JP2023520224A

JP2023520224A - Ａｔｐ依存性ｄｎａリガーゼ

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Publication number: JP2023520224A
Application number: JP2022560040A
Authority: JP
Inventors: ストリベルニー、ベルントケテルセン; ソルスタッド、テレーゼ; ラネス、オラフ
Original assignee: Arcticzymes ASA
Current assignee: Arcticzymes ASA
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2023-05-16
Also published as: CN115916965A; CA3173175A1; WO2021198341A1; EP4127147A1; KR20230026987A; US20230125232A1

Abstract

本発明は、リガーゼの分野に関する。より具体的には、本発明は、様々な分子生物学技術においてリガーゼを特に有用にする独自のリガーゼ活性を有する、新規で高効率なＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼに関する。さらに、本発明は、上記ＤＮＡリガーゼを含む組成物およびキット、その製造および使用の方法に関する。

Description

本発明は、リガーゼの分野に関する。より具体的には、本発明は、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ、上記ＤＮＡリガーゼを含むキットおよび組成物、製造方法および使用に関する。

ＤＮＡリガーゼは、適切に整列したＤＮＡ配列中の５’－ホスホリル末端基と３’－ヒドロキシル末端基の間のＤＮＡの糖－リン酸骨格におけるホスホジエステル結合の形成を触媒する。ｉｎｖｉｖｏのリガーゼは、ＤＮＡの複製と修復にとって重要な一本鎖および二本鎖切断だけでなくニックの修復においても重要な役割を担う。

ＤＮＡの複製および修復に重要であることに加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのバクテリオファージから単離されたＤＮＡリガーゼは、数十年にわたって分子生物学において組換えプラスミド構築のためのベクターへのＤＮＡ断片の挿入、次世代ＤＮＡシーケンシングライブラリ構築の際のアダプターライゲーションおよびｄｓＤＮＡの環状化において、広範に使用されてきた。非特許文献１を参照されたい。

ＤＮＡリガーゼ酵素は、補助因子ＡＴＰまたはＮＡＤのピロリン酸加水分解と連動し、あるＤＮＡ鎖の３’－ヒドロキシル末端基と隣接する別のＤＮＡ鎖の５’－ホスホリル末端基との共有結合を触媒する（非特許文献２）。

基質の好みに基づいて、リガーゼはＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼとして分類される場合があり、つまりそれぞれはＤＮＡまたはＲＮＡいずれかのホスホジエステル結合を形成する酵素である（非特許文献３）。

非対称制限酵素消化によって生成されたｄｓＤＮＡ分子内のプレハイブリダイズした粘着末端をライゲーションさせるなど、二本鎖核酸分子中の一本鎖切断を塞ぐことは、ライゲーションさせるべき２つの末端が溶液中で遊離している平滑末端ライゲーションよりもはるかに効率的である。テンプレート依存性リガーゼによって触媒されるライゲーション反応は、ライゲーション接合部にまたがる相補的な核酸分子の存在下で２つの一本鎖核酸分子のライゲーションを触媒し、したがって２つの末端を近接させてつなげることとなり、平滑末端ライゲーションよりはるかに速くかつより効率的となる。

バクテリオファージＴ３、Ｔ４、およびＴ７から単離された複数のＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼは、過去数十年以内に単離され特徴付けられた（非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）。プラスミドまたはオリゴヌクレオチドを使用したｉｎｖｉｔｒｏ実験では、Ｔ４核酸リガーゼがさまざまな効率および基質特異性を有しながら二本鎖核酸中のニックを結合させることが明らかとなった。非特許文献７を参照されたい。本研究では、Ｔ４ＲＮＡ（Ｔ４ＲｎＬ）リガーゼおよびＴ４ＤＮＡ（Ｔ４ＤｎＬ）リガーゼがさまざまなＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドをライゲーションできることを示した。ワクシニアウイルスまたは真核生物のＬ細胞から単離されたＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド内のニックを塞ぐことが報告されている（非特許文献８および非特許文献９）。

