択／組換えに生き残った細胞間でエレクトロポレーションにより トランスフェクトされ得る。あるいは、選択／スクリーニングを生き残った細胞 から押し出されたウイルスはプールされ得、そして高多重度で細胞を重感染する ために使用され得る。あるいは、組換えのための新鮮な基質は、プラスミドまた はウイルスベクター上のいずれかで細胞に導入され得る。II ．代謝工学および細胞工学のための循環的配列組換え技術 Ａ．出発物質 従って、本明細書中の実施態様のための循環的配列組換えの一般的な方法は、 酵素または酵素サブユニットをコードする遺伝子から始め、そして新規の基質に 作用する能力または元の基質との増強した触媒特性のいずれかについて、単独ま たは多段階経路における他の遺伝子との組み合わせのいずれかで、その遺伝子を 進化させることである。用語「遺伝子」は、生物学的機能に関するDNAの任意の セグメントまたは配列を言及するために本明細書中で広く使用される。遺伝子は 、種々の供給源から得られ得（目的の供給源からのクローニングまたは既知のも しくは推定される配列情報からの合成を含む）、そして所望のパラメーターを有 するように設計された配列を含み得る。新規の基質を使用する能力は、ある場合 には、栄養供給源としての基質上で増殖する能力によりアッセイされ得る。他の 情況において、このような能力は、宿主細胞に対する基質の低減した毒性（それ 故、宿主がその基質の存在下で増殖し得る）によりアッセイされ得る。新規化合 物（例えば、抗生物質）の生合成は、進化した遺伝子を発現する宿主の存在下で の指標生物の増殖により同様にアッセイされ得る。例えば、指標生物が、進化し た遺伝子を発現する宿主の重層(overlay)に使用される場合（ここで、指標生物 は、所望の抗生物質に対して感受性であるか、また は感受性であると期待される）、指標生物の増殖は、進化した遺伝子を発現する 宿主細胞またはコロニーの周囲の領域では阻害される。 新規の化合物を同定する別の方法は、標準的な分析技術（例えば、質量分析法 、核磁気共鳴法、高速液体クロマトグラフィーなど）の使用である。組換え微生 物はプールされ得、そしてこれらのプールからの抽出物または培地上清はアッセ イされる。次いで、任意のポジティブプールがさらに分けられ得、そしてこの手 順は単一のポジティブが同定されるまで繰り返される（「姉妹選択法」）。 ある場合には、循環的配列組換えのための出発物質は、特定のクラスの基質の 代謝に関連することが知られているかまたは考えられる、別々の遺伝子、遺伝子 クラスター、または遺伝子ファミリーである。 本発明の利点の１つは、機能的なハイブリッド酵素を生成するためにどの部分 の配列を変異させるべきであるのかを評価するために構造的情報が必要とされな いことである。 本発明のいくつかの実施態様において、特定のアッセイにおける酵素活性の最 初のスクリーニングは、出発物質としての候補酵素の同定に有用であり得る。例 えば、高スループットスクリーニングを使用して、基質として芳香族酸を使用す るジオキシゲナーゼ型の活性について酵素をスクリーニングし得る。代表的には 、ジオキシゲナーゼは、インドール-2-カルボキシレートおよびインドール-3-カ ルボキシレートを着色生成物（インジゴを含む）に変換する（Eatonら、J.Bacte riol．177:6983-6988(1995)）。次いで、最初のアッセイにおいていくらかの活 性を与える酵素をコードするDNAは、本発明の循環的技術により組換えられ、そ して再スクリーニングされ得る。所望の標的分子または標的分子のアナログに対 する候補酵素についてのこのような最初のスクリーニングの使用は、人工汚染物 質の異化のような目的の反応を触媒する酵素を作製するのに特に有用であり得る 。 この型の高スループットスクリーニングはまた、最高レベルの所望の活性を有 する変異体を同定するために、各ラウンドの循環的配列組換えの間に使用され得 る。例えば、ペニシリンＧアシラーゼは、ロイシン栄養要求体がペニシリ ンＧアナログであるフェニルアセチル-L-ロイシンを加水分解し、それによりロ イシンを生成し、そして細胞増殖を可能にするコロニーを探すことによって単離 された（Martn，L.ら、FEMS Microbiology Lett．125:287-292(1995)）。次いで 、この選択からのポジティブは、ペニシリンＧを加水分解する能力についてより 大きな労働力を要する方法によりスクリーニングされる。 フェニルアセチル-L-ロイシンでのこの同じ選択は、循環的配列組換えにより さらに大きな活性のためにペニシリンＧアシラーゼを進化させる場合に使用され 得る。各ラウンドの組換えの後、アシラーゼ遺伝子のライブラリーは、ロイシン 栄養要求体に形質転換される。最も早く増殖するものが、恐らく最も活性なアシ ラーゼを有するものとして拾われる。次いで、アシラーゼは、HPLCのようなより 骨の折れるスクリーニングにより、真の基質であるペニシリンＧに対して試験さ れる。従って、たとえ酵素または代謝経路についての便利な高スループットスク リーニングがないとしても、所望の表現型をほぼ測定し、それにより正確にスク リーニングされなければならないコロニーの数を減少させ得る迅速な検出法を見 出すことがしばしば可能である。 出発物質はまた、その周囲のDNAの単離において組換えられるが、組換え産物 のスクリーニング／選択の前にその周囲のDNAに再連結される、このような遺伝 子またはクラスターのセグメントであり得る。他の例において、組換えのための 出発物質は、コード配列または未知の位置での特定の基質の代謝と関連した他の 遺伝子座を含むより大きなDNAセグメントである。例えば、出発物質は、染色体 、エピソーム、YAC、コスミド、またはファージP1クローンであり得る。さらに 他の例において、出発物質は、所望の代謝特性を有することが知られているが、 これらの特徴に関連した遺伝子を局在化させる情報が利用可能でない生物の全ゲ ノムである。 一般的に、任意の型の細胞が、進化される遺伝子のレシピエントとして使用さ れ得る。特定の目的の細胞は、多くの細菌型細胞（グラム陰性およびグラム陽性 の両方（例えば、Rhodococcus、Streptomycetes、Actinomycetes、Corynebacter ia、Penicillium、Bacillus、Escherichia coli、Pseudomonas、Salmonella、お よびErwinia））を含む。目的の細胞はまた、真核生物細胞、特に哺乳動 物細胞（例えば、マウス、ハムスター、霊長類、ヒト）（細胞株および初代培養 物の両方）を含む。このような細胞は、幹細胞（胚幹細胞を含む）、接合子、線 維芽細胞、リンパ球、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、マウス線維芽細胞( NIH3T3)、腎臓細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、および皮膚細胞を含む。他の目的の 真核生物細胞は、植物細胞（例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、ワタ、ダイ ズ、サトウキビ、タバコ、およびアラビドプシス）；魚類、藻類、真菌(Penicil lium、Fusarium、Aspergillius、Podospora、Neurospora)、昆虫、酵母(Picchia およびSaccharomyces)を含む。 宿主の選択は、操作される宿主の意図される使用に依存した多くの因子（病原 性、基質範囲、環境忍耐(hardiness)、重要な中間体の存在、遺伝子操作の容易 さ、および遺伝情報の他の生物への無差別な移入の見込み）に依存する。特に有 利な宿主は、E.coli、lactobacilli、Streptomycetes、Actinomycetesおよびfil amentous fungiである。 交配手順は、互いに実質的な配列同一性（すなわち、少なくとも約50％、70％ 、80％、または90％の配列同一性）を一般的に示すが、特定の位置で互いに異な る、少なくとも２つの基質で始まる。この差異は、任意の型の変異（例えば、置 換、挿入、および欠失）であり得る。しばしば、異なるセグメントは、おそらく ５〜20の位置で互いに異なる。出発物質と比較して増大した多様性を生じるため の組換えのために、出発物質は、少なくとも２つのヌクレオチド位置で互いに異 ならなければならない。すなわち、２つしか置換がない場合、少なくとも２つの 互いに異なる位置にあるべきである。例えば、３つの基質がある場合、１つの基 質は、１つの位置で第２の基質と異なり得、そして第２の基質は、別の１つの位 置で第３の基質とは異なり得る。出発DNAセグメントは、互いの天然の改変体（ 例えば、対立遺伝子または種改変体）であり得る。セグメントはまた、ある程度 の構造的関係および通常には機能的関係を示す非対立遺伝子（例えば、免疫ブロ ブリンスーパーファミリーのようなスーパーファミリー内の異なる遺伝子）由来 であり得る。出発DNAセグメントはまた、互いの誘導された改変体であり得る。 例えば、１つのDNAセグメントは、他のDNAセグメントの誤り易いPCR複製により 、または変異原性カセットの置換により生成され得る。誘導 された変異体はまた、変異原性株において１つ（または両方の）セグメントを増 殖することにより調製され得る。これらの情況において、厳密に言えば、第２の DNAセグメントは、単一のセグメントではないが、関連セグメントの大きなフア ミリーである。出発物質を形成する異なるセグメントは、しばしば同じ長さであ るか、または実質的に同じ長さである。しかし、必ずしも行である必要はない。 例えば、１つのセグメントは、別のセグメントの部分配列であり得る。セグメン トは、より大きな分子（例えば、ベクター）の一部として存在し得るか、または 単離形態であり得る。 出発DNAセグメントは、上記の循環的配列組換えのいずれかのフォーマットに より組換えられ、組換えDNAセグメントの多様なライブラリーが作製される。こ のようなライブラリーは、サイズが10未満から10⁵、10⁷、または10⁹を超えるメ ンバーまで広範に変化し得る。一般的に、出発セグメントおよび作製される組換 えライブラリーは、完全長のコード配列および任意の必須の調節配列（例えば、 発現に必要とされるプロモーターおよびポリアデニル化配列）を含む。しかし、 こうでない場合には、ライブラリー中の組換えDNAセグメントは、スクリーニン グ／選択を行う前に欠けた配列を提供する共通のベクターに挿入され得る。 使用される循環的配列組換えフォーマットがインビボフォーマットである場合 、作製される組換えDNAセグメントのライブラリーは、細胞内に既に存在する。 この細胞は、通常、基質特異性が変化した酵素の発現が所望される細胞型である 。循環的配列組換えがインビトロで行われる場合、組換えライブラリーは、スク リーニング／選択前に所望の細胞型に導入されるべきである。組換えライブラリ ーのメンバーは、導入前にエピソームまたはウイルスに連結される得るか、また は直接導入され得る。ライブラリーが細胞型に導入される様式は、細胞型のDNA 取り込み特徴に依存する。例えば、この細胞型が、天然および化学誘導コンピテ ンスに対して不感受性であるが、エレクトロポレーションに感受性である場合、 通常エレクトロポレーションを使用する。細胞型が同様にエレクトロポレーショ ンに不感受性である場合、微粒子銃を使用し得る。微粒子銃PDS-1000 Gene Gun( Biorad，Hercules，CA)は、DNAをコートした金またはタングステンのマイクロキ ャリアを標的細胞に向けて加速させるためにヘリウム圧を使 用する。このプロセスは、広範な組織（植物、細菌、真菌、藻類、インタクトな 動物組織、組織培養細胞、および動物胚を含む）に適用可能である。あるいは、 電気パルス送達を使用し得、これは、本質的に、動物および患者の生組織に対し て穏やかなエレクトロポレーションフォーマットである。Zhao，Advanced Drug Delivery Reviews 17，257-262(1995)。細胞をコンピテントにする新たな方法は 、1996年３月25日に出願された、同時係属中の米国特許出願第08/621,430号に記 載される。組換えDNA遺伝子のライブラリーの導入後、細胞は、遺伝子の発現を 生じさせるために必要に応じて増殖される。Ｂ．選択およびスクリーニング 一般的に、スクリーニングは２段階プロセスである。ここで、最初にどの細胞 がスクリーニングマーカーを発現し、発現しないのか決定し、そして所望の特性 を有する細胞を物理的に分ける。選択は、例えば、いくつかの遺伝子環境におい て、マーカーを発現する細胞を生存させ、一方他の細胞を死滅させる（または、 逆もまた同じ）選択マーカーの発現により、同定および物理的分離が同時に達成 されるスクリーニングの形態である。スクリーニングマーカーは、例えば、ルシ フェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、および緑色蛍光タンパク質を含む。スクリ ーニングはまた、コロニーサイズ、ハロ（halo）形成などのような増殖の局面を 観察することにより行われ得る。さらに、所望の化合物（例えば、治療薬物）の 生成のためのスクリーニングまたは「デザイナー化学(designer chemical)」は 、細胞産物のレセプターまたはリガンド（例えば、固体支持体またはカラム上の ）への結合を観察することにより達成され得る。このようなスクリーニングは、 さらに、ELISAのように抗体への結合により達成され得る。いくつかの例におい て、スクリーニングプロセスは、好ましくは自動化されて、適切な数のコロニー または細胞のスクリーニングを可能にする。自動化スクリーニングデバイスのい くつかの例は、特にアガロースに固定化された細胞と組み合わせた蛍光活性化細 胞選別（Powellら、Bio/Technology ８:333-337(1990)；Weaverら、Methods ２: 234-247(1991)を参照のこと）、自動化ELISAアッセイ、シンチレーション近接ア ッセイ(Hart,H.E.ら、Molecular Immunol．16:265 -267(1979))、およびアガープレートまたはマイクロタイターウェル上での蛍光 、呈色、またはUV吸収化合物の形成（Krawiec,S.，Devel.Indust.Microbiology 31:103-114(1990)）を含む。選択マーカーは、例えば、薬物、毒素耐性、または 栄養分合成遺伝子を含み得る。選択はまた、基質を解毒する能力を有する宿主に ついて選択するための毒性基質上での増殖、栄養供給源を利用する能力を有する 宿主を選択するための新鮮な栄養供給源上での増殖、栄養供給源を利用する能力 に基づいた培養における競合増殖などのような技術により行われ得る。 