JP2011521626A - Ｒｎａポリホスファターゼの組成物、キットおよびそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、当該分野においてこれまでに教示されていないＲＮＡ５’ポリホスファターゼ酵素の発見、当該酵素を見出す方法、当該酵素の組成物、当該酵素の製造方法、ならびに生物医学的な研究、ヒトおよび非ヒトの診断、治療薬の製造、および他の用途のために当該酵素を使用する種々の方法およびキットに関する。より詳細には、いくつかの実施形態は、生物学的な試料またはインビトロキャップ形成反応から得られた試料を用いる、キャップ形成されているＲＮＡの単離、精製、生成およびアッセイに、ＲＮＡポリホスファターゼを使用する組成物、キットおよび方法を提供する。上記試料はまた、キャップ形成されていないＲＮＡを含有している。他の実施形態は、ＲＮＡポリホスファターゼが分析物特異的なアッセイのためのシグナル増幅酵素を含んでいる、組成物、キットおよび方法を提供する。

Description

本願の特許請求の範囲は、２００８年５月２日に出願された米国出願６１／０５０，０４１号に対する優先権を主張するものである。当該出願の引用によって、その全体が本願に援用される。
本発明は、当該分野において教示されていない酵素、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼの発見に関し、当該酵素の発見の方法、当該酵素を含んでいる組成物、当該酵素を作製する方法、ならびに生物医学的な研究、ヒトおよび非ヒトにおける診断、治療薬の製造、および他の用途に対して当該酵素を使用する方法およびキットに関する。特に、いくつかの実施形態は、キャップ形成されていないＲＮＡを含んでいる生物学的な試料またはインビトロキャップ形成反応に由来する試料を用いた、キャップ形成されているＲＮＡの分離、精製、生産およびアッセイにＲＮＡポリホスファターゼを使用するキットおよび方法を提供する。他の実施形態は、ＲＮＡポリホスファターゼが分析物に特異的なアッセイにとってのシグナル増幅酵素を構成している組成物、キットおよび方法を提供する。
ＲＮＡ分子の５’末端上の化学的な部分は、細胞または生体におけるＲＮＡ分子の構造、安定性、生化学的な過程、輸送、生物的機能および運命に影響する。ＲＮＡの５’末端に一般的に見られる化学的な部分は、三リン酸基、一リン酸基、ヒドロキシル基、キャップヌクレオチドである。５’末端における特定の化学的な部分は、ＲＮＡの生成、プロセシング、成熟および安定性に関する重要な手かがりを提供する。新たに同定されたＲＮＡにおけるこの’部分の性質決定によって細胞における当該ＲＮＡの役割さえも示唆され得る。
例えば、バクテリアｍＲＮＡ、原核生物の低分子量のリボソームＲＮＡ、真核生物の低分子量のリボソームＲＮＡ（例えば５Ｓまたは５．８Ｓ ｒＲＮＡ）および転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、一般的に５’三リン酸基を有している。
高分子量のリボソームＲＮＡ（例えば、真核生物の１８Ｓおよび２６Ｓもしくは２８ＳｒＲＮＡ、または原核生物の１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡ）ならびに真核生物のマイクロＲＮＡまたはウイルスにコードされているマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、一般的に５’一リン酸基を有している。また、前ｍＲＮＡスプライシング反応に由来する最初に生成されるイントロンＲＮＡ分子の少なくともいくつかは、５’リン酸基を有している。
ＲＮａｓｅＡによって分解されたＲＮＡ、およびその他のヌクレオチド鎖を切断するように処理されたＲＮＡ分子は、５’ヒドロキシル基を有している。
真核細胞のｍＲＮＡのほとんどおよび真核生物に感染するウイルス性のｍＲＮＡのほとんどは、５’末端に“キャップ”または“キャップヌクレオチド”（例えば、一次ｍＲＮＡ（primary mRNA）のほとんどの５’−ヌクレオチドの５’−炭素に対して順に連結されている三リン酸基に対して、５’炭素を介して連結されている“Ｎ７−メチルグアノシン”または“ｍ7Ｇ”キャップヌクレオチド）。さらに、“非コーディングＲＮＡ”または“ｎｃＲＮＡ”と呼ばれる、タンパク質に転写されない真核生物のＲＮＡのいくつかが、教示されており、それらのいくつかは、キャップ形成されている。また、キャップ形成されているｎｃＲＮＡのいくつかは、真核生物のｍＲＮＡのほとんどと同様に、３’ポリ（Ａ）テイルを有している。例えば、Rinn, JL et al.（Cell 129: 1311-1323, 2007）には、１つのキャップが形成されており、ポリアデニル化されている２．２ＫのｎｃＲＮＡ（"ＨＯＴＡＩＲ"と呼ばれる）について記載されている。当該ｎｃＲＮＡは、ヒト染色体１２のＨＯＸＣ領域にコードされており、ヒト染色体２におけるＨＯＸＤ遺伝子の発現に対する大きな影響を示す。さらに、試料における真核生物の他のＲＮＡ（例えば小分子核ＲＮＡ（“ｓｎＲＮＡ”）および前ｍｉＲＮＡ）は、キャップ形成されている。
真核生物細胞およびウイルスのｍＲＮＡ（および他の形態のＲＮＡのいくつか）の５’キャップは、ｍＲＮＡ代謝において重要な役割を果たし、核におけるｍＲＮＡ転写物のプロセシングおよび成熟、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、ｍＲＮＡの安定性、ならびにｍＲＮＡからタンパク質への効率的な翻訳のために程度を変更する必要がある。例えば、キャップは、タンパク質合成の開始、真核生物のｍＲＮＡのプロセシング、および当該ｍＲＮＡのインビボにおける安定性において、中心的な役割を果たしている。キャップは、５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）活性に対して耐性を付与し、キャップがない場合、ｍＲＮＡは、５’エキソリボヌクレアーゼによる急速な解を受ける（例えば、Mol. Biol. Med. 5: 1-14, 1988; Cell 32: 681-694, 1983を参照すればよい）。したがって、真核細胞への導入（例えば、卵母細胞への微量注入、または細胞へのトランスフェクションを介する）および真核細胞における発現のために（例えば、インビトロにおいて）調製されるｍＲＮＡは、キャップ形成されるべきである。
真核生物に感染するウイルスのＲＮＡの多くは、キャップ形成されている場合にのみ感染性を示し、キャップ形成されていないＲＮＡ分子（すなわちＲＮＡ分子が“キャップを有していない”）が、トランスフェクションまたは微量注入によって細胞に導入された場合に、細胞のＲＮａｓｅによって素早く分解される（例えば、Krieg, and Melton, Nucleic Acids Res. 12: 7057, 1984; Drummond, et al. Nucleic Acids Res. 13: 7375, 1979を参照すればよい）。
真核細胞の遺伝子および真核生物に感染するウイルスの遺伝子の一次転写物は、これらのコーディング領域における介在配列（イントロン）のプロセシングおよび除去を必要とする。また、キャップ形成は、前ｍＲＮＡの安定化という利点を与える。例えば、前ｍＲＮＡにおけるキャップの存在は、酵母における前ｍＲＮＡのインビボにおけるスプライシングを促進させるが、インビトロまたはインビボにおける酵母スプライシング系のいずれかにおいて、スプライシングを必要としないことが示された（Fresco, LD and Buratowski, S, RNA 2: 584-596, 1996、Schwer, B et al., Nucleic Acids Res. 26: 2050-2057, 1998、Schwer, B and Shuman, S, RNA 2: 574-583, 1996を参照すればよい）。前ｍＲＮＡが、キャップの非存在において５'エキソリボヌクレアーゼによって素早く分解されるので、スプライシングの促進は、主に前ｍＲＮＡの増大した安定性に起因する。（Schwer, B, Nucleic Acids Res. 26: 2050-2057, 1998を参照すればよい）。したがって、インビトロにおけるＲＮＡスプライシング実験のために合成された転写物が、キャップ形成を受けていることは、有利である。
キャップ形成されているｍＲＮＡは、核から移出たれた後に細胞質に留まり、他のＲＮＡのいくつか（例えば、ｓｎＲＮＡのいくつか）は、さらにメチル化されているキャップを有しており、それから核に移入され、ここで、これらは前ｍＲＮＡからのイントロンのスプライシングを伴って、ｍＲＮＡのエキソンを生成する（Mattaj, Cell 46: 905-911, 1986、Hamm et al., Cell 62: 569-577, 1990、Fischer, et al., J. Cell Biol. 113: 705-714, 1991を参照すればよい）。スプライシング反応は、５'一リン酸基を有しているＲＮＡを最初に含んでいるスプライスされたイントロンＲＮＡを生成する。
ＲＮＡの５’末端を修飾する酵素は、インビトロにおける様々なＲＮＡ分子を同定し、研究し、操作するための有用なツールである。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（例えば、ＡＰＥＸ（商標）アルカリホスファターゼ（EPICENTRE Technologies, Madison, WI, USA）；エビのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）；またはＡｒｃｔｉｃアルカリ性ホスファターゼ（New England Biolabs, MA））は、５’三リン酸基（例えば、キャップ形成されていない一次ＲＮＡ）および５’一リン酸基（例えばｒＲＮＡ）を５’ヒドロキシル基に転化し、ヒドロキシル基を有しているが、キャップ形成されているＲＮＡに影響しないＲＮＡを生成する。
核酸ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）（例えば、タバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ））は、三リン酸基（例えば、キャップ形成されている５’三リン酸化されたＲＮＡおよびキャップ形成されていない５’三リン酸化されたＲＮＡの両方の）を切断して、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを合成する。Ｄｃｐ１／Ｄｃｐ２複合体の脱キャップ酵素（すなわち“Ｄｃｐ２型”の脱キャップ酵素）は、キャップ形成されているＲＮＡ（例えばｍ7Ｇキャップ形成されているＲＮＡ）を、５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化するが、５’三リン酸基を有しているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化しない。Ｄｃｐ１／Ｄｃｐ２複合体の上記脱キャップ酵素は、例えば、酵母の脱キャップ酵素、哺乳類も脱キャップ酵素、Arabidopsis thalianaの脱キャップ酵素、ワクシニアウイルスの脱キャップ酵素である。ワクシニアウイルスの脱キャップ酵素は、例えば、ワクシニアウイルスの脱キャップ酵素Ｄ９またはＤ１０である。キャップ形成酵素は、５’三リン酸基を有しているＲＮＡまたは５’二リン酸基を有しているＲＮＡを、キャップ形成されているＲＮＡに転化する。上記キャップ形成酵素は、例えば、ポックスウイルスのキャップ形成酵素、ワクシニアウイルスのキャップ形成酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素、またはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標） キャップ形成酵素（EPICENTRE）が挙げられる。ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えばＴ４ ＰＮＫ）は、ＲＮＡ分子の５'末端のヒドロキシル基を一リン酸基化して、ＲＮＡ分子の３'末端の一リン酸基（例えば、ＲｎａｓｅＡの作用から生成される３'一リン酸基）を除去する。さらに、５'エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）は、５’一リン酸化されているＲＮＡをモノヌクレオチドに消化するが、５’三リン酸基、５’キャップまたは５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡを消化しない。上記５’エキソリボヌクレアーゼは、例えば、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ Ｉエキソリボヌクレアーゼ、またはＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標） ５’リン酸基依存性のエキソリボヌクレアーゼ（EPICENTRE）である。
また、ＲＮＡリガーゼの反応特異性は、異なる５’末端基を有しているＲＮＡ分子を識別するための有用なツールであり得る。この酵素は、特にドナーＲＮＡにおける５’一リン酸基とアクセプターオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチド）における３’ヒドロキシル基との間における、ホスホジエステル結合の形成の触媒する。したがって、試料に存在するか、または処理によって得られる、５’末端に一リン酸基を有しているＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼによって３’ヒドロキシ基を有しているアクセプター核酸との連結にとってのドナー基質である。当該処理は、例えば、５’三リン酸化されたＲＮＡ、または５’末端キャップ形成されているＲＮＡのＴＡＰを用いた処理である。上記ＲＮＡリガーゼは、例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（EPICENTRE）またはバクテリオファージＴＳ２１２６ ＲＮＡ リガーゼ（EPICENTRE）である。５’三リン酸基、５’二リン酸基、５’ヒドロキシル基または５’ヌクレオチドキャップを有しているＲＮＡ分子は、ＲＮＡリガーゼのドナー分子として機能しない。したがって、試料に存在するか、または処理（例えば、ＴＡＰを用いた処理）によって得られる、５’末端にヒドロキシ基を有しているＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼのドナーとして機能し得ない。同様に、３’末端に封鎖基（例えば、例えば、３’リン酸基または３’−β−メチオキシフェニルホスフェト基）を有しているＲＮＡ分子は、ＲＮＡリガーゼのアクセプター基質として機能しない。
多くの公開物に、ｍ7Ｇキャップ形成されている真核生物のｍＲＮＡを操作するための、アルカリ性リン酸塩（ＡＰ）、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）およびＴ４ ＲＮＡリガーゼの用途について開示されている。公開物は、例えば、国際公開公報第０１０４２８６号；国際公開公報第２００７／１１７０３９号；米国特許第５，５９７，７１３号；Suzuki, Y and Sugano, S, Methods in Molecular Biology, 175: 143 - 153, 2001, ed. by Starkey, MP and Elaswarapu, R, Humana Press, Totowa, NJ；Fromont-Racine, M et al., Nucleic Acids Res. 21: 1683-4, 1993；およびin Maruyama, K and Sugano, S, Gene 138: 171-174, 1994である。これらの方法においては、真核生物のＲＮＡまたはポリアデニル化されている単離されたＲＮＡの総量は、ＡＰを用いて最初に処理する。ＡＰは、５’三リン酸基を有しているＲＮＡ（例えば、キャップ形成されていない一次ＲＮＡ）および５’一リン酸基を有しているＲＮＡを、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに転化する。それから、上記試料をＴＡＰを用いて処理する。ＴＡＰは、５’−キャップ形成されている真核生物のｍＲＮＡを、５’一リン酸基を有しているｍＲＮＡに転化する。それから、得られた５’一リン酸化されているｍＲＮＡは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いてアクセプターオリゴヌクレオチドに連結される。得られた”少数のキャップが形成されている”ｍＲＮＡは、一本鎖ｃＤＮＡおよび二本鎖ｃＤＮＡの合成に使用される。当該ｍＲＮＡは、例えば、全長のｃＤＮＡライブラリの生成、および配列決定もしくは５’ＲＡＣＥといった方法によって真核生物のｍＲＮＡの５’末端の同定のために使用される。
遺伝子発現および生物的代謝におけるキャップ形成されているＲＮＡの重要性をかんがみて、研究、産業、農業および医療を目的とする、各種のキャップ形成されているＲＮＡの試験および使用に、現在、多大な関心が集まっている。したがって、当該分野において必要とされているのは、キャップ形成されていない他のＲＮＡをも含む試料における、キャップ形成されているＲＮＡ分子の単離、精製、生成およびアッセイのための改善された方法である。
したがって、キャップ形成されているＲＮＡを除去しない条件において、キャップ形成されていないＲＮＡを選択的に除去する方法が、必要とされている。酵素はこの目的のための有用なツールであり得る。しかし、本発明より以前には、当該分野において、キャップ形成されている真核生物のｍＲＮＡを消化せずに、一次ＲＮＡ（例えば、キャップ形成されていない真核生物の一次ＲＮＡまたは細菌のｍＲＮＡ）の５’三リン酸基を５’一リン酸基に選択的に消化するための、十分に性質決定された酵素が証明されていなかった。これは、この選択的な酵素活性を有している酵素が、キャップ形成されていない一次ＲＮＡをも含んでいる試料における、キャップ形成されているＲＮＡの分離、精製、製造または定量に使用され得るので、遺憾な点である。したがって、当該分野に必要とされているのは、十分に性質決定されているＲＮＡ５’ポリホスファターゼ酵素、当該酵素を含んでいるキット、およびそれらに関する方法である。
当該分野に必要とされているのは、一次ＲＮＡ転写物の５’三リン酸基を５’一リン酸基に転化し得る、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ酵素の組成物、およびキャップ形成されている所望のＲＮＡを５’一リン酸基に転化せずに、５’三リン酸基を含んでいるキャップ形成されていない所望されない一次ＲＮＡを、５’一リン酸基を有しているＲＮＡへ選択的に転化するために、ＲＮＡポリホスファターゼ酵素の上記組成物を使用する方法である。
さらに必要とされているのは、（例えば、キャップ形成されているＲＮＡ分子のみからなる組成物の準備、真核細胞（例えば、卵母細胞または体細胞）における発現、研究用途および治療用途を目的として）試料に含まれている５’一リン酸基を有しているＲＮＡ、およびＲＮＡ５’ポリホスファターゼ酵素反応によって得られた生成物に含まれている５’一リン酸基を有しているＲＮＡの両方を選択的に除去するために、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ酵素の組成物と組み合わせるか、または当該組成物に加えて、１つ以上の他の酵素を使用する方法、組成物、および酵素を含んでいるキットである。
さらにまた、リン酸基を除去可能な酵素（例えばホスファターゼおよびピロホスファターゼ）は、研究、分子診断、免疫診断および他の用途にとっての生体分子を検出するシグナル増幅物質として、当該分野において広く知られており、広く使用されている。例えば、これらのリン酸除去酵素は、核酸、タンパク質および他の分析物の高感度な検出のためのシグナル増幅物質として使用する、小分子（例えば、ビオチンまたはジゴキゲニン）との抱合物、ならびに核酸またはタンパク質（例えば、ストレプトアビシン、プロテインＡ、一次抗体または二次抗体）との抱合物の作製に広く使用されている。広く使用されているリン酸除去酵素の１つは、子ウシの腸または細菌から得られたアルカリホスファターゼである。しかし、当該技術に使用されるシグナル増幅酵素は、ホモダイマーとして活性を有しており、かつ触媒として二価の金属カチオンを必要とするので、これらの酵素は、サブユニットが解離してアッセイの感度を低下させ得るために、特定のアッセイにおいて好ましくない場合がある。また、当該技術におけるシグナル増幅酵素が二価の金属イオンを必要とするので、いくつかのアッセイにおけるそれらの使用は、困難であるか、もしくは不可能であるか、または追加のアッセイのステップが必要であるので、不都合である。したがって、当該技術に必要とされているのは、核酸、タンパク質または分析物を高感度に検出するシグナル増幅物質として使用するための、二価の金属イオンの非存在下においてリン酸基を除去する酵素活性を示す単一のサブユニットの酵素である。必要とされているのは、シグナル増幅物質として使用するための、親和性結合分子との抱合物の作製に使用され得る単一のサブユニットの酵素である。
また、当該技術に使用されるシグナル増幅酵素は、ホモダイマーとして活性を示すので、シグナル増幅酵素およびタンパク質性の親和性結合分子（例えば、アトレプトアビシン、単鎖の人工抗体、またはプロテインＡ）からなる融合タンパク質を遺伝子組換えし、作製することがさらに困難である。したがって、当該技術にさらに必要とされているのは、シグナル増幅酵素および親和性結合分子からなる融合タンパク質をシグナル増幅物質として使用するための遺伝子組換えに使用され得る、単一のサブユニットの酵素である。
いくつかの実施形態において、本発明は、実質的に精製されているＲＮＡポリホスファターゼ（例えば、E. coli由来）、または当該ＲＮＡポリホスファターゼをコードしている精製されている核酸配列を含んでいる組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、実質的に精製されているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる組成物を提供する。当該ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号２のうちの少なくとも６の連続するアミノ酸を含んでいる。
特定の実施形態において、上記ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号２の少なくとも６（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０）の連続するアミノ酸を含んでいる。他の実施形態において、上記ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号２に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％または９９％）同一である。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％同一である。さらなる実施形態において、上記ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡポリホスファターゼは配列番号２を含んでいる。他の実施形態において、上記ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号２からなるか、または本質的に配列番号２からなる。さらなる実施形態において、上記ＲＮＡポリホスファターゼは、１つ以上の保存的なアミノ酸変化を有している配列番号２からなる。
いくつかの実施形態において、本発明は、実質的に精製されているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる組成物を提供する。当該ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号１のうちの少なくとも１８の連続する塩基を含んでいる核酸分子、または配列番号１を含んでいるか、もしくは配列番号１からなる核酸配列によってコードされている。特定の実施形態において、上記核酸分子は、配列番号１のうちの少なくとも５０の連続する塩基を含んでいる。
さらなる実施形態において、上記核酸分子は、配列番号と実質的に相同である。他の実施形態において、上記核酸分子は、配列番号１と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９９％）相同である。いくつかの実施形態において、上記組成物は、細菌細胞からなる天然の生成源、ならびに組換えの生成源（ここで、ＲＮＡポリホスファターゼの遺伝子が原核生物または真核生物の宿主細胞において発現される）のなかから選択される生成源から入手される。さらなる実施形態において、天然の生成源は、E. coliまたはShigellaの細菌細胞である。特定の実施形態において、E. coliまたはShigellaの細菌細胞から得られる上記ＲＮＡポリホスファターゼは、細菌細胞が培養されている培養培地に硫酸亜鉛を加えることを包含している方法によって生成される。他の実施形態において、硫酸亜鉛は０．２ｍＭである。
特定の実施形態において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｌ）の核酸配列によってコードされているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる組成物を提供する。（ａ）ホスホグリセンリン酸ムターゼ様スーパーファミリーにとってのモチーフを含んでいる配列；（ｂ）アルミニウム誘導性（ａｉｓ）の遺伝子である配列；（ｃ）E. coliのＫ２１株（ＭＧ１６５５）における５０．４マイニュート（minutes）に位置し、当該タンパク質が遺伝子座タグｂ２２５２を有している配列；（ｄ）宿主細胞において発現される配列番号１に相補的なｍＲＮＡをコードしている配列；（ｅ）ベクターにクローニングされているＲＮＡポリホスファターゼの遺伝子から宿主細胞において発現される配列；（ｆ）Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼにとってのプロモータの下流においてベクターにクローニングされている配列（ここで、宿主細胞がＴ７型のＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能である）；（ｇ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにとってのプロモータの下流においてベクターにクローニングされている配列（ここで、宿主細胞がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能である）；（ｈ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにとってのプロモータの下流においてベクターにクローニングされている配列（ここで、宿主細胞がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能である）；（ｉ）E. coli宿主細胞の染色体または染色体外ＤＮＡに挿入されている配列；（ｊ）誘導可能なプロモータに連結されており、ＥＺ−ＴＮ（商標）トランスポゾン、ＨＹＰＥＲＭＵ（商標）もしくは人工的なＭｕトランスポゾン、トランスポザーゼをコードしていない人工的な他のトランスポゾンのなかから選択される人工的なトランスポゾンを用いて、Escherichia coliの宿主細胞の染色体に挿入されている配列；（ｋ）配列番号１の完全な配列を含んでいる配列；または（ｌ）配列番号１のうちの１０３から６０３ヌクレオチドを含んでいる配列。
他の実施形態において、実質的に精製されているＲＮＡポリホスファターゼは、（ａ）配列番号２のうちの少なくとも６の連続するアミノ酸を含んでいるアミノ酸配列を示す単一のポリペプチドを含んでいるか；（ｂ）約２４ｋＤの分子量を有しているか；（ｃ）アミノ末端の最初の４アミノ酸がＭＬＡＦであるアミノ酸配列を示しているか；（ｄ）約１９ｋＤの分子量を有しているか；（ｅ）アミノ末端の最初の４アミノ酸がＳＮＧＬであるアミノ酸配列を示しているか；（ｆ）ＥＤＴＡの存在下において活性であり、その酵素活性が酵素反応混合物における１ｍＭ以上の濃度のＭｇ2+カチオンの存在によって阻害されるか；（ｇ）反応緩衝液がｐＨ７．５の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＭＥおよび０．０１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００からなり、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を基質として使用する場合と比べて、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＤｉＦＭＵＰ）を基質として使用する場合に少なくとも５０倍以上の酵素活性を有しているか；または（ｈ）当該ＲＮＡポリホスファターゼを発現している細胞の周辺質の画分から精製されるか、もしくは単離される。いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＮＡポリホスファターゼを備えているキットを提供する。