しかし、ライゲーション接合部にまたがる相補的ＤＮＡ分子の存在下でＤＮＡ分子をＲＮＡ分子の５’末端に高効率でライゲーションさせることは、これまで文献に記載されていない。例えば、非特許文献７、非特許文献８、および非特許文献９を参照されたい。

組換えＤＮＡ技術での使用に適したいくつかの核酸リガーゼが存在するにもかかわらず、独自の基質特異的ライゲーション特性を備えたさらなる高効率なリガーゼが常に必要とされている。

本発明者らは、ライゲーション接合部にまたがる相補的な一本鎖ＤＮＡテンプレートの存在下でＲＮＡ分子の５’末端に一本鎖ＤＮＡ分子を高効率でライゲーションさせることが可能であることが生化学的特性評価により示された、バクテリオファージから単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼの新しいファミリーのクローニングおよび組換え発現および単離により、上記の必要性を解決した。

本発明によるリガーゼは、上記の独自の基質特異性に加え、ライゲーション接合部にまたがる相補的な一本鎖ＤＮＡテンプレートの存在下で、ＲＮＡ分子の３’末端に一本鎖ＤＮＡ分子を高効率でライゲーションさせる能力も有する。

"Ｌｉｇａｓｅｓ"，ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓＧｕｉｄｅ．ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．ｐｐ．８－１４Ｇｕｍｐｏｒｔ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７１），ｖｏｌ．６８：２５５９－６３Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．ｅｔａｌ，Ｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｆｏｒｅｎｚｙｍｅ－ａｄｅｎｙｌａｔｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＤＮＡｌｉｇａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，ｖｏｌ．８８，ｐ．４００－４０４Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．，１４８：３０３－３０（１９８１）Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１１：７１４５－５６（１９８３）Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１９３：４７９－９５（１９８７）Ｂｕｌｌａｒｄ，Ｄ．Ｒ．，＆Ｂｏｗａｔｅｒ，Ｒ．Ｐ，．Ｄｉｒｅｃｔｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｉｃｋ－ｊｏｉｎｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｌｉｇａｓｅｓｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４，ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２００６，３９８（１），１３５－１４４Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｊ．ａｎｄＳｈｕｍａｎ，Ｓ．，ＬｉｇａｔｉｏｎｏｆＲＮＡ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄｕｐｌｅｘｅｓｂｙＶａｃｃｉｎｉａＤＮＡｌｉｇａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，ｖｏｌ．３６，９０７３－９０７９Ｂｅｄｏｗｓ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＬｃｅｌｌＤＮＡｌｉｇａｓｅｊｏｉｎｓＲＮＡｔｏＤＮＡｏｎａＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，ｖｏｌ．１６，ｎｏ．１０，２２３１－２２３５

第１の態様によれば、本発明は、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントを提供し、前記ＤＮＡリガーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることが可能である。

第１の態様の一実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントは、配列番号１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。

第１の態様の一実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。第１の態様のさらなる一実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。その酵素活性フラグメントであって、ＤＮＡリガーゼ断片が、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることを可能にする酵素活性フラグメントもまた提供される。

第１の態様のさらなる一実施形態において、配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ファージから単離されたＤＮＡリガーゼである。好ましくは、クロノバクターファージ、ペクトバクテリウムファージまたはアシネトバクターファージ由来のものである。

本発明による別の実施形態では、配列番号１（Ｌ１３）に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号７、配列番号１０および配列番号１６を有するＤＮＡリガーゼのいずれかから選択される。

さらなる一態様では、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントが提供され、前記ＤＮＡリガーゼは以下から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１０またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｄ）配列番号１６またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列
を有し、前記ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることができる。

本発明の本態様の好ましい実施形態では、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１、７、１０または１６に対して少なくとも８５％、９０％、または９５％、例えば、少なくとも９８％または９９％または９９．５％同一である、アミノ酸配列を有する。