特に、クローニングされていないが、ディファレンシャルに発現するタンパク 質（例えば、培地中の生分解性汚染物質のような新規の化合物に応答して誘導さ れるタンパク質）は、ディファレンシャルディスプレイ（Appleyardら、Mol.Gen .Gent. 247:338-342(1995)）によりスクリーニングされ得る。Hopwood（Phil Tr ans R.Soc.Lond B 324:549-562）は、抗生物質生成についてのスクリーニングの 概要を提供する。Omura（Microbio.Rev. 50:259-279(1986)およびNisbet(Ann Re p.Med.Chem. 21:149-157(1986))は、高感受性細菌、β-ラクタマーゼのおよびD, D-カルボキシペプチダーゼ阻害の検出、β-ラクタマーゼ誘導、色素原基質およ びモノクローナル抗体スクリーニングを含む、抗菌剤についてのスクリーニング を開示する。抗生物質標的はまた、高スループットスクリーニングにおけるスク リーニング標的として使用され得る。抗真菌剤は、代表的に、真菌増殖の阻害に よりスクリー−ニングされる。薬理学的薬剤は、酵素および色素原基質を含むプ レートを用いて、または自動化レセプターアッセイにより酵素インヒビターとし て同定され得る。加水分解酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ）は、アガ ープレートに基質を含ませて、加水分解した透明な領域をスコア付けすることに より、または比色インジケーターを用いることによりスクリーニングされ得る（ Steeleら、Ann.Rev.Microbiol. 45:89-106(1991)）。これは、酵素作用の効果を 検出するための染料（例えば、セルロースおよびヘミセルロースの分解の程度を 検出するためのコンゴレッド）の使用と組み合わされ得る。タグ化した基質もま た使用され得る。例えば、リパーゼおよびエステラーゼは、ウンベリフェリル(u mbelliferyl)に連結した異なる長さの脂肪酸を用いてスクリーニングされ得る。 リパーゼまたはエステラーゼの作用は、こ のタグを脂肪酸から取り除き、ウンベリフェリル蛍光のクエンチングまたは増強 をもたらす。これらの酵素は、ロボットデバイスによりマイクロタイタープレー トにおいてスクリーニングされ得る。 蛍光活性化細胞選別(FACS)法はまた、選択／スクリーニングのための強力なツ ールである。いくつかの例において、蛍光分子は細胞内で作られる（例えば、緑 色蛍光タンパク質）。このタンパク質を産生する細胞は、FACSにより単純に分類 され得る。ゲル微小滴（gel microdrop）技術は、アガロース微小滴に包まれた 細胞のスクリーニングを可能にする（Weaverら、Methods 2:234-247(1991)）。 この技術において、細胞により分泌された産物（例えば、抗体または抗原）は、 それらを生成した細胞内に固定化される。従って、所望の産物を含む滴の選別お よび回収はまた、産物を作った細胞を回収し、そして所望の機能をコードする遺 伝子のクローニングにそくざの供給源を提供する。所望の産物は、包まれた細胞 と蛍光抗体とをインキュベートすることにより検出され得る（Powellら、Bio/Te chnology 8:333-337(1990)）。FACS選別はまた、複数の細胞を含む小滴（すなわ ち、細胞傷害性化合物の存在下での連続分割の産物；Goguenら、Nature 363:186 -190(1995)）を選択することにより毒性化合物および抗生物質に対する耐性をア ッセイするこの技術により使用される。この方法は、アガロース小滴に固定化さ れ得る基質の蛍光を変え得る任意の酵素について選択し得る。 本発明のいくつかの実施態様において、スクリーニングは、遺伝子産物のよう な所望の特徴と反応するレポーター分子との反応性をアッセイすることにより達 成され得る。従って、抗原ドメインのような特定の機能性は、それらの決定基に 特異的な抗体を用いてスクリーニングされ得る。 本発明の他の実施態様において、スクリーニングは、好ましくは、細胞−細胞 インジケーターアッセイを用いて行われる。このアッセイフォーマットにおいて 、別々のライブラリー細胞（細胞Ａ、アッセイされる細胞）およびレポーター細 胞（細胞Ｂ、アッセイ細胞）が使用される。この系のただ１つの成分であるライ ブラリー細胞が進化させられる。スクリーニングは、一般的に、２次元固定化フ ォーマットにおいて（例えば、プレート上で）行われる。これらの 遺伝子によりコードされる代謝経路の産物（この場合、通常、二次代謝物（例え ば、抗生物質、ポリケチド、カロテノイドなど））は、ライブラリー細胞からレ ポーター細胞へ拡散する。ライブラリー細胞の産物は、多くの方法のうちの１つ でレポーター細胞に影響し得る。 アッセイ系（インジケーター細胞）は、ライブラリー細胞産物により誘導され るが、ライブラリー細胞に影響しない、単純な読み出し(readout)（例えば、緑 色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ。β-ガラクトシダーゼ）を有し得る。これ らの例において、所望の産物は、ライブラリー細胞に隣接したレポーター細胞に おける比色変化により検出され得る。 他の実施態様において、次いで、インジケーター細胞は、フィードバック機構 を介してライブラリー細胞の増殖速度を改変するものを生成し得る。増殖速度フ ィードバックは、非常に小さな差異を検出し、そして蓄積し得る。例えば、ライ ブラリーおよびレポーター細胞が栄養分について競合する場合、レポーター細胞 の増殖を阻害する化合物を生成するライブラリー細胞が、栄養分をより利用可能 であり、従って増殖の機会がより大きくなる。これは、抗生物質またはポリケチ ド合成遺伝子のライブラリー（ここで各ライブラリー細胞は、異なるポリケチド 遺伝子産物を発現し、そして輸出する）に対する有用なスクリーニングである。 このテーマの別のバリエーションは、抗生物質選択のためのレポーター細胞自 身が、ライブラリー細胞の増殖を阻害する毒素または抗生物質を分泌し得ること である。従って、レポーター細胞の増殖を抑制し得る抗生物質のライブラリー細 胞による生成は、ライブラリ一細胞の阻害されない増殖を可能にする。 逆に、ライブラリーが、レポーター細胞の増殖を刺激する化合物の生成につい て（例えば、化学合成の改善において）スクリーニングされる場合、ライブラリ ー細胞は、栄養分（例えば、アミノ酸）を栄養要求性レポーターに、または増殖 因子を増殖因子依存性レポーターに供給し得る。次いで、レポーター細胞は、ラ イブラリー細胞の増殖を刺激する化合物を生成するはずである。インターロイキ ン、増殖因子、および栄養分は可能性がある。 さらなる可能性は、周囲の細胞を死滅させる能力に基づく競合、正のフィー ドバックを含む。ここで、進化された細胞により作られる所望の産物は、細胞Ａ に対する正の増殖因子を生成するインジケーター細胞を刺激し、従って、増大し た産物形成について間接的に選択する。 本発明のいくつかの実施態様において、スクリーニングについて、最終産物に おいて使用される生物とは異なる生物（または遺伝的バックグラウンド）を使用 することは有利であり得る。例えば、マーカーは、それらのマーカーが最終的な 組換え微生物に望まれないかもしれなくても、改善プロセスの間に構築物に依存 した微生物を作製するために、循環的配列組換えに使用されるDNA構築物に付加 され得る。 同様に、いくつかの実施態様において、進化される酵素のスクリーニングにつ いて、最終産物に使用される基質とは異なる基質を使用することは有利であり得 る。例えば、Evninら、(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87:6659-6663(1990))は、 変種トリプシンが、アルギニンβ-ナフチルアミドの切断によりアルギニン栄養 要求体に対して必須アミノ酸を生成することを必要とすることにより、基質特異 性が変化したトリプシン変種を選択した。従って、これは、宿主の増殖速度が酵 素活性と比例した、アルギニン特異的トリプシンについての選択である。 スクリーニングおよび／または選択に生き残った細胞のプールは、所望の表現 型（例えば、変化した基質特異性、変化した生合成能力など）を付与する組換え 遺伝子について富化される。さらなる富化は、所望であれば、さらなる多様性を 生じることなく第２ラウンドのスクリーニングおよび／または選択を行うことに より得られ得る。 １ラウンド目のスクリーニング／選択に生き残った組換え遺伝子またはこのよ うな遺伝子のプールは、２ラウンド目の組換えのための１つ以上の基質を形成す る。また、組換えは、上記の循環的配列組換えフォーマットのいずれかにより、 インビボまたはインビトロで行われ得る。循環的配列組換えがインビトロで行わ れる場合、組換えのための基質を形成する組換え遺伝子は、スクリーニング／選 択が行われた細胞から抽出されるべきである。必要に応じて、このような遺伝子 のサブ配列は、より標的化されるその後の組換えのために切り出 され得る。組換え遺伝子がエピソーム内に含まれる場合、それらの単離は困難を 示さない。組換え遺伝子が染色体上に組み込まれる場合、それらは、組換えが起 こった領域に隣接する既知の配列からプライムされる増幅により単離され得る。 あるいは、全ゲノムDNAが単離され、必要に応じて増幅され、そして組換えのた めの基質として使用され得る。ゲノムDNAの小さなサンプルは、縮重プライマー を用いた全ゲノム増幅により増幅され得る（Barrettら、Nucleic Acids Researc h 23:3488-3492(1995)）。これらのプライマーは、多量のランダム3'末端をもた らし、これは細胞に再導入された場合に相同組換えを受け得る。 よくあることであるが、２ラウンド目の組換えがインビボで行われる場合、こ れはスクリーニング／選択に生き残った細胞において行われ得るか、または組換 え遺伝子は、別の細胞型（例えば、高頻度の変異および／または組換えを有する 細胞型）に移入され得る。この情況において、組換えは、さらなるDNAセグメン トを組換え遺伝子を有する細胞に導入することによりもたらされ得る。他の方法 において、細胞は、例えば、エレクトロポレーションにより、遺伝情報を互いに 交換するように誘導され得る。いくつかの方法において、２ラウンド目の組換え は、１ラウンド目のスクリーニング／選択に生き残った細胞のプールを２つの亜 集団に分けることにより行われる。１つの亜集団由来のDNAは単離され、そして 他の集団にトランスフェクトされる。ここで、２つの亜集団由来の組換え遺伝子 は組換えを行って、組換え遺伝子のさらなるライブラリーを形成する。これらの 方法において、第１の亜集団から特定の遺伝子を単離するか、または抽出の間の DNAのランダム剪断を避けるための工程をとる必要はない。むしろ、扱いやすい サイズのフラグメントに剪断されたか、さもなければ切断された全ゲノムのDNA は、第２の亜集団にトランスフェクトされる。このアプローチは、いくつかの遺 伝子が同時に進化し、そして／または染色体内のこのような遺伝子の位置および 同一性が知られていない場合に特に有用である。 ２ラウンド目の組換えは、時々、選択に生き残った組換え分子間で排他的に行 われる。しかし、他の実施態様において、さらなる基質が導入され得る。さらな る基質は、１ラウンド目の組換えに使用される基質と同一の形態（すなわち、１ ラウンド目の基質を形成する、遺伝子または遺伝子クラスターのさらな る天然または誘導された変異体）であり得る。あるいは、２ラウンド目の組換え におけるさらなる基質は、１ラウンド目の複製における基質と正確に同一物であ り得る。 ２ラウンド目の組換えの後、所望の表現型を付与する組換え遺伝子は再度選択 される。この選択プロセスは、本質的に前の通りに進行する。選択マーカーを有 する自殺(suicide)ベクターが、１ラウンド目の選択で使用された場合、同じベ クターが再度使用され得る。また、選択に生き残った細胞または細胞プールが選 択される。細胞プールの場合、細胞はさらなる富化に供され得る。 III．バイオリメディエーション(bioremediation)のための遺伝子の循環的配列 組換え 現代産業は多くの汚染物質を生成し、これに対して環境は無限のはきだめであ るともはや考えられ得ない。天然に存在する微生物は、天然に見出され得ない多 くのもの（例えば、生体異物）を含む、数千の有機化合物を代謝し得る。バイオ リメディエーション（人工廃棄物生分解のための微生物の計画的な使用）は、従 来の方法の処分を超えた費用および実用性利点を提供する新たな技術である。バ イオリメディエーションの成功は、汚染物質を解毒または無機物化し得る生物の 入手可能性に依存する。特定の汚染物質を分解し得る微生物は、遺伝子操作およ び循環的配列組換えにより生成され得る。 バイオリメディエーションは汚染制御の１つの局面であるが、長期的により有 用なアプローチは、産業廃棄物が環境に汲み出される前の防止の１つである。産 業廃棄物の流れの、それらが含む汚染物質を分解し得る循環的配列組換えにより 生成された微生物への暴露は、廃棄物の流れが環境に入る前にこれらの汚染物質 の解毒または無機物化をもたらす。組換え生物を放出する問題は、それらを産業 排出物パイプに適したバイオリアクター内に含ませることにより避けられ得る。 このアプローチはまた、使用される微生物混合物が、生成される特定の廃棄物を 最も良く分解するために調節されることを可能にする。最後に、この方法は、外 界に適合して、多くの実験微生物に直面する競合を扱う問題を避ける。 自然状態において、微生物は、汚染物質を競合なく栄養供給源として利用し得 る新規の異化活性を進化させてきた。しかし、環境において低濃度で存在する汚 染物質は、異化酵素の進化を刺激するのに十分な利点を提供し得ない。このよう な天然に起こる生分解経路の進化、および古典的な技術によるいくつかの微生物 の操作の概要については、Ramosら、Bio/Technology 12:1349-1355(1994)を参照 のこと。 従って、バイオリメディエーションのための新規の異化酵素または経路の生成 は、生物間の特定の遺伝子の計画的な転移（Wackettら、前出）、特定の代謝能 を有する細菌間の強制的な交配（Brennerら、Biodegradation 5:359-377(1994) ）、またはケモスタットにおける長期の選択に依存している。いく人かの研究者 は、種々の異化経路を有する微生物を含ませることにより、ケモスタット選択に おいて天然に存在する遺伝機構を介した進化を促進させることを試みた(Kellogg ら、Science 214:1133-1135(1981)；Chakrabarty American Society of Micro.B iol．News 62:130-137(1996)）。