特定の実施形態において、本発明は、５’エキソリボヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＲＮＡ５’モノホスファターゼおよびキャップ形成酵素系からなる群から選択される少なくとも１つの他の構成要素と組み合わせて、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼを備えているキットを提供する。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡ５’ポリホスファターゼが、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼ１およびShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼからなる群から選択され；上記５’エキソリボヌクレアーゼが、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ ＩエキソリボヌクレアーゼおよびＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼからなる群から選択され；上記ポリヌクレオチドキナーゼが、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼから選択され；上記キャップ形成酵素系が、ポックスウイルスのキャップ形成酵素系、ワクシニアのキャップ形成酵素系、Saccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素系、およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標）キャップ形成酵素キットからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＮＡポリホスファターゼ、およびマグネシウムを実質的に含んでいない保存緩衝液もしくは反応緩衝液を備えているキットを提供する。
他の実施形態において、本発明は、ＲＮＡポリホスファターゼと、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ＥＤＴＡ、β−メルカプトエタノール、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、およびＲＮａｓｅを含んでいない水のうちの１つ以上を含んでいる反応緩衝液とを備えているキットを提供する。
特定の実施形態において、本発明は、ＲＮＡポリホスファターゼと、グリセロール、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のうちの１つ以上を含んでいる保存緩衝液とを備えているキットを提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または細胞の抽出物もしくは画分から得られるタンパク質を含んでいる試料におけるＲＮＡポリホスファターゼを同定するか、入手するか、単離するか、または精製する方法を提供する。当該方法は、（Ａ）上記試料における上記タンパク質を分離することによって、分離されたタンパク質の溶液の回収物を入手するステップ；（Ｂ）ＲＮＡポリホスファターゼが活性である本明細書に記載の条件において、分離されたタンパク質の上記溶液のそれぞれを、βリン酸またはγリン酸の少なくとも１つが標識されている５’三リン酸基または５’二リン酸基を有しているＲＮＡ分子と接触させ、かつ標識されている上記βリン酸またはγリン酸がＲＮＡ分子から除去されているか否かを検出するステップ；（Ｃ）標識されている上記βリン酸またはγリン酸がＲＮＡ分子から除去されている、分離されたタンパク質の溶液のなかから、上記ＲＮＡ分子の上に５’αリン酸が存在している、分離されたタンパク質の溶液を同定することによって、ＲＮＡポリホスファターゼを同定するか、入手するか、単離するか、または精製するステップを包含している。
特定の実施形態において、上記ＲＮＡ分子の上に５’αリン酸が存在している、分離されたタンパク質の溶液を同定するステップ（３）は、標識されている上記リン酸がステップ（２）において除去されたＲＮＡ分子を、５’エキソリボヌクレアーゼが、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを消化し、５’三リン酸基または５’二リン酸基を有しているＲＮＡを消化しないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップを包含している。当該ステップにおいて、上記ＲＮＡ分子の消化がＲＮＡポリホスファターゼの存在を示す。
いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡ分子上に５’αリン酸が存在している、分離されたタンパク質の溶液を同定するステップ（３）は、上記ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドが５’一リン酸基を有している上記ＲＮＡ分子の５’末端に連結されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、標識されている上記リン酸がステップ（２）において除去されたＲＮＡ分子を、ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させるステップを包含している。当該ステップにおいて、上記ＲＮＡ分子に対する上記ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドの連結がＲＮＡポリホスファターゼの存在を示す。
他の実施形態において、本発明は、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化し、キャップ形成されているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化しない方法を提供する。当該方法は、（１）キャップ形成されているＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを含んでいる試料、ならびにＲＮＡポリホスファターゼを準備するステップと；（２）５’α一リン酸基を除くすべてのリン酸が除去され、５’一リン酸を有しているＲＮＡが生成されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、上記試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップを包含している。
さらなる実施形態において、５’三リン酸基を有している上記ＲＮＡが、真核生物の一次ＲＮＡ；原核生物の一次ＲＮＡ；ｎｃＲＮＡ；およびＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応（当該インビトロ転写反応がＲＮＡ増幅反応の一部である場合が挙げられる）において合成されるＲＮＡのなかから選択される。さらなる実施形態において、５’二リン酸基を有している上記ＲＮＡは、キャップ形成酵素系のＲＮＡトリホスファターゼを用いた、一次ＲＮＡ転写物の消化生成物である。
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡをも含んでいる試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製する方法を提供する。当該方法は、（１）キャップ形成されているＲＮＡ、ならびに５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよび５’一リン酸基を有しているＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡと；ＲＮＡポリホスファターゼと；５’エキソリボヌクレアーゼとを準備するステップ；（２）５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）から得られた試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップ；ならびに（３）５’一リン酸基を有しているＲＮＡが消化され、キャップ形成されているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（２）から得られた試料を５’エキソリボヌクレアーゼと接触させることによって、キャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製するステップを包含している。
特定の実施形態において、５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡは、５’三リン酸基を有しているＲＮＡおよび５’二リン酸基を有しているＲＮＡからなる群から選択される。さらなる実施形態において、入手されるか、単離されるか、または精製されるキャップ形成されている上記ＲＮＡは、治療用途または研究用途のための真核生物の細胞を形質転換するために使用される。いくつかの実施形態において、入手されるか、単離されるか、または精製されるキャップ形成されている上記ＲＮＡは、樹状細胞、マクロファージ、上皮細胞およびワクチン調製用の人工の抗原提示細胞のなかから選択される抗原提示細胞（ＡＰＣ）をトランスフェクションするために使用される。他の実施形態において、ステップ（１）において準備されたキャップ形成されているＲＮＡは、（ｉ）生物学的な試料から入手されるか、または（ｉｉ）転写と同時のインビトロキャップ形成反応および転写後のなかから選択されるインビトロキャップ形成反応から入手される。当該実施形態において、転写と同時のインビトロキャップ形成反応は、ＲＮＡポリメラーゼおよびジヌクレオチドキャップ類似物を含んでおり、転写後のインビトロキャップ形成反応は、キャップ形成酵素系を含んでいる。さらなる実施形態において、キャップ形成されている上記ＲＮＡは、キャップ形成酵素系を用いてインビトロにおいてキャップ形成されている細菌性のｍＲＮＡを含んでいる。
特定の実施形態において、上記方法は、上記試料におけるキャップ形成されているＲＮＡの量を定量するステップをさらに包含しており、以下のサブステップ：（１）（ａ）上記試料におけるＲＮＡの総量を定量するステップ；および（４）ステップ（３）において消化されなかったＲＮＡの量を定量することによって、上記試料におけるキャップ形成されているＲＮＡの量を定量するステップを包含している。他の実施形態において、上記方法は、ステップ（３）において消化されなかったＲＮＡの量を定量することによって、上記試料においてキャップ形成されていないＲＮＡの量を定量するステップをさらに包含している。特定の実施形態において、ステップ（４）は、上記ＲＮＡに結合しているＲＩＢＯＧＲＥＥＮ ＤＹＥの蛍光を測定することによってか；または２．５Ｍの酢酸アンモニウム、０．３Ｍの酢酸ナトリウムもしくは０．３Ｍの酢酸カリウムおよびエタノールもしくはイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、水にペレットを懸濁させ、Ａ260の吸光係数に基づいて分光光度的にＲＮＡを定量することによって、キャップ形成されているＲＮＡを定量するステップを包含している。さらなる実施形態において、ステップ（１）において準備された上記試料が、５’一リン酸基を有しているＲＮＡをさらに含んでおり、上記方法は、上記試料を上記ＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップ（２）の前に、上記試料における５’一リン酸基を有しているＲＮＡの定量するステップをさらに包含しており、以下のサブステップ：（１）（ｂ）記試料における５’一リン酸基を有している上記ＲＮＡが消化されるが、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよびキャップ形成されているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）において準備された上記試料を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップ；ならびに（１）（ｃ）ステップ（１）（ｂ）において消化されたＲＮＡ、または消化されなかったＲＮＡの量を定量するステップを包含している。ここで、上記試料において消化されたＲＮＡの量が、上記試料における５’一リン酸基を有しているＲＮＡの量を示す。
いくつかの実施形態において、上記試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップ（２）の前に、ステップ（１）において準備された上記試料が５’一リン酸基を有しているＲＮＡを含んでおり、上記方法は、以下のサブステップ：ステップ（１）においてＲＮＡ５’モノホスファターゼをさらに準備するステップ、および上記試料における５’一リン酸基を有しているＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに転化されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）において準備された上記試料を、上記ＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させるステップをさらに包含している。ここで、ステップ（３）において５’エキソリボヌクレアーゼによって消化される、上記試料におけるＲＮＡポリホスファターゼの量が、５’ポリリン酸を有している、上記試料におけるＲＮＡの量を示すが、５’一リン酸を有している、上記試料におけるＲＮＡの量を示さない。
さらなる実施形態において、上記５’ＲＮＡモノホスファターゼは、ステップ（２）の前に不活化されているか、もしくは除去されているか、またはステップ（２）に採用される反応条件によって不活化される。他の実施形態において、ステップ（１）において準備された上記試料が、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡをさらに含んでおり、上記方法は、ステップ（１）においてポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを準備するステップをさらに包含しており、（５）ステップ（３）から得られた上記試料を、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡがリン酸化されて、５’一リン酸基を有しているＲＮＡになるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰと接触させるステップ；（６）５’一リン酸基を有しているＲＮＡが消化されるが、キャップ形成されているＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよび５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（５）から得られた上記試料を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップ；ならびに（７）ステップ（６）において消化されＲＮＡまたは消化されなかったＲＮＡの量を定量するステップをさらに包含している。ここで、上記試料における消化されたＲＮＡの量が、上記試料における５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡの量を示す。
いくつかの実施形態において、本発明は、試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、精製するか、または当該ＲＮＡの量を定量するキットを提供する。当該キットは、（１）アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰ ＩおよびShigellaのＲＰＰ Ｉからなる群から選択されるＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）；ならびに（２）ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標）５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼおよびSaccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ Ｉエキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ Ｉ）からなる群から選択される５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）を備えている。
特定の実施形態において、上記キットは、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）をさらに備えている。他の実施形態において、上記キットは、ＲＮＡ５’モノホスファターゼをさらに備えている。
いくつかの実施形態において、本発明は、親和性結合分子と抱合されているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる組成物を提供する。特定の実施形態において、上記親和性結合分子は、（ａ）ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでいる核酸；（ｂ）タンパク質；（ｃ）糖タンパク質；（ｄ）リポタンパク質；（ｅ）含水炭素；（ｆ）脂質；（ｇ）レクチン；（ｈ）ホルモン；（ｉ）ホルモン受容体；（ｊ）ビオチン；（ｋ）アビジンもしくはストレプトアビジン；（ｌ）プロテインＡ；（ｍ）プロテインＧ；（ｎ）抗体；（ｏ）抗原；および（ｐ）ジゴキシゲニンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明は、親和性結合分子を標識する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＲＮＡポリホスファターゼ、親和性結合分子、および化学抱合試薬を準備するステップ；ならびに（ｉｉ）上記ＲＮＡポリホスファターゼが上記親和性結合分子と抱合され、かつ上記ＲＮＡポリホスファターゼの酵素活性および上記親和性結合分子の、特異的な結合対の形成能が維持される条件において、上記ＲＮＡポリホスファターゼを、上記親和性結合分子および上記化学抱合試薬と接触させるステップを包含している。
さらなる実施形態において、上記親和性結合分子は、核酸プローブ、タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、抗体、人工の抗体、ＳＥＬＥＸを用いて選択されるアプタマー、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明は、親和性結合分子と抱合されているか、または結合されているＲＮＡポリホスファターゼからなるシグナル増幅物質を調製する方法を提供する。当該方法は、（ａ）反応部分を有している親和性結合分子からなる反応性の親和性結合分子、およびＲＮＡポリホスファターゼを準備するステップ；ならびに
（ｂ）反応性の上記親和性結合分子が上記ＲＮＡポリホスファターゼと共有結合的に抱合され、上記ＲＮＡポリホスファターゼの酵素活性、および上記親和性結合分子の特異的な結合対の形成能が維持される条件において、反応性の上記親和性結合分子をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップを包含している。
さらなる実施形態において、上記親和性結合分子は、核酸プローブ、タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、抗体、人工の抗体、ＳＥＬＥＸを用いて選択されるアプタマー、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）および組換え融合タンパク質を含んでいる組成物を提供する。当該組成物において、上記ＲＮＡポリホスファターゼは、アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰ、およびShigellaのＲＰＰからなる群から選択され、上記組換え癒合タンパク質は、ストレプトアビジン、人工の短鎖抗体およびプロテインＡからなる群から選択されるタンパク質からなる。特定の実施形態において、本発明は、ＲＮＡポリホスファターゼ、およびＲＮＡを含んでいる試料を混合することによって形成されている反応混合物を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、ＲＮＡポリホスファターゼをコードしている発現ベクター、または当該発現ベクターを含んでいる細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組換え生成源に由来するＲＮＡをコードしている遺伝子を含んでいる組換え宿主細胞を提供する。当該遺伝子は、組換えベクターまたは人工のトランスポゾンを用いて当該宿主細胞に導入されている。特定の実施形態において、上記組換え宿主細胞は、組換え生成源に由来する上記ＲＮＡポリホスファターゼをコードしている遺伝子によって示される配列と相補的なｍＲＮＡを発現する細菌細胞である。他の実施形態において、上記組換え宿主細胞によって発現される上記ｍＲＮＡは、配列番号１または配列番号１の１０３〜６００ヌクレオチドを含んでいる配列と相補的である。他の実施形態において、上記組換え宿主細胞はE. coli宿主細胞である。
特定の実施形態において、本発明は、核酸分子を修飾する方法を提供する。当該方法は、ＲＮＡ分子を含んでいる試料を、ＲＮＡポリホスファターゼにさらすことによって当該ＲＮＡ分子を修飾するステップを包含している。
ＲＮＡ５’ポリホスファターゼによって触媒される反応の例を示す図である。 E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。
我々は、“ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ”または単に“ＲＮＡポリホスファターゼ”と呼ぶ新たなクラスの酵素を見出した。ＲＮＡポリホスファターゼは、５’ポリリン酸基を有しており、キャップ形成されていないＲＮＡを、５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化する（図１）。我々は、タンパク質についての研究の結果として、βリン酸およびγリン酸を一次ＲＮＡ転写物から除去可能なＲＮＡポリホスファターゼを見出した。驚くべきことに、ＲＮＡポリホスファターゼは、公知の酵素と異なり、αリン酸をＲＮＡの５’末端に残してβリン酸およびγリン酸を一次ＲＮＡ転写物から除去し、かつキャップ形成されているＲＮＡの三リン酸架橋（例えばｍ7Ｇ−キャップ形成されているＲＮＡ）を消化しない。我々の知る限り、酵素活性のこの特性を有している酵素は報告されていない。ＲＮＡポリホスファターゼを用いた一次ＲＮＡ分子の処理の後に、ＲＮＡ分子は、５’エキソリボヌクレアーゼ（例えば、Ｘｒｎ Ｉ エキソリボヌクレアーゼ）によって分解可能になる。
ＲＮＡポリスフェターゼを使用する様々な方法を以下に示す。本明細書の記載に基づいて、当業者は、ＲＮＡポリホスファターゼを単独にか、または他の酵素と組み合わせて使用する方法を知り、理解するであろう。当該方法のすべては、本発明の範囲内にある。
本発明の一実施形態は、ＲＮＡポリホスファターゼの精製されている組成物である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの精製されている組成物は、当該ＲＮＡポリホスファターゼが当該組成物に存在する最も多いタンパク質であるように、実質的に精製されている。いくつかの実施形態において、この精製されている組成物は、ＲＮＡポリホスファターゼが得られている細胞の他の細胞成分の大部分から分離されている。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの精製されている組成物は天然生成源から得られる。いくつかの実施形態において、天然生成源は細菌細胞である。いくつかの実施形態において、細菌細胞を含んでいる天然生成源から得られたＲＮＡポリホスファターゼは、培養培地におけるアルミニウムイオンまたは亜鉛イオンの存在によって誘導される。いくつかの実施形態において、当該天然生成源はE. coliまたはShigellaの細菌細胞である。いくつかの実施形態において、E. coliまたはShigellaの細菌細胞から得られるＲＮＡポリホスファターゼは、例えば当該細菌が培養されている培地に０．２ｍＭの硫化亜鉛を加えることによって、少なくとも１０倍以上のレベルまで誘導される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは約１９ｋＤの細胞周辺質タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは細胞周辺質画分から分離されている。
他の実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの精製されている組成物は組換え生成源から入手され得る。ここで、当該ＲＮＡポリホスファターゼの遺伝子は原核生物または真核生物の宿主細胞において発現されている。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの精製されている組成物は組換え生成源から入手される。ここで、当該ＲＮＡポリホスファターゼの遺伝子は、少なくとも１８の連続する配列番号１（図２）のヌクレオチドを含んでいる配列を示す。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、その配列は、ホスホグリセリン酸塩ムターゼ様スーパーファミリーにとってのモチーフを含んでいる遺伝子を示す。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、その遺伝子によって示される配列はアルミニウム誘導性の（ａｉｓ）遺伝子である。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、ＲＮＡポリホスファターゼの遺伝子によって示される配列は、E. coliのＫ２１株（ＭＧ１６５５）における５０．４マイニュートに位置し、当該タンパク質が遺伝子座タグｂ２２５２を有している。本発明のいくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号１の完全な配列を示す遺伝子が組み込まれている組換え生成源から得られる。本発明のいくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは、配列番号１の１０３〜６０３位のヌクレオチドを含んでいる配列を示す遺伝子が導入されている組換え生成源から得られる。いくつかの実施形態において、本発明の任意の実施形態のポリホスフェターゼをコードしている配列は、配列番号１と７０％を超える（例えば、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９８％を超える）相同性を有している。例えば、いくつかの実施形態において、ポリホスフェターゼをコードしている配列は、配列番号１と７１％以上の相同性（例えば、配列番号１と７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の相同性）を有している。
いくつかの実施形態において、組換え生成源から得られたＲＮＡポリホスファターゼ組成物は、ベクターにクローニングされているＲＮＡポリホスファターゼ遺伝子によって示される配列から、宿主細胞において発現される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼによって示される配列は、ベクターのＴ７型のＲＮＡポリメラーゼのプロモータの下流にクローニングされており、宿主細胞は当該Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼによって示される配列は、ベクターのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモータの下流にクローニングされており、宿主細胞はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能である。ＲＮＡポリホスファターゼを使用する任意の方法を包含している本発明の実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡポリホスファターゼ遺伝子によって示される配列は、ｐＥＴベクターにクローニングされており、宿主細胞はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能なE. coli細胞である。
他の実施形態において、組換え生成源由来のＲＮＡポリホスファターゼは、宿主細胞の染色体内または染色体外ＤＮＡに挿入されているＲＮＡポリホスファターゼに示される配列から発現される。これらの実施形態のいくつかにおいて、宿主細胞はE. coli宿主細胞である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは、誘導可能なプロモータと抱合され、ＲＮＡポリホスファターゼ遺伝子を発現可能な人工トランスポゾン（例えば、ＥＺ−ＴＮ５（商標）トランスポゾンまたはＨＹＰＥＲＭＵ（商標）トランスポゾン（EPICENTRE, Madison, WI）、またはトランスポザーゼ酵素をコードしない他の人工的なトランスポゾン）を用いて、Escherichia coli宿主細胞の染色体に挿入されている。ＥＺ−ＴＮ５（商標） トランスポゾンまたはＨＹＰＥＲＭＵ（商標） トランスポゾンは、トランスポザーゼ遺伝子をコードしていないことを意味する“人工トランスポゾン”であり、それゆえ、上記人工トランスポゾン内のトランスポゾン認識配列を使用して転位をもたらし得る外因性のトランスポザーゼの供給を受けることなく転位できない。