第１の態様の一実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントであって、前記ＤＮＡリガーゼは、配列番号１、配列番号７、配列番号１０および配列番号１６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。

第１の態様の一実施形態では、Ｈｉｓタグを含む単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントであって、前記ＤＮＡリガーゼは、配列番号２、配列番号８、配列番号１１および配列番号１７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。

第１の態様の一実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有する。
第１の態様の一実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有する。

第１の態様の一実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を有する。
第１の態様の一実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を有する。

第１の態様の一実施形態によれば、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、二本鎖核酸分子における一本鎖切断を含む基質に接触してライゲーション産物を提供する変換率を与えるリガーゼであり、ここで二本鎖核酸分子は、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子および５’－ホスホリルリボ核酸を、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子とともに複合体を成して含み、変換率は少なくとも０．０２、少なくとも０．０３、少なくとも０．０４、少なくとも０．０５または少なくとも０．１であり、変換率は、ＡＴＰ、Ｍｇ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１５ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

第１の態様の一実施形態によれば、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、二本鎖核酸分子における一本鎖切断を含む基質に接触してライゲーション産物を提供する変換率を与えるリガーゼであり、ここで二本鎖核酸分子は、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子および５’－ホスホリルリボ核酸を、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子とともに複合体を成して含み、変換が少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．８、少なくとも１．０、少なくとも１．５であり、変換率は、ＡＴＰ、Ｍｎ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１５ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

第１の態様の一実施形態では、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼはテトラペプチドモチーフＫＸａａＤＧを含み、ここでＸａａは脂肪族および非極性アミノ酸であり、テトラペプチドモチーフはアミノ酸１５９位～１６２位に対応し、この番号付けは配列番号１におけるアミノ酸の番号付けに一致している。

さらなる一実施形態では、脂肪族および非極性アミノ酸残基は、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ロイシン、アラニンおよびグリシンから成る群より選択される。

さらに別の実施形態では、脂肪族および非極性アミノ酸残基はメチオニンである。
第１の態様の別の実施形態では、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントは、バクテリオファージに由来する。

本発明の第２の態様では、第１の態様による単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントをコードする組換え核酸分子、もしくは前記単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントを含むタンパク質をコードする組換え核酸分子が提供される。

第２の態様の一実施形態では、組換え核酸分子は、配列番号３の核酸分子または配列番号３のコドン最適化核酸配列を含むか、またはそれからなる。
第２の態様の一実施形態では、組換え核酸分子は、配列番号９の核酸分子または配列番号９のコドン最適化核酸配列を含むか、またはそれからなる。

第２の態様の一実施形態では、組換え核酸分子は、配列番号１８の核酸分子または配列番号１８のコドン最適化核酸配列を含むか、またはそれからなる。
第２の態様の一実施形態では、組換え核酸分子は、配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８のいずれか１つから選択される核酸分子または配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８のコドン最適化核酸配列を含むか、またはそれからなる。

第２の態様の一実施形態では、組換え核酸分子は、配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８のいずれか１つから選択される核酸分子または配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８の縮重バージョンを含むか、またはそれらから構成される。

本発明の第３の態様では、第１の態様による単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントをコードする核酸分子を含むベクター、または第２の態様による組換え核酸分子を含むベクターが提供され、ここでベクターは、組換え発現ベクター、クローニングベクター、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、ラムダファージまたは細菌人工染色体である。

第３の態様の一実施形態では、核酸分子を含む、または核酸分子からなるベクターが提供され、前記核酸分子は、
ａ）ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントをコードし、ここでＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、または、
ｂ）ａ）におけるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼをコードする配列番号３の核酸分子または配列番号３のコドン最適化核酸配列を含み、かつ、
ｃ）ａ）またはｂ）におけるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることができる。

第３の態様の一実施形態では、核酸分子を含む、または核酸分子からなるベクターが提供され、前記核酸分子は、
ａ）ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントをコードし、ここでＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、または
ｂ）ａ）におけるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼをコードする配列番号３の核酸分子または配列番号３のコドン最適化核酸配列を含み、かつ、
ｃ）ａ）またはｂ）におけるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることができる。