この領域における努力の概要については、Came ronら、Applied Biochem．Biotech．38:105-140(1993)を参照のこと。 バイオリメディエーションのために生物を改善する現在の努力は、非常に骨の 折れるアプローチをとっている。ここで、多くのパラメーター（天然および異種 プロモーターからの転写活性、調節回路および転写効率ならびにタンパク質安定 性および活性の改善を含む）が独立的に最適化されている（Timmisら、Ann．Rev ．Microbiol．48:525-527(1994)）。 循環的配列組換えアプローチは、天然に存在する微生物のバイオリメディエー ション能力における多くの制限を克服する。酵素活性および特異性の両方が、同 時にまたは連続的に、本発明の方法により変化され得る。例えば、異化酵素は、 それらが基質に作用する速度を増大するために進化させられ得る。代謝経路にお ける律速段階の知識は、本発明を行うのに必要とされないが、経路における律速 タンパク質は、増大した発現および／または活性を有するように進化させられ得 、基質を誘導するための必要性が除去され得、そして新規の反応を触媒する酵素 が進化させられ得る。 バイオリメディエーションのための化学標的のいくつかの例として、ベンゼン 、キシレン、およびトルエン、樟脳、ナフタレン、ハロゲン化炭化水素、ポリ塩 素化ビフェニル（PCB）、トリクロロエチレン、農薬（例えば、ペンタクロロフ ェニル(PCP)）、および除草剤（例えば、アトラジン）が挙げられる。 Ａ．芳香族炭化水素 好ましくは、酵素が「進化」して新規の触媒機能を有する場合、その機能は、 構成的にまたは新規の基質に応答してのいずれかで発現される。循環的配列組換 えは、タンパク質の構造的エレメントおよび調節的エレメントの両方（調節タン パク質の構造を含む）を、同時に組換え変異誘発に供する。新規の基質を栄養供 給源として効率的に使用し得る変異体の選択は、タンパク質構造またはオペロン 調節のいずれかの詳細な分析なく、酵素およびその調節の両方が最適化されるこ とを確実にするのに十分である。 芳香族炭化水素の例として、ベンゼン、キシレン、トルエン、ビフェニル、お よび多環式芳香族炭化水素（例えば、ピレンおよびナフタレン）が挙げられるが 、これらに限定されない。これらの化合物は、カテコール中間体を介して代謝さ れる。Pseudomonas putidaによるカテコールの分解は、CatR調節タンパク質に作 用するcis,cis-muconateによる異化オペロンの誘導を必要とする。CatRタンパク 質に対する結合部位は、G-N₁₁-Aであるが、一方アクチベーターのLysRクラス（C atRがメンバーである）に対する最適配列はT-N₁₁-Aである。CatR結合部位におけ るGからTへの変異は、カテコール代謝遺伝子の発現を増強する（Chakrabarty，A merican Society of Microbiology News62:130-137(1996)）。これは、存在する 異化経路の制御が、特定の生体異物の代謝について最適化されないことを実証す る。これはまた、オペロンの循環的配列組換え、続いて標的化合物をより良好に 分解し得る細菌の選択から期待される変異型の例である。 出発物質の例として、ジオキシゲナーゼは、芳香族化合物が異化される多くの 経路に必要とされる。ジオキシゲナーゼ配列における小さなな差異でも、基質特 異性において有意な差異を導き得る（Furukawaら、J．Bact．175:5224-5232(199 3)；Ericksonら、App．Environ．Micro．59:3858-3862(1993)）。２つの 「親」酵素由来の配列を用いて作られたハイブリッド酵素は、両親間の中間の触 媒活性を有し得るか（Erickson，同節）、または実際に、特定の反応について親 のいずれかより良好であり得る（Furukawaら、J．Bact．176:2121-2123(1994)） 。これらの場合の１つにおいて、部位特異的変異誘発を使用して、ハイブリッド 配列を有する単一のポリペプチドを作製した（Erickson，同節）；もう１つの場 合において、４つのサブユニット酵素を、２つの異なるジオキシゲナーゼのそれ ぞれからの２つのサブユニットを発現させることにより作製した（Furukawa、同 節）。従って、ジオキシゲナーゼをコードする１つ以上の遺伝子由来の配列を、 本発明の循環的配列組換えに使用して、新規の特異性を有する酵素を作製し得る 。さらに、他の特性の代謝経路もまた、目的の活性の代謝経路を最適化するため に、これらの技術を用いて同時にまたは連続的に進化され得る。 Ｂ．ハロゲン化炭化水素 多量のハロゲン化炭化水素が、溶媒および殺生物剤としての使用のために毎年 生産されている。これらは、米国のみにおいて、米国のみでのPVC生産に使用さ れる５百万トン以上の1,2-ジクロロエタンおよび塩化ビニルの両方を含む。この 化合物は、主として、単一の生物におけるプロセスにより生分解性でないが、ハ ロゲン芳香族（haloaromatic）異化経路は、異なる微生物由来の遺伝子を組み合 わすことにより構築され得る。酵素を操作して、それらの基質特異性と変化させ 得る。循環的配列組換えは、酵素の詳細な構造解析を必要とすることなく、新規 の基質に対する酵素特異性を仕立てる可能性を提供する。 本発明の方法のための可能な出発物質の例として、Wackettら、(Nature 368:6 27-629(1994))は、古典的な技術により、２つの多成分オキシゲナーゼをコード する７つの遺伝子を組み合わせた組換えPseudomonas株が、ポリハロゲン化化合 物を連続的な還元および酸化技術により代謝して、非毒性産物を生成し得る単一 の宿主を生じたことを最近証明した。これらのおよび／または関連物質は、上記 の技術に供されて、単一の生物における生分解経路を進化および最適化させ得る 。 トリクロロエチレンは、重大な地下水汚染物質である。同時代謝（cometaboli c）方法（すなわち、エネルギーまたは栄養分が得られない）で微生物により分 解される。酵素は、異なる化合物により誘導されなければならない（例えば、Ps eudomonas cepaciaは、トルエンによる誘導を必要とするトルエン-4-モノオキシ ゲナーゼを使用して、トリクロロエチレンを破壊する）。さらに、分解経路は、 酵素を不活化し得る高い反応性のエポキシドの形成を含む（Timmisら、Ａnn．Re v．Microbiol．48:525-557(1994)）。本発明の循環的配列組換え技術を使用して 、酵素およびその調節領域を、それが構成的に生成し、かつエポキシド不活化に 対して不感受性になるように変異させ得る。本発明のいくつかの実施態様におい て、酵素を構成的に生成し、かつエポキシドに対して不感受性の宿主の選択は、 漸増濃度のトリクロロエチレンの存在下、誘導基質の非存在下で増殖に損害を与 えることにより達成され得る。 Ｃ．ポリ塩素化ビフェニル(PCB)および多環式芳香族炭化水素(PAH) PCBおよびPAHは、多くのSuperfundサイトでの主要な汚染物質である構造的に 関連した化合物のファミリーである。より広い基質特異性を有する酵素をコード するプラスミドで形質転換された細菌は、商業的に使用されている。天然には、 、より大きなまたはより多量に塩素化したPCBを分解する単一の宿主において生 成されている経路は全く知られていない。確かに、しばしば、嫌気性および好気 性細菌の協調が、完全な代謝に必要とされる。 従って、恐らく、循環的配列組換えのための出発物質の供給源は、大きな（20 〜100KB）プラスミド上のPAH分解異化経路をコードする同定された遺伝子を含む （Sanseverinoら、Applied Environ．Micro．59:1931-1937(1993)；Simonら、Ge ne 127:31-37(1993)；Zylstraら、Annals of the NY Acad．Sci．721:386-398(l 994)）；一方、ビフェニルおよびPCB代謝酵素は、染色体遺伝子クラスターによ りコードされ、そして多くの場合、プラスミドにクローニングされている（Haya seら、J．Bacteriol．172:1160-1164(1990)；Furukawaら、Gene 98:21-28(1992) ；Hoferら、Gene 144:9-16(1994)）。物質は上記の技術に供されて、単一の生物 において生分解経路を進化させ得る。 PCB経路における基質特異性は、主として、最初のジオキシ化反応に関与する 酵素から生じ、そしてそれらの酵素における変異により著しく変化され得る（Er icksonら、Applied Environ．Micro．59:3858-38662(1993)；Furukawaら、J．Ba ct．175:5224-5232(1993)）。PAHおよびPCBの無機物化は、下流経路が最初の反 応の産物を代謝し得ることを必要とする（Brennerら、Biodegradation 5:359-37 7(1994)）。この場合、唯一の炭素供給源としてPCBまたはPAHを使用し得る細菌 の選択を伴う、全経路の循環的配列組換えは、新規のPCBおよびPAH分解細菌の生 成を可能にする。 Ｄ．除草剤 不溶性除草剤の異化のための遺伝子を進化させるための一般的な方法は、アト ラジンについての通りに例示される。アトラジン[2-クロロ-4-(エチルアミノ)-6 -(イソプロピルアミノ)-1,3,5-トリアジン]は、EPAにより設定された3ppbの健康 勧告レベルを超える濃度で地面および地表水に頻繁に検出される、適度に残留性 の除草剤である。アトラジンは、Pseudomonas種によりゆっくりと代謝され得る （Mandelbaumら、Appl．Environ．Micro．61:1451-1457(1995)）。Pseudomonas によるアトラジン代謝における最初の２つの段階を触媒する酵素は、遺伝子AtzA およびAtzBによりコードされる（de Souzaら、Appl．Environ．Micro．61:3373- 3378(1995)）。これらの遺伝子は、6.8kbフラグメントでpUC18(AtzAB-pUC)にク ローニングされた。このプラスミドを有するE.coliは、アトラジンをよりずっと 可溶性の代謝産物に変換する。従って、アトラジンを含むプレート上で細菌を増 殖させることにより酵素活性についてスクリーニングすることは可能である。除 草剤は、プレート上に半透明の沈殿物を形成するが、AtzAB-pU18を含む細胞はア トラジン分解酵素を分泌し、それらの細胞またはコロニーの周囲に透明なハロ（ halo）を誘導する。代表的に、ハロのサイズおよびその形成速度を使用して、活 性レベルを評価し得、その結果、最も大きなハロを有するコロニーを採取するこ とにより、より活性のまたは大いに生成したアトラジン分解酵素の選択を可能に する。したがって、これらの遺伝子を有するプラスミドは、上記の循環的配列組 換えフォーマットに供して、E.coliまたは別の選 択した宿主（これは、Pseudomonasを含む）におけるアトラジンの異化を最適化 し得る。各ラウンドの組換えの後、進化させられた遺伝子を発現する宿主コロニ ーのスクリーニングは、ハロ形成を観察するためにアトラジンを含む寒天プレー ト上で行われ得る。これは、一般的に、不溶性化合物を可溶性である化合物（例 えば、多環式芳香族炭化水素）に代謝する酵素をスクリーニングするための適用 可能な方法である。さらに、アトラジンの異化は、細胞に窒素供給源を提供し得 る；他の窒素が利用可能でない場合、細胞増殖は、細胞が窒素を異化し得る速度 により制限される。従って、窒素供給源としてアトラジンを利用可能な細胞は、 非利用者またはわずかな利用者のバックグラウンドから選択され得る。 Ｅ．重金属解毒 細菌は、硫砒鉄鉱金鉱の採鉱により生じた砒酸塩衰弱を解毒するために商業的 に使用されている。採鉱廃棄物と同様に、産業廃水は、しばしば重金属（例えば 、電子部品およびプラスチックの製造で使用されたもの）で汚染されている。従 って、他のバイオレメディエーション機能を単に行うことができるために、微生 物は、存在する重金属（水銀、砒酸塩、クロム酸塩、カドミウム、銀など）のレ ベルに対して耐性でなければならない。 強力な選択圧は、毒性化合物を毒性の少ない化合物に代謝する能力である。 重金属は、タンパク質を変性するそれらの能力により大いに毒性である（Fordら 、Bioextraction and Biodeterioration of Metals，1-23頁）。重金属汚染の解 毒は、多くの方法（金属の可溶性または生物学的利用能の変化、その酸化還元状 態の変化（例えば、毒性の塩化水銀が還元により非常に揮発性の水銀元素に解毒 される）、および固定化細菌またはプレートによる金属の生体蓄積によるもので さえ）においてもたらされ得る。十分に高い濃度までの金属の蓄積は、金属がリ サイクルされることを可能にする；製錬して、生物の有機部分を取り除き、再利 用可能な蓄積金属を残す。多くの重金属（砒酸塩、カドミウム、コバルト、クロ ム酸塩、銅、水銀、ニッケル、鉛、銀、および亜鉛）に対する耐性は、多くの種 （これは、StaphylococcusおよびPseudomonasを含む）にコー ドされるプラスミドである(Silverら、Environ．Health Perspect．102:107-113 (1994)；Jiら、J．Ind．Micro．14:61-75(1995))。これらの遺伝子はまた、同様 に他の種（例えば、E.coli）において重金属耐性を付与する。本発明の循環的配 列組換え（RSR）技術を使用して、微生物重金属耐性を増大させ得、ならびに細 胞が重金属を蓄積する程度を増大させ得る。例えば、E.coliが砒酸塩を解毒する 能力は、RSRにより少なくとも100倍改善され得る（1996年3月25日に出願された 、同時係属出願第08/621,859号を参照のこと）。 シアン化物は、１トンあたり0.2オンスほどの少ない金を含む岩石から金を抽 出するために非常に効率的に使用される。このシアン化物は、微生物的に中和さ れ得、そして真菌またはPseudomonas fluorescensのような細菌により窒素供給 源として使用され得る。微生物シアン化物分解の問題は、浸出液中の毒性重金属 の存在である。RSRを使用して、毒性重金属に対するバイオレメディエーション 微生物の耐性を増大させ得る。その結果、多くの産業およびSperfundサイトに存 在するレベルに生存し得る。これにより、それらが有機汚染物質（芳香族炭化水 素、ハロゲン化炭化水素、および殺生物剤を含むが、これらに限定されない）を 生分解し得る。 Ｆ．微生物採鉱 「生体浸出(bioleaching)」は、細菌が不溶性金属沈殿物（通常、金属硫化物 または酸化物）を可溶性金属硫酸塩に変換するプロセスである。