本発明の他の実施形態は、組換え生成源由来のＲＮＡポリホスファターゼをコードしている遺伝子を含んでいる組換え宿主細胞であり、当該遺伝子は、組換えベクターまたは人工トランスポゾンを用いて宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、細菌宿主細胞であり、組換え生成源由来のＲＮＡポリホスファターゼをコードしている遺伝子を示す配列と相補的なｍＲＮＡを発現する。いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞によって発現されたｍＲＮＡは、配列番号１、または配列番号１の１０３〜６００位のヌクレオチドを含んでいる配列と相補的である。これらの実施形態のいくつかにおいて、組換え宿主細胞はE. coli宿主細胞である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの精製されている組成物は、配列番号２のうちの少なくとも６の連続するアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列を示す、単一のポリペプチドを含んでいる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡポリホスファターゼは約２４ｋＤの分子量を有している。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡポリホスファターゼは、アミノ末端の最初の４アミノ酸がＭＬＡＦであるアミノ酸配列を示す。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡポリホスファターゼは約１９ｋＤの分子量を有している。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡポリホスファターゼは、アミノ末端の最初の４アミノ酸がＳＮＧＬであるアミノ酸配列を示す。
本発明のいくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの精製されている組成物は、ＥＤＴＡの存在下において活性を示し、その酵素活性は、酵素反応混合物における１ｍＭ以上の濃度のＭｇ2+カチオンの存在下において阻害される。いくつかの実施形態において、精製されているＲＮＡポリホスファターゼは、ｐＨ５．０〜８．０のｐＨ範囲にわたって、反応混合物において最適な活性を示す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を基質として使用する場合と比べて、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＤｉＦＭＵＰ）を基質として使用する場合に少なくとも５０倍以上の酵素活性を有しており、ここで反応緩衝液がｐＨ７．５の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＭＥおよび０．０１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００から構成されている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの精製されている組成物は、当該組成物が発現されている細胞の細胞周辺質画分から精製されるか、または分離される。
本発明の他の実施形態は、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、例えば、E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（E. coli ＲＰＰ Ｉ または ＲＰＰ Ｉ（EPICENTRE））もしくはShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ）を、単独に備えているキット、または５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）（例えば、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ Ｉ エキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ Ｉ）、もしくはＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼ、EPICENTRE）；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ ＰＮＫ、EPICENTRE）；ＲＮＡ５’モノホスフェート（ＲＭＰ）（例えば、ＲＮＡ５’モノホスフェート１またはＲＭＰ１、（EPICENTRE））およびキャップ形成酵素系（例えば、ポックスウイルスのキャップ形成酵素系、ワクシニアのキャップ形成酵素系、Saccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素系またはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標）キャップ形成酵素キット（EPICENTRE））からなる群から選択される少なくとも１つの他の成分と組み合わせて備えているキットである。キットは、小容器（例えばチューブまたはバイアル）を格納している容器（例えば箱）を備え得る。試薬は、溶液（例えば、安定な保存液または反応緩衝液）、または乾燥された形態（例えば、凍結乾燥物）として提供され得る。キットは、制御試薬（例えばＲＮＡ分子）、取扱説明書、ソフトウェア、または所望の生物学的反応または一連の反応（例えば、本明細書の記載の反応）を実施にとって有用、必要または十分な他に利用する成分を備え得る。
本発明の別の実施形態は、細胞または細胞の抽出物もしくは画分から得られるタンパク質を含んでいる試料におけるＲＮＡポリホスファターゼを同定するか、入手するか、単離するか、または精製する方法である。当該方法は、以下のステップ：（Ａ）上記試料における上記タンパク質を分離する（例えば、大きさ、電荷、電荷密度に基づいて）ことによって、分離されたタンパク質の溶液を回収するステップ；（Ｂ）ＲＮＡポリホスファターゼが活性を示す条件（例えば、本明細書に述べる条件）において、分離されたタンパク質の上記溶液のそれぞれを、βリン酸またはγリン酸の少なくとも１つが標識されている５’三リン酸基または５’二リン酸基を有しているＲＮＡ分子と接触させ、標識されている上記βリン酸またはγリン酸がＲＮＡ分子から除去されているか否かを検出するステップ；（Ｃ）標識されている上記βリン酸またはγリン酸がＲＮＡ分子から除去されている分離されたタンパク質の溶液から、上記ＲＮＡ分子上に５’αリン酸が存在している分離されたタンパク質の溶液を同定することによって、ＲＮＡポリホスファターゼを同定するか、入手するか、単離するか、または精製するステップを包含している。
いくつかの実施形態において、これらのＲＮＡ分子上に５’αリン酸が存在している分離されたタンパク質の溶液を同定するステップ（Ｃ）は、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを消化し、５’三リン酸基または５’二リン酸基を有しているＲＮＡを消化しないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、標識されたリン酸がステップ（Ｂ）において除去された上記ＲＮＡ分子を、５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）（例えば、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ Ｉ エキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ Ｉ）、またはＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標）５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼ、EPICENTRE）と接触させるステップを包含している。ここで、上記ＲＮＡ分子の消化がＲＮＡポリホスファターゼの存在を意味する。
いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡ分子上に５’αリン酸が存在している分離されたタンパク質のこれらの溶液を同定するステップ（Ｃ）は、ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドが５’一リン酸基を有しているＲＮＡ分子の５’末端に十分に連結されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、標識されたリン酸がステップ（Ｂ）において除去された上記ＲＮＡ分子を、上記ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼ（例えばＴ４ＲＮＡリガーゼまたはバクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（EPICENTRE））と接触させるステップを包含している。ここで、上記ＲＮＡ分子に対する上記ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドのライゲーションがＲＮＡポリホスファターゼの存在を意味する。
本発明の他の実施形態は、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化し、キャップ形成されているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化しない方法であって、（１）キャップ形成されているＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを含んでいる試料、ならびにＲＮＡポリホスファターゼを準備するステップと；（２）５’α一リン酸基を除くすべてのリン酸が除去され、５’一リン酸を有しているＲＮＡが生成されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、上記試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップを包含している、方法である。
この方法のいくつかの実施形態において、５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが、５’三リン酸基を有しているＲＮＡおよび５’二リン酸基を有しているＲＮＡのなかから選択される。
５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡが、５’三リン酸基を有しているＲＮＡを含んでいるか、または当該ＲＮＡからないくつかの実施形態において、５’三リン酸基を有している当該ＲＮＡは、真核生物の一次ＲＮＡ；原核生物の一次ＲＮＡ（例えば細菌のｍＲＮＡ）；ｎｃＲＮＡ；およびＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応によって合成されているＲＮＡ（ＲＮＡ増幅反応の一部であるインビトロ転写反応に由来するＲＮＡが挙げられる）から選択される。
５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡが、５’二リン酸基を有しているＲＮＡを含んでいるか、または当該ＲＮＡからなるいくつかの実施形態において、５’三リン酸基を有している当該ＲＮＡは、キャップ形成酵素系（例えば、ポックスウイルスのキャップ形成酵素系、ワクシニアのキャップ形成酵素系、Saccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素系またはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標） キャップ形成酵素キット（EPICENTRE））のＲＮＡトリホスファターゼを用いた一次ＲＮＡ転写物の消化生成物である。
５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化する方法のいくつかの実施形態において、当該方法は、（例えば、真核細胞（例えば、卵母細胞または体細胞）における発現の調査または使用、研究用途ならびに治療用途を目的とした）キャップ形成されているＲＮＡの改良された組成物を調製するために使用される。ここで、当該組成物は、キャップ形成されていないＲＮＡ分子と比べて、キャップ形成されているＲＮＡ分子を高い割合において含んでいる。例えば、いくつかの実施形態において、当該方法は、インビトロキャップ形成酵素系または同時転写のキャップ形成酵素系におけるカップ類似物を用いたキャップ形成されていないＲＮＡ分子の合成に続いて、キャップ形成されていないＲＮＡ分子と比べて、キャップ形成されているＲＮＡ分子を高い割合において含んでいる、キャップ形成されているＲＮＡの改良された組成物を調製するために用いられる。当該インビトロキャップ形成酵素系は、例えば、ポックスウイルスのキャップ形成酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素、およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標） キャップ形成酵素（ｍＳＣＲＩＰＴ（商標） ｍＲＮＡ生成系（EPICENTRE, Madison, WI）に含まれている）のなかから選択される。当該同時転写系は、例えば、ＭＥＳＳＡＧＥＭＡＸ（商標） Ｔ７ ＡＲＣＡ−ＣＡＰＰＥＤ ＭＥＳＳＡＧＥ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮキット（EPICENTRE, Madison, WI）であり、当該キャップ類似物は、例えば、ＡＲＣＡアンチリバースキャップ類似物である。例えば、いくつかの実施形態において、当該方法は、治療用のワクチン作製に使用される樹枝状細胞を形質転換するためのキャップ形成されているＲＮＡ分子の改良された組成物の調製のために用いられる。
したがって、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化する方法の一つの特定の実施形態は、キャップ形成されていないＲＮＡを少なくとも１つ含んでいる試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製する方法である。当該方法は、（１）キャップ形成されているＲＮＡ、ならびに５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡ（例えば、５’三リン酸基を有しているＲＮＡ（すなわち、一次ＲＮＡ）または５’二リン酸基を有しているＲＮＡ）および必要に応じて５’一リン酸基を有しているＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡと；ＲＮＡポリホスファターゼと；付加的に５’エキソリボヌクレアーゼとを準備するステップと；（２）５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）から得られた試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップと；（３）５’一リン酸基を有しているＲＮＡが消化され、キャップ形成されているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（２）から得られた試料を５’エキソリボヌクレアーゼと接触させることによって、キャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製するステップとを包含している。
本発明のこの実施形態は、キャップ形成されていない一次ＲＮＡまたは５’二リン酸基もしくは付加的に５’一リン酸基を有しているＲＮＡをさらに含んでいる混合物から、キャップ形成されているＲＮＡの改良された組成物を調製する方法である。当該組成物は、キャップ形成されていないＲＮＡ分子に比べてキャップ形成されているＲＮＡ分子を高い割合において含んでいる。
この方法は、キャップ形成されているＲＮＡからのキャップ形成されていないＲＮＡの除去（例えば、治療用途または研究用途を目的とした、例えば細胞の形質転換のための）にとって有用である。例えば、この方法の一つの実施形態において、この方法を用いて入手されるか、単離されるか、または精製されたキャップ形成されているＲＮＡは、樹枝状細胞、マクロファージ、上皮細胞および人工ＡＰＣ（例えば、ワクチン調製用の）から選択される抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の形質転換に使用される。ＡＰＣ（例えば樹枝状細胞）はキャップ形成されているＲＮＡにコードされているタンパク質を発現し、発現した当該タンパク質は、ＡＰＣにおける酵素によってペプチドへと次々に分解される。ここで、当該ペプチドは、他の免疫系細胞に対してＡＰＣの表面に提示され、これによって免疫応答を誘導する。
いくつかの実施形態において、ステップ（１）において準備された、キャップ形成されているＲＮＡおよび少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡを含んでいる溶液は、生物学的な試料から入手される。
いくつかの実施形態において、ステップ（１）において準備された、キャップ形成されているＲＮＡおよび少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡを含んでいる試料は、ＲＮＡポリメラーゼおよびジヌクレオチド類似物を用いた転写と同時のインビトロキャップ形成反応、およびキャップ形成酵素系を用いた転写後のインビトロキャップ形成反応のなかから選択されるインビトロキャップ形成反応から入手される。
いくつかの他の実施形態において、ステップ（１）において準備された、キャップ形成されているＲＮＡおよび少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡを含んでいる試料は、転写と同時のインビトロ反応から入手される。転写と同時のインビトロ反応は、キャップ形成されているＲＮＡおよびキャップ形成されていないＲＮＡを含んでいるＲＮＡが合成されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼと共にＲＮＡポリメラーゼプロモータと機能的に連結されたＤＮＡ鋳型を、ジヌクレオチドキャップ類似物およびＮＴＰと共にインキュベートすることを包含している。これらの実施形態において、この方法は、低い割合のＲＮＡがキャップ形成されている場合でさえ（例えば、インビトロ転写反応においてＧＴＰに対するジヌクレオチドキャップ類似物の割合が低い場合に）、８０％、９０％または９５％を超えてキャップ形成されているＲＮＡを入手するために使用され得る。多くのジヌクレオチドキャップ類似物が当分野において公知である。キャップ形成されているＲＮＡは、インビトロ転写反応のためのＲＮＡポリメラーゼを用いて組み込まれるという条件の下に、任意の公知のジヌクレオチドキャップ類似物を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、当該ジヌクレオチドキャップ類似物は、ＧｐｐｐＧ；ｍ7ＧｐｐｐＧ；ｍ7ＧｐｐｐＡ；ｍ2 7,3'-OＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡ；ｍ2 7,2'-OＧｐｐｐＧ；キャップヌクレオチドおよび他のキャップ類似物のヌクレオシドの間の三リン酸のヌクレオシド間の結合の代わりの四リン酸（ｐｐｐｐ）のヌクレオシド間の結合を有している上述のキャップ類似物のうちのいずれかのバリアント；ならびに三リン酸または四リン酸のヌクレオシド間の結合のうちの１つ以上のリン酸の代わりにチオリン酸を有している上述のキャップ類似物のうちのいずれかのバリアントのなかから選択される。
いくつかの他の実施形態において、ステップ（１）において準備された、キャップ形成されているＲＮＡおよび少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡを含んでいる試料は、キャップ形成酵素系を含んでいる転写後のインビトロキャップ形成反応から入手される。これらの実施形態において、当該方法は、キャップ形成されていないＲＮＡの少なくとも一部がキャップ形成されるための、条件における、かつ十分な時間にわたるインビトロキャップ形成酵素反応において、５’三リン酸基を有しているＲＮＡまたは５’二リン酸基を有しているＲＮＡから構成されるキャップ形成されていないＲＮＡを、ＧＴＰ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびキャップ形成酵素系と共にインキュベートすることをさらに包含している。そのようなステップ（１）〜（３）を包含している実施形態において、キャップ形成酵素系によってキャップ形成されているＲＮＡの割合が低い場合（例えば、ＲＮＡがキャップ形成され難いものである場合）でさえ、８０％、９０％または９５％を超えてキャップ形成されているＲＮＡを入手するために、当該方法は使用される。種々のキャップ形成酵素系が公知であり、キャップヌクレオチドをＲＮＡに付加可能な任意のキャップ形成酵素系が当該方法に使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、キャップ形成酵素系は、ポックスウイルスのキャップ形成酵素、ワクシニアのキャップ形成酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素、およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標） キャップ形成酵素キット（EPICENTRE）のなかから選択される。
ステップ（１）〜（３）を包含しているいくつかの実施形態において、ステップ（１）において準備された試料におけるキャップ形成されているＲＮＡおよび少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡは、キャップ形成酵素系を用いてインビトロにおいてキャップ形成されている原核生物のＲＮＡ（例えば、細菌のｍＲＮＡ）を含んでいるか、または当該ＲＮＡからなる。
いくつかの実施形態において、試料におけるキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製する方法は、試料中におけるキャップ形成されているＲＮＡの量を定量する方法を付加的に包含している。当該方法は、（１）（ａ）上記試料におけるＲＮＡの総量を定量するステップ；および（４）ステップ（３）において消化されなかったＲＮＡの量を定量することによって、上記試料におけるキャップ形成されているＲＮＡの量を定量するステップを包含している。いくつかの実施形態において、当該方法は、ステップ（３）において消化されたＲＮＡの量を定量し、これによって試料におけるキャップ形成されていないＲＮＡの量を定量するステップをさらに包含している。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、公知の方法を用いて（例えば、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ ＤＹＥ（Invitrogen, Carlsbad CA）を用いたか、または２．５Ｍの酢酸アンモニウム、０．３Ｍの酢酸ナトリウムもしくは０．３Ｍの酢酸カリウムおよびエタノールもしくはイソプロパノールを用いた沈殿、ペレットの水への再懸濁、ならびに吸光係数Ａ２６０に基づいた分光光度法によるＲＮＡの定量による）各ステップにおいて定量される。
試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを定量する方法のいくつかの実施形態において、試料は、５’一リン酸基を有しているＲＮＡ（例えば、１８Ｓおよび２６Ｓもしくは２８Ｓの真核生物のｒＲＮＡ、１６Ｓおよび２３Ｓの原核生物のｒＲＮＡ、真核生物のｍｉＲＮＡもしくはウイルスにコードされているｍｉＲＮＡ、またはスプライスされているか、もしくは内在性のリボ核酸分解性のプロセスを受けているＲＮＡのイントロン）を含み得る。したがって、試料におけるキャップ形成されているＲＮＡおよびキャップ形成されていないＲＮＡの量を定量する方法のいくつかの実施形態において、ステップ（１）において準備された上記試料が、５’一リン酸基を有しているＲＮＡをさらに含んでおり、当該方法が、上記ＲＮＡポリホスファターゼと上記試料を接触させるステップ（２）の前に、上記試料における５’一リン酸基を有しているＲＮＡの定量するステップをさらに包含しており、以下のサブステップ：（１）（ｂ）上記試料における５’一リン酸基を有している上記ＲＮＡが消化されるが、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよびキャップ形成されているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）において準備された上記試料を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップ；ならびに（１）（ｃ）ステップ（１）（ｂ）において消化されたＲＮＡ、または消化されなかったＲＮＡの量を定量するステップを包含している。ここで、上記試料において消化されたＲＮＡの量が、上記試料における５’一リン酸基を有しているＲＮＡの量を示す。
試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを定量する方法であって、当該試料が、５’一リン酸基を有しているＲＮＡ（例えば、１８Ｓおよび２６Ｓもしくは２８Ｓの真核生物ｒＲＮＡ、１６Ｓおよび２３Ｓの原核生物のｒＲＮＡ、真核生物のｍｉＲＮＡもしくはウイルスにコードされているｍｉＲＮＡ、またはスプライスされているか、もしくは内在性のリボ核酸分解性のプロセスを受けているＲＮＡのイントロン）を含み得る方法のいくつかの実施形態において、５’エキソリボヌクレアーゼのステップの前に（例えば、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡのキャップ形成の効率の定量を煩雑にする、５’エキソリボヌクレアーゼによる消化を、５’一リン酸基を有しているＲＮＡが受けないように）、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに転化することが望ましい。したがって、ステップ（１）において準備された試料が５’一リン酸基を有しているＲＮＡを含んでおり、ステップ（２）の前に試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させる、試料におけるキャップ形成されているＲＮＡまたはキャップ形成されていないＲＮＡの量を定量する方法のいくつかの実施形態において、当該方法は、次のサブステップ：（１）（ｄ）ステップ（１）において付加的にＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）（例えば、ＲＭＰ１（EPICENTRE））を準備するステップ；（１）（ｅ）試料における５’一リン酸基を有しているＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに転化されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）において準備された試料をＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させるステップを包含している。
ここで、ステップ（３）において５’エキソリボヌクレアーゼによって消化された、上記試料におけるＲＮＡの量が、５’ポリリン酸を有する試料におけるＲＮＡの量を示し、ステップ（１）において準備された５’一リン酸基を有している試料におけるｒＲＮＡの量を示さない。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡ５’モノホスファターゼは、ステップ（２）の前に不活性化されるか、または除去される。
いくつかの他の実施形態において、ＲＮＡ５’モノホスファターゼはステップ（２）に採用された反応条件によって不活性化される。
いくつかの実施形態において、ＲＭＰは、反応に使用された後に、すぐに不活性化されるか、または除去される（例えば、ＲＭＰ１に関しては、加熱、またはＥＤＴＡもしくは亜鉛の添加によって）。
出願人は、ＲＭＰ、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（EPICENTRE, Madison, WI）が、１８Ｓおよび２６Ｓもしくは２８Ｓの真核生物のｒＲＮＡ、ならびに１６Ｓおよび２３Ｓの原核生物のｒＲＮＡを含んでいるｒＲＮＡから５’一リン酸基を除去することと、この酵素をこの目的に使用し得ることとを見出した。しかし、出願人は、特定の他の方法が、ほとんどの試料における大量のｒＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡは、ほとんどの細胞における総ＲＮＡの約９５〜９６％を構成している）の除去するためのＲＮＡ５’モノホスファターゼ１による処理と比べて、より効率的であることを見出した。したがって、いくつかの好ましい実施形態において、本発明の方法で用いるためのステップ（１）において準備された試料は、既にｒＲＮＡが除去されている（例えば、ＲＩＢＯＭＩＮＵＳ（商標） キット（Invitrogen Life Technologies）を用いて）。ＲＩＢＯＭＩＮＵＳを用いる予めのｒＲＮＡの除去、または実質的にｒＲＮＡの量が少ない試料を準備する代替的な方法は、本発明の方法を、所望の目的にとってより効率的かつ有効にする。したがって、本明細書において特に断りがない限り、いくつかの好ましい実施形態において、５’一リン酸化されているリボソームＲＮＡ分子が、本発明のステップ（１）において準備された試料から実質的にすでに除去されていることについて理解されるであろう。