第３の態様の一実施形態では、核酸分子を含む、または核酸分子からなるベクターが提供され、前記核酸分子は、
ａ）ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントをコードし、ここでＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１、配列番号７、配列番号１０および配列番号１６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する、または、
ｂ）ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントをコードし、ここでＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、配列番号１またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、配列番号７またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、配列番号１０またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、もしくは配列番号１６またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、または、
ｃ）ａ）におけるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼをコードする、配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８のいずれか１つから選択される核酸分子、または配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８のコドン最適化核酸配列を含み、かつ、
ｄ）ａ）またはｂ）におけるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることができる。

第３の態様の一実施形態では、ベクターは、組換え発現ベクター、クローニングベクター、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、ラムダファージまたは細菌人工染色体である。

第３の態様の一実施形態では、ベクターは組換え発現ベクターである。
第３の態様の一実施形態では、ベクターは好ましくはプラスミドである。
本発明の第４の態様では、第３の態様によるベクターを含む宿主細胞が提供され、ここで宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、ヒト細胞株または細菌細胞である。

第４の態様の一実施形態では、細菌細胞は、好ましくは大腸菌である。
本発明の第５の態様では、第１の態様およびその実施形態によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントを単離および精製する方法が提供され、前記方法は：
ａ）第４の態様による宿主細胞を、第１の態様およびその実施形態によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントの発現に適した条件下で培養する工程、および、
ｂ）ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントを宿主細胞から、あるいは培養培地または上清から単離する工程
を含む。

本発明の第６の態様では、第１の態様によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントを含む組成物が提供される。
第６の態様の一実施形態では、組成物は緩衝液をさらに含む。

緩衝液は、一実施形態では、ＡＴＰおよびＭｇ^２＋またはＭｎ^２＋を含む緩衝液であり得る。
緩衝液は、一実施形態では、ＡＴＰおよびＭｇＣｌ_２またはＭｎＣｌ_２を含む緩衝液であり得る。

一実施形態では、緩衝液は、本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを保存するために適した緩衝液であり得、ここで緩衝液は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＫＣｌ、Ｍｇ^２＋、ＢＳＡおよびグリセロールを含む。

第６の態様の一実施形態では、組成物は、少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子、少なくとも１つの５’ホスホリル－リボ核酸分子、および少なくとも１つの第２の相補的デオキシリボ核酸分子をさらに含み、ここでＤＮＡリガーゼは、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を、少なくとも１つの５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることができる。

第６の態様の一実施形態では、少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子は、ビーズ上に固定化されるか、または捕捉標識、好ましくはビオチン、または色素、好ましくは蛍光色素などの誘導体化ヌクレオチドをさらに含み、ここでビーズ、捕捉標識または誘導体化ヌクレオチドは、前記第１のデオキシリボ核酸分子の５’末端に付着する。

第６の態様の一実施形態では、組成物は、ＡＴＰを含むライゲーション緩衝液をさらに含む。
さらなる一実施形態では、ライゲーション緩衝液のＡＴＰ濃度は、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭのＡＴＰであり、好ましくは約０．０５ｍＭ～約２．５ｍＭのＡＴＰである。

さらなる一実施形態では、ライゲーション緩衝液は二価の陽イオンを含む。
さらなる一実施形態では、ライゲーション緩衝液の二価の陽イオンは、例えばＭｇＣｌ_２またはＭｎＣｌ_２の形態のＭｇ^２＋またはＭｎ^２＋であり、Ｍｇ^２＋またはＭｎ^２＋の濃度は、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約１０ｍＭである。

さらなる一実施形態では、ライゲーション緩衝液の二価の陽イオンは、例えばＭｇＣｌ_２の形態のＭｇ^２＋であり、ここでＭｇ^２＋の濃度は、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約１０ｍＭである。