生体浸出は、硫 砒鉄鉱の採鉱において商業的に重要であるが、廃棄物の山からの金属および酸の 解毒および回収においてさらなる可能性を有する。生体浸出し得る天然に存在す る細菌は、RawlingsおよびSilver(Bio/Technology 13:773-778(1995))により概 説されている。これらの細菌は、典型的に、それらの増殖のための好ましい温度 により群に分けられる。より重要な中温性生物は、ThiobacillusおよびLeptospi rillum種である。中程度の好熱性生物として、Sulfobacillus種が挙げられる。 極端な好熱性生物として、Sulfolobus種が挙げられる。これらの生物の多くは、 商業的な産業設定において増殖し難くする。これは、それらの異化能力を、他の 生物（例えば、Pseudomonas、Rhodococcus、T.ferrooxidans） またはE.coli）への転移およびそれらにおける最適化のための魅力的な候補物に する。遺伝系は、T.ferrooxidansの少なくとも１つの株に対して利用可能であり 、これはプラスミド上のその遺伝物質の操作を可能にする。 上記の循環的配列組換え法を使用して、進化させられる生体浸出遺伝子または 経路の天然宿主または異種宿主における触媒能力（例えば、不溶性塩から可溶性 塩に金属を変換する能力）を最適化し得る。さらに、特定の鉱石の浸出速度は、 例えば、鉱石精鉱における毒性化合物に対する増大した耐性、特定の基質に対す る増大した特異性、栄養供給源として異なる基質を使用する能力などの結果とし て改善され得る。 Ｇ．石油脱硫 化石燃料中の硫黄の存在は、パイプライン、ポンプおよび精製装置の腐食、な らびに燃焼エンジンの早い故障に関連してきた。硫黄はまた、化石燃料の精製に 使用される多くの触媒に有害である。硫黄燃焼産物の大気中への排出は、酸性雨 として知られている。 微生物脱硫は、興味をそそるバイオレメディエーション適用である。化石燃料 に見出される硫黄化合物クラスの代表的な化合物であるジベンゾチオフェン(DBT )を異化し得る、いくつかの細菌が報告されている。米国特許第5,356,801号は、 石油の脱硫を生体触媒し得るRhodococcus rhodochrous由来のDNA分子のクローニ ングを開示する。Denomeら（Gene 175:6890-6901(1995)）は、ジベンゾチオフェ ンをも分解する上位のナフタレン異化経路をコードするPseudomonas由来の9.8kb DNAフラグメントのクローニングを開示する。類似の機能を行う他の遺伝子が同 定されている（米国特許第5,356,801号に開示される）。 これらの酵素の活性は、現在あまりにも低いので商業的に利用可能でないが、 この経路は、本発明の循環的配列組換え技術を用いて効率を増大させ得る。目的 の遺伝子の所望の特性は、ジベンゾチオフェンまたはそのアルキルもしくはアリ ール置換アナログを脱硫するそれらの能力である。本発明のいくつかの実施態様 において、選択は、好ましくは、この経路と細菌への栄養分を提供し得る経路と を組み合わせることにより達成される。従って、例えば、ジベンゾチ オフェンの脱硫は、ヒドロキシビフェニルの形成を生じる。これは、炭素および エネルギーを提供するビフェニル触媒経路の基質である。従って、選択は、ジベ ンゾチオフェン遺伝子を「シャッフリング」し、そしてそれらをビフェニル異化 経路を含む宿主に形質転換することにより行われる。増大したジベンゾチオフェ ン脱硫は、増大した栄養分利用可能性および増大した増殖速度をもたらす。一旦 遺伝子が進化させられると、それらは容易にビフェニル分解遺伝子から分離され る。後者は、目的が石油のエネルギー含有量を減少させることなく脱硫すること であるので、最終産物において所望でない。アルキルまたはアリル置換ジベンゾ チオフェンは、蛍光の変化（Krawiec,S.，Devel．Indus．Microbiology 31:103- 114(1990)）または脱硫の結果として形成されるフェノール基の検出（Dacre,J.C ．Anal．Chem．43:589-591(1971)）により検出され得る。 Ｈ．有機ニトロ化合物 有機ニトロ化合物は、爆薬、染料、薬物、ポリマー、および抗菌剤として使用 される。これらの化合物の生分解は、通常、ニトロレダクターゼ（広い特異性の 酵素のファミリー）により触媒される硝酸基の還元により天然に起こる。有機ニ トロ化合物の部分的な還元は、しばしば、もとの化合物より、より毒性の化合物 の形成を生じる（Hassanら、1979 Arch Bloch Biop．196:385-395）。ニトロレ ダクターゼの循環的配列組換えは、より特異性であり、そしてそれらの標的化合 物（例えば、ニトロトルエンおよびニトロベンゼンを含むが、これらに限定され ない）をより完全に還元し得る（従って、解毒し得る）酵素を生成し得る。ニト ロレダクターゼは、爆薬に汚染された土壌から単離された細菌（例えば、Morgan ella morganii、およびEnterobacter cloacae）から単離され得る（Bryantら、1 991.J.BiolChem．266:4126-4130）。好ましい選択法は、目的の有機ニトロ化合 物に対する増大した耐性を探すことである。なぜなら、それは、酵素がまた、最 初の化合物の任意の毒性部分的還元産物を還元し得ることを示すからである。 IV．化学合成のための代替基質の使用 代謝工学を使用して、産業的に有用な化学物質を生成する微生物を、それらが 代替のおよびより豊富な栄養供給源（人工の産業廃棄物を含む）を用いて増殖す るように変化させ得る。これは、代表的に、代替基質を操作細胞に与えるための 輸送系および天然宿主生物から操作細胞への異化酵素の両方を提供することを含 む。いくつかの例において、酵素は、代替基質を操作細胞により容易に取り込ま れ得る形態に分解するために、操作細胞により培地に分泌され得る；他の例にお いて、操作細胞のバッチが、１つの好ましい基質上で増殖され、次いで代替基質 に対する加水分解酵素を培地に遊離させるために溶解され得るが、一方、同じ操 作宿主の第２の接種物または第２の宿主が、加水分解物を利用するために添加さ れる。 循環的配列組換えのための出発物質は、代表的に、基質の利用またはその輸送 のための遺伝子である。目的の栄養供給源の例は、ラクトース、乳清、ガラクト ース、マンニトール、キシラン、セロビオース、セルロース、およびスクロース を含むが、これらに限定されない。従って、これは、化合物（エタノール、トリ プトファン、ラムノリピド(rhamnolipid)界面活性剤、キサンゴム、およびポリ ヒドロキシルアルカノエートを含むが、これらに限定されない）のより安価な生 成を可能にする。所望の標的物質としてのこのような基質の概要については、Ca meronら、(Appl．Biochem．Biotechnol．38:105-140(1993))を参照のこと。 上記の循環的配列組換え法を使用して、目的の基質を利用する、より効率的な 輸送系を進化させる、特定の基質に対する特異性を増大または変化させるなどの ために、天然または異種宿主の能力を最適化し得る。 Ｖ．生合成 代謝工学を使用して、特に任意の代謝中間体（抗生物質、ビタミン、アミノ酸 （例えば、フェニルアラニンおよび芳香族アミノ酸）、エタノール、ブタノール 、ポリマー（例えば、キサンゴムおよび細菌性セルロース）、ペプチド、ならび に脂質を含む）の生成を最適化するために生物を変化させ得る。このような化合 物が宿主により既に生成されている場合、上記の循環的配列組換え技 術を使用して、所望の代謝中間体の生成を最適化し得る。これは、酵素基質特異 性および代謝回転数を増大させる、代謝の流れを変化させて毒性基質または中間 体の濃度を減少させる、このような毒性化合物に対する宿主の耐性を増大させる 、遺伝子発現／活性のインデューサーの必要性を排除するか、減少させるか、ま たは変化させる、代謝に必要な酵素の生成を増大させる、などのような特性を含 む。 酵素はまた、水以外の溶媒中の改善した活性について改善され得る。これは、 化学合成での中間体がしばしば、水性溶媒中での化合物の溶解性に劇的に影響す る保護基によって保護されるために有用である。多くの化合物が、純粋な化学物 質と酵素的に触媒される反応との組み合わせ生成され得る。ほとんど不溶性の基 質に対する酵素反応の実施は、明らかに非常に非効率的であり、それ故、他の溶 媒中で活性である酵素の利用可能性は非常に有用である。このようなスキームの １つの例は、loracarbef合成における中間体から保護基を取り除くパラ-ニトロ ベンジルエステラーゼの進化である（Moore，J.C.およびArnold，F.H.Nature Bi otechnology 14:458-467(1996)）。この場合、誤り易いPCRの交互性のラウンド および基質アナログからの蛍光レポーターの生成についてのコロニースクリーン グを使用して、30％ジメチルホルムアミド中で親分子より16倍大きな活性の変異 体エステラーゼを生成した。２倍を超える活性の増加に寄与する個々の変異は見 い出されなかったが、全増加を導いたのは、多くの変異の組み合わせであった。 変異体タンパク質の構造解析により、アミノ酸変化は、合理的に予想され得ない 様式でタンパク質の全長にわたって分布していることが示された。誤り易いPCR の連続的なラウンドは、各ラウンドの後に、１つの変異体以外の全てが、全ての 他の有益な変異において含まれる情報の同時に生じる消失と共に全ての他の有益 な変異において含まれる情報の同時に生じる消失と共に、捨てられるという問題 がある。循環的配列組換えはこの問題を避け、従って、他の溶媒中での、ならび に塩濃度またはpHが最初の酵素最適とは異なる条件での触媒について酵素を進化 させることに理想的に適してしる。 さらに、ほとんど任意の代謝経路の収量が、宿主生物に内因的な遺伝子、また は全てまたは部分的に異種の遺伝子から完全になるかにかかわらず、増大さ れ得る。経路における酵素の発現レベルの最適化は、単に発現を最大にするより 複雑である。いくつかの場合において、酵素の構成的発現よりむしろ調節が、フ ェニルアラニン（Backmanら、Ann．NY Acad Sci．589:16-24(1990)）および2-ケ ト−L-グルコン酸（Andersonら、米国特許第5,032,514号）の生成について理解 されるように、細胞増殖およびそれ故産物収量に有利であり得る。さらに、それ らの生物宿主以外の生物においてタンパク質を発現する産業目的のためにしばし ば有利である。新規の宿主株は、種々の理由（クローニングおよび形質転換の容 易さ、病原性、特定の環境に生き残る能力、ならびに生物の生理学および遺伝学 の知識の各々を含む）に好ましいものであり得る。しかし、異種生物において発 現されるタンパク質は、しばしば、種々の理由（新規の宿主において正確に折り たたむ能力がないことを含む）のために著しく低減した活性を示す（Sarthyら、 Appl．Environ．Micro．53:1996-2000(1987)）。このような困難は、本発明の循 環的配列組換えストラテジーにより確かに克服され得る。 Ａ．抗生物質 天然の低分子抗生物質の範囲として、ペプチド、ペプチドラクトン、チオペプ チド、β-ラクタム、糖ペプチド、ランチバイオティック(lantibiotic)、マイク ロシン（microcin）、ポリケチド誘導抗生物質（アンスラサイクリン、テトラサ イクリン、マクロライド、アベルメクチン、ポリエーテル、およびアンサマイシ ンシン）、クロラムフェニコール、アミノグリコシド、アミノサイクリトール、 ポリオキシン、アグロシン、ならびにイソプレノイドが挙げられるが、これらに 限定されない。 本発明の循環的配列組換え技術を使用して、新規の薬物合成を容易にし得るか 、または存在する抗生物質の生合成を改善し得る、少なくとも３つの方法が存在 する。 第１に、抗生物質合成酵素は、抗生物質前駆体として使用される化合物の侵入 を可能にする輸送系と共に「進化」されて、機能を変化させる人工側鎖前駆体の 取り込みおよび組み込みを改善し得る。例えば、ペニシリンＶは、Penicillium に人工側鎖前駆体フェノキシ酢酸を与えることにより生成され、そしてLY1 46032は、Streptomyces roseosporusにデカン酸を与えることにより生成される （Hopwood，Phil．Trans．R．Soc．Lond．B 324:549-562(1989)）。合成酵素に よるわずかな前駆体取り込みおよびわずかな組み込みは、しばしば、所望の産物 の非効率的な形成を導く。これらの２つの系の循環的配列組換えは、所望の産物 の収量を増大させ得る。 さらに、酵素が新規の触媒活性／基質認識のために（恐らく、活性部位のよう な重要な位置においてランダム化オリゴヌクレオチドを含ませることにより）シ ャッフルされる、コンビナトリアルアプローチが利用され得る。次いで、多くの 異なる基質（例えば、通常、抗生物質に組み込まれる側鎖のアナログ）は、全て の異なる酵素との組み合わせにおいて試験され得、そして生物学的活性について 試験され得る。この実施態様において、異なる潜在的な抗生物質前駆体（例えば 、側鎖アナログ）を含むプレートが作製される。シャッフルされたライブラリー を含む微生物（ライブラリー株）は、競合する抗生物質感受性の微生物（インジ ケーター株）を共にそれらのプレート上で複製される。従って、効果的な抗生物 質を生成するために新規の側鎖を組み込み得るライブラリー細胞は、インジケー ター株と競合し、そして選択され得る。 第２に、１つの抗生物質合成生物から別の抗生物質合成生物に移される異種遺 伝子の発現が最適化され得る。新らたに導入された酵素は、宿主細胞中の２次代 謝産物に作用し、それらを新規の特性を有する新らたな化合物に変える。従来の 方法を用いた、外来遺伝子の抗生物質合成宿主への導入は、既に、新規のハイブ リッド抗生物質の生成をもたらした。例として、メダデロジン（mederrhodin） 、ジヒドログラナチロジン、6-デオキシエリスロマイシンＡ、イソバレリルスピ ラマイシン、および他のハイブリッドマクロライドが挙げられる（Cameronら、A ppl．Biochem．Biotechnol．38:105-140(1993)）。本発明の循環的配列組換え技 術を使用して、外来遺伝子の発現を最適化し、新規の宿主細胞において酵素を安 定化し、そして新規の宿主細胞においてその新規の基質に対する導入酵素の活性 を増大させ得る。本発明のいくつかの実施態様において、宿主ゲノムはまた、こ のように最適化され得る。 第３に、２次代謝に関与する酵素の基質特異性は、それが新規の化合物に作 用して、そして改変するか、またはその活性が変化して、そしてその正常な基質 の異なるサブセットの位置で作用するように、変化させられ得る。循環的配列組 換えを使用して、酵素の基質特異性を変化させ得る。