例えば、キャップ形成されていないＲＮＡも含んでいる試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、もしくは精製する方法、または付加的に、試料におけるキャップ形成されているＲＮＡの量を定量する方法および／または試料におけるキャップ形成されていないＲＮＡの量を定量する方法におけるいくつかの好ましい実施形態において、ステップ（１）において準備された試料は、当該方法に使用する前に、リボソームＲＮＡのみを特に除去する処理がなされている（例えば、ＲＩＢＯＭＩＮＵＳ（商標） ｒＲＮＡ除去キット（INVITROGEN）または他の好適な方法を用いて）。ＲＩＢＯＭＩＮＵＳキット用の手順のような手順を用いる試料からのリボソームＲＮＡの除去は、試料における所望の他のＲＮＡ分子（キャップ形成されているＲＮＡおよびキャップ形成されていないＲＮＡ（例えば、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡ、およびリボソームＲＮＡの除去の後に試料にある５’一リン酸基を有しているＲＮＡ）が挙げられる）の分析を容易にする。
試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、精製するか、または定量する方法のいくつかの実施形態において、試料は、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡを（例えば、ＲＮａｓｅＡのようなリボヌクレアーゼによって消化された結果として）含み得る。５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡは５’エキソリボヌクレアーゼによって消化されない。したがって、試料におけるキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、精製するか、またはその量を定量する方法のいくつかの実施形態において、ステップ（１）において準備された試料は、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡを付加的に含んでおり、当該方法は、以下のステップ：（１）（ｆ）ステップ（１）においてポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、ファージＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ）およびＡＴＰを付加的に準備するステップ；（５）５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡが５’一リン酸基を有しているＲＮＡにリン酸化されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（３）から得られた試料を、ポリヌクレオチドキナーゼ（ファージＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ）およびＡＴＰと接触させるステップ；（６）５’一リン酸基を有しているＲＮＡが消化されるが、５’ポリリン酸基を有しているキャップ形成されているＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよび５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（５）から得られた上記試料を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させて、キャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、精製するか、および／または定量するステップをさらに包含する。
いくつかの実施形態において、試料における５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡの量を定量する方法は、以下のステップ：（７）ステップ（６）において消化されたＲＮＡまたは消化されなかったＲＮＡの量を定量するステップをさらに包含しており、ここで、上記試料における消化されたＲＮＡの量が、上記試料における５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡの量を示す。
当業者は、本発明の様々な方法のステップを実行する順番が重要であることを理解するが、試料に存在するであろうＲＮＡ分子の５’末端にある基に対するそれぞれの酵素の作用が、所望の目的にとって逆に影響しないように注意深く配慮されることを条件に、ステップの順番が変更され得ることを理解する。
本発明の別の実施形態は、試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、精製するか、または当該ＲＮＡの量を定量するキットであって、（１）ＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）（例えば、アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰ ＩおよびShigellaのＲＰＰ Ｉからなる群から選択される）；ならびに（２）５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）（例えば、ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼおよびSaccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ Ｉエキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ Ｉ）からなる群から選択される）を備えている。いくつかの実施形態において、キットは、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えばＴ４ ＰＮＫ）を付加的に備えている。他のいくつかの実施形態において、キットは、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（EPICENTRE））を備えている。
本発明のさらなる他の実施形態は、親和性結合分子と抱合されているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる組成物である。いくつかの実施形態において、親和性結合分子は、分析物と特異的に結合し得る分析物結合物質（ＡＢＳ）である。いくつかの実施形態において、親和性結合分子が、（ａ）ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでいる核酸；（ｂ）タンパク質；（ｃ）糖タンパク質；（ｄ）リポタンパク質；（ｅ）含水炭素；（ｆ）脂質；（ｇ）レクチン；（ｈ）ホルモン；（ｉ）ホルモン受容体；（ｊ）ビオチン；（ｋ）アビジンもしくはストレプトアビジン；（ｌ）プロテインＡ；（ｍ）プロテインＧ；（ｎ）抗体；（ｏ）抗原；および（ｐ）ジゴキシゲニンからなる群から選択される。
親和性結合分子（分析物結合物質およびそれらの分析物が挙げられる）は、本発明の方法に使用され得る、特異的な結合対を形成する任意の物質であり得る。いくつかの実施形態において、分析物は、細胞性の生化学的な小分子（例えば、ステロイドもしくは他のホルモン、ビタミンおよび細胞性の代謝物から選択される）、または巨大分子（例えば、核酸、タンパク質、脂質および含水炭素から選択される）。いくつかの実施形態において、分析物は、小分子（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、および可視染料、蛍光染料もしくは化学発光染料から選択される）と抱合されている。いくつかの実施形態において、ＡＢＳは、生化学的な小分子（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニンから選択される）、または巨大分子（例えば、核酸、およびタンパク質（例えば、ストレプトアビジン、プロテインＡ、抗体およびホルモン受容体から選択される）から選択される）。巨大分子であるＡＢＳは、生化学な小分子（ビオチン、ジゴキシゲニン、可視染料、蛍光染料および化学発光染料から選択される）と抱合され得る。
本発明の別の実施形態は、親和性結合分子（例えば、分析物結合物質）を標識する方法であって、（ｉ）ＲＮＡポリホスファターゼ、親和性結合分子（例えば、分析物結合物質）、および化学抱合試薬を準備するステップ；ならびに（ｉｉ）上記ＲＮＡポリホスファターゼが上記親和性結合分子と抱合され、かつ上記ＲＮＡポリホスファターゼの酵素活性、および上記親和性結合分子の特異的な結合対の形成能が維持される条件において、上記ＲＮＡポリホスファターゼを、上記親和性結合分子および上記化学抱合試薬と接触させるステップを包含している方法である。いくつかの実施形態において、親和性結合分子は、核酸プローブ、タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、抗体、人工の抗体、ＳＥＬＥＸを用いて選択されるアプタマー、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される。本発明のＲＰＰは、親和性結合分子との抱合物の作製に有用であり、当該抱合物は、二価の金属イオンの非存在下において核酸、タンパク質または他の分析物を高感度に検出するシグナル増幅物質として使用される。
本発明の別の実施形態は、親和性結合分子と抱合されているか、または結合されているＲＮＡポリホスファターゼからなるシグナル増幅物質を調製する方法であって、（ａ）反応部分を有している親和性結合分子からなる反応性の親和性結合分子、およびＲＮＡポリホスファターゼを準備するステップ；ならびに（ｂ）反応性の上記親和性結合分子が上記ＲＮＡポリホスファターゼと共有結合的に抱合され、上記ＲＮＡポリホスファターゼの酵素活性、および上記親和性結合分子の特異的な結合対の形成能が維持される条件において、反応性の上記親和性結合分子を、ＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップを包含している方法である。いくつかの実施形態において、親和性結合分子は、核酸プローブ、タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、抗体、人工の抗体、ＳＥＬＥＸを用いて選択されるアプタマー、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される。したがって、本発明のＲＰＰは、核酸、タンパク質および他の分析物を子感度に検出するためのシグナル増幅物質として用いるための、ビオチンまたはジゴキシゲニン等の小型分子ならびに核酸またはタンパク質（例えば、ストレプトアビジン、プロテインＡ、一次抗体または二次抗体）との抱合物の作製に有用である。
本発明のＲＰＰは単一のサブユニットの酵素であるので、ＲＰＰ酵素およびタンパク質の親和性結合分子からなる融合タンパク質をシグナル増幅物質として、遺伝工学的に作製するために有用である。したがって、本発明の実施形態は、ＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）（例えば、アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰ、およびShigellaのＲＰＰからなる群から選択される）、および分析物結合物質（ＡＢＳ）であるタンパク質（例えば、ストレプトアビジン、人工の短鎖抗体およびプロテインＡからなる群から選択される）からなる組換え融合タンパク質を含んでいる組成物である。融合タンパク質は、ＡＢＳをコードしている核酸配列の５’末端または３’末端に連結されている、ＲＰＰをコードしている核酸配列からなる組換え核酸を作製すること、それから発現ベクター（例えばプラスミド）のうちの条件付で誘導可能なプロモータ配列（例えば、Ｔ７プロモータ）の下流に当該組換え核酸をクローニングして、組換えベクターを作製すること、それから、条件付で組換え核酸を発現可能な宿主細胞を形質転換して、組換え宿主細胞を入手すること、組換え融合タンパク質が発現される条件において組換え宿主細胞を培養すること、ならびに組換え融合タンパク質を精製することによって作製される。
したがって、本発明のＲＰＰは、研究、分子診断、免疫診断および他の用途において生体分子を検出する方法に使用するためのシグナル増幅物質を作製する多様な方法に使用され得る。
〔定義〕
本発明は、以下に規定されるような用語の定義に基づいて、理解され、解釈されるだろう。
“例えば”、“のような”、“が挙げられる（include）”、“が挙げられる（including）”またはこれらの変化形の用語が本明細書に使用されるとき、これらの用語は、限定の用語と判断されず、“に限定されないが”または“限定されることなく”と解釈されるだろう。
本明細書に使用されるとき、“アクセプターオリゴヌクレオチド”は、ＲＮＡリガーゼの作用によって、５’リン酸基を有しているＲＮＡの５’末端に連結され得る３’ヒドロキシル基を有しているオリゴヌクレオチドを意味し、５’リン酸基を有している当該ＲＮＡは“ドナー”と呼ばれる。リボヌクレオチドからなるアクセプターオリゴヌクレオチドは、“ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチド”または“ＲＮＡアクセプター”である。
本明細書において“親和性結合分子”または“特異的な結合対”は、互いにとっての親和性を有しており、“結合条件”と呼ばれる特定の条件において互いと“結合”する二分子である。特異的な結合対を構成する二分子のそれぞれは、“親和性結合分子”である。ビオチンおよびストレプトアビシンもしくはアビジンは、“親和性結合分子”または“特異的な結合対”の例であり、それぞれが“親和性結合分子”である。
“分析物”は、試料における分析物の存在、濃度または量が、アッセイまたは測定法において決定されている基質である。“分析物結合物質”（または“ＡＢＳ”）は、分析物と特異的に結合する基質である。本明細書に使用されるとき、分析物、および当該分析物と結合するＡＢＳは、“特異的な結合対”を構成し、当該分析物およびＡＢＳのそれぞれが“親和性結合分子”である。本発明における方法またはアッセイのうちのいずれかは、（例えば、当該技術に公知のサンドイッチアッセイの方法および組成物を用いる）試料における１つ以上の分析物の検出、回収または定量のために、複数の特異的な結合対（分析物、分析物結合物質または他の親和性結合分子が挙げられる）を利用し得る。
本発明は、任意の特異的な親和性結合分子、特異的な結合対、分析物または分析物結合物質に限定されない。親和性結合分子、分析物および分析物結合物質としては、例えば、タンパク質（糖タンパク質およびリポタンパク質、酵素、ホルモン、受容体、抗原ならびに抗体が挙げられる）、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）、核酸の断片、生化学的な分子および多糖が挙げられる。分析物は、分析物が存在する場合、および当該場合にのみ、試料に存在する生物学的な構成要素としばしばと会合する。多くの他の分析物は、当業者にとって明らかである。
２つの抗体の利用をともなう免疫測定法の場合におけるいくつかの実施形態においては、分析物は、第一の抗体と抱合されているか、もしくは結合されている抗原（サンドイッチアッセイの場合）または抗原と抱合されているか、もしくは結合されている第一の抗体（免疫吸着アッセイの場合）である；ＡＢＳは、シグナル増幅物質としてのＲＮＡポリホスファターゼと代わりに抱合されているか、もしくは結合されている第二の抗体である。核酸アッセイの場合のいくつかの実施形態において、分析物は、核酸分子または核酸分子の一部分（例えば、特定の配列を示す一部分）である。ＡＢＳは、当該分析物と相補的な他の核酸分子である。上記ＡＢＳである上記核酸（例えば、核酸プローブ）は、第一の親和性結合分子（例えばビオチンまたはジゴキシゲニン）と代わりに抱合されており、当該ＡＢＳまたは当該核酸プローブは、第三の親和性性分子と結合する第二の親和性結合分子（例えば、それぞれ、ストレプトアビシン、またはジゴキシゲニンと結合する抗体）を用いて検出され、当該第三の親和性性分子は、シグナル増幅物質としてのＲＮＡポリホスファターゼと代わりに抱合されているか、または結合されている。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは、当該技術において公知の方法を用いてシグナル増幅物質として使用するために、親和性結合分子と抱合されている。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは、１９９６年にAcademic Press, Inc.（San Diego, CA）によって出版されたGreg T. Hermansonによる“BIOCONJUGATE Techniques”に記載の試薬および方法を用いて巨大分子の親和性結合分子と抱合されている。ここで、当該巨大分子の親和性結合分子は、例えば、分析物結合基質（例えば、抗体、ストレプトアビシン、プロテインＡ）、核酸または他の親和性結合分子である。他の実施形態において、親和性結合分子（例えば、分析物結合物質）は固体の表面に抱合されている。さらなる他の実施形態においては、ＲＮＡポリホスファターゼは、当該技術において周知の方法を用いてシグナル増幅物質として使用するために、親和性結合分子（例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン）と抱合されている。例えば、いくつかの実施形態において、ビオチンまたは親和性小分子は、D. Savageらによる“Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook”（Pierce Chemical Company, 1992）、およびR.P. Hoaglandによる“Handbook of Fluorescent Probes and Research Products”の第９版（Molecular Probes, Inc）に記載のビオチン標識試薬および方法を用いてＲＮＡポリホスファターゼと抱合されている。また、ＤＮＡまたはＲＮＡと抱合されている親和性結合分子は、当該技術において公知の試薬および方法を用いたオリゴヌクレオチド合成機を利用して合成され得る。したがって、いくつかの実施形態において、第一の親和性結合分子（ビオチンまたはジゴキシゲニン）は、他の分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）と抱合されており、第二の親和性結合分子（例えば、ビオチンと結合するストレプトアビシンもしくはアビジン、またはジゴキシゲニンと結合する特異性抗体）は、当該技術において公知のいずれかの方法を用いて、固体表面と共有結合的に結合されているか、または非共有結合的に結合されている。
好ましい分析物結合物質は、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸もしくはポリヌクレオチドの断片（複数のモノヌクレオシド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方）から構成されている核酸が挙げられる）である。当該複数のモノヌクレオシドとしては、修飾されているＤＮＡまたはＲＮＡの複数のモノヌクレオシドが挙げられる。核酸を含んでいる分析物結合物質が使用される場合、本発明の好ましい分析物は、分析物結合物質の少なくとも断片または領域と少なくとも部分的に相補的な断片または領域を有している核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。このような核酸親和性結合分子は、公知の多くのインビボまたはインビトロの技術（自動核酸合成技術、ＰＣＲまたはインビトロ転写が挙げられる）によって作製され得る。当該技術において理解されているように、ＤＮＡ親和性結合分子またはＲＮＡ親和性結合分子がアッセイにおいてあらかじめ決定されている特異性を必須に提供すべき長さは、アッセイされる試料における核酸の量および複雑さに部分的に依存する。そのような親和性結合分子は、通常、少なくとも５つのヌクレオチドを必要とする。いくつかの実施形態において、GoldおよびTuerkによる米国特許第５２７０１６３号に記載の“ＳＥＬＥＸ”と呼ばれる方法は、本発明に係る分析物結合物質として使用するための核酸を選択するために使用される。ＳＥＬＥＸは、少なくとも一部がランダム化された配列を有している複数の核酸分子の大きな集団からの、特定の分析物に対して高い親和性を有している核酸分子の選択を可能にする。例えば、考えられるすべてのランダムな２５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの集団（すなわち、すべての位置において考えられる４つの核酸塩基のそれぞれを有している）は、４25の（または１０15の）異なる核酸分子を含んでおり、当該核酸分子はそれぞれ、異なる三次元構造および異なる分析物結合特性を有している。いくつかの実施形態において、ＳＥＬＥＸは、例えば以下の特許文献に記載の方法にしたがって、核酸またはポリヌクレオチドではない特定の分析物（例えば、タンパク質の分析物（例えば抗体または酵素など））に対して高い親和性を有している核酸からなる分析物結合物質を選択するために使用される。当該特許文献は、米国特許第５，２７０，１６３号；米国特許第５，５６７，５８８号；米国特許第５，５８０，７３７号；米国特許第５，５８７，４６８号；米国特許第５，６８３，８６７号；米国特許第５，６９６，２４９号；米国特許第５，７２３，５９４号；米国特許第５，７７３，５９８号；米国特許第５，８１７，７８５号；米国特許第５，８６１，２５４号；米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，９９８，１４２号；米国特許第６，００１，５７７号；米国特許第６，０１３，４４３号；および米国特許第６，０３０，７７６号である。ＳＥＬＥＸによって選択されると、核酸親和性結合分子は、多くの公知のインビボまたはインビトロの技術（自動化された核酸合成技術、ＰＣＲまたはインビトロ転写が挙げられる）によって作製され得る。
分析物および分析物結合物質の説明から、本発明が広い適用範囲（免疫アッセイまたは核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイが採用される用途が挙げられる）を有していることが明らかである。したがって、他の用途のなかでも、本発明は、植物および動物（ヒトが挙げられる）における疾患の診断；ならびに生成物（例えば、食品、血液および組織培養物）の夾雑物ついての試験に有用である。
本発明によれば、“結合”という用語は、複数の親和性結合分子または特異性結合対の間（例えば、一方の親和性結合分子および他方の親和性結合分子（例えば、分析物およびその分析物結合物質）の間）における、非共有結合を生じる相互作用である。当該非共有結合は、例えば、水素結合、疎水性結合、ファンデルワールス結合およびイオン結合である。理論に束縛されることなく、これらの種類の非共有結合が、特異的な結合対に関連する分子の相補的な形状または構造に部分的に起因する結合を生じると、当該技術において考えられている。“結合”に関する定義、および広範な親和性結合分子もしくは特異性結合対に基づいて、結合条件は異なる特異的な結合対にとって異なることについて明らかである。当業者は、試料において親和性結合分子間に結合が生じる条件を容易に見出し得るか、または決定し得る。特に、当業者は、当該技術において“特異的な結合”と考えられる親和性結合分子間の結合が生じるようにされ得る条件を容易に条件を決定し得る。当該技術に公知のように、このような特異性は、通常、試料における他の物質および組成物（例えば容器の壁、固体支持体）に対してよりも高い、親和性結合分子間の親和性に起因する。また、特定の場合に、その特異性は、試料における他の分子および成分との会合よりも、親和性結合分子の有意により速い会合に関連し得るか、または起因し得る。
本明細書に使用されるとき、“緩衝液”または“緩衝試薬”という用語は、溶液に加えられると、ｐＨ値変化に対する耐性を当該溶液にもたらす物質を指す。本明細書に使用されるとき、“反応緩衝液”は、酵素反応が実施される緩衝溶液を指す。本明細書に使用されるとき、“保存緩衝液”という用語は、酵素が保存される緩衝液溶液を指す。
“キャップ”または“キャップヌクレオチド”は、その５’末端を介して一次ＲＮＡ転写物の５’に抱合されているグアニンヌクレオチドである。その５’末端に抱合されているキャップヌクレオチドを有しているＲＮＡは、“キャップ形成されているＲＮＡ”、“キャップ形成されているＲＮＡ転写物”または“キャップ形成されている転写物”と呼ばれる。通常のキャップヌクレオシドは、“ｍ7Ｇ”と表される構造を有している７−メチルグアノシンまたはＮ7−メチルグアノシン（ときに“標準的なキャップ”と呼ばれる）である。“ｍ7Ｇ”は、キャップ形成されているＲＮＡまたは“ｍ7Ｇ−キャップ形成されているＲＮＡ”が、ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ1（ｐＮ）X−ＯＨ（３’）、またはより簡単にｍ7ＧｐｐｐＮ1（ｐＮ）Xもしくはｍ7Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｎと表される構造を有している場合における構造である。ここで、ｍ7Ｇは７−メチルグアノシルキャプヌクレオシドを表し、ｐｐｐはキャップヌクレオシドの５’炭素と一次ＲＮＡ転写物の最初のヌクレオチドとの間における三リン酸架橋を表し、Ｎ1（ｐＮ）X−ＯＨ（３’）は一次ＲＮＡ転写物を表す。これらにおいて、Ｎ1は最も５’側にあるヌクレオチドであり、“ｐ”はリン酸基を表し、“Ｇ”はグアノシンヌクレオシドを表し、“ｍ7”はグアニンの７位におけるメチル基を表し、“［５’］”は、“ｐ”がキャップヌクレオチドのリボースおよびｍＲＮＡ転写物の最初のヌクレオシド（“Ｎ”）に抱合されている位置を示す。この“標準的なキャップ”に加えて、天然に存在する様々な他のキャップ類似物および合成のキャップ類似物が当該技術において公知である。任意のキャップヌクレオチドを有しているＲＮＡは“キャップ形成されているＲＮＡ”と呼ばれる。いくつかの実施形態において、キャップ形成されているＲＮＡは、生物学的な試料に由来して天然に存在している。いくつかの実施形態において、キャップ形成されているＲＮＡは、キャップ形成酵素系（例えば、ワクシニアのキャップ形成酵素系またはSaccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素系）を用いた、５’三リン酸基を有しているＲＮＡまたは５’二リン酸基を有しているＲＮＡのインビトロキャップ形成によって得られる。この代わりのいくつかの実施形態において、キャップ形成されているＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含んでいるＤＮＡ鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）によって得られる。ここで、ＧＴＰに加えて、ＩＶＴ反応はまた、当該技術において公知の方法（例えば、ＡＭＰＬＩＣＡＰ（商標）Ｔ７ キャップ形成キット（EPICENTRE））を用いた、ジヌクレオチドキャップ類似物（例えば、ｍ7ＧｐｐｐＧキャップ類似物；Ｎ7−メチル，２’−Ｏ−メチル−ＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡキャップ類似物；Ｎ7−メチル，３’−Ｏ−メチル−ＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡキャップ類似物）を含んでいる。
５’三リン酸化を受けている一次ＲＮＡ転写物のインビボにおけるキャップ形成は、種々の酵素的なステップを介して生じる（例えば、Martin, S A et al., J. Biol. Chem. 250: 9322, 1975、Myette、J R and Niles, E G, J. Biol. Chem. 271: 11936, 1996、M A Higman, et al., J. Biol. Chem. 267: 16430, 1992を参照すればよい）。
以下の酵素反応は、真核生物のｍＲＮＡのキャップ形成に関連する。
（１）ＲＮＡ三リン酸がｍＲＮＡの５’三リン酸を切断して、二リン酸にする。
pppN1(p)NX-OH(3') → ppN1(p)NX-OH(3')+Pi
（２）それから、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼが、ｍＲＮＡの最も５’側にあるヌクレオチド（Ｎ1）の５’二リン酸へのＧＴＰの抱合を触媒する。
ppN1(p)NX-OH(3') + GTP → G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi
（３）最後に、グアニン−７−メチルトランスフェラーゼが、補足因子としてＳ−アデノシル−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を用いて、キャップヌクレオチドにおけるグアニンの７位の窒素のメチル化を触媒する。