さらなる一実施形態では、ライゲーション緩衝液の二価の陽イオンは、例えばＭｎＣｌ_２の形態のＭｎ^２＋であり、ここでＭｎ^２＋の濃度は、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約１０ｍＭである。

さらなる一実施形態では、ライゲーション緩衝液は、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭのＡＴＰ、好ましくは約０．０５ｍＭ～約２．５ｍＭのＡＴＰの濃度のＡＴＰ、および例えばＭｇＣｌ_２の形態のＭｇ^２＋を含み、ここでＭｇ^２＋の濃度は約１ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約１０ｍＭである。

さらなる一実施形態では、ライゲーション緩衝液は、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭのＡＴＰ、好ましくは約０．０５ｍＭ～約２．５ｍＭのＡＴＰの濃度のＡＴＰ、および例えばＭｎＣｌ_２の形態のＭｎ^２＋を含み、ここでＭｎ^２＋の濃度は約１ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約１０ｍＭである。

本発明の第７の態様では、デオキシリボ核酸分子をリボ核酸分子の末端にライゲーションさせるためのキットが提供され、前記キットは、
ａ．第１の態様による単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメント、もしくは第６の態様によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを含む組成物を含む第１の容器；
ｂ．ＡＴＰおよび二価の陽イオンを含むライゲーション緩衝液を含む第２の容器；
ｃ．任意選択で、５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションされる少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子、および少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子を含む第３の容器であって、少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子は３’領域および５’領域を含み、前記３’領域は第１のデオキシリボ核酸分子に相補的であり、前記５’領域は既知の配列を含むリボ核酸分子に相補的な配列であるか、または前記５’領域は未知の配列を有するもしくは様々な配列を含むリボ核酸分子に結合するため縮重した配列であり、第１のデオキシリボ核酸分子および第２のデオキシリボ核酸分子はプレハイブリダイズした複合体の形態である、第３の容器；および
ｄ．任意選択で、キットの使用説明書
を含む。

第７の態様の一実施形態では、キットは、３’－ヒドロキシル－リボ核酸分子の３’末端にライゲーションされる少なくとも１つの第１の５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸分子、および少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子を含む第４の容器を含み、前記少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子は３’領域および５’領域を含み、前記５’領域は第１のデオキシリボ核酸分子に相補的であり、前記３’領域は既知の配列を含むリボ核酸分子に相補的な配列であるか、または前記３’領域は未知の配列を有するもしくは様々な配列を含むリボ核酸分子に結合するため縮重した配列であり、第１の５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸および第２のデオキシリボ核酸分子は、プレハイブリダイズした複合体の形態であってもよい。

一実施形態では、ライゲーション緩衝液のＡＴＰおよび二価の陽イオンの濃度は、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭのＡＴＰ、好ましくは約０．０５ｍＭ～約２．５ｍＭのＡＴＰであり、二価の陽イオンは、例えばＭｇＣｌ_２またはＭｎＣｌ_２の形態のＭｇ^２＋またはＭｎ^２＋であり、ここでＭｇ^２＋またはＭｎ^２＋の濃度は、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約１０ｍＭである。好ましくは、二価の陽イオンは、ＭｎＣｌ_２の形態のＭｎ^２＋である。

本発明のさらなる態様では、二本鎖核酸分子中の一本鎖切断をライゲーションさせる方法が提供され、前記方法は、一本鎖切断を含む二本鎖核酸分子を、第１の態様による単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたは酵素活性フラグメント、もしくは第６の態様による組成物と接触させることを含む。

本発明の第８の態様では、二本鎖核酸分子における一本鎖切断をライゲーションさせる方法が提供され、前記方法は、一本鎖切断を含む二本鎖核酸分子を、第１の態様およびその実施形態による単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントと、二本鎖核酸分子中の５’－ホスホリルリボ核酸分子の５’末端への３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子のライゲーションを可能にする条件下で接触させることを含む。ここで、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子および５’－ホスホリルリボ核酸は、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子とともに複合体を成している。