さらに、新規の抗生物質を 生成するストラテジーである個々の酵素の循環的配列組換えに加えて、経路全体 の循環的配列組換えは、酵素の比率を変えることにより、代謝産物の流れを変化 させ、そして増大した抗生物質合成だけでなく、異なる抗生物質合成ももたらし 得る。これは、外来宿主における同じクラスター由来の異なる遺伝子の発現によ り、異なる産物が形成されるという観察から推理され得る（Hutchinsonら、（19 91）Ann NY Acad Sci，646:78-93の80頁を参照のこと）。導入遺伝子クラスター の循環的配列組換えは、クラスター内の異なるタンパク質の種々の発現レベルを もたらし得る（なぜなら、この場合、調節的な変異の異なる組み合わせを生じる からである）。次いで、これは、種々の異なる最終産物に導き得る。従って、存 在する抗生物質合成経路の「進化」を使用して、その経路における酵素の速度ま たは基質特異性のいずれかを改変することにより、新規の抗生物質を生成し得る 。 さらに、抗生物質はまた、前駆体に対する精製酵素の作用によりインビトロで 生成され得る。例えば、イソペニシリンＮシンターゼは、その正常な基質（d-(L -a-アミノアジピル)-L-システイニル-D-バリン）の多くのアナログの環化を触媒 する（Hutchinson，Med．Res．Rev．8:557-567(1988)）。これらの産物の多くは 抗生物質として活性である。広範な種々の基質アナログは、最初の反応効率を考 慮せずに、２次代謝産物合成酵素による組み込みについて試験され得る。循環的 配列組換えを続いて使用して、有望な新規の基質との反応速度を増大させ得る。 従って、所望の抗生物質を既に生成する生物は、抗生物質の生成を最大にする ために、上記の循環的配列組換え技術を用いて進化させられ得る。さらに、新規 の抗生物質は、上記の循環的配列組換えにより宿主由来の遺伝物質の操作により 進化させられ得る。抗生物質生成のための遺伝子は、循環的配列組換えのサイク ルの後に好ましい宿主に移され得るか、または上記の好ましい宿主において進化 させられ得る。抗生物質遺伝子は、一般的にクラスター化され、そ してしばしば正に調節され、これはそれらを本発明の循環的配列組換え技術のた めの特に魅力的な候補物にする。さらに、関連経路のいくつかの遺伝子はクロス ハイブリダイゼーションを示し、これはそれらを、本発明の循環的配列組換え技 術による新規抗生物質の新規経路の生成のための好ましい候補物にする。さらに 、基質の流れの増強を含む２次代謝産物生成の増大（律速酵素の速度の増大、負 の制御エレメントの抑制またはアクチベーターの過剰発現による経路の調節解除 、および調節酵素のフィードバック不感受性の調節解除されたタンパク質への変 異によるフィードバック制御の除去による）は、関連遺伝子クラスターの発現を 支配する調節機構の徹底的な解析なく、循環的配列組換えにより達成され得る。 進化させられた遺伝子の発現のために選択された宿主は、好ましくは生成され た抗生物質に耐性であるが、いくつかの例において、生成方法は、生成される抗 生物質の量が宿主に対して商業的になお著しく致死的である場合、宿主細胞を犠 牲にするように設計され得る。同様に、バイオリアクターは、増殖培地が連続的 に補給され、それにより生成される抗生物質を「出させ（drawing off）」、そ して生成細胞の命を節約するように設計され得る。好ましくは、耐性機構は、生 成される抗生物質の分解ではない。 増大した抗生物質の発現についての多くのスクリーニング方法（それらが生成 する抗生物質により耐性の生物についてのスクリーニングを含む）が、上記で議 論したように公知である。これは、抗生物質合成遺伝子および抗生物質耐性遺伝 子の発現間のつながりから生じ得る（Chater，Bio/Technology 8:115-121(1990) ）。別のスクリー−ニング方法は、レポーター遺伝子（例えば、Pseudomonas TO Lプラスミド由来のxy1E）を抗生物質生成遺伝子に融合させることである。次い で、抗生物質合成遺伝子発現は、レポーターの発現（例えば、xy1Eは、コロニー がカテコールでスプレーされた場合、黄色のムコンセミアルデヒドを生成する、 カテコールデジキシゲナーゼをコードする）を探すことにより測定され得る（Zu kowskiら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80:1101-1105(1983)）。 広範な種々のクローニングされた抗生物質遺伝子は、本発明の循環的組換え技 術のための多量の出発物質を提供する。例えば、非抗生物質生産株Streptomy ces lividansにおいてセファマイシンＣ合成を指向する遺伝子は、Streptromyce s cattleyaからクローニングされた（Chenら、Bio/Technology 6:1222-1224(198 8)）。ペニシリン生合成のクラスター化遺伝子（δ-(L-α-アミノアジピル)-L- システイニル-D-バリンシンターゼ；イソペニシリンＮシンターゼおよびアシル 補酵素Ａ：6-アミノペニシリン酸アセチルトランスフェラーゼ）は、Penicilliu m chrysogenumからクローニングされた。これらの遺伝子のNeurospora crassaお よびAspergillus nigerへの転移は、活性ペニシリンＶの合成をもたらす（Smith ら、Bio/Technology 8:39-41(1990)）。セファロスポリンＣ、ペニシリンＧおよ びＶ，ならびにセファマイシンＣ生合成に関与するクローン化された遺伝子の概 要については、Piepersberg，Crit.Rev.Biotechnol．14:251-285(1994)を参照の こと。抗生物質生成遺伝子のクローニングされた遺伝子の概要については、Chat er，Bio/Technology 8:115-121(1990)を参照のこと。工業生産株に移された抗生 物質合成遺伝子の他の例、または遺伝子の過剰発現の例としては、Cameronら、A ppl．Biochem．Biotechnol．38:105-140(1993)において概要される、タイロシン 、セファマイシンＣ、セファロスポリンＣ、LL-E33288複合体（抗腫瘍剤および 抗菌剤）、ドキソルビシン、スピラマイシン、および他のマクロライド抗生物質 が挙げられ、。 Ｂ．抗生物質の化学合成を置換する生合成 いくつかの抗生物質が、生物学的に生成された出発化合物の化学修飾により現 在作製されている。所望の分子の完全な生合成は、必要とされる酵素活性および 基質特異性を有する酵素を欠くことにより、現在非実用的であり得る。例えば、 7-アミノデアセトオキシセファロスポラン酸（7-ADCA）は、半合成的に生成され たセファロスポリンである。7-ADCAは、ペニシリンＶからの化学的環伸長、続く フェノキシアセチル基の酵素的脱アシル化により作製される。セファロスポリン は、原則として、ペニシリンＮエクスパンダーゼを用いてそれらの対応するペニ シリン（例えば、ペニシリンＶまたはＧからのセファロスポリンＶまたはＧ）か ら生物学的に生成され得るが、他のペニシリン（例えば、ペニシリンＶまたはＧ ）は既知のエクスパンダーゼにより基質として使用されな い。本発明の循環的配列組換えを使用して、ペニシリンＶを基質として使用する ように酵素を変化させ得る。同様に、ペニシリントランスアシラーゼは、このよ うに改変されて、セファロスポリンまたはセファマイシンを基質として受容し得 る。 なお別の例において、E.coliにおいて発現したペニシリンアミダーゼは、ペニ シリンＧ誘導体の生成における重要な酵素である。この酵素は、前駆体ペプチド から生成され、そして代謝可能でない糖が培地中に存在しなければ、ペリプラズ ムにおいて不溶性凝集体として蓄積する傾向がある（Scherrerら、Appl.Microbi ol．Biotechnol．42:85-91(1994)）。本発明の方法によるこの酵素の進化を使用 して、より高レベルの活性酵素発現を導く、より良好に折りたたむ酵素を生成し 得る。 なお別の例において、アガロースに共有結合したペニシリンＧアシラーゼは、 ペニシリンＧ誘導体合成に使用される。この酵素は、化学的修飾により増大した 活性、寿命、および／または熱安定性について安定化され得る（Fernandez-Lafu enteら、Enzyme Microb．Technol．14:489-495(1992)）。増大した熱安定性は、 本発明の循環的配列組換え技術の特に魅力的な適用であり、これはこのような酵 素の化学的修飾の必要性を回避し得る。熱安定性についての選択は、より高温で E.coliまたは好熱性生物においてインビボで行われ得る。一般的に、熱安定性は 、酵素の一般的な安定性の増強における良好な第１段階である。ランダム変異誘 発および選択も使用して、酵素が非水溶性溶媒において機能するように適応させ 得る（Arnold Curr Opin Biotechnol，4:450-455(1993)；Chenら、Proc．Natl． Acad．Sci．U.S.A.,90:5618-5622(1993)）。循環的配列組換えは、非水溶性環境 において安定かつ活性な変異酵素を生成するより強力な（組換えを促進するので ）方法を示す。さらなるスクリーニングは、溶媒中の酵素安定性に基づいて行わ れ得る。 Ｃ．ポリケチド ポリケチドとして、抗生物質（例えば、テトラサイクリンおよびエリスロマイ シン）、抗ガン剤（例えば、ダウノマイシン）、免疫抑制剤（例えば、FK506 およびラパマイシン）、ならびに獣医学的製品（例えば、モネシンおよびアベル メクチン）が挙げられる。ポリケチドシンターゼ(PKS)は、鎖の長さ、鎖構築単 位の選択、および天然に存在するポリケチドにおいて大きなバリエーションを生 じる還元サイクルを制御する、多機能酵素である。ポリケチドは、「伸長単位（ extender unit）」（脂肪アシルCoA基）の適切な開始単位(starter unit)（例え ば、アセテート、クマレート、プロピオネート、およびマロンアミド）への連続 的な転移により組み立てられる。PKSは、縮合反応の数および添加される伸長基 の型を決定し、そしてポリケチド前駆体を折りたたみ、そして環化もし得る。PK Sは、特定のβ-ケト基を還元し、そして得られたβ-水酸基を脱水して、二重結 合を形成し得る。使用される構築ブロックの性質または数、β-ケト基が還元さ れる位置、還元の程度、および異なる位置の可能な環化の改変は、異なる最終産 物の形成を生じる。ポリケチド研究は、現在、新らたなポリケチド生成物を導く 酵素における合理的な変化の基礎を築くための、改変およびインヒビター研究、 部位特異的変異誘発、および3-D構造解明に焦点があてられている。 最近、McDanielら(Science 262:1546-1550(1995))は、効率的な構築および組 換えPKS発現のためのStreptomyces宿主-ベクター系を開発した。Hutchinson(Bio /Technology 12:375-308(1994))は、特定の生合成遺伝子の標的化変異を概説し 、そして微生物単離物が、既知の薬理学的に活性な薬剤に関連した遺伝子につい てDNAハイブリダイゼーションによりスクリーニングし得、新規の代謝産物また は既に生成されている代謝産物の増大した収量を提供し得ることを示唆した。特 に、その概説は、アミノグリコシドおよびオリゴペプチド抗生物質に対するポリ ケチドシンターゼおよび経路に焦点をあてている。 本発明の循環的配列組換え技術を使用して、このような詳細な解析努力を伴わ ずに新規のポリケチドを生成する改変酵素を作製し得る。プラスミド上のPKS遺 伝子の利用可能性およびE.coli-Streptomycesシャトルベクター（Wehmeier Gene 165:149-150(1995)）の存在は、循環的配列組換えのプロセスを上記の技術によ り特に魅力的にする。抗生物質産生生物の選択技術は上記のように使用され得る ；さらに、いくつかの実施態様において、特定の所望のポリケチド活性 または化合物についてのスクリーニングが好ましい。 Ｄ．イソプレノイド イソプレノイドは、セスキテルペンシンターゼによりファルネシルピロフォス フェートの環化から生じる。イソプレノイドの多様性は、骨格によるものでなく 、環化の制御により生じる。イソプレノイド合成遺伝子のクローニング例として 、Fusarium sprorotrichioides由来のトリコジエンシンターゼ、Streptomyces由 来のペンタレンシンターゼ、Penicillium roquefortii由来のアリストロロケン シンターゼ、およびN.tabacum由来のepi-アリストロロケンシンターゼ（epi-ari stolochene synthase）が挙げられる（Cane，D.E.(1995).Isoprenoidantibiotic s,633-655頁、「Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production」、Vin ing，L.C.およびStuttard,C.編、Butterworth-Heinemann発行）。セスキテルペ ンシンターゼの循環的配列組換えは、これらの酵素の発現を異種宿主（例えば、 植物および産業微生物株）において可能にすることおよび作られる環化産物を変 えるための酵素変化の両方において有用である。多数のイソプレノイドが、抗ウ イルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、除草剤、殺虫剤、または細胞増殖抑制剤として活 性である。従って、抗菌性および抗真菌性イソプレノイドは、好ましくは、上記 のインジケーター細胞型系を用いてスクリーニングされ得る。生成細胞は、細菌 または真菌と栄養分について競合する。抗ウイルス性イソプレノイドは、好まし くは、生成細胞でのウイルス攻撃に対する耐性を付与するそれらの能力によりス クリーニングされ得る。 Ｅ．生体活性ペプチド誘導体 生体活性非リボソーム合成ペプチドの例として、抗生物質シクロスポリン、ペ プスタチン、アクチノマイシン、グラミシジン、デプシペプヂド、バンコマイシ ンなどが挙げられる。これらのペプチド誘導体は、リボソームよりむしろ複合酵 素により合成される。また、従って、このような非リボソーム合成ペプチド抗生 物質の収量の増大は、生合成「ボトルネック(bottleneck)」の遺伝的同定および 特定の酵素の過剰発現により行われてきた（例えば、133-135頁、「G enetics and Biochemistry of Antibiotic Production」、Vining，L.C.およびS tuttard，C.編、Butterworth-Heinemann発行を参照のこと）。酵素クラスターの 循環的配列組換えを使用して、天然および異種宿主の両方における生体活性の非 リボソーム的に作られたペプチドの収量を改善し得る。