G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet → m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc。
ＲＮＡポリホスファターゼおよびＲＮＡグアニルトランスフェラーゼの酵素活性の作用から生じるＲＮＡ、ならびにグアニン−７−メチルトランスフェラーゼによってさらにメチル化されているＲＮＡは、本明細書において“５’キャップ形成されているＲＮＡ”または“キャップ形成されているＲＮＡ”と呼ばれる。本明細書において、“キャップ形成酵素系”またはより簡単に“キャップ形成酵素”は、“キャップ形成されているＲＮＡ”を生じる酵素活性を有している１つ以上のポリペプチドの任意の組合せを意味する。キャップ形成酵素系（当該酵素のクローニングされている形態が挙げられる）が、多くの生成源から同定され、精製されており、当該技術において公知である（例えば、Shuman, S, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66: 1-40, 2001、Shuman, S, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 50: 101-129, 1995、Shuman, S et al., J. Biol. Chem. 255: 11588, 1980; Banerjee, A K, Microbiol. Rev. 44: 175-205, 1980、Wang, S P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9573, 1997、Higman M.A. et al., J. Biol. Chem. 267: 16430, 1992、Higman, MA et al., J. Biol. Chem. 269: 14974-14981, 1994; Myette, JR and Niles, EG, J. Biol. Chem. 271: 11936-11944, 1996を参照すればよい）。５’ポリリン酸を有しているキャップ形成されていないＲＮＡをキャップ形成されているＲＮＡに転化し得る任意のキャップ形成酵素系は、本発明の実施形態のうちのいずれかにとってのキャップ形成されているＲＮＡを提供するために使用され得る。いくつかの実施形態において、キャップ形成酵素系は、ポックスウイルスのキャップ形成酵素系である。いくつかの好ましい実施形態において、キャップ形成酵素系はワクシニアウイルスのキャップ形成酵素である。いくつかの実施形態において、キャップ形成酵素系はSaccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素である。１つの生成源に由来するＲＮＡポリホスファターゼ、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼおよびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子が、他の生成源に由来するこれらの遺伝子の１つまたはすべてにおける欠失を補完し得るという観点から、キャップ形成酵素系は、単一の生成源に由来し得るか、またはＲＮＡポリホスファターゼ、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼおよび／またはグアニン−７−メチルトランスフェラーゼの活性の１つ以上が異なる生成源に由来するポリペプチドに含まれ得る。
本明細書に使用されるとき、“キレーター”または“キレート剤”という用語は、金属カチオンに結合可能な非共有電子対を有している２以上の原子を有している任意の物質を指す。ＥＤＴＡは、本発明に使用され得るキレーターまたはキレート剤の一例である。本明細書に使用されるとき、“２価の塩”または“２価の金属カチオン”という用語は、金属が溶液において２＋の正味の電荷を有している任意の塩を指す。
本発明において、“脱キャップ酵素”は、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化しない条件において、キャップ形成されているＲＮＡを、５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化するＤｃｐ１／Ｄｃｐ２複合体脱キャップ酵素（または“Ｄｃｐ２型脱キャップ酵素”）を意味する。本明細書において“Ｄｃｐ２型脱キャップ酵素”は、酵素のＮｕｄｉｘスーパーファミリーのメンバーである脱キャップ酵素を意味する。当該酵素は、ＮｕｄｉｘモチーフまたはＮｕｄｉｘボックスと呼ばれる保存されているアミノ酸配列を共有しており、当該アミノ酸配列は、ＧＸ5ＥＸ7ＲＥＵＸＥＥＸＧＵによって表される（Dunckley, T and Parker, R. EMBO J 18: 5411-5422, 1999、van Dijk, E et al., EMBO J. 21: 6915-6924, 2002; Steiger, M et al., RNA 9: 231-238, 2003、Xu, W et al. J. Biol. Chem. 279: 24861-24865, 2004、Gunawardana, D et al., Nucleic Acids Res. 36: 203-216, 2008）。
本明細書に使用されるとき、“酵素”という用語は、化学反応または生物学的な反応を触媒することを担っているタンパク質分子またはタンパク質分子の集合物を指す。出願人によって発見された１つの酵素の分類は、５’ポリリン酸基を有しているが、キャップ形成されていないＲＮＡを、５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化するＲＮＡ５’ポリホスファターゼを含んでいるか、または当該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼからなる。しかし、他の酵素もまた、本発明の種々の方法およびキットに使用される。一般的に、本発明の方法またはキットは、特定の生成源に由来する特定の酵素の使用に限定されない。むしろ、本発明の方法またはキットは、特定の方法またはキットに関して本明細書に開示されている特定の酵素と同等の酵素活性を有している、任意の生成源に由来する任意の酵素を含んでいる。例えば、いくつかの実施形態において、当該方法またはキットにおけるＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、Escherichia coliもしくはShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ、および５’ポリリン酸基を有しているが、キャップ形成されていないＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化する他のＲＮＡ５’ポリホスファターゼのなかから選択される。また、当該方法またはキットにおける５’リボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）は、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ Ｉエキソリボヌクレアーゼ、ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼ（EPICENTRE）、および一リン酸化を受けているＲＮＡをモノヌクレオチドに消化するが、５’三リン酸基、５’キャップ基または５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡを一般的に消化しない他の酵素のなかから選択される。また、当該方法またはキットにおけるポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ、および５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡの５’末端に対してＡＴＰもしくは他のヌクレオシド５’三リン酸から一リン酸基を、好適な反応条件において転移させ得る任意の他の酵素のなかから選択される。また、当該方法またはキットにおけるＲＮＡモノホスファターゼは、ＲＮＡ５’モノホスファターゼＩ（EPICENTRE, Madison, WI, USA）（例えば、製造者の取扱説明書にしたがって使用される）、および当該ＲＮＡ５’モノホスファターゼが、５’三リン酸基を有しているＲＮＡを、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡへと実質的に消化しない条件において、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに転化する任意の他のＲＮＡモノホスファターゼのなかから選択される。
現在、本明細書に示されているか、または市販の製品において提供されており、実施例に挙げられている方法、緩衝液および反応条件は、本発明の方法、組成物およびキットの実施形態にとって好ましい。しかし、当該技術において公知の他の酵素保存緩衝液、反応緩衝液および反応条件が、本発明の他の実施形態に使用される。
本明細書に使用されるとき、“５’エキソリボヌクレアーゼ”（“ＸＲＮ”）は、５’一リン酸化されている末端を有している一本鎖ＲＮＡ基質に対する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が、５’キャップ形成されている末端を有している同じＲＮＡ基質に対する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の２０倍を超えている５’エキソヌクレアーゼを意味する。本発明の５’エキソリボヌクレアーゼの酵素活性は、多くの異なる方法を用いて測定され得る。５’三リン酸、５’キャップまたは５’一リン酸を有しているＲＮＡ基質を用いて活性を定量化し、相対活性を決定する好適な方法は、StevensおよびPoole（J. Biol. Chem., 270: 16063, 1995）によって説明されている。５’エキソリボヌクレアーゼの好ましい組成物の１つは、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ１ｐ／５’エキソリボヌクレアーゼ１（または“Ｘｒｎ Ｉ エキソリボヌクレアーゼ”、“Ｘｒｎ Ｉ ５’エキソリボヌクレアーゼ”もしくは“Ｘｒｎ１ｐ エキソリボヌクレアーゼ”）（例えば、当該技術において公知の方法を用いて調製される）である。いくつかの実施形態において、５’エキソリボヌクレアーゼは、プラスミドにクローニングされ、それから複製され、Escherichia coliにおいて発現されるSaccharomyces cerevisiaeのＸＲＮ１遺伝子の発現によって得られる。好ましい５’エキソリボヌクレアーゼの１つは、ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼ（EPICENTRE, Madison, WI, USA）（例えば、製造者の取扱説明書にしたがって使用される）である。
“単離されているか、または精製されているポリヌクレオチド”、“単離されているか、または精製されているオリゴヌクレオチド”、または“単離されているか、または精製されているＲＮＡ”のように核酸に関して使用されるとき、“単離されている”または“精製されている”という用語は、それまたはそれらの生成源において通常、それまたはそれらが会合している少なくとも１つの夾雑物から分離されている通常の性質を有している１つ以上の核酸分子（例えば、それらの５’末端に同じ化学部分または化学基を有している分子）を指す。したがって、単離されているか、または精製されている核酸は、それらが天然に見られる形態または状態と異なる形態または状態において存在している。一方で、単離されていないか、または精製されていない核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、それらが天然に存在している状態において見られる。例えば、（複数の）所定のＲＮＡ分子は、多数の他のＲＮＡ分子（例えば、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、分解されたＲＮＡ）との混合物として細胞に見られる。
本明細書に使用されるとき、“ヌクレオシド”は、ペントース糖と共有結合されているグアニン（Ｇ）もしくはアデニン（Ａ）のプリン塩基、またはチミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）もしくはシチジン（Ｃ）のピリミジン塩基からなる化合物を指し、一方で、“ヌクレオチド”は、上記ペントース糖のヒドロキシル基の１つにおいてリン酸化されているヌクレオシドを指す。
本明細書に使用されるとき、“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、１つのヌクレオチドの糖部分の３’位が、隣のヌクレオチドの糖部分の５’位と、ホスホジエステル結合によって連結されており、複数のヌクレオチド残基（塩基）が特定の配列（すなわちヌクレオチドの線状の整列）に連結されている複数のヌクレオチドの共有結合されている配列である。本明細書に使用されるとき、“オリゴヌクレオチド”は、短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部である。オリゴヌクレオチドは、約２塩基から約１００塩基の配列を典型的に含んでいるが、より長い分子もときにオリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。“オリゴ”という単語は、ときに“オリゴヌクレオチド”という単語の代わりに使用される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは複数の２’デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）からなる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは複数のリボヌクレオチド（ＲＮＡ）からなる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは複数のＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなる。
直鎖状の核酸分子は、“５’末端”（または“５’−末端”）および“３’末端”（または“３’−末端”）を有していると言える。これは、キャップに関する場合を除いて（本明細書の他の箇所に説明されるように）、１つのモノヌクレオチドの糖部分の５’炭素におけるリン酸基が、その隣のモノヌクレオチドの糖部分の３’炭素における酸素と連結されるように、複数のモノヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して一方向に連結されて、オリゴヌクレオチドを形成しているためである。したがって、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドの糖部分の３’炭素の酸素と連結されていない場合に“５’末端”と呼ばれ、その３’酸素が次のモノヌクレオチドの糖部分の５’リン酸と連結されていない場合に“３’末端”と呼ばれる。
核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する“相補的な”または“相補性”という用語は、塩基対の規則によって関連付けられているヌクレオチドの配列を指して、本明細書において使用される。例えば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は、配列３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’と相補的である。核酸の塩基のいくつかのみが塩基対の規則にしたがって適合している相補性は、“部分的”であり得る。また、相補性は、核酸間における“完全”または“全体的”な相補性であり得る。核酸鎖間における相補性の程度は、核酸鎖間におけるハイブリダイゼーションの効率および強度に重大な影響を有している。これは、増幅反応および核酸のハイブリダイゼーションに依存する検出方法において特に重要である。
“相同性”という用語は、１つの核酸配列の、他の核酸配列に対する相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち相補性）があり得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的の核酸とハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する配列であり、“実質的に相同性を示す”という機能的な用語を用いて呼ばれる。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、配列番号１と実質的に相同性を示す酵素を含んでいるか、または当該酵素からなる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、配列番号１と少なくとも７０％の相同性を示す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を示す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を示す。ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、配列番号１と少なくとも９５％の相同性を示す。完全に相補的な配列の標的配列に対するハイブリダイゼーションの阻害は、低いストリンジェンシーの条件におけるハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノザンブロット、ならびに溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて試験され得る。実質的に相同性を示す配列またはプローブは、低いストリンジェンシーの条件における標的に対する完全に相同性を示す配列の結合（すなわちハイブリダイゼーション）と競合し、阻害する。これは、低いストリンジェンシーの条件が非特異的な結合を許容するということではなく、低いストリンジェンシーの条件は、２つの配列のお互いの結合が特異的な（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的な結合の非存在は、相補性を有していないか、または程度の低い相補性（例えば、約３０％未満の相補性）しか有していない他の標的の使用によって試験され得る。特異的な結合が少ないか、または存在しない場合、プローブは核酸の標的とハイブリダイズしない。二本鎖の核酸配列（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムクローン）を指して使用されるとき、“実質的に相同性を示す”という用語は、本明細書に記載のような低いストリンジェンシーの条件において、二本鎖の核酸配列のいずれかまたは両方の鎖とハイブリダイズし得る任意のプローブを指す。本明細書に使用されるとき、“ハイブリダイゼーション”または“アニーリング”という用語は、相補的な核酸鎖の対合を指して使用される。ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションの強度（すなわち核酸鎖間における会合の強度）は、当該技術において公知の多くの要素によって影響される。当該要素としては、核酸間における相補性の程度、例えば塩濃度によって影響される関連する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ（融解温度）、他の要素の存在（例えば、ポリエチレングリコールまたはベタインの存在または非存在）、ハイブリダイズする鎖の部分、および核酸鎖のＧ：Ｃ含量が挙げられる。本明細書において、例えばｍＲＮＡが特定の配列を示す遺伝子に相補的である場合、一般的に、第１の核酸は第２の核酸に対して相補的であると言える。これは、第１の核酸が、高いストリンジェンシーの条件において第２の核酸とアニールするために十分な相補性または相同性を第２の核酸に対して有していることを意味する。しかし、いくつかの実施形態において、第１の核酸は、穏やかなストリンジェンシーの条件において第２の核酸とアニールするために十分な相補性または相同性を第２の核酸に対して有している。穏やかなストリンジェンシーは、低いストリンジェンシーと高いストリンジェンシーとの間を意味している。穏やかなストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーの条件をどのように整えるかは、当業者にとって公知である。
“オリゴキャップ”または“オリゴヌクレオチドキャップ”は、“オリゴキャップ形成”法の一部としてＲＮＡリガーゼの作用によって、５’一リン酸化されているＲＮＡ分子の５’末端に連結されているアクセプターオリゴヌクレオチドである。“オリゴキャップ”は、真核生物のｍＲＮＡ分子に典型的に見られる“ｍ7Ｇキャップ”と異なる。真核生物のｍＲＮＡおよびいくつかの他の真核生物のＲＮＡ分子におけるキャップは、“オリゴヌクレオチドキャップ”または“オリゴキャップ”と区別するために、本明細書において、ときに“ｍ7Ｇ−キャップ”、“キャップヌクレオチド”または“ヌクレオチドキャップ”と呼ばれる。本明細書において真核生物のｍＲＮＡを指して“ｍ7Ｇキャップ形成されているＲＮＡ”と、ときに記載するが、キャップヌクレオチドはグアニン塩基のＮ７メチル基に加えて、他の修飾を有し得る。
第１のアミノ酸残基の骨格にあるアミノ基と第２のアミノ酸残基の骨格にあるカルボキシル基との間にペプチド結合が存在しているので、ポリペプチドは、“アミノ末端”（Ｎ末端）および“カルボキシ末端”（Ｃ末端）を有していると言える。
“一次ＲＮＡ”または“一次ＲＮＡ転写物”は、インビボまたはインビトロにおいてＲＮＡポリメラーゼによって合成されており、その最も５’末端側のヌクレオチドの５’炭素に三リン酸を有しているＲＮＡ分子を意味する。
本発明によれば、“ＲＮＡ増幅”または“ＲＮＡ増幅反応”は、試料に存在するＲＮＡ配列のコピー数と比べて、ＲＮＡ配列またはその相補的な配列のコピー数の増加をもたらす、ＲＮＡ産物の合成を生じる方法である。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＩＢＯＭＵＬＴＩＰＬＩＥＲ（商標） センスＲＮＡ増幅キット（EPICENE）は、試料にあらかじめ存在しているＲＮＡからセンスＲＮＡを生成するために使用される。代わりのいくつかの実施形態において、一本差ｃＤＮＡの合成プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）プロモータのプライマーを使用する方法は、Van Gelder, R.N., et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1663, 1990）によって説明されているように、アンチセンスＲＮＡの合成に使用される。いくつかの実施形態において、増幅されたアンチセンスＲＮＡを生成するための市販のキットが使用される（例えば、ＴＡＲＧＥＴＡＭＰ（商標） ａＲＮＡ増幅キット（EPICENTRE, Madison, WI））。代わりのいくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼプロモータの１つの鎖の配列をその５’位に示し、一本鎖ｃＤＮＡの３’末端にあるタグによって示される配列と相補的な配列をその３’位に示す二本鎖ｃＤＮＡの合成プライマー（またはＰＣＲプライマー）が、センスＲＮＡの合成に使用される。この実施形態において、ｍＲＮＡのアクセプターオリゴヌクレオチドは、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを含んでいる所望のＲＮＡの５’末端に連結されており、これによって５’ライゲーションタグつきのＲＮＡが得られる。５’ライゲーションタグつきのＲＮＡは、それからＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼを用いた一本鎖ｃＤＮＡの合成用の鋳型として使用される。それから、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含んでいる二本鎖のｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼおよびｃＤＮＡ合成プライマー（またはＰＣＲプライマー）を用いて合成される。最後に、増幅されたセンスＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプライマーに結合し、転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼを用いた二本鎖ｃＤＮＡのインビトロ転写によって合成される。試料における所望のＲＮＡが５’一リン酸基をすでに有している場合、５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化される（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて、キャップ形成されているＲＮＡおよび５’ポリリン酸基の両方を含んでいる所望のＲＮＡに転化するか、またはＲＮＡポリホスファターゼを用いて５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡのみに転化する）。
また、本発明は、二本鎖ｃＤＮＡの合成に必要なＲＮＡの増幅方法に限定されない。また例えば、本発明は、一本鎖のプロモータと機能的に連結されている一本鎖の鋳型を用いてＲＮＡを合成し得るＲＮＡポリメラーゼを使用する、米国特許出願公開第２００４／０１７１０４１号に説明されているＲＮＡの増幅方法および組成物（例えば、ＭＩＮＩ−Ｖ ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＩＮＩ−Ｖ（商標） インビトロ転写キットとしてEPICENTREから入手可能）を使用する方法）を包含している。これらの実施形態において、一本鎖のプロモータは、プライマーを伸張させるためにＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼを用いたｍＲＮＡの逆転写によって作製されているｃＤＮＡの５’末端またはｃＤＮＡの３’末端のいずれかに連結されており、続いて起こる一本鎖ＤＮＡの鋳型のインビトロ転写（例えば、ＭＩＮＩＶ ＲＮＡポリメラーゼを用いる）によって、増幅されたアンチセンスＲＮＡまたは増幅されたセンスＲＮＡのそれぞれの合成をもたらす。
“ＲＮＡリガーゼ”は、５’末端にリン酸基を有しているＲＮＡ（すなわちＲＮＡドナー）に対する、３’末端にヒドロキシル基を有しているＲＮＡ（すなわちＲＮＡアクセプタ）の連結を触媒する酵素または酵素の組成物を意味する。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡリガーゼは、バクテリオファージのＴ４遺伝子６３によってコードされているポリペプチド（ｇｐ６３）である。第２のＲＮＡリガーゼ（ｇｐ２４．１）がHo, CKおよびShuman, S（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 12709-12714, 2002）によって報告されているので、通常には単に“Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ”と呼ばれるこの酵素は、現在ではより正確に“Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１”と呼ばれている。上記第２のＲＮＡリガーゼは、バクテリオファージのＴ４遺伝子２４．１によってコードされており、現在“Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２”と呼ばれている。特に断りがない限り、“Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ”が、本明細書において使用され、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを意味する。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡリガーゼは、Thermus scotoductusに感染するバクテリオファージＴＳ２１２６から得られたＲＮＡリガーゼ遺伝子に由来するか、または当該ＲＮＡリガーゼ遺伝子によってコードされているポリペプチド（すなわちバクテリオファージＴＳ２１２２６ ＲＮＡリガーゼ）である。当該ポリペプチドとしては、米国特許第７，３０３，９０１号に記載の核酸によってコードされている未処理のファージ酵素および他のポリペプチドが挙げられる。