上記の方法による一実施形態では、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子は、ビーズ上に固定化されるか、または捕捉標識、好ましくはビオチン、または色素、好ましくは蛍光色素などの誘導体化ヌクレオチドをさらに含み、ここでビーズ、捕捉標識または誘導体化されたヌクレオチドは、前記３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子の５’末端に連結される。

上記の方法による一実施形態では、リボ核酸（ＲＮＡ）分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リピート関連ｓｉＲＮＡ（ｒｅｐｅａｔａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｉＲＮＡ）（ｒａｓｉＲＮＡ）を含む群より選択されるＲＮＡ分子である。

上記の方法による一実施形態では、ＡＴＰおよび二価の陽イオンを含むライゲーション緩衝液を添加することをさらに含む。
上記の方法によるさらなる一実施形態では、ＡＴＰの濃度は、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭ、好ましくは約０．０５ｍＭ～約２．５ｍＭであり、二価の陽イオンは、例えばＭｇＣｌ_２またはＭｎＣｌ_２の形態のＭｇ^２＋またはＭｎ^２＋であり、Ｍｇ^２＋またはＭｎ^２＋の濃度は、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約１０ｍＭである。好ましくは、二価の陽イオンは、ＭｎＣｌ_２の形態のＭｎ^２＋である。

上記の方法による一実施形態では、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを、一本鎖切断を含む二本鎖核酸分子とともに、６時間以内、例えば１時間以内、例えば４５分以内または好ましくは３０分以内、より好ましくは１５分以内でインキュベートすることで、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％の核酸フラグメントのライゲーションを達成することをさらに含む。

上記方法による一実施形態では、方法は、ＲＮＡの５’末端アダプターライゲーションに、既知または未知の配列のＲＮＡ分子の捕捉に、プロモーターエレメントおよび／または翻訳エンハンサーエレメントを含むｃＤＮＡ分子合成におけるテンプレートとして機能するＤＮＡエレメントをｉｎｖｉｔｒｏ転写の目的でＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションすることに、使用される。

本発明の第９の態様は、ＲＮＡの５’末端アダプターライゲーションのため、既知または未知の配列のＲＮＡ分子を捕捉するため、プロモーターエレメントおよび／または翻訳エンハンサーエレメントを含むｃＤＮＡ分子合成におけるテンプレートとして機能するＤＮＡエレメントをｉｎｖｉｔｒｏ転写の目的でＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションさせるための、第１の態様によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメント、もしくは第６の態様によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを含む組成物の使用を提供する。

本発明の第１０の態様では、デオキシリボ核酸分子をリボ核酸分子の５’末端および３’末端にライゲーションさせる方法が提供され、この方法は：
ａ．リボ核酸分子のうちの１つ以上が、５’ホスホリル末端基および３’ヒドロキシル末端基を含む、リボ核酸分子の集合を含む試料を提供すること；
ｂ．少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を、少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸の存在下で前記リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることであって、前記少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子が３’領域および５’領域を含み、前記３’領域が第１のデオキシリボ核酸分子に相補的であり、前記５’領域が既知の配列を含むリボ核酸分子に相補的な配列であるか、または前記５’領域が未知の配列を有するか様々な配列を含むリボ核酸分子に結合するために縮重した配列であり、第１のデオキシリボ核酸分子および第２のデオキシリボ核酸分子がプレハイブリダイズした複合体の形態であり得ること；および、
ｃ．３’領域および５’領域を含む少なくとも１つのさらなる第２のデオキシリボ核酸の存在下で、少なくとも１つのほかの５’ホスホリル－デオキシリボ核酸分子を、ステップｂにおけるリボ核酸分子の３’末端にライゲーションさせることであって、前記５’領域は前記５’ホスホリル－デオキシリボ核酸分子に相補的であり、前記３’領域はステップｂにおける既知の配列を含むリボ核酸分子に相補的な配列であるか、前記３’領域は未知の配列を有するか様々な配列を含むリボ核酸分子に結合するために縮重した配列であり、前記５’ホスホリル－デオキシリボ核酸および前記さらなる第２のデオキシリボ核酸分子は、プレハイブリダイズした複合体の形態であり得ること；を含み、
ステップｂおよびｃにおけるライゲーション反応は、第１の態様によるＡＴＰ依存性リガーゼによって触媒され、ステップｂおよびｃにおけるライゲーション反応は、同時にまたは逐次的におこなわれる。