ポリケチドシンターゼと 同様に、ペプチドシンターゼは、活性化構築ブロック（この場合アミノ酸）間の 縮合反応、その後のそれらの構築ブロックの修飾を触媒するモジュール酵素およ び多機能酵素である（Kleinkauf，H.およびvon Dohren，H．Eur.J.Biochem．236 :335-351(1996)を参照のこと）。従って、ポリケチドシンターゼと同様に、循環 的配列組換えはまた、ペプチドシンターゼを変化させるために使用され得る：酵 素上の各結合部位により認識されるアミノ酸の特異性を改変し、そしてこれらの アミノ酸を修飾する部位の活性または基質特異性を変化させて、抗生物質活性を 有する新規の化合物を生成する。 他のペプチド抗生物質がリボソームにより合成され、次いで、翻訳後修飾され る。この型の抗生物質の例は、ランチバイオテック(グラム陽性細菌（例えば、S taphylococcus、Streptomyces、Bacillus、およびActinoplanes）により生成さ れる)、ならびにマイクロシン（Enterobacteriaceaeにより生成される）である 。最初のペプチド修飾として、（ランチバイオテックにおいて）セリンおよびス レオニンの脱水、デヒドロアミノ酸のシステインとの縮合、または単純なＮおよ びＣ末端ブロック（マイクロシン）が挙げられる。リボソームにより作られた抗 生物質については、ペプチドコード配列および修飾酵素の両方が、それらの発現 レベルを、循環的配列組換えにより改変させ得る。また、これは、増大したレベ ルの抗生物質合成、ならびに修飾酵素（およびリボソームにより合成されたペプ チド自身の配列）のレベルの調節による新規抗生物質の両方を導く。 スクリーニングは、感受性（または初めに不感受性）微生物種との競合を含め て、上記の他の抗生物質と同様に行われ得る。生成された抗生物質に対する耐性 を有する競合細菌の使用は、この抗生物質の非常に増強したレベル（その結果、 耐性機構を切り開く）または耐性機構により中和されないこの抗生物質の新規誘 導体のいずれかについて強力に選択する。 Ｆ．ポリマー バイオポリマーを生成するための代謝操作のいくつかの例が、生物分解性プラ スチックであるポリヒドロキシブタレート（PHB）および多糖キサンゴムの生成 を含めて、報告されている。概説については、Cameronら、Applied Biochem.Bio tech．38:105-140(1993)を参照のこと。これらの経路の遺伝子はクローニングさ れており、それらを上記の循環的配列組換え技術のための優秀な候補物にする。 市販の生存可能な宿主（例えば、E.coli）におけるこのような進化させられた遺 伝子の発現は、この技術の特に魅力的な適用である。 循環的配列組換えのための出発物質の例として、ストレスに応答してエネルギ ー保存物質として細胞内でポリヒドロキシアルカノエート(PHA)（例えば、ポリ ヒドロキシブチレート(PHB)）を生成する、細菌（例えば、Alcaligenes、Zooglo ea、Rhizobium、Bacillus、およびAzobacter）由来の遺伝子が挙げられるが、こ れらに限定されない。アセトアセチルCoAのPHBへの変換を触媒する酵素をコード する、Alcaligenes eutrophus由来の遺伝子は、E.coliおよび植物Arabidopsis t halianaの両方に移入された（Poirierら、Science 256:520-523(1992)）。これ らの遺伝子（phbBおよびphbC、それぞれ、アセトアセチルCoAレダクターゼおよ びPHBシンターゼをコードする）の２つは、ArabidopsisにおけるPHB生成を可能 にする。プラスチックを生成する植物は、恐らく、新規代謝経路と植物の元の代 謝との間の有害な相互作用（すなわち、メバロン酸経路からの基質の枯渇）によ り成長が妨げられる。植物における改善したPHB生成は、細胞小器官（例えば、 色素体）への経路酵素の局在化により試みられている。他のストラテジー（例え ば、組織特異性の調節、発現のタイミング、および細胞内局在化）は、植物にお けるPHB発現の有害な影響を解明することを示唆している。本発明の循環的配列 組換え技術を使用して、このような異種遺伝子ならびに特定のクローニングされ た相互作用経路（例えば、メバロン酸）を改変し、そして産業微生物株における PHB合成を最適化し得る（例えば、増殖条件におけるストレス（例えば、窒素制 限）の必要性を取り除く）。 さらに、他の微生物ポリエステルが異なる細菌により作られ、ここでさらな るモノマーがポリマーに組み込まれる（Peopleら、Novel Biodegradable Microb ial Polymers，EA Dawes編、191-202頁(1990)）。異種宿主への単一または組み 合わせた、これらの遺伝子または経路の循環的配列組換えは、異なる特性（ポリ マー中のモノマーサブユニット比のバリエーションを含む）を有する種々のポリ マーの生成を可能にする。合成が循環的配列組換えにより操作され得る別のポリ マーはセルロースである。セルロース生合成遺伝子は、Agrobacterium tumefaci ensからクローニングされている（Matthysse，A.G.ら、J．Bacteriol.177:1069- 1075(1995)）。この生合成経路の循環的配列組換えを使用して、セルロース合成 を増大させるか、または代替の糖がポリマーに組み込まれた変異体を生成させる のいずれかを行い得る。 Ｇ．カロテノイド カロテノイドは、一般的なイソプレノイド生合成経路において、細菌、真菌お よび植物により生成される600以上のテルペノイドファミリーである（概説につ いては、Armstrong，J．Bact．176:4795-4802(1994)を参照のこと）。これらの 色素は、光酸化傷害に対して生物を保護し、ならびに抗腫瘍剤、フリーラジカル 除去抗酸化剤、および免疫応答のエンハンサーとして機能する。さらに、それら は、養殖された魚および貝の着色において商業的に使用される。カロテノイドの 例として、ミクソバクトン、スフェロイデン、スフェロイデノン、ルテイン、ア スタキサンチン、ビオラキサンチン、4-ケトルレン、ミクソキサントロフィル、 エチネノン、リコペン、ゼアキサンチン、およびそのモノグルコシドおよびジグ ルコシド、α-、β-、γ-、およびδ-カロテン、β-クリプトキサンチンモノグ ルコシド、およびネオキサンチンが挙げられるが、これらに限定されない。 カロテノイド合成は、相対的に少数のクラスター化遺伝子：Myxococcus xanth us由来の12kb DNA内の11の異なる遺伝子（Botellaら、Eur．J．Biochem．233:23 8-248(1995)）およびRhodobacter sphaeroides由来の９kb DNA内の８つの遺伝子 （Langら、J．Bact．177:2064-2073(1995)）により触媒される。いくつかの微生 物（例えば、Thermus thermophilus）において、これらの遺伝子はプラ スミド媒介性である（Tabataら、FEBS Letts 341:251-255(1994)）。これらの特 性は、カロテノイド合成経路を、循環的配列組換えのための特に魅力的な候補物 にする。 いくつかのカロテノイド遺伝子の異種生物への転移は発現をもたらす。例えば 、Erwina uredovoraおよびHaematococcus pluvialis由来の遺伝子は、E.coli内 で共に機能する（Kajiwaraら、Plant Mol.Biol．29:343-352(1995)）。E.herbic ola遺伝子は、R.sphaeroidesにおいて機能する（Hunterら、J.Bact．176:3692-3 697(1994)）。しかし、いくつかの他の遺伝子は機能しない；例えば、R.capsula tus遺伝子は、カロテノイド合成をE.coliにおいて指向しない（Marrs，J.Bact． 146:1003-1012(1981)）。 本発明の実施態様において、本発明の循環的配列組換技術を使用して、異種宿 主において増大した発現を可能にする、カロテノイド合成経路の調節および／ま たは構造エレメント遺伝子における変異型を生成し得る。確かに、伝統的な技術 が、Thermus thermophilusにおける律速酵素の発現を増大させることにより、カ ロテノイド生成を増大させるために使用された（Hoshinoら、Appl．Environ．Mi cro．59:3150-3153(1993)）。さらに、調節遺伝子の変異は、アクチノマイスト のカロテノイド生合成の構成的発現を引き起こし得る。ここで、その他の点では 、カロテノイド光誘導は不安定であり、そして比較的高い頻度でいくつかの種で 消失する（Katoら、Mol．Gen．Genet．247:387-390(1995)）。これらは、循環的 配列組換えにより得られ得る変異の両方である。 上記の本発明の循環的配列組換え技術を使用して、調節機構の解析の必要なく 、所望の宿主において１つ以上のカロテノイド生合成遺伝子を進化させ得る。カ ロテノイドは着色しているので、比色アッセイ（マイクロタイタープレートにお いてまたは増殖培地プレートにおいてでさえも）が、増大した生成のスクリーニ ングに使用され得る。 カロテノイド発現を増大させることに加えて、カロテノイド生合成経路は、広 範な多様性のカロテノイドを生成する能力を有する。なぜなら、関与する酵素は 、それらが触媒する反応型に特異的であるが、それらが修飾する基質に特異的で ないと思われるからである。例えば、海洋性細菌Agrobacterium auranti acum由来の２つの酵素(CrtWおよびCrtZ)は、６つの異なるケトカロテノイドをβ -カロテンから合成する（Misawaら、J．Bact．177:6576-6584(1995)）。この緩 和した基質特異性は、基質の多様性が、産物のより大きな多様性に変換され得る ことを意味する。外来カロテノイド遺伝子の細胞への導入は、例えば、光合成複 合体における新規および機能的なカロテノイドタンパク質複合体を導き得る（Hu nterら、J．Bact．176:3692-3697(1994)）。したがって、本発明の循環的配列組 換え技術による酵素の計画的な組換えは、新規の化合物を生成するようである。 このような化合物のスクリーニングは、例えば、上記の細胞競合／生存技術およ び着色化合物の比色アッセイにより達成され得る。 新規化合物を同定する別の方法は、標準的な分析技術（例えば、質量分析、核 磁気共鳴、高速液体クロマトグラフィーなど）を使用することである。組換え微 生物はプールされ得、そして抽出物または培地上清がこれらのプールからアッセ イされ得る。次いで、任意のポジティブプールがさらに分けられ得、そしてこの 手順は単一のポジティブが同定されるまで繰り返される（「姉妹選択法」）。 Ｈ．インジゴ生合成 多くの染料（すなわち、色を与える薬剤）は、著しい需要を有する特別な化学 物質である。例えば、インジゴは、現在化学的に生産されている。しかし、トリ プトファン／インドール経路を介したグルコースからのインジゴの合成を可能に する９つの遺伝子がE.coliにおいて結合されている（Murdockら、Bio/Technolog y 11:381-386(1993)）。多くの操作がインジゴ合成を最適化するために行われた ：９つの遺伝子のクローニング、発酵培地の改変、ならびにいくつかの酵素の反 応速度および触媒活性を増大させるための２つのオペロンにおける指向された変 化。それにもかかわらず、細菌的に生成されたインジゴは、現在経済的な見込み がない。本発明の循環的配列組換え技術を使用して、インジゴ合成酵素発現レベ ルおよび触媒活性を最適化して、増大したインジゴ生成を導き得る。それにより 、このプロセスを商業的に利用可能にし、そしてインジゴ製造の環境影響を減少 させる。増大したインジゴ生成についてのスクリーニン グは、マイクロタイタープレートにおいて培養物の比色アッセイにより行われ得 る。 Ｉ．アミノ酸 特定に商業的に重要なアミノ酸として、フェニルアラニン、グルタミン酸ソー ダ、グリシン、リジン、スレオニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げ られるが、これらに限定されない。Backmanら（Ann．NY Acad．Sci．589:16-24( 1990)）は、生物選択を覆う系統的および下流ストラテジー、生合成能の最適化 、ならびに発酵および回収プロセスの開発を介した、E.coliにおけるフェニルア ラニンの増強した生成を開示した。 Simpsonら（Biochem Soc Trans，23:381-387(1995)）に記載されるように、ア ミノ酸生成の分野における現在の研究は、非常に分子的な詳細におけるこれらの 経路の調節に焦点があてられている。本発明の循環的配列組換え技術は、より高 い分泌されたアミノ酸収量を有する細菌株を得るために、この解析の必要性を除 去する。アミノ酸生成は、Serratia marcescens、Bacillus、およびCorynebacte rium-Brevibacterium群のような生物由来の、アミノ酸合成および分泌遺伝子な らびに調節ホスホエノールピルビン酸分岐点の酵素の循環的配列組換えを用いて 発現のために最適化され得る。本発明のいくつかの実施態様において、増強した 生成についてめスクリーニングは、好ましくは、所望のアミノ酸に特異的な当該 分野で周知の化学試験を用いて、マイクロタイターウェルにおいて行われ得る。 アミノ酸合成のスクリーニング／選択はまた、問題のアミノ酸を自分自身は合成 し得ない栄養要求性レポーター細胞を用いることにより行われ得る。これらのレ ポーター細胞がまたアミノ酸プロデューサーの増殖を刺激する化合物（これは、 増殖因子または異なるアミノ酸でさえもあり得る）を生成する場合、次いで、よ り多くのアミノ酸を生成するライブラリー細胞は、順により多くの増殖刺激物を 受け、従ってより急速に増殖する。 Ｊ．ビタミンＣ合成 L-アスコルビン酸（ビタミンＣ）は、1984年に35,000トン以上の世界生産を 有する商業的に重要なビタミンである。ほとんどのビタミンＣは、Reichsteinプ ロセスにより現在化学的に製造されているが、グルコースを2,5-ケト-グルコン 酸に、その産物を2-ケト−L-ヨウ素酸に、その前駆体をL-アスコルビン酸に変換 し得る細菌が最近操作された（Boudrant，Enzyme Microb．Technol．12:322-329 (1990)）。 細菌におけるこれらの酵素工程の効率は現在低い。この遺伝子を本発明の循環 的配列組換え技術を用いて遺伝子操作して、１つ以上のオペロンを作製し、続い てこのようなハイブリッドL-アスコルビン酸合成経路の発現最適化を行い、商業 的に利用可能な微生物ビタミンＣ生合成をもたらし得る。