本明細書に規定されるとき、“ＲＮＡ５’モノホスファターゼ”、“ＲＮＡ５’モノホスファターゼ酵素”、“ＲＮＡ５’モノホスファターゼの組成物”または“ＲＭＰ”は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼが、キャップ形成されていない一次ＲＮＡ（すなわち５’三リン酸基を有しているＲＮＡ）を、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに実質的に消化しない条件において、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに転化可能な酵素または酵素の組成物を意味する。ＲＮＡ５’モノホスファターゼは、ＲＮＡの５’一リン酸基の５’ヒドロキシル基への消化能に関して本明細書に規定されているが、他の酵素活性を有し得る。例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼが３’一リン酸基を有しているＲＮＡから３’一リン酸基を除去する活性を有し得る（が、必須ではない）ことについて本明細書から理解される。さらに、ＲＮＡ５’モノホスファターゼはまた、ＤＮＡ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの５’末端から一リン酸基を切断可能であり得る（が、必須ではない）。これと同時に、ＲＮＡ５’モノホスファターゼは、非核酸の基質からでさえ一リン酸基を切断可能であり得る。本発明の方法またはキットのいくつかの実施形態において、ＲＮＡ５’モノホスファターゼは、例えば製造者の取扱説明書にしたがって使用されるＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）（EPICENTRE, Madison, WI, USA）である。本発明は、ＲＭＰ１を含んでいる実施形態に限定されず、所望の目的のために酵素が機能する限り、任意のＲＮＡ５’モノホスファターゼが使用され得る。所望の目的とは、同じ反応混合物に存在する５’三リン酸基を有しているＲＮＡを、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに転化することなく、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡへと特異的に転化することである。
ＲＮＡ５’モノホスファターゼの酵素活性は、異なる基質（例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ＮＭＰまたは５’一リン酸基を有しているＲＮＡ）、条件およびアッセイを用いた種々の方法において規定され得る。例えば、使用され得るユニットの定義の１つは、“ＲＮＡ５’モノホスファターゼの１のユニットは、１５ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェートおよび５ｍＭの塩化カルシウムを含んでいるｐＨ９．８の１Ｍのジエタノールアミン緩衝液、２５℃において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニルホスフェートを脱リン酸化する酵素の量”である。例えば、使用され得るユニットの定義の他の１つは、“ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）（EPICENTRE））の１の分子生物学的ユニット（ＢＭＵ）は、好適な反応緩衝液、３０℃において６０分間に、５’一リン酸基を有している核酸基質の規定の調製物の１μｇから５’一リン酸基を除去する酵素の量”である。ここで、当該調製物は、例えば、ＲＭＰ１にとってのＲＮＡ基質またはＤＮＡ基質（例えば、１６Ｓおよび／または２３Ｓ 細菌リボソームＲＮＡの規定の調製物、または５’一リン酸基を有している規定のＤＮＡ）であり、当該反応緩衝液は、例えば、ｐＨ７．５の３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５ｍＭの塩化カルシウムおよび０．５ｍＭのＤＴＴを含んでいる、ＲＭＰ１にとって好適な反応緩衝液である。
本明細書に規定されるとき、“ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ”または“ＲＮＡポリホスファターゼ”は、ＲＮＡポリホスファターゼがキャップ形成されているＲＮＡを、５’一リン酸基を有しているＲＮＡに消化しない条件において、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを、５’一リン酸基を有しているＲＮＡに消化可能な酵素の組成物を意味する。５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡは、例えば、５’二リン酸基を有している一次ＲＮＡまたはＲＮＡである。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、本明細書に記載されているEscherichia coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（E. coliのＲＰＰ Ｉ）およびShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（ShigellaのＲＰＰ Ｉ）のなかから選択される。しかし、本発明の方法に関して、上記酵素は、特定の方法においてＲＮＡ５’ポリホスファターゼ活性を有している、任意の生成源から得られる任意の酵素であり得る。例えば、バキュロウイルスのホスファターゼ（ＢＶＰ）（Takagi, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9808-9812, 1998；Gross, C.H. and Shuman, S., J. Virology 72: 7057-7063, 1998）、ヒトのＰＩＲ１タンパク質（Deshpande, T. et al., J. Biol. Chem. 274: 16590-16594, 1999）およびE. coliのＲｐｐＨタンパク質（Deana, A et al., Nature 451: 355-358, 2008）が、５’三リン酸化されているＲＮＡを５’一リン酸化されているＲＮＡに転化することについて報告されている。しかし、キャップ形成されているＲＮＡに対するそれらの活性は、調べられていないか、または報告されていない。この活性は試験されるであろうと考えられる。本発明の方法のいくつかの実施形態において、キャップ形成されているＲＮＡまたは５’一リン酸基を有しているＲＮＡを転化する活性を有していない、ＢＶＰ、ＰＩＲ１およびＲｐｐＨタンパク質のなかから選択されるタンパク質のいずれかが、ＲＮＡポリホスファターゼとして使用される。
また、ＲＮＡポリホスファターゼは、５’ポリリン酸基（例えば、一次ＲＮＡの５’三リン酸基）を５’一リン酸基に消化する能力に関して、本明細書に規定されているが、ＲＮＡポリホスファターゼは、他の酵素活性を有し得る。また例えば、ＲＮＡポリホスファターゼは、ＲＮＡ分子の５’末端に連結されており、２以上のリン酸を含んでいる任意の直鎖状のポリリン酸からリン酸を除去し得ることについて理解される。さらにまた、ＲＮＡポリホスファターゼは、ＤＮＡ、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはさらに非核酸のポリリン酸基質の５’末端に連結されている、２以上のリン酸を含んでいる任意の直鎖状のポリリン酸を消化可能である。
ＲＮＡポリホスファターゼは、未処理のタンパク質または組換えタンパク質から入手され得る。“未処理のタンパク質”という用語は、天然に存在する（すなわち非組換えの）生成源から単離されたタンパク質を指して、本明細書に使用される。本明細書に使用されるとき、“組換えタンパク質”または“組換えポリペプチド”という用語は、組換えＤＮＡ分子から発現されたタンパク質分子を指す。タンパク質の未処理の形態と比べて、同一または類似の性質を有しているタンパク質の組換え形態を生成するために、分子生物学的な技術が使用され得る。また、未処理の種々の配列は、発現、精製またはポリペプチドの他の所望の性質を向上させるために作製され得る。
組換えタンパク質であるＲＮＡポリホスファターゼは、融合タンパク質であり得る。本明細書に使用されるとき、“融合タンパク質”という用語は、外来性のタンパク質断片と連結されている所望のタンパク質を含んでいるキメラタンパク質を指す。当該所望のタンパク質は、例えば、ＲＮＡポリホスファターゼまたはこれらの断片であり、当該外来性のタンパク質は、例えば、非ＲＮＡポリホスファターゼタンパク質を含んでいる融合パートナーである。当該融合パートナーは、宿主細胞において発現されるときのＲＮＡポリホスファターゼタンパク質の可溶性を増強させ得、宿主細胞もしくは培養物の上清、またはこれらの両方からの組換え融合タンパク質の精製を可能にする親和性タグを提供し得る。必要に応じて、融合タンパク質は、当該分野において公知の種々の酵素的または化学的な手段によって、所望のタンパク質（例えば、ＲＮＡポリホスファターゼまたはこれらの断片）から除去され得る。
本発明の好ましい実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの組成物は、精製されているタンパク質を含んでいる。本明細書に使用されるとき、“精製されている”または“精製すること”は、所望の構成要素から夾雑物のいくつかを除去する任意の処理の結果を意味する。例えば、特定の所望のタンパク質（例えば、ＲＮＡポリホスファターゼ）は、混入している所望されない他のタンパク質、核酸、糖質、脂質および／または生化学的な小分子の除去によって精製される。夾雑物の除去は、組成物における所望のタンパク質の割合の向上をもたらす。例えば、好ましい実施形態においてＲＮＡポリホスファターゼの組成物は、核酸分子に対する活性を有している、混入している核酸および酵素がないように精製されている。
いくつかの好ましい実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは、Escherichia coliにおいて複製され、発現されるプラスミドまたは他のベクターにおけるEscherichia coliのＲＮＡポリホスファターゼ遺伝子（および／または機能的な種々のバリアントおよびこれらの相同物）の発現によって入手される。これは、そのような組換え生成源から入手されるＲＮＡポリホスファターゼが、非組換え生成源から入手されるＲＮＡポリホスファターゼより、精製度が高く、混入している酵素活性がなく、一般的に酵素濃度がより高いからである。
本明細書に使用されるとき、“遺伝子”という用語は、コードされているポリペプチドまたはタンパク質の前駆体（例えば、ＲＮＡポリホスファターゼ）の産生に必要な制御配列およびコーディング領域を含んでいるＤＮＡ配列を指す。当該ポリペプチドは、全長のコーディング配列、または所望の酵素活性が維持される限りのコーディング配列の任意の部分によってコードされ得る。
本発明の好ましい実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼは、“安定化されている”。“安定化されている”とは、ＲＮＡポリホスファターゼが、分解および酵素活性の低下の原因になるプロテアーゼおよび夾雑物のない十分な純度であり、少なくとも６ヶ月間にわたる−２０℃における保存の間に活性が顕著に低下しない酵素保存緩衝液の調製物に含まれていることを意図している。安定化されているＲＮＡポリホスファターゼを提供するための好適な酵素保存緩衝液の１つは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴおよび１％の非イオン性の界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有している５０％のグリセロール溶液を含んでいる。精製されているE. coliの酵素の一形態は、約１９ｋＤａのタンパク質であることが見出された。精製されているE. coliの酵素の他の形態は、約２４ｋＤａのタンパク質であると見出された。E. coliのＲＮＡポリホスファターゼのバリアントの核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）が決定された（図２）。また、ShigellaがE. coliに見られるＲＮＡポリホスファターゼと同一の配列を示すＲＮＡポリホスファターゼタンパク質を含んでいることが見出された。特に断りがない限り、本明細書に使用されるとき、“ＲＮＡポリホスファターゼ”は、タンパク質または遺伝子のバリアントを指し得る。
またさらに、ＲＮＡポリホスファターゼのバリアントの形態は、本明細書にさらなる詳細が記載されているこれらのタンパク質およびＤＮＡ分子と等価であると考えられる。例えば、イソロイシンもしくはバリンを用いたロイシンの置換、グルタミン酸を用いたアスパラギン酸の置換、セリンを用いたスレオニンの置換、または構造的に関連のあるアミノ酸を用いたアミノ酸の類似の置換（すなわち保存的な変異）は、生じる分子の生物学的な活性に重大な影響を与えないと考えられる。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、保存的な置換を含んでいる本明細書に開示されているＲＮＡポリホスファターゼのバリアントを提供する。保存的な置換は、それらの側鎖に関連のあるアミノ酸の群の範囲において生じる置換である。遺伝的にコードされているアミノ酸は、４つの群：（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；および（４）無電荷の極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）に分けられる。ときにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として、ともに分類される。同様にして、アミノ酸の種類は、（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、任意にこのうちセリンおよびスレオニンは脂肪族のヒドロキシルとして別に分類される；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；ならびに（６）含硫（システインおよびメチオニン）として分類され得る（例えば、Stryer ed., Biochemistry, pg. 17-21, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981）。ペプチドアミノ酸配列における変化が機能的なポリペプチドを生じさせるか否かは、野生型のタンパク質と同様に機能するバリアントペプチドの能力を評価することによって容易に決定され得る。２つ以上の置換を有しているペプチドは、同じ手法において容易に試験され得る。
よりまれに、バリアントは、“非保存的な”変化（例えば、トリプトファンを用いたグリシンの置換）を含んでいる。また、類似の軽度の変異は、アミノ酸欠失もしくはアミノ酸挿入またはその両方を含み得る。生物学的な活性を消失させることなくアミノ酸残基が置換され得るか、挿入され得るか、または欠失され得るかを決定する教示は、コンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（DNASTAR Inc., Madison, WI））を用いて見出され得る。
バリアントは、後ほどその詳細が記載されている方法（例えば、定方向の進化またはバリアントの組換えライブラリを生成する他の技術）によって生成され得る。本発明のさらなる他の実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、ＲＮＡポリホスファターゼのコーディング配列を変化（遺伝子産物のクローニング、局在化、分泌および／または発現を調節する変化変更が挙げられる）させるために、改変され得る。例えば、変異は、当該分野において十分に知られている技術（例えば、新たな制限酵素部位を挿入するか、糖鎖形成の型を変更するか、またはコドンの優先度を変更するなどのための部位特異的な突然変異誘発）を用いて導入され得る。いくつかの実施形態において、バリアントの核酸配列は、遺伝コードの縮重のために未処理のタンパク質をコードしている。いくつかの実施形態において、バリアントは、所望の特定の組換え発現系にとって最適なコドンを選択するために提供される。
本発明のさらなる他の実施形態は、ＲＮＡポリホスファターゼの変異体またはバリアントの形態を提供する。活性または安定性を増強させることを目的として、ＲＮＡポリホスファターゼの活性を有しているペプチドの構造を修飾することが可能である。当該安定性は、例えば、エクスビボにおける保存期間および／またはインビボにおける加水分解性の分解に対する耐性である。そのような修飾されているペプチドは、本明細書に規定されるような対象となるＲＮＡポリホスファターゼの活性を有しているペプチドの、機能的な等価物と考えられる。例えばアミノ酸置換、アミノ酸欠失（トランケーションが挙げられる）またはアミノ酸付加によって、アミノ酸配列が改変されている、修飾されているペプチドが生成され得る。
さらに、上述のように、対象となるＲＮＡポリホスファターゼタンパク質のバリアントの形態（例えば変異体）はまた、さらなる詳細について述べられているこれらのペプチドおよびＤＮＡ分子と等価であると考えられる。例えば、上述のように、本発明は、保存的または非保存的なアミノ酸置換を含んでいる変異体およびバリアントのタンパク質を包含している。
本発明は、本発明のＲＮＡポリホスファターゼタンパク質の組換え変異体の組と同様に、トランケーション変異体の組を生成させる方法をさらに意図しており、ＲＮＡポリホスファターゼ活性に関して機能的であるバリアントの配列（すなわち変異体）の同定にとって特に有用である。そのような組換えライブラリのスクリーニングの目的は、例えば改善されているか、または変更されているＲＮＡポリホスファターゼ活性を有している新規なＲＮＡポリホスファターゼのバリアントを生成することである。
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼのバリアントは、本発明の方法によって改変されて、変更されている（例えば、向上されているか、または低下させられている）ＲＮＡポリホスファターゼ活性をもたらす。他の実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼのバリアントは、改変されて、特定の用途のための熱安定性（すなわち熱耐性）または熱不安定性のＲＮＡポリホスファターゼの活性をもたらす。本発明の他の実施形態において、天然に存在しているＲＮＡポリホスファターゼと異なる基質可変性（substrate variability）を有している、組合せ的に生成されているバリアントが生成される。組換えＤＮＡ構築物から発現される場合に、そのようなタンパク質には、本明細書に記載の方法における使用が見出される。
本発明のさらなる他の実施形態は、対応する野生型タンパク質と異なる細胞内の半減期を有しているＲＮＡポリホスファターゼのバリアントを提供する。例えば、変更されているタンパク質は、加水分解性の分解、またはＲＮＡポリホスファターゼの破壊もしくは不活化を生じる他の細胞過程に対してより安定または不安定な状態のいずれかにし得る。そのようなバリアント、およびそれらをコードしている遺伝子は、タンパク質の半減期を調節することによってＲＮＡポリホスファターゼ発現の局在を変更するために利用され得る。例えば、短い半減期は、ＲＮＡポリホスファターゼのより短い生物学的な作用をもたらし得、誘導性の発現系の一部である場合に、細胞内のＲＮＡポリホスファターゼのレベルのより厳密な制御を可能にする。
本発明のさらなる他の実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼのバリアントは、対応する野生型タンパク質の能力を妨害して細胞機能を制御可能なアンタゴニストとして作用するために、組換え手法によって生成される。
本発明の組合せの変異生成手法のいくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼの相同物、バリアントまたは他の関連タンパク質の集団に関するアミノ酸配列は、考え得る最も高い相同性を好ましく求めるために整列化される。バリアントのそのような集団としては、例えば、１つ以上の種もしくは亜種から得られるＲＮＡポリホスファターゼの相同物、または同じ種もしくは亜種から得られるが、変異または多形に起因して異なるＲＮＡポリホスファターゼのバリアントが挙げられる。整列化されている配列の各位置に現れるアミノ酸が、組合せの配列の変質した組を作り出すために選択される。
本発明の好ましい実施形態において、組合せのＲＮＡポリホスファターゼライブラリは、ＲＮＡポリホスファターゼタンパク質の見込みのある配列の少なくとも一部をそれぞれが含んでいるポリペプチドのライブラリをコードしている遺伝子の変性したライブラリによって生成される。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、ＲＮＡポリホスファターゼの見込みのある配列の変性した組が個々のポリペプチド、またはＲＮＡポリホスファターゼの配列の組を含んでいる（例えば、ファージディスプレイ用の）より大きなタンパク質の組として発現可能に、遺伝子配列に酵素的に連結され得る。
ＲＮＡポリホスファターゼの見込みのある相同物およびバリアントのライブラリが変性したオリゴヌクレオチド配列から生成される多くの方法が存在している。いくつかの実施形態において、変性した遺伝子配列の化学合成は自動化されたＤＮＡ合成機において実施され、合成された遺伝子は発現にとって適切な遺伝子と連結される。遺伝子の変性した組の目的は、ＲＮＡポリホスファターゼの見込みのある配列の所望の組をコードしている配列のすべてを、単一の混合物において提供することである。変性したオリゴヌクレオチドは、当該技術においてよく知られている（例えば、Narang, Tetrahedron Lett., 39: 39, 1983；Itakura et al., Recombinant DNA, in Walton (ed.), Proceedings of the 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, Elsevier, Amsterdam, pp 273-289, 1981；Itakura et al., Annu. Rev. Biochem., 53: 323, 1984；Itakura et al., Science 198: 1056, 1984；Ike et al., Nucl. Acid Res., 11: 477, 1983を参照すればよい）。そのような技術は、他のタンパク質の定方向の進化に採用される（例えば、Scott et al., Science 249: 386, 1980；Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2429, 1992；Devlin et al., Science 249: 404, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378, 1990；ならびに米国特許第５２２３４０９号；米国特許第５１９８３４６号；および米国特許第５０９６８１５号を参照すればよい）。
ＲＮＡポリホスファターゼの核酸（例えば、配列番号１、ならびにそれらの断片、バリアントおよび相同物）が、定方向の進化のための開始核酸として利用され得ることが意図されている。これらの技術は、所望の特性（例えば、増強されているか、低下させられているか、または変更されているＲＮＡポリホスファターゼ活性）を有しているＲＮＡポリホスファターゼバリアントを構築するために利用され得る。
いくつかの実施形態において、人工的な進化は、無作為の変異生成（例えば、所望のコーディング配列に無作為に変異を導入するためのエラー−プローンＰＣＲ（error-prone PCR））によって実施される。この方法は、変異の頻度が精密に調整されている必要がある。一般的な法則として、有益な変異はまれであり、有害な変異が多く見られる。これは、有害な変異および有益な変異の組合せが不活性な酵素をしばしば生じるためである。標的の遺伝子に関する塩基置換の理想的な数は、一般的に１．５から５の間である（Moore and Arnold, Nat. Biotech., 14, 458, 1996；Eckert and Kunkel, PCR Methods Appl., 1: 17-24, 1991； Caldwell and Joyce, PCR Methods Appl., 2: 28, 1992；およびZhao and Arnold, Nuc. Acids Res. 25: 1307, 1997）。変異生成の後に、生じたクローンは所望の活性に関して選択される（例えば、ＲＮＡポリホスファターゼ活性についてスクリーニングされる）。所望の特性を有している酵素の構築には、変異生成および選択の繰返しに成功する必要がしばしばある。有用な変異のみが次回の変異生成に持ち越されることに留意されたい。
本発明の他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子シャッフリングまたはセクシャルＰＣＲ法（sexual PCR procedures）に使用される（例えば、Smith, Nature, 370: 324, 1994；米国特許第５８３７４５８号；米国特許第５８３０７２１号；米国特許第５８１１２３８号；米国特許第５７３３７３１号）。遺伝子シャッフリングは、種々の変異体ＤＮＡのランダムな断片化、これに続くＰＣＲによる全長分子への再構築に関する。種々の遺伝子シャッフリング法の例としては、ＤＮａｓｅ処理に続く構築、食い違いの伸張過程（staggered extension process）、およびインビトロ組換えにおけるランダムプライミングが挙げられる。ＤＮａｓｅを使用する方法において、陽性の変異体のプールから単離されたＤＮＡセグメントが、ＤＮａｓｅ Ｉを用いてランダムな断片に切断され、プライマーを加えない多段階のＰＣＲに供される。ランダムな断片の長さが、ＰＣＲサイクルが進むにつれて切断されていないセグメントの長さに近づいてゆき、異なるクローンに存在する変異を、混合して生じさせ、生じる配列のいくつかに蓄積させる。選択およびシャッフリングの繰返しによって、種々の酵素の機能的な増強に導く（Stemmer, Nature, 370:398, 1994；Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747, 1994；Crameri et al., Nat. Biotech., 14: 315, 1996; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4504, 1997；およびCrameri et al., Nat. Biotech., 15: 436, 1997）。
点変異によって作製される組合せのライブラリの遺伝子産物のスクリーニング、および特定の特性を有している遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに関する広範な手法が、当該技術において公知である。そのような手法は、ＲＮＡポリホスファターゼの相同物もしくはバリアントの、組合せの変異生成または組換えによって生成される遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングと一般的に適合する。大きな遺伝子ライブラリのスクリーニングに最も広く使用される手法は、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリのクローニング、生じたライブラリの複数のベクターを用いた細胞の形質転換、および組合せの遺伝子の発現を典型的に包含している。ここで、当該遺伝子は、所望の活性の検出が、生成物を検出した遺伝子をコードしているベクターの簡単な単離を比較的に容易にする条件において発現される。
また、本発明の核酸およびタンパク質の断片は、当該断片が所望の酵素活性をコードしているか、または保有している限り、使用され得る。
ＲＮＡポリホスファターゼの酵素活性は、異なる基質（例えば、ＮＴＰ、一次ＲＮＡまたは６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート）、条件およびアッセイを用いた種々の方法において規定され得る。例えば、使用され得るユニットの定義の１つは、“ＲＮＡポリホスファターゼの１ユニットが、標準的な反応アッセイ条件、３７℃において６０分間にＡＴＰから１ｎｍの無機リン酸を放出する酵素の量”である。当該条件は、例えば、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＭＥおよび０．０１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００からなる反応緩衝液における１ｍＭのＡＴＰを用いた条件である。
“試料”および“生物学的な試料”という用語は、広義の意味に使用され、任意の生成源（生物学的な生成源および環境の生成源が挙げられる）から得られる試料または分析物を包含している。生体から得られる生物学的な試料を指して本明細書に使用されるとき、“試料”という用語は、液体、固体、組織および気体を包含している。本発明の好ましい実施形態において、生物学的な試料としては、体液、単離された細胞、固定された細胞、および細胞溶解液などが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態において、試料は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）組織切片であり、当該試料に含まれいているＲＮＡは、分解されたＲＮＡ分子（キャップ形成されている分解されたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有している分解されたＲＮＡ、５’一リン酸基を有している分解されたＲＮＡ、および／または５’ヒドロキシル基を有している分解されたＲＮＡが挙げられる）を含んでいる。したがって、１つ以上のＲＮＡ分子を入手するか、単離するか、精製するか、または定量化する方法のいずれかのいくつかの実施形態において、試料は分解されたＲＮＡを含んでおり、当該方法は、当該試料における分解されたＲＮＡ（例えば、キャップ形成されている分解されたＲＮＡまたは５’三リン酸化されている分解されたＲＮＡ）のそれぞれを入手するか、単離するか、精製するか、または定量化するために使用される。いくつかの実施形態において、入手されるか、単離されるか、精製されるか、または定量化される１つ以上のＲＮＡ分子は、天然に存在する未分解のＲＮＡ分子から得られたＲＮＡ分子の５’末端部分のみか、または当該５’末端部分を主に（例えば、キャップ形成されているＲＮＡ分子または５’三リン酸化されているＲＮＡ分子の５’末端部分のみを）含んでいる。しかし、これらの試料は、本発明とともに使用を見出す試料の種類を限定するようには構成されていない。いくつかの実施形態において、試料は、例えば当該技術に公知のＲＮＡ増幅反応のいずれかを用いて増幅されているＲＮＡを含んでいる。一般的に、そのようなＲＮＡ増幅反応の少なくとも一段階は、試料に元から存在しているＲＮＡから調製される二本鎖のｃＤＮＡのインビトロ転写を包含している。