第１０の態様の一実施形態では、試料は、ＡＴＰおよび二価の陽イオン、好ましくはＭｎ^２＋またはＭｇ^２＋をさらに含む。
本発明のさらなる態様は、ＲＮＡライブラリ構築における第１０の態様の方法の使用を提供する。

本発明のＴ４ＤＮＡリガーゼおよびＬ１３リガーゼのアミノ酸配列を比較した配列アラインメント。異なるバクテリオファージに由来する本発明によるＤＮＡリガーゼの多重配列アラインメント。すべての配列は、これまでに同定されたすべてのリガーゼに共通のモチーフであるＫＸＤＧアデニル化部位を含む。同上。同上。非特許文献７に記載されている実験の仕組に基づくリガーゼ活性を測定するための一般的な実験の仕組を示す。ほかの既知のリガーゼと比較したＡＺＬ１３の基質特異性。リガーゼＡＺＬ１３および市販の参照酵素（ＡＺＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ）、Ｔ４Ｒｎｌ１（ＮＥＢ）、Ｔ４Ｒｎｌ２（ＮＥＢ）、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ））の酵素活性を検証するために、８種類の異なるニックの入った基質のセットを使用した。使用した基質は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）オリゴのみ（基質Ｓ１）リボ核酸（ＲＮＡ）オリゴのみ（基質Ｓ２）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）オリゴおよびリボ核酸（ＲＮＡ）オリゴの混合物（基質Ｓ３～Ｓ８）のいずれかで構成され得るそれぞれ３つのオリゴの集合体である。正のリガーゼ活性は、図１ｂに示すように、蛍光標識した核酸オリゴの長さの増加をもたらす。ライゲーションされていない一本鎖８－ｍｅｒオリゴヌクレオチド産物である下のバンドと、ライゲーションされた一本鎖２０－ｍｅｒオリゴヌクレオチド産物である上のバンドによって、バンドが表される。ＤＮＡオリゴが、ＤＮＡライゲーションテンプレートの存在下で、本発明のＡＴＰ依存性ＤＮＡＬ１３リガーゼ酵素を使用してＲＮＡの５’末端にライゲーションされ、ここでＤＮＡテンプレートの配列は半縮重されており、したがって配列の混合を含む、本発明の一態様を図で示す。半縮重ＤＮＡテンプレートの１つの領域は、第１のＤＮＡオリゴに相補的であり、残りの領域は、未知の配列であるＲＮＡ分子を捕捉するために、または異なるアレルからのＲＮＡ分子を捕捉するために、異なる５’－モノホスホリル化ＲＮＡオリゴへ非特異的ハイブリダイゼーションをする１つ以上の縮重ヌクレオチドを含み、ＲＮＡオリゴ中のいくつかのヌクレオチド位置は、異なるアレルにおいて異なる。アレルは、同じ遺伝子を意味する遺伝子変異型である。ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかを表す。ＲＮＡ分子のプールが、モノホスホリル化ＲＮＡ分子および５’修飾、例えば５’キャップまたは三リン酸基などを含むＲＮＡ分子の混合物を含む、図４に記載の態様の一実施形態を示す図である。５’修飾を含むＲＮＡ分子はライゲーションから除外される。モノホスホリル化ＲＮＡ分子にライゲーションされることになるＤＮＡ分子が、この図ではビオチンタグとして示される５’タグを含む、図４に記載される本発明の態様の一つの代替的な実施形態を示す。捕捉は、例えば、カラムまたは磁気ビーズに結合するビオチンタグおよびストレプトアビジンを使用することによって実施され得る。特定のｍＲＮＡ種を捕捉する方法を、図４に記載される本発明の態様の一つの代替的な実施形態として示す。上記のように、ｍＲＮＡの５’－モノホスホリル化末端のみへのＤＮＡオリゴの選択的ライゲーションが存在する。ｍＲＮＡは通常キャップされておりホスホリル化されておらず、これは上記のＬ１３リガーゼを使用するライゲーションを妨げる。脱リン酸化酵素による、すべての５’－リン酸含有ＲＮＡ種の脱リン酸化およびその後のｍＲＮＡの脱キャップは、ｍＲＮＡの５’末端をＤＮＡの３’末端にライゲーションするための準備となる。捕捉は、ビオチンタグおよびストレプトアビジンを使用することによって実施され得る。直接的セルフリーｉｖＴＴ（ｉｎｖｉｔｒｏ転写－翻訳）における使用のため、脱キャップ化されたｍＲＮＡにプロモーターがタグ付けされている、本発明の態様の一つの代替的な実施形態を示す。図４に記載されるような非特異的ハイブリダイゼーションのための縮重領域を有するＤＮＡテンプレートを用いた、ｍＲＮＡの５’－モノホスホリル化末端でのＤＮＡオリゴの選択的ライゲーション。非ｍＲＮＡＲＮＡ種の脱リン酸化およびｍＲＮＡの脱キャップ化。