いくつかの実施態様に おいて、増強したL-アスコルビン酸生成についてのスクリーニングは、好ましく は、当該分野で周知のアッセイを用いてマイクロタイタープレートにおいて行わ れる。 VI．細胞特性の改変 中間代謝の操作の例は厳密でないが、循環的配列組換え技術を用いて、細胞特 性の他の局面を、増殖速度から特定の所望の化合物を分泌する能力に温度上昇ま たは他の環境ストレスを許容する能力に改善または変化させ得る。従来の方法に より操作された形質のいくつかの例として、細菌、酵母、および他の真核生物細 胞における異種タンパク質の発現、抗生物質耐性、ならびにファージ耐性が挙げ られる。これらの形質のいずれもが、本発明の循環的配列組換え技術により有利 に進化させられる。例として、１つの栄養取り込み系（例えば、Methylophilus methylotrophusにおけるアンモニア）のよりエネルギー効率的な別の系での置換 ；酸素制限条件下での増殖を改善するためのヘモグロビンの発現；毒性代謝終末 産物のおよびより少ない毒性化合物へ再指向；塩、乾燥および毒性化合物に対す る耐性ならびに病原体、抗生物質およびバクテリオファージに対する耐性を付与 する遺伝子の発現が挙げられ、これらはCameronら、ApplBiochem Biotechnol,38 :105-140(1993)に概説される。 これらの機能をコードする異種遺伝子は全て、存在する循環的配列組換え技術 により、それらの新規の宿主におけるさらなる最適化のための可能性を有す る。これらの機能は、所望の増殖条件下で細胞増殖速度を増大させるので、進化 による遺伝子の最適化は、単に、DNAを循環的に組換えること、および酸素制限 、より高い毒性化合物濃度、またはパラメーターが改善されるどんな適切な増殖 条件でもより早く増殖する組換え体を選択することを含む。 これらの機能は、所望の増殖条件下で細胞増殖速度を増大させるので、「進化 」による遺伝子の最適化は、単に、DNAを「シャッフリング」すること、および 酸素制限、より高い毒性化合物濃度、または克服されるどんな制限条件でも供な ってより早く増殖する組換え体を選択することを含み得る。 培養哺乳動物細胞はまた、増殖培地に存在するべき必須アミノ酸を必要とする 。この要求はまた、これらのアミノ酸を合成する異種代謝経路の発現により回避 され得る（Reesら、Biotechnology 8:629-633(1990)）。循環的配列組換えは、 哺乳動物細胞においてこれらの遺伝子発現を最適化する機構を提供する。もう一 度、好ましい選択が、添加されるアミノ酸の非存在下で増殖し得る細胞について 行われる。 本発明の技術による改善のためのさらに別の候補は、共生的窒素固定である。 根粒形成（nod、ndv）、窒素還元（nif、fix）、宿主範囲決定（nod、hsp）、バ クテリオシン産生（tfx）、表面多糖合成（exo）、およびエネルギー利用（dct 、hup）に関する遺伝子が同定されている（Paau、Biotech．Adv．9:173-184(199 1)）。 この場合における循環的配列組換えの主な機能は、より良好な窒素固定株とし て既に知られている株の生存を改善することにある。これらの株は、それらが窒 素固定においてより良好であっても、環境に既に存在する株との競合においてあ まり良好でない傾向がある。循環的配列組換えの標的（例えば、根粒形成および 宿主範囲決定遺伝子）が改変され、そして新規の宿主において増殖するそれらの 能力により選択され得る。同様に、その株の競合を改善する任意のバクテリオシ ンまたはエネルギー利用遺伝子もまた、より大きな増殖速度をもたらす。選択は 、単に、標的遺伝子を循環的配列組換えに供し、そして接種物を野生型窒素固定 細菌と競合させることにより行われ得る。より良好な窒素固定細菌が新規宿主で 増殖するほど、より多くのコピーのそれらの組換えられた 遺伝子が次ラウンドの組換えのために存在する。この増殖速度区別選択は、詳細 に先に記載される。 VI．バイオディテクター／バイオセンサー 生体発光または蛍光遺伝子は、それらを特定の調節遺伝子に融合させることに よりレポーターとして使用され得る（Cameronら、Appl Biochem Biotechnol,38: 105-140(1993)）。特定の例は、Vibrio fischeriのルシフェラーゼ遺伝子luxCDA BEが、Pseudomonas putida RE204由来のイソプロピルベンゼン異化オペロンの調 節領域に融合された例である。この融合構築物のE.coliへの形質転換は、種々の 疎水性化合物（例えば、置換ベンゼン、塩素化溶媒、およびナフタレン）に応答 して光を生じる株を生じた(Selifonavaら、Appl Environ Microbiol 62:778-783 (1996)）。この型の構築物は、汚染物質レベルの検出に有用であり、そして生物 学的に利用可能な（従って、潜在的に毒性の）これらの汚染物質を測定するだけ のさらなる利点を有する。他の単一の分子（例えば、クラゲ緑色蛍光タンパク質 ）もまた、環境中の化学物質に応答する遺伝子調節領域に融合され得る。これは 、種々の分子が、光、蛍光、またはいくつかの他の容易に検出されるシグナルを 生じるタンパク質の発現を誘導するそれらの能力により検出されるのを可能にす るはずである。 循環的配列組換えは、この型の生体検出系を改変するいくつかの方法において 使用され得る。例えば、緑色蛍光タンパク質の蛍光を増大させることにより、反 応の大きさを増大させるために使用され得る。循環的配列組換えはまた、他のシ グナル発生系（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）の誘導発現レベルまたは触媒活 性を増大させるために使用され得る。 循環的配列組換えはまた、バイオセンサーの特異性を変化させるために使用さ れ得る。調節領域ならびにこの領域および転写を誘導する化学物質と相互作用す る転写アクチベーターもまたシャッフルされ得る。これは、転写が正常なインデ ューサーのアナログにより活性化される調節系を生じるはずであり、異なる化学 物質に対するバイオディテクターが開発され得る。この場合、選択は、検出され る（新規の）特異的な化学物質により活性化される構築物に対して行 われる。スクリーニングは、所望の改善が光の発生であるので、蛍光（または光 ）活性化細胞選別により単純に行われ得る。 環境汚染物質の検出に加えて、任意の化学物質（ホルモン、増殖因子、金属、 および薬物）に反応するバイオセンサーが開発され得る。任意の化学物質に対す るレセプターは存在するか、またはレセプターは循環的配列組換えにより進化さ せられ得る。これらのレセプターは、転写の細胞内および直接的なアクチベータ ーであるか、またはそれらは、シグナルの転写を間接的に活性化する（例えば、 リン酸化カスケードにより）膜結合レセプターであり得る。それらはまた、決し て転写に作用し得ないが、シグナル発生経路の成分のいくつかの転写後修飾によ りシグナルを生じ得る。これらのレセプターはまた、異なるリガンドの結合を担 うドメインと異なるシグナルドメインとを融合することにより作製され得る。ま た、循環的配列組換えを使用して、発生するシグナルの大きさを増大させてキメ ラレセプターの発現および機能を最適化し、そしてレセプターにより検出される 化学物質の特異性を変化させ得る。 以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されない。 実施例 I. 酵素活性および特異性の変化 本実施例において、本発明の循環的配列組換え技術を使用して、E.coliβ-ガ ラクトシダーゼにより効率的に加水分解される基質の範囲を広げた。目標は、野 生型E.coliβ-ガラクトシダーゼをフコシダーゼに進化させることである。この 酵素は、ρ-ニトロフェニルーβ-D-フコピラノシドおよびο-ニトロフェニル-β -D-フコピラノシドの両方に非常に弱い活性を示した（それぞれ、ρ-ニトロフェ ニル-β-D-ガラクトピラノシドより80倍および160倍ほど効率的でないと評価さ れた）。 これらのフコピラノシド誘導体に対するE.coliβ-ガラクトシダーゼの活性を 増大させるために、E.coliβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子（プラ スミドpCH110,Pharmacia由来の3.8kb HindIII-BamHIフラグメント）を、プラス ミドp18SFI-BLA-SFI(Stemmer，Nature，370:389-391(1994))にサブクローニ ングした。得られたプラスミドp18-lacZを、循環的配列組換えおよび変異体スク リーニングのために使用した。 精製したプラスミドp18-lacZ（４〜５μg）を、DNaseIフラグメント化に直接 使用した。50〜200bpのサイズを有するフラグメントを、２％アガロースゲルか ら精製し、そして再組み立て(reassembly)PCR(Stemmer，Nature 370:389-391(19 94)）に使用した。組み立て反応は、製造者の供給緩衝液中のTthポリメラーゼ（ Perkin Elmer）を使用した。組み立てのためのPCRプログラムは以下の通りであ る：94℃、２分、次いで94℃、30秒；55℃、３秒；72℃、１分（１サイクルあた り＋５秒）；次いで最後に72℃、５分の40サイクル。 この反応物を、40マーのプライマ-p50F 5'-AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCC-3'およびpR34 5'-CTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCAT-3'を 用いて標準的なPCR反応物に100希釈した。これは、所望のDNAバンド（約４kbの サイズ）ならびに２つのより小さなサイズの産物（約600bpおよび100bpバンド） の両方の増幅をもたらした。PCR産物を、BamHIおよびHindIIIで消化し、そして 正しいサイズの産物を、BamHI-HindIII消化p18-lacZにクローニングした。得ら れた組換えlacZ変異体のプールを含むプラスミドを、カナマイシンおよび5-ブロ モ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-フコピラノシド（X-fuco）を補充したLBプレー トにプレートした。プレートを37℃で20時間インキュベートし、そしてX-fucoの 加水分解を示すかすかな青色のコロニーについてスクリーニングした。プラスミ ドDNAをポジティブコロニーから調製し、そしてこの手順を繰り返す。このよう に、６ラウンドの循環的配列組換えにより、X-fuco加水分解活性が10倍の増大を 生じた。 II. 全代謝経路の進化 全代謝経路の進化の実施例として、本発明の循環的配列組換え技術を使用して 、水銀塩に対する耐性をコードするプラスミドを改変した。Wangら(J．Bact.171 :83-92(1989))により開示されるこのプラスミドは、クローニングベクターpUC9 に挿入された13.5kbのBacillus DNA内に少なくとも８つの遺伝子を含む。このプ ラスミドに使用された循環的配列組換えプロトコルは以下の通りである。 プラスミドDNA（130μg/ml）を、50mM Tris-Cl(pH7.4)、10mM MnCl₂中の0.09U /ml DNAseで10分間25℃で消化した。DNAフラグメントはサイズ選択しなかったが 、フェノール抽出およびエタノール沈殿により精製した。組み立て反応を、以下 ：7.5％ポリエチレングリコール、8000MW；35mMテトラメチルアンモニウムクロ ライド；および４U/mlのPwo(Boehringer Mannheim)、Pfu(Stratagene)、Vent(Ne w England Biolabs)、Deep Vent(New England Biolabs)、Tfl(Promega)、または Tli(Promega)耐熱性DNAポリメラーゼを補充した製造者の供給緩衝液を用いて、T thポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いて行った。DNAフラグメントを約10μg/m lで使用した。 組み立てのためのPCRプログラムは以下の通りであった：94℃、20秒、次いで4 0サイクル（94℃、15秒；40℃、30秒；72℃、30秒（＋２秒／１サイクル））； 最後に72℃、10分。 次いで、組換えプラスミドを、プラスミドに含まれる比較的均等に間隔があい た３つのAlwNI制限部位に隣接しているプライマーを用いることにより、３つの フラグメントにおいて増幅した。これらのプライマーの配列は以下の通りである ： ３つのフラグメントを、プライマー１＋４（６kbフラグメント）、２＋５（４ kbフラグメント）、および３＋６（６kbフラグメント）を用いて増幅した。次い で、これらをAlwNIで消化し、ゲル精製し、そして共に連結した。AlwNIが非パリ ンドロームカッターであるので、プラスミドは正しい（最初の）順番で再組み立 のみし得る。得られたプラスミドを、E.coli DH10B株（Gibco BRL）に形質転換 し、そしてアンピシリン50μg/mlおよび漸増濃度の塩化水銀（100μM〜1000μM ）または酢酸フェニル水銀（50μM〜400μM）を含む栄養寒天上で選択し た。このように、２ラウンドの循環的配列組換えにおいて、これらの化合物に対 するE.coliの耐性は、10の係数で（約100〜約1,000μM）増大した。 III．関連酵素ファミリーの循環的配列組換え 本実施例において、ヌクレオチド配列を、C.freundii、E.cloacae、K.pneumon ia、およびY.enterocolitica由来の４つの相同なβ-ラクタマーゼ間で組換えた 。４つの遺伝子を、Stemmerら、Gene 164:49-53(1995)に記載されるオリゴヌク レオチドから合成した。簡単には、遺伝子の全コード配列を、市販のオリゴヌク レオチド合成機で重複する50マーのオリゴヌクレオチドとして合成した。次いで 、オリゴヌクレオチドを、標準的な循環的配列組換え反応、続いて４つ全ての遺 伝子に共通したプライマーを用いた増幅により完全長遺伝子に組み立てた。オリ ゴヌクレオチドを、組換え頻度を増大するための相同性ならびに同じ5'および3' 末端配列を増加させる目的により、合成遺伝子において最適E.coliコドン使用頻 度を与えるように設計した。遺伝子の組み立ておよび活性クローンについての選 択（必要であれば）の後、それらをDNase処理して、長さが50〜200bpのフラグメ ントを生成する。フラグメントを、15μlのKlenow(DNAポリメラーゼIラージフラ グメント)緩衝液（New England Biolabs）中で100μg/mlで溶解し、そして以下 のように手動PCRに供した：95℃、１分；ドライアイスおよびエタノール上での 凍結；25℃に暖め、そしてKlenow緩衝液中の２μlのKlenow（1U/μl）の添加；2 5℃で２分間のインキュベートの15サイクル。 