“転写”は、ＤＮＡ分子を鋳型として用いたＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の形成または合成を意味する。本発明は、転写に使用されるＲＮＡポリメラーゼに限定されない。
本明細書に規定されるとき、“Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼ”は、Ｔ７型バクテリオファージから得られたＲＮＡポリメラーゼの野生型または変異体（ファージにコードされる酵素、ならびにＤＮＡベクターにおけるＲＮＡポリメラーゼのクローニングおよび細菌細胞もしくは他の細胞における発現によって得られた酵素が挙げられる）の形態である。これは、試験されているすべてのＴ７型バクテリオファージの遺伝的起源が、Ｔ７の遺伝的起源と必須に同じであるとの知見に基づいている。Ｔ７型バクテリオファージの例としては、Escherichia coli ファージのＴ３、ｐｈｉ Ｉ、ｐｈｉ ＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、Ａ１、１２２、ｃｒｏ、Ｃ２１、Ｃ２２およびＣ２３；Pseudomonas putida ファージのｇｈ−１；Salmonella typhimurium ファージのＳＰ６；Serratia marcescens ファージのＩＶ；Citrobacter ファージのＶｉＩＩＩ；ならびにKlebsiella ファージのＮｏ．１１が挙げられる（Hausmann, Current Topics in Microbiology and Immunology 75: 77-109, 1976；Korsten et al., J. Gen. Virol. 43: 57-73, 1975；Dunn, et al., Nature New Biology 230: 94-96, 1971；Towle, et al., J. Biol. Chem. 250: 1723-1733, 1975; Butler and Chamberlin, J. Biol. Chem. 257:5772-5778, 1982）。また、変異体Ｔ７型のＲＮＡＰが、いくつかの実施形態において、本発明の方法またはアッセイに使用され得る。変異体Ｔ７型のＲＮＡＰは、米国特許第５，８４９，５４６号；Padilla, R and Sousa, R, Nucleic Acids Res., 15: e138, 2002；Sousa, R and Mukherjee, S, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol., 73: 1-41, 2003に記載されているようなものである。変異体Ｔ７型のＲＮＡＰは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡＰ Ｙ６３９Ｆ変異体酵素、Ｔ３ ＲＮＡＰ Ｙ６４０Ｆ変異体酵素、ＳＰ６ ＲＮＡＰ Ｙ６３１Ｆ変異体酵素、６３９位および７８４位の両方に変更されたアミノ酸を有しているＴ７ ＲＮＡＰ、６４０位および７８５位の両方に変更されたアミノ酸を有しているＴ３ ＲＮＡＰ、または６３１位および７７９位の両方に変更されたアミノ酸を有しているＳＰ６ ＲＮＡＰである。特にそのような変異体酵素は、特定の特性および用途を有しているＲＮＡ分子の合成に有利な特定の基質またはｄｄＮＴＰに加えて、ｄＮＴＰおよび２’−Ｆ−ｄＮＴＰを（例えば、Ｔ７ Ｒ＆ＤＮＡ（商標） ポリメラーゼまたはＤＵＲＡＳＣＲＩＢＥ（商標） Ｔ７ 転写キット（EPICENTRE）を用いて）を組み込み得る。いくつかの実施形態において、ファージ Ｎ４ ｍｉｎｉ−ｖＲＮＡＰが、Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼとして使用される。ファージ Ｎ４ ｍｉｎｉ−ｖＲＮＡＰは、Ｎ４ ｖＲＮＡＰの転写活性のある１１０６のアミノ酸ドメインであり、当該アミノ酸ドメインは、Ｔ７型のＲＮＡＰと共通する特定のドメインを有しているＮ４ ＶＲＮＡＰの９９８−２１０３アミノ酸に対応する（Kazmierczak, K.M., et al., EMBO J 21: 5815-5823, 2002；米国特許第７，４５２，７０５号）。代わりのいくつかの実施形態において、標準的ではないヌクレオチド（例えば、２’−Ｆ−ｄＮＴＰ、米国特許第７，４５２，７０５号）を組み込み得るＮ４−ｍｉｎｉ ｖＲＮＡＰ Ｙ６７８Ｆ変異体酵素が、Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼとして使用される。転写を実施するために、ＲＮＡポリメラーゼは、“ＲＮＡポリメラーゼプロモータ”、“転写プロモータ”または単に“プロモータ”と呼ばれるおよそ長さ２５ヌクレオチドのＤＮＡ配列を認識し、当該ＤＮＡ配列に結合し、それらから転写を開始する。ほとんどの場合、プロモータ配列は二本鎖である。本明細書に使用されるとき、ＲＮＡの合成用の鋳型と共有結合的に連結されている二本鎖のプロモータの鎖は、“センス鎖”または“センスプロモータ配列”と規定され、その相補物は、“アンチセンス鎖”または“アンチセンスプロモータ配列”と規定される。
次の実施例は本発明の好ましい特定の実施形態および態様を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。
〔ＲＮＡポリホスファターゼの発見と精製〕
我々は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのインシチュにおいてEscherichia coliのタンパク質を復元して、ＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）を発見した。γ32Ｐによって末端標識したＲＮＡの存在下においてポリアクリルアミドを重合させることによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動ゲル（１５％）を準備した。当該ＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７反応緩衝液、γ32Ｐによって標識されたＧＴＰ、非標識のＡＴＰ、非標識のＣＴＰおよび非標識のＵＴＰを用いた、直鎖状の鋳型ＤＮＡのインビトロにおける転写によって合成された。電気泳動の後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファは、ＳＤＳを含んでいない緩衝液においてゲルをインキュベートすることによって交換されて、ＳＤＳを除去し、インシチュにおけるタンパク質の復元を可能にした。ゲルは、緩衝液において一晩にわたってインキュベートされ、当該ゲルは、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて染色された。約３００００の分子量の位置に移動していた未染色のバンドが明確に認められた。しかし、ゲルが７．５％の酢酸中において固定され、それから乾燥され、オートラジオグラフィーにかけられると、オートラジオグラフィーにおいて放射性を示さない２つのバンドが、約３００００（３０ｋＤａ）および約１９０００の分子量（１９ｋＤａ）の位置に移動して、認められた。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色は、１９ｋＤａバンドにおけるＲＮＡの存在を示しており、これは１９ｋＤａのタンパク質による32Ｐによって末端標識したＲＮＡの、分解を伴わない脱リン酸化を意味する。３０ｋＤａバンドにおいてＳＹＢＲゴールドによって染色されていないことは、当該バンドにおけるタンパク質が、おそらくＲＮａｓｅＩであるＲＮａｓｅであることとを意味している。
酵素活性についてのアッセイを簡素化し、酵素の精製を容易にするために、我々は代替となる酵素の基質を探索した。我々は、蛍光発生性のホスファターゼ基質である６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）が１９ｋＤａタンパク質にとっての基質であることを見出した。加水分解によって、この基質は、蛍光性の生成物６，８−ジフロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（ＤｉＦＭＵ）に転換された。ＤｉＦＭＵは３５８ｎｍに吸収ピークを有しており４５５ｎｍに吸収ピークを有している。驚いたことに、ＲＰＰ酵素は、ＤｉＦＭＵＰを基質として用いる場合に、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４ＭＵＰ）を基質として用いる場合よりも、５０倍を超える活性を示した。それゆえに、ＤｉＦＭＵＰは、ポリアクリルアミドゲルのインシチュにおいてタンパク質を復元させた後、標準的なＵＶトランスイルミネーターを用いてEscherichia coliの全抽出物において１９ｋＤａの単一の蛍光のバンドを検出するために使用された。また、上記バンドはクーマシーブルーのタンパク質染色によって染色された。より簡便なＤｉＦＭＵＰアッセイを使用して、我々は、ＲＮＡポリホスファターゼタンパク質の精製の大規模化を可能にし、物理的特性および酵素特性の性質決定を可能にした。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリホスファターゼ活性は、以下の方法：ポリエチレンイミン分画、硫酸アンモニウム分画、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ ７０カチオン交換カラムクラマトグラフィー（例えば、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ７０クラマトグラフィー）；ゲルろ過カラムグラマトグラフィー（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ ＳｌＯＯ）；アニオン交換カラムグラマトグラフィー（例えばＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の１つ以上を用いて精製されている。ＲＮＡポリホスファターゼ活性は、イオン交換カラムおよびゲルろ過カラムの両方における単一のピークとしてクロマトグラム化され、これは、１９ｋＤａのタンパク質がこの活性を示す単一の酵素であることを示唆している。
〔ＲＮＡポリホスファターゼをコードしている遺伝子の同定〕
タンパク質を同定し、ＲＮＡポリホスファターゼ酵素をコードしている遺伝子座を決定するために、ＲＮＡポリホスファターゼをトリプシンを用いてゲルにおいて消化し、生じたトリプシン消化物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）によって分析した。ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いて、ＮＣＢＩデータベースにおけるタンパク質配列と比較すると、ＲＮＡポリホスファターゼから得られたトリプシンによって生じたペプチド配列は、Escherichia coliの５３６３８に由来するタンパク質と一致した。実際には、上位の１２位が、データベースにおけるEscherichia coliの異なる菌種に由来する同じタンパク質と一致した（タンパク質スコアは４３９〜２２９の範囲である、ｐ＜０．０５）。Escherichia coliの異なる菌種に由来する１２のタンパク質の配列は、実質的に同一である。Escherichia coliのＫｌ ２（ＭＧ １６５５）において、このタンパク質（遺伝子座タグｂ２２５２）は、未知の機能を有しているアルミニウム誘導タンパク質と注釈されている。対応するアルミニウム誘導性（ａｉｓ）の遺伝子は、５０．０４マイニュートに位置しており、約２００アミノ酸のタンパク質をコードしている。当該遺伝子は、非必須の遺伝子に分類され、無機リン酸を含んでいない規定の培地において培養された培養物に０．２ｍＭのＺｎＳＯ４を添加した後に、当該遺伝子のｍＲＮＡレベルが１６倍に誘導された。この遺伝子によるタンパク質産物の情報は、当該タンパク質産物がこれまでに発見されていないため、入手不可能である。理論に束縛されることなく、ＯＲＦに保存されているドメインの探索によって、上記タンパク質は、ホスホグリセリン塩酸ムターゼ様スーパーファミリーの一員であり得ることが示されている。このファミリーにおける酵素の触媒活性は、ヒスチジンのリン酸化と典型的に関連する。
〔ａｉｓ遺伝子のクローニングおよび過剰発現〕
我々は、Escherichia coli Ｋｌ２（ＭＧ １６５５）から分離されたゲノムＤＮＡおよびＮｄｅｌおよびＢａｍＨＩの制限酵素にとっての認識部位を有している特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ａｉｓ遺伝子（ｂ２２５２遺伝子座）を増幅した。Ｎｄｅｌ認識配列を有しているこのフォワードプライマーを、最初のコドンをＧＴＧからＡＴＧに変更するために改変した。増幅生成物を、誘導可能なＴ７に基づくｐＥＴプラスミド発現ベクターの対応する部位にクローンし、続いてEscherichia coliのＥｃ１００コンピテント細胞の形質転換、および組換え体の選択を行い、挿入されたＤＮＡの配列がａｉｓ遺伝子であることを確認した。組換えクローンに由来するタンパク質のＲＮＡポリホスファターゼ活性は、上述のようにインシチュゲルアッセイを用いて蛍光によって検出し、誘導によるタンパク質の過剰発現をクーマシーブルー染色によってモニターした。精製された天然ＲＮＡポリホスファターゼを、これらの実験において対照として使用した。組換えクローンから得られたタンパク質の全量より少ない量を、誘導されていない細胞に存在する内在性のＲＮＡポリホスファターゼの検出を最小化するために、ゲルアッセイに使用した。
２つの蛍光およびクーマシーブルー染色のバンドは、誘導された組換え細胞から調製されたタンパク質抽出物に見られた。誘導された組換え細胞に由来するこれらのバンドの１つは、１９ｋＤａの天然のＲＮＡポリホスファターゼと大きさおよび特性が同一の、ＲＮＡポリホスファターゼ活性を有している溶解性のタンパク質であった。さらに、ＲＮＡポリホスファターゼ活性を有しており、大部分が封入体に存在する第２の２４ｋＤａのタンパク質はまた、誘導された組換え細胞において過剰発現された。精製された天然酵素、ならびに組換えの２４ｋＤａおよび１９ｋＤａのＲＮＡポリホスファターゼのアミノ末端を、エドマン分解によって決定した。天然のタンパク質および過度発現された組換え体の１９ｋＤａタンパク質のアミノ末端の配列は、Ｓ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｐであり、同一であった。２４ｋＤａの組換え体のタンパク質のアミノ末端は、Ｍ−Ｌ−Ａ−Ｆであり、クローンされたａｉｓ遺伝子のアミノ末端と一致している。天然の酵素のアミノ末端配列Ｓ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｐによって、当該タンパク質は、おそらくシグナルぺプチダーゼによって処理され、成熟した酵素が細胞膜周辺腔に存在することが示唆された。天然の酵素の細胞における局在を決定するために、Escherichia coliのＢ 細胞をスフェロプラストに転換し、上清（細胞膜周辺腔画分）に放出されたＲＮＡポリホスファターゼ活性、および上記スフェロプラスト（細胞質画分）によって保持されたＲＮＡポリホスファターゼ活性を蛍光のインシチュゲルアッセイによって測定した。ＲＮＡポリホスファターゼが、細胞周辺質画分において検出され、活性成分は、精製された１９ｋＤａの天然の酵素と共に移動した。また、細胞質画分は、１９ｋＤａタンパク質のように移動するＲＮＡポリホスファターゼ活性を有していたが、２４ｋＤａ ＲＮＡポリホスファターゼは検出されなかった。理論に束縛されことなく、上記データによって、組換えの１９ｋＤａのＲＮＡポリホスファターゼは、アミノ末端の処理によって２４ｋＤａタンパク質から得られる細胞周辺質のタンパク質であることが示唆された。非組換え細胞の細胞質画分に認められた１９ｋＤａのＲＮＡポリホスファターゼ活性の存在は、細胞からスフェロプラストへの不完全な転換に起因し得、組換え細胞における２４ｋＤａの活性なタンパク質の存在は、組換え細胞内の封入体に存在する未処理のタンパク質におそらく起因し得る。ａｉｓ遺伝子は、Zalucki, YMら（Nucleic Acids Res. 35: 5748-5754, 2007）によって分泌タンパク質に分類されたが、予測される断裂部位は、同定されたアミノ端末と異なっていたことを鑑みると興味深い。
〔精製されたＲＮＡポリホスファターゼの触媒性質〕
精製されたＲＮＡポリホスファターゼ酵素は、広いｐＨ範囲において活性を示す（例えば、ｐＨ５．０からｐＨ８．０の範囲において最適の活性を有している）。驚くことに、いくつかの他のリン酸除去酵素と対照的に、当該ＲＮＡポリホスファターゼ酵素は、Ｍｇ2+といった二価のカチオンを必要とせず、ＥＤＴＡ存在下において活性を有している。実際に、当該酵素は、１ｍＭのＭｇ2+カチオン存在下において阻害される。
一次ＲＮＡまたは５’二リン酸化されているＲＮＡ（例えば、キャップ形成酵素ＲＮＡ三リン酸化反応から得られる）といった核酸から、βリン酸およびｒリン酸を除去することに加えて、精製された〜１９ｋＤａの単一のサブユニットのＲＮＡポリホスファターゼは、多くの他の基質（ヌクレオシド５’二リン酸およびヌクレオシド５’三リン酸（例えば、ＮＴＰ、ＮＤＰ、ｄＮＴＰ、ｄＮＤＰｓ）が挙げられる）からリン酸基を除去し得る。加水分解の生成物は、ヌクレオシド５’一リン酸および無機のオルトリン酸である。ヌクレオシド５’一リン酸は基質ではない。ＡＤＰは、ＡＴＰと比べて５０％の効率において加水分解された。上記酵素は、ヌクレオシド三リン酸を段階的に加水分解し、ピロリン酸の代わりに無機のオルトリン酸を放出する。薄層クラマトグラフィーによるＡＴＰ加水分解の生成物の経時的な分析によって、ＡＭＰ出現を受けたＡＤＰの蓄積が示された。興味深いことに、ポリリン酸は、ＡＴＰと同様にＲＮＡポリホスファターゼにとっての良好な基質であると同時に、無機のピロリン酸は基質ではように思われる。左右対称のジヌクレオシド三リン酸であるＧ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇおよびそのメチル化誘導体である ｍ７Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇは、加水分解を受るにしてもほとんどまれであり、当該酵素がエキソポリホスファターゼであることを示唆している。また、酵素の最初のスクリーニングおよび同定に使用された基質であるＤｉＦＭＵＰは、良好な基質であると同時に、４−メチル−ウンベリフェリルリン酸およびｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）は当該酵素にとって良好な基質ではなく、ビス（ｐ−ニトリルフェニル）リン酸はほとんど加水分解を受けなかった。理論に束縛されることなく、ＤｉＦＭＵＰが一リン酸を有しているにもかからず、６位および８位にあるフッ素がＤｉＦＭＵＰを上記酵素の基質にする役割をおそらく果たしていると仮定される。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドーリル リン酸、およびホスホアミノ酸であるホスホセリンは、基質としてまったく認識されなかった。
我々は、ＲＮＡの５’末端上に三リン酸基または二リン酸基を有しているＲＮＡを一リン酸塩に切断できるが、キャップ形成されているＲＮＡを一リン酸塩に切断できないＲＮＡポリホスファターゼが、当該技術においてこれまでに教示されていないと確信する。この活性は本明細書に記載の種々の方法に有用である。しかし、理論に束縛されることなく、我々は、ＲＮＡポリホスファターゼが得られるバクテリアが、天然において類似の機能のために当該酵素を利用しているとは考えていない。むしろ、我々は、ＲＮＡポリホスファターゼが原核生物における細胞周辺質の酵素であるとの知見から、その天然の機能が、酵素の周囲にある必要の栄養素（例えばリン酸）を捕集するためであり得ることを示していると考える。したがって、本明細書に記載の方法は、我々の目的にとって好都合であるとはいえ、人工的なものであり得る。それにもかかわらず、これらおよびいくつかの他のホスファターゼは多機能であり、広範なリン酸化化合物（例えば、ヌクレオチド、糖リン酸、ホスホリン脂質およびポリリン酸）に対して活性であるので、天然におけるＲＮＡポリホスファターゼによって果たされる役割は不明なままである。
〔キャップ形成されていないＲＮＡおよびキャップ形成されているＲＮＡの混合物から、キャップ形成されているＲＮＡを入手するか、分離するか、もしくは精製するキットおよび方法、またはキャップ形成されていないＲＮＡおよびキャップ形成されているＲＮＡの混合物から、キャップ形成されているＲＮＡの割合を定量するキットおよび方法の例〕
（Ａ．キットの内容物）
組成物およびキットは、以下の成分：
１．２Ｕ／μｌのＲＮＡ５’ポリホスファターゼ
２．１Ｕ／μｌのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ５’リン酸依存性エキソヌクリアーゼ
３．１０×酵素反応用緩衝液：
４１．５％（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのＭｇＣｌ2および１ＭのＮａＣｌ）および５８．５％（０．５ＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のβ−メルカプトエタノールおよび０．１％のトリトン Ｘ−１００）
４．ＲＮａｓｅを含んでいない水
を含んでいるか、または当該成分からなる。
保存緩衝液：ＲＮＡポリホスファターゼおよびＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ エキソヌクレアーゼの両方は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトールおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００を含有している５０％のグリセロール溶液に含まれている。
活性およびユニットの定義：１ユニットのＲＮＡポリホスファターゼは、標準的なアッセイ条件、３７℃において１時間に、１ナノモルの無機リン酸をＡＴＰから放出させる。１ユニットのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ エキソヌクリアーゼは、標準的なアッセイ条件、３７℃において１時間に、０．１μｇのｒＲＮＡ基質を酸可溶性のヌクレオチドに消化する。
保存：霜取りサイクルを有していないフリーザーにおいて−２０℃に保存する。
ＲＮＡの定量：いくつかの実施形態において、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標） ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標） ＲＮＡ試薬／キット（Molecular Probes（登録商標）／Invitrogen（商標））がＲＮＡの定量に使用される。
（Ｂ．キャップ形成されているＲＮＡおよびキャップ形成されていないＲＮＡの混合物から、キャップ形成されているＲＮＡを分離するか、または当該ＲＮＡの割合を定量する方法またはアッセイ）
背景：
キットにおけるＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、５’三リン酸基を有しているＲＮＡを、５’一リン酸基を有しているＲＮＡに選択的に消化するが、試料におけるキャップ形成されているＲＮＡを消化しない。それから、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクリアーゼは、５’一リン酸基を有しているＲＮＡをＲＮＡモノヌクレオチドに選択的に消化するが、キャップ形成されているＲＮＡを消化しない。必要に応じて、試料におけるキャップ形成されているＲＮＡを定量し、試料におけるキャップ形成されているＲＮＡの割合を、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼおよびＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクリアーゼを用いた処理前におけるＲＮＡの初期量と、定量されたキャップ形成されているＲＮＡとの比較によって算出する。
キャップ形成されているＲＮＡおよびキャップ形成されていないＲＮＡの混合物を含有している試料または溶液は、任意の生成源から（細胞もしくは細胞の混合物に由来する精製されている総ＲＮＡを含んでいる生物学的な試料からか、またはインビトロキャップ形成反応からが挙げられる）入手され得る。いくつかの実施形態において、インビトロキャップ形成反応から得られるＲＮＡは、転写と同時のキャップ形成反応（例えば、ｍＳＣＲＩＰＴ（商標） ｍＲＮＡ生成システムまたはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標） キャップ形成酵素；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）から得られる。
〔方法またはアッセイの手順〕
以下の手順は４μｇのＲＮＡを含んでいる試料を使用するが、ユーザのニーズ、または以下に示されているＲＮＡのμｇ数に対する酵素の同じ割合を用いたＲＮＡの有効性に依存して、反応を大規模化または小規模化し得る。平行して進める対照は、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクリアーゼによって処理されていない同じ試料からなる。
（ステップ１）
生物学的な試料または転写と同時もしくは転写後のキャップ形成反応から精製された８μｇのＲＮＡを含んでいる試料を準備し、当該試料４μｇを含んでいる分量に分ける。一方に“対照”（未処理）のラベルを付し、他方に“試験”（処理済）のラベルを付す。
（ステップ２）
以下の反応成分を記載の順に混合する。
Figure 2011521626
（ステップ３）
３７℃において３０分間にわたってインキュベートする。
（ステップ４）
ドライアイスの上に置くことによって反応を停止させる。
（ステップ５）
必要に応じて、各チューブにおけるＲＮＡを定量する。
例えば、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ試薬／キット（Molecular Probes／Invitrogen）を用いて、メーカーの推薦にしたがって０−２００ｎｇ（０−１０００ｎｇ／ｍｌ）範囲にわたる標準曲線を作成する。個々に上述の反応物から５μｌを分注し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１ｍＭのＥＤＴＡを含んでいる１９５μｌのＴＥ緩衝液を分注したものに加える。この４０μｌをＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイに使用する。４０μｌは、キャップ形成反応が１００％の効率である場合の８０ｎｇのＲＮＡに等しい。すべての反応は、最小限かつ２通りに実施されるべきである。
キャップ形成されているＲＮＡの割合＝実験反応におけるＲＮＡの量／対照反応におけるＲＮＡの量×１００
正確さは、Ｑｕａｎｔ− ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ試薬／キットを用いて＋／−１０％か、それよりも正確であった。
注：マグネシウム（Ｍｇ++）はＲＮＡ５’ポリホスファターゼ活性に対して抑制性である。前段の反応（例えば、転写と同時または転写後のキャップ形成反応）からＭｇ++を含まないようにＲＮＡを精製することに注意すべきである。
本明細書に述べられている刊行物および特許は、参照によって本明細書に援用される。記載されている方法および組成物の改良および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者にとって明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求の範囲に記載の発明は、そのような特定の好ましい実施形態に不当に限定されるべきではないことについて理解される。実際には、本発明を実施するために記載されている態様の、関連分野の当業者にとって明らかな種々の変形は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。

Claims (67)

  1. 実質的に精製されているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる、組成物。
  2. 上記ＲＮＡポリホスファターゼがE. coliから得られている、請求項１に記載の組成物。