５’－ホスホリル化ｍＲＮＡは、縮重領域およびプロモーター配列を含む５’－ＤＮＡアダプターでタグ付けされる。第１鎖のｃＤＮＡ合成によって、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含むｍＲＮＡのＲＮＡポリメラーゼの読み取り可能なコピーがもたらされ、それによりｃＤＮＡはｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳技術において直接使用可能である。本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（ＡＺＬ１３）の野生型アミノ酸配列である配列番号１。本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（ＡＺＬ１３）のＨｉｓタグ付きアミノ酸配列である配列番号２。図９ａのアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列（配列番号３）。本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３ｒｅｌ１）のアミノ酸配列である配列番号７。本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３ｒｅｌ１）のＨｉｓタグ付きアミノ酸配列である配列番号８。図１０ａのアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列（配列番号９）。本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３ｒｅｌ２）のアミノ酸配列である配列番号１０。本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３ｒｅｌ２）のＨｉｓタグ付きアミノ酸配列である配列番号１１。図１１ａのアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列（配列番号１２）。ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３ｒｅｌ３）のアミノ酸配列である配列番号１３。図１２ａのＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３ｒｅｌ３）のＨｉｓタグ付きアミノ酸配列である配列番号１４。図１２ａのアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列（配列番号１５）。本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３ｒｅｌ４）のアミノ酸配列である配列番号１６。本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３ｒｅｌ４）のＨｉｓタグ付きアミノ酸配列である配列番号１７。図１３ａのアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列（配列番号１８）。ワクシニアＤＮＡリガーゼおよび本発明のＬ１３リガーゼのアミノ酸配列を比較する配列アラインメント。

以下の説明において、本発明のより深い理解を当業者に提供するために、本発明の様々な実施例および実施形態を記載する。様々な実施形態の文脈において、そして添付の図面を参照して説明される特定の詳細は、限定として解釈されることを意図していない。

別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、遺伝学、生化学、および分子生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

上記のように、本発明者らは、第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を含む二本鎖核酸複合体中の一本鎖切断を、ライゲーション接合部にまたがる相補的な第２のデオキシリボ核酸分子の存在下で、５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせる性能を有する新規のＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３）を同定した。図解は図３ａを参照されたい。

本発明者らはまた、バクテリオファージから最初に単離されたさらなるＤＮＡリガーゼであって、配列番号１を有するＬ１３リガーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有し、Ｌ１３と同様