次いで、手動PCR反応の５μlのアリコートを、標準Taq反応混合物（オリゴヌ クレオチドプライマーなし）に６倍に希釈し、そして94℃、30秒；40℃、30秒； および72℃、30秒の30サイクルからなる標準PCRプログラムを用いて組み立てた 。 次いで、この第２のPCR反応の４、８、または16μlのアリコートを、４つ全て のβ-ラクタマーゼ遺伝子に含まれる配列でプライムする以下のオリゴヌクレオ チドプライマーを含む標準Taq反応混合物に希釈した： 5'-AGGGCCTCGTGATACGCCTATT-3'および 5'-ACGAAAACTCACGTTAAGGGATT-3'。 完全長産物を、94℃、30秒；45℃、30秒；および72℃、45秒の25サイクルから なる標準PCRプログラムを用いて増幅した。 この手順により、その活性が抗生物質（アンピシリン、カルベニシリン、セフ ォタキシム、セフォキシチン、クロキサシリン、セフタジジム、セファロリジン 、モキサラクタムを含むが、これらに限定されない）に対して試験され得る、ハ イブリッドβ-ラクタマーゼ遺伝子が生成されて、そのように作製されたハイブ リッド酵素の特異性を決定した。モキサラクタムを、ハイブリッド遺伝子に対す る試験抗生物質として選択した。本研究で使用した最良の最初のβ-ラクタマー ゼ遺伝子は、0.125μg/mlのモキサラクタムに対する耐性を付与した。第１ラウ ンドの循環的配列組換えの後、４倍の増加を生じる、0.5μg/mlモキサラクタム に対する耐性を付与したハイブリッド遺伝子を単離した。 IV． 改善した砒酸塩解毒細菌を生成するためのシャッフリング 砒素解毒は、金鉱を含む硫砒鉄鉱の金採掘および他の使用（例えば、環境レメ ディエーション）に重要である。砒酸塩解毒オペロンをコードするオペロンを含 むプラスミドpGJ103（Wangら、(1989)Bacteriol．171:83、本明細書中に参考と して援用される）を、Siom Silver教授（イリノイ大学，Chicago，IL）から入手 した。pJG103を含むE.coli TG1（pUC19にクローニングされたp1258arsオペロン を含む）は、LB ampプレート上で４μg/mlのMIC（最小阻害濃度）を有した。全5 .5kbプラスミドを100〜1000bpのフラグメントにDNAseIでフラグメント化し、そ してPerkin Elmer XL-PCR試薬を用いるPCRにより再組み立てした。組み立て後、 プラスミドを、独特の制限酵素BamHIで消化した。完全長プロモーターをアガロ ースゲルから精製し、連結し、そしてE.coli TG1細胞にエレクトロポレーション した。形質転換細胞を、ある範囲の砒酸ナトリウム濃度（１回目では２、４、８ 、16mM）にプレートし、そして最も高い砒酸塩レベルを有するプレートから約10 00コロニーを、プレートをこそげることによりプールした。細胞を、同じ濃度の 砒酸塩の存在下で液体中で増殖させ、そしてプラスミドをこの培養物から調製し た。２および３ラウンド目は、細胞をより高い砒酸塩レベルにプレートした以外 は１ラウンド目と同じであった。８、16、32、64mMが２ラウンド目に使用された ；そして32、64、128、256mMが３ラウンド目の選択 に使用された。 最良の変異体を、128mMの砒酸塩（MIC=256）、64倍の改善まで一晩増殖させた 。改善した株のうちの１つは、TG1（野生型pGGJ103）が10mMまで液体中で増殖し たが、シャッフルされたTG1(変異体pGJ103)は150mM砒酸塩濃度まで増殖したこと を示した。 組み立てのためのPCRプログラムは、プライマーなしのサーキュラーPCRを用い た、94℃20秒、50×（94℃15秒、50℃１分、72℃30秒＋２秒／サイクル）であっ た。 ４サイクルのプロセスは、シャッフルされた砒酸塩耐性オペロンにより付与さ れた、砒酸塩に対する耐性において50〜100倍の改善をもたらした；改善された オペロンを含む細菌は、500mMの砒酸塩までを含む培地において増殖した。 前述の発明は、理解の明瞭の目的のための例示および例のために、いくらか詳 細に記載されたが、一定の変化および改変が、添付の請求の範囲の範囲内で実施 され得ることは明らかである。 本明細書中に引用された全ての参考文献は、明確に、全ての目的のためにそれ らの全体が援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／６５０，４００ (32)優先日 平成８年５月20日(1996．5．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞の生体触媒活性を進化させる方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）目的の反応を触媒する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子由来の少 なくとも第１および第２のDNAセグメントを組換えて、組換え遺伝子のライブラ リーを生成する工程であって、該セグメントは少なくとも２つのヌクレオチドに おいて互いに異なる、工程； （ｂ）野生型形態の遺伝子と比較して、該細胞による目的の反応を触媒する増 強した能力を付与するライブラリーから、少なくとも１つの組換え遺伝子をスク リーニングする工程； （ｃ）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 該少なくとも１つの遺伝子由来の、該第１および第２のセグメントと同一かまた は異なるさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらなるライブ ラリーを生成する工程； （ｄ）以前の組換え遺伝子と比較して、該細胞による目的の反応を触媒する増 強した能力を付与する組換え遺伝子のさらなるライブラリーから、少なくとも１ つのさらなる組換え遺伝子をスクリーニングする工程； （ｅ）必要であれば、該さらなる組換え遺伝子が、該細胞による目的の反応を 触媒する増強した能力の所望のレベルを付与するまで、（ｃ）および（ｄ）を繰 り返す工程、 を包含する、方法。 ２．前記目的の反応が、栄養供給源として基質を利用する能力である、請求項１ に記載の方法。 ３．前記目的の反応が、化合物を異化する能力である、請求項１に記載の方法。 ４．前記目的の反応が、化合物を解毒する能力である、請求項１に記載の方法。 ５．前記目的の方法が、目的の化合物を合成する能力である、請求項１に記載の 方法。 ６．前記化合物が抗生物質である、請求項５に記載の方法。 ７．前記化合物がアミノ酸である、請求項５に記載の方法。 ８．前記化合物がポリマーである、請求項５に記載の方法。 ９．前記化合物がカロテノイドである、請求項５に記載の方法。 １０．前記化合物がビタミンＣである、請求項５に記載の方法。 １１．前記化合物がインジゴである、請求項５に記載の方法。 １２．請求項１に記載の方法であって、少なくとも１つの組換え工程がインビト ロで行われ、そして得られた組換え体のライブラリーが、生体触媒活性が増強さ れるべき細胞に導入されて、異なる組換え体を含む細胞のライブラリーを作製す る、方法。 １３．請求項１２に記載の方法であって、前記インビトロ組換え工程が以下の工 程： 前記第１のセグメントおよび第２のセグメントを切断してフラグメントにする 工程； 該フラグメントを混合し、そして変性する工程；および 該変性されたフラグメントを、該変性されたフラグメントのアニーリングおよ び前記組換え遺伝子のライブラリーの形成を生じる条件下で、ポリメラーゼとイ ンキュベートする工程、 を包含する、方法。 １４．少なくとも１つの組換え工程がインビボで行われる、請求項１に記載の方 法。 １５．前記組換え工程が、生体触媒活性が増強されるべき細胞内で行われる、請 求項１に記載の方法。 １６．少なくとも１つのDNAセグメントが、目的の反応を触媒する能力を集合的 に付与する遺伝子のクラスターを含む、請求項１に記載の方法。 １７．目的の反応を触媒する能力を付与する遺伝子を進化させる方法であって、 該方法は以下の工程： （１）目的の反応を触媒する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子由来の少 なくとも第１および第２のDNAセグメントを組換えて、組換え遺伝子のライブラ リーを生成する工程であって、該セグメントは少なくとも２つのヌクレオチドに おいて互いに異なる、工程； （２）野生型形態の遺伝子と比較して、目的の反応を触媒する増強した能力を 付与するライブラリーから少なくとも１つの遺伝子をスクリーニングする工程； （３）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 該少なくとも１つの遺伝子由来の、該第１および第２のセグメントは同一かまた は異なるさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらなるライブ ラリーを生成する工程； （４）少なくとも１つのさらなる組換え遺伝子を、以前の組換え遺伝子と比較 して、目的の反応を触媒する増強した能力を付与する組換え遺伝子のさらなるラ イブラリーからスクリーニングする工程； （５）必要であれば、該さらなる組換え遺伝子が、目的の反応を触媒する増強 した能力の所望のレベルを付与するまで、（３）および（４）を繰り返す工程、 を包含する、方法。 １８．細胞において新たな生体触媒活性を生成させる方法であって、該方法は以 下の工程： （１）目的の第２の反応に関連した第１の反応を触媒する能力を付与する少な くとも１つの遺伝子由来の少なくとも第１および第２のDNAセグメントを組換え て、組換え遺伝子のライブラリーを生成する工程であって、該セグメントは少な くとも２つのヌクレオチドにおいて互いに異なり； （２）該目的の第２の反応を触媒する新たな能力を付与するライブラリーから 少なくとも１つの組換え遺伝子をスクリーニングする工程； （３）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 該少なくとも１つの遺伝子由来の、該第１および第２のセグメントと同一かまた は異なるさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらなるライブ ラリーを生成する工程； （４）少なくとも１つのさらなる組換え遺伝子を、以前の組換え遺伝子と比較 して、細胞において該目的の第２の反応を触媒する増強した能力を付与する組換 え遺伝子のさらなるライブラリーからスクリーニングする工程； （５）必要であれば、さらなる組換え遺伝子が、細胞において該目的の第２の 反応を触媒する増強した能力の所望のレベルを付与するまで、（３）および（４ ）を繰り返す工程、 を包含する、方法。 １９．細胞の改変形態であって、該改変は、循環的配列組換えにより進化させら れた代謝経路を含む、細胞の改変形態。 ２０．遺伝子産物の発現を最適化する方法であって、該方法は以下の工程： （１）遺伝子産物を生成する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子由来の少 なくとも第１および第２のDNAセグメントを組換えて、組換え遺伝子のライブラ リーを生成する工程であって、該セグメントは少なくとも２つのヌクレオチ ドにおいて互いに異なり； （２）少なくとも１つの組換え遺伝子を、野生型形態の遺伝子と比較して、該 遺伝子産物の最適化された発現を付与するライブラリーからスクリーニングする 工程； （３）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 該少なくとも１つの遺伝子由来の、第１および第２のセグメントと同一かまたは 異なるさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え遺伝子のさらなるライブラ リーを生成する工程； （４）少なくとも１つのさらなる組換え遺伝子を、以前の組換え遺伝子と比較 して、該遺伝子産物を生成する最適化された能力を付与する組換え遺伝子のさら なるライブラリーからスクリーニングする工程； （５）必要であれば、さらなる組換え遺伝子が、該遺伝子産物を発現する最適 化された能力の所望のレベルを付与するまで、（３）および（４）を繰り返す工 程、を包含する。 ２１．前記少なくとも１つの遺伝子が前記遺伝子産物をコードする、請求項２０ に記載の方法。 ２２．前記少なくとも１つの遺伝子が、前記遺伝子産物をコードする遺伝子を含 むベクターである、請求項２０に記載の方法。 ２３．少なくとも１つの組換え工程がインビボで行われる、請求項２０に記載の 方法。 ２４．前記組換え工程が、前記遺伝子産物が発現される宿主細胞において行われ る、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記少なくとも１つの遺伝子が宿主細胞遺伝子であり、そして該宿主細胞 遺伝子が前記遺伝子産物をコードしない、請求項２０に記載の方法。 ２６．最適化が、前記遺伝子産物の増大した発現をもたらす、請求項２０に記載 の方法。 ２７．目的の化合物Ａのバイオセンサーを進化させる方法であって、該方法は以 下の工程： （１）関連化合物Ｂを検出する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子由来の 少なくとも第１および第２のDNAセグメントを組換えて、組換え遺伝子のライブ ラリーを生成する工程であって、該セグメントは少なくとも２つのヌクレオチド において互いに異なる、工程； （２）野生型形態の遺伝子と比較して、化合物Ａを検出する最適化された能力 を付与するライブラリーから、少なくとも１つの組換え遺伝子をスクリーニング する工程； （３）少なくとも１つの組換え遺伝子由来の少なくとも１つのセグメントと、 該少なくとも１つの遺伝子由来のさらなるDNAセグメントとを組換えて、組換え 遺伝子のさらなるライブラリーを生成する工程； （４）以前の組換え遺伝子と比較して、化合物Ａを検出する最適化された能力 を付与する組換え遺伝子のさらなるライブラリーから、少なくとも１つのさらな る組換え遺伝子をスクリーニングする工程； （５）必要であれば、さらなる組換え遺伝子が、化合物Ａを検出する最適化さ れた能力の所望のレベルを付与するまで、（３）および（４）を繰り返す工程、 を包含する、方法。 ２８．最適化が、前記バイオセンサーによる応答の増大した大きさをもたらす、 請求項２７に記載の方法。 ２９．化合物Ａおよび化合物Ｂが異なる、請求項２７に記載の方法。 ３０．化合物Ａおよび化合物Ｂが同一である、請求項２７に記載の方法。