  3. 上記ＲＮＡポリホスファターゼが、配列番号２のうちの少なくとも２０の連続するアミノ酸を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
  4. 上記ＲＮＡポリホスファターゼが、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を示す、請求項１に記載の組成物。
  5. 上記ＲＮＡポリホスファターゼが、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を示す、請求項１に記載の組成物。
  6. 上記ＲＮＡポリホスファターゼが、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を示す、請求項１に記載の組成物。
  7. 上記ＲＮＡポリホスファターゼが、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を示す、請求項１に記載の組成物。
  8. 上記ＲＮＡポリホスファターゼが配列番号２を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
  9. 上記ＲＮＡポリホスファターゼが配列番号２からなる、請求項１に記載の組成物。
  10. 上記ＲＮＡポリホスファターゼが、保存的なアミノ酸変化を有している配列番号２からなる、請求項１に記載の組成物。
  11. 配列番号１のうちの少なくとも１８の連続する塩基を含んでいる核酸分子によってコードされている実質的に精製されているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる、組成物。
  12. 上記核酸分子が配列番号１のうちの少なくとも５０の連続する塩基を含んでいる、請求項１１に記載の組成物。
  13. 上記核酸分子が配列番号１に対して実質的に相同性を示す、請求項１１に記載の組成物。
  14. 上記核酸分子が配列番号１に対して７０％の相同性を示す、請求項１１に記載の組成物。
  15. 上記核酸分子が配列番号１に対して８０％の相同性を示す、請求項１１に記載の組成物。
  16. 上記核酸分子が配列番号１に対して９０％の相同性を示す、請求項１１に記載の組成物。
  17. 上記核酸分子が配列番号１に対して９５％の相同性を示す、請求項１１に記載の組成物。
  18. 細菌細胞からなる天然の生成源、および上記ＲＮＡポリホスファターゼの遺伝子が原核生物または真核生物の宿主細胞において発現されている組換え生成源から選択される生成源のなかから入手されている、請求項１または１１に記載の組成物。
  19. 天然の上記生成源がE. coliまたはShigellaの細菌細胞である、請求項１７に記載の組成物。
  20. E. coliまたはShigellaの上記細菌細胞から得られる上記ＲＮＡポリホスファターゼが、当該細菌細胞が培養されている培養培地に対する硫酸亜鉛の添加によって誘導することを包含している方法によって生成される、請求項１８に記載の組成物。
  21. 上記硫酸亜鉛が０．２ｍＭである、請求項１９に記載の組成物。
  22. 核酸配列にコードされている実質的に精製されているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる組成物であって、
    上記核酸配列が
    （ａ）ホスホグリセリン酸塩ムターゼ様のスーパーファミリーに関するモチーフを含んでいるか；
    （ｂ）アルミニウム誘導性の（ａｉｓ）遺伝子であるか；
    （ｃ）E. coliのＫ２１株（ＭＧ１６５５）における５０．４マイニュートに位置し、当該タンパク質が遺伝子座タグｂ２２５２を有しているか；
    （ｄ）宿主細胞において発現される配列番号１に相補的なｍＲＮＡをコードしているか；
    （ｅ）ベクターにクローニングされているＲＮＡポリホスファターゼの遺伝子から、宿主細胞において発現されるか；
    （ｆ）Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼにとってのプロモータの下流においてベクターにクローニングされており、ここで宿主細胞がＴ７型のＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能であるか；
    （ｇ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにとってのプロモータの下流においてベクターにクローニングされており、ここで宿主細胞がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能であるか；
    （ｈ）ｐＥＴベクターにクローニングされており、ここで宿主細胞がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導可能なE. coli細胞であるか；
    （ｉ）E. coli宿主細胞の染色体または染色体外ＤＮＡに挿入されるか；
    （ｊ）誘導可能なプロモータに連結されており、ＥＺ−ＴＮ（商標）トランスポゾン、ＨＹＰＥＲＭＵ（商標）もしくは人工的なＭｕトランスポゾン、トランスポザーゼをコードしていない人工的な他のトランスポゾンのなかから選択される人工的なトランスポゾンを用いて、Escherichia coliの宿主細胞の染色体に挿入されるか；
    （ｋ）配列番号１の完全な配列を含んでいるか；または
    （ｌ）配列番号１のうちの１０３から６０３ヌクレオチドを含んでいる、組成物。
  23. 実質的に精製されている上記ＲＮＡポリホスファターゼが、
    （ａ）配列番号２のうちの少なくとも６の連続するアミノ酸を含んでいるアミノ酸配列を示す単一のポリペプチドを含んでいるか；
    （ｂ）約２４ｋＤの分子量を有しているか；
    （ｃ）アミノ末端の最初の４アミノ酸がＭＬＡＦであるアミノ酸配列を示すか；
    （ｄ）約１９ｋＤの分子量を有しているか；
    （ｅ）アミノ末端の最初の４アミノ酸がＳＮＧＬであるアミノ酸配列を示しているか；
    （ｆ）ＥＤＴＡの存在下において活性であり、その酵素活性が酵素反応混合物における１ｍＭ以上の濃度のＭｇ2+カチオンの存在によって阻害されるか；
    （ｇ）４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を基質として使用する場合と比べて、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＤｉＦＭＵＰ）を基質として使用する場合に少なくとも５０倍以上の酵素活性を有しており、ここで反応緩衝液がｐＨ７．５の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＭＥおよび０．０１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００から構成されているか；または
    （ｈ）当該ＲＮＡポリホスファターゼを発現している細胞の周辺質の画分から精製されるか、もしくは単離される、請求項２１に記載の組成物。
  24. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリホスファターゼを備えている、キット。
  25. ５’エキソリボヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＲＮＡ５’モノホスファターゼおよびキャップ形成酵素系からなる群から選択される少なくとも１つの他の構成要素と組み合わせて、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼを備えている、キット。
  26. 上記ＲＮＡ５’ポリホスファターゼが、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩおよびShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩからなる群から選択され；上記５’エキソリボヌクレアーゼが、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ ＩエキソリボヌクレアーゼおよびＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼからなる群から選択され；上記ポリヌクレオチドキナーゼが、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼから選択され；上記キャップ形成酵素系が、ポックスウイルスのキャップ形成酵素系、ワクシニアのキャップ形成酵素系、Saccharomyces cerevisiaeのキャップ形成酵素系、およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標） キャップ形成酵素キットからなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。
  27. ＲＮＡポリホスファターゼ、および実質的にマグネシウムを含んでいない保存緩衝液もしくは反応緩衝液を備えている、キット。
  28. ＲＮＡポリホスファターゼと、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ＥＤＴＡ、β−メルカプトエタノール、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、およびＲＮａｓｅを含んでいない水のうちの１つ以上を含んでいる反応緩衝液とを備えている、キット。
  29. ＲＮＡポリホスファターゼと、グリセロール、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、ジチオスレイトールおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のうちの１つ以上を含んでいる保存緩衝液とを備えている、キット。
  30. 細胞または細胞の抽出物もしくは画分から得られる、タンパク質を含んでいる試料におけるＲＮＡポリホスファターゼを同定するか、入手するか、単離するか、または精製する方法であって、
    （Ａ）上記試料における上記タンパク質を分離することによって、分離されたタンパク質の溶液の収集物を入手するステップ；
    （Ｂ）ＲＮＡポリホスファターゼが活性を示す条件において、分離されたタンパク質の上記溶液のそれぞれを、βリン酸またはγリン酸の少なくとも１つが標識されている５’三リン酸基または５’二リン酸基を有しているＲＮＡ分子と接触させ、かつ標識されている上記βリン酸またはγリン酸がＲＮＡ分子から除去されているか否かを検出するステップ；ならびに
    （Ｃ）標識されている上記βリン酸またはγリン酸がＲＮＡ分子から除去されている分離されたタンパク質の溶液のなかから、上記ＲＮＡ分子上に５’αリン酸が存在している分離されたタンパク質の溶液を同定することによって、ＲＮＡポリホスファターゼを同定するか、入手するか、単離するか、または精製するステップを包含している、方法。
  31. 上記ＲＮＡ分子上にある５’αリン酸が存在している分離されたタンパク質の溶液を同定するステップ（３）は、５’エキソリボヌクレアーゼが、５’一リン酸基を有しているＲＮＡを消化し、５’三リン酸基または５’二リン酸基を有しているＲＮＡを消化しないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、標識されている上記リン酸がステップ（２）において除去されたＲＮＡ分子を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップであって、上記ＲＮＡ分子の消化がＲＮＡポリホスファターゼの存在を示すステップを包含している、請求項２９に記載の方法。
  32. 上記ＲＮＡ分子上にある５’αリン酸が存在している分離されたタンパク質の溶液を同定するステップ（３）は、上記ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドが、５’一リン酸基を有している上記ＲＮＡ分子の５’末端に連結されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、標識されている上記リン酸がステップ（２）において除去されたＲＮＡ分子を、ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させるステップであって、上記ＲＮＡ分子に対する上記ＲＮＡアクセプターオリゴヌクレオチドの連結がＲＮＡポリホスファターゼの存在を示すステップを包含している、請求項２９に記載の方法。
  33. ５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化し、キャップ形成されているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化しない方法であって、
    （１）キャップ形成されているＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを含んでいる試料、ならびにＲＮＡポリホスファターゼを準備するステップと；
    （２）５’α一リン酸基を除くすべてのリン酸が除去され、５’一リン酸を有しているＲＮＡが生成されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、上記試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップを包含している、方法。
  34. ５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが、５’三リン酸基を有しているＲＮＡおよび５’二リン酸基を有しているＲＮＡのなかから選択される、請求項３２に記載の方法。
  35. ５’三リン酸基を有している上記ＲＮＡが、真核生物の一次ＲＮＡ；原核生物の一次ＲＮＡ；ｎｃＲＮＡ；およびＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応であって、ＲＮＡ増幅反応の一部である場合が挙げられる当該インビトロ転写反応において合成されるＲＮＡのなかから選択される、請求項３３に記載の方法。
  36. ５’二リン酸基を有している上記ＲＮＡが、キャップ形成酵素系のＲＮＡトリホスファターゼを用いた一次ＲＮＡ転写物の消化生成物である、請求項３３に記載の方法。
  37. 少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡをも含んでいる試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製する方法であって、
    （１）キャップ形成されているＲＮＡ、ならびに５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよび５’一リン酸基を有しているＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡと；ＲＮＡポリホスファターゼと；５’エキソリボヌクレアーゼとを準備するステップ；
    （２）５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）から得られた上記試料を上記ＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップ；ならびに
    （３）５’一リン酸基を有しているＲＮＡが消化され、キャップ形成されているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（２）から得られた試料を５’エキソリボヌクレアーゼと接触させることによって、キャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製するステップを包含している、方法。
  38. ５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが、５’三リン酸基を有しているＲＮＡおよび５’二リン酸基を有しているＲＮＡからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  39. 入手されるか、単離されるか、または精製されるキャップ形成されている上記ＲＮＡが、治療用途または研究用途のための真核生物の細胞を形質転換するために使用される、請求項３６に記載の方法。
  40. 入手されるか、単離されるか、または精製されるキャップ形成されている上記ＲＮＡが、ワクチン調製用の、樹状細胞、マクロファージ、上皮細胞および人工の抗原提示細胞のなかから選択される抗原提示細胞（ＡＰＣ）をトランスフェクションするために使用される、請求項３８に記載の方法。
  41. ステップ（１）において準備されたキャップ形成されているＲＮＡが、生物学的な試料から入手されるか、またはインビトロキャップ形成反応から入手され、当該インビトロキャップ形成反応が、（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼおよびジヌクレオチドキャップ類似物を含んでいる、転写と同時のインビトロキャップ形成反応、ならびに（ｉｉ）キャップ形成酵素系を含んでいる転写後のインビトロキャップ形成反応のなかから選択される、請求項３６に記載の方法。
  42. キャップ形成されている上記ＲＮＡが、キャップ形成酵素系を用いてインビトロにおいてキャップ形成されている細菌性のｍＲＮＡを含んでいる、請求項３６に記載の方法。
  43. 上記試料におけるキャップ形成されているＲＮＡの量を定量するステップをさらに包含しており、以下のサブステップ：
    （１）（ａ）上記試料におけるＲＮＡの総量を定量するステップ；および
    （４）ステップ（３）において消化されなかったＲＮＡの量を定量することによって、上記試料におけるキャップ形成されているＲＮＡの量を定量するステップを包含している、請求項３６に記載の方法。
  44. ステップ（３）において消化されなかったＲＮＡの量を定量することによって、上記試料においてキャップ形成されていないＲＮＡの量を定量するステップをさらに包含している、請求項４２に記載の方法。
  45. ステップ（４）が、上記ＲＮＡに結合しているＲＩＢＯＧＲＥＥＮ ＤＹＥの蛍光を測定することによってか；または２．５Ｍの酢酸アンモニウム、０．３Ｍの酢酸ナトリウムもしくは０．３Ｍの酢酸カリウムおよびエタノールもしくはイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させること、水にペレットを懸濁させること、ならびにＡ260の吸光係数に基づいて分光光度的にＲＮＡを定量することによって、キャップ形成されているＲＮＡを定量するステップを包含している、請求項４２に記載の方法。
  46. ステップ（１）において準備された上記試料が、５’一リン酸基を有しているＲＮＡをさらに含んでおり、上記試料における５’一リン酸基を有しているＲＮＡの定量するステップをさらに包含しており、上記ＲＮＡポリホスファターゼと上記試料を接触させるステップ（２）の前に、以下のサブステップ：
    （１）（ｂ）上記試料における５’一リン酸基を有している上記ＲＮＡが消化されるが、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよびキャップ形成されているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）において準備された上記試料を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップ；ならびに
    （１）（ｃ）ステップ（１）（ｂ）において消化されたＲＮＡ、または消化されなかったＲＮＡの量を定量するステップであって、上記試料における消化されたＲＮＡの量が、５’一リン酸基を有している、上記試料におけるＲＮＡの量を示すステップをさらに包含している、請求項４２に記載の方法。
  47. ステップ（１）において準備された上記試料が５’一リン酸基を有しており、上記試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップ（２）の前に、以下のサブステップ：
    ステップ（１）においてＲＮＡ５’モノホスファターゼをさらに準備するステップ、および５’一リン酸基を有している、上記試料におけるＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡに転化されるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（１）において準備された上記試料を、上記ＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させるステップであって、ステップ（３）において５’エキソリボヌクレアーゼによって消化される、上記試料におけるＲＮＡポリホスファターゼの量が、５’ポリリン酸を有している、上記試料におけるＲＮＡの量を示すが、５’一リン酸を有している、上記試料におけるＲＮＡの量を示さないステップをさらに包含している、請求項４２に記載の方法。
  48. 上記５’ＲＮＡモノホスファターゼが、ステップ（２）の前に不活化されているか、もしくは除去されているか、またはステップ（２）に採用される反応条件によって不活化される、請求項４６に記載の方法。
  49. ステップ（１）において準備された上記試料が、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡをさらに含んでおり、ステップ（１）においてポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを準備するステップをさらに包含しており、
    （５）５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡがリン酸化されて、５’一リン酸基を有しているＲＮＡになるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（３）から得られた上記試料を、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰと接触させるステップ；
    （６）５’一リン酸基を有しているＲＮＡが消化されるが、キャップ形成されているＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよび５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡが消化されないための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（５）から得られた上記試料を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップ；ならびに
    （７）ステップ（６）において消化されたＲＮＡまたは消化されなかったＲＮＡの量を定量するステップであって、上記試料における消化されたＲＮＡの量が、５’ヒドロキシル基を有している、上記試料におけるＲＮＡの量を示すステップをさらに包含している、請求項４２に記載の方法。
  50. 試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、精製するか、または当該ＲＮＡの量を定量するキットであって、
    （１）アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰ ＩおよびShigellaのＲＰＰ Ｉからなる群から選択されるＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）；ならびに
    （２）ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標） ５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼおよびSaccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ Ｉエキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ Ｉ）からなる群から選択される５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）を備えている、キット。
  51. ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）をさらに備えている、請求項４９に記載のキット。
  52. ＲＮＡ５’モノホスファターゼをさらに備えている、請求項４９に記載のキット。
  53. 親和性結合分子と抱合されているＲＮＡポリホスファターゼを含んでいる、組成物。
  54. 上記親和性結合分子が、（ａ）ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでいる核酸；（ｂ）タンパク質；（ｃ）糖タンパク質；（ｄ）リポタンパク質；（ｅ）含水炭素；（ｆ）脂質；（ｇ）レクチン；（ｈ）ホルモン；（ｉ）ホルモン受容体；（ｊ）ビオチン；（ｋ）アビジンもしくはストレプトアビジン；（ｌ）プロテインＡ；（ｍ）プロテインＧ；（ｎ）抗体；（ｏ）抗原；および（ｐ）ジゴキシゲニンからなる群から選択される、請求項５２に記載の組成物。
  55. 親和性結合分子を標識する方法であって、
    （ｉ）ＲＮＡポリホスファターゼ、親和性結合分子、および化学抱合試薬を準備するステップ；ならびに
    （ｉｉ）上記ＲＮＡポリホスファターゼが上記親和性結合分子と抱合され、かつ上記ＲＮＡポリホスファターゼの酵素活性および上記親和性結合分子の、特異的な結合対の形成能が維持される条件において、上記ＲＮＡポリホスファターゼを、上記親和性結合分子および上記化学抱合試薬と接触させるステップを包含している、方法。
  56. 上記親和性結合分子が、核酸プローブ、タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、抗体、人工の抗体、ＳＥＬＥＸを用いて選択されるアプタマー、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
  57. 親和性結合分子と抱合されているか、または結合されているＲＮＡポリホスファターゼからなるシグナル増幅物質を調製する方法であって、
    （ａ）反応部分を有している親和性結合分子からなる反応性の親和性結合分子、およびＲＮＡポリホスファターゼを準備するステップ；ならびに
    （ｂ）反応性の上記親和性結合分子が上記ＲＮＡポリホスファターゼと共有結合的に抱合され、上記ＲＮＡポリホスファターゼの酵素活性、および上記親和性結合分子の特異的な結合対の形成能が維持される条件において、反応性の上記親和性結合分子を、ＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップを包含している、方法。
  58. 上記親和性結合分子が、核酸プローブ、タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、抗体、人工の抗体、ＳＥＬＥＸを用いて選択されるアプタマー、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
  59. アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰ、およびShigellaのＲＰＰからなる群から選択されるＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）、ならびにストレプトアビジン、人工の短鎖抗体およびプロテインＡからなる群から選択される分析物結合分子（ＡＢＳ）であるタンパク質からなる組換え融合タンパク質を含んでいる、組成物。
  60. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリホスファターゼ、およびＲＮＡを含んでいる試料を混合することによって形成されている、反応混合物。
  61. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリホスファターゼをコードしている、発現ベクター。
  62. 請求項６０に記載の発現ベクターを含んでいる宿主細胞。
  63. 組換え生成源に由来するＲＮＡポリホスファターゼをコードしている遺伝子を含んでいる組換え宿主細胞であって、当該遺伝子が、組換えベクターまたは人工のトランスポゾンを用いて当該宿主細胞に導入されている、組換え宿主細胞。
  64. 上記組換え生成源に由来する上記ＲＮＡポリホスファターゼをコードしている遺伝子によって示される配列と相補的なｍＲＮＡを発現する細菌細胞である、請求項６１または６２に記載の組換え宿主細胞。
  65. 上記組換え宿主細胞によって発現される上記ｍＲＮＡが、配列番号１または配列番号１の１０３〜６００ヌクレオチドを含んでいる配列と相補的である、請求項６３に記載の組換え宿主細胞。
  66. E. coliの宿主細胞である、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  67. ＲＮＡ分子を含んでいる試料を、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリホスファターゼにさらすことによって当該ＲＮＡ分子を修飾するステップを包含している、核酸分子を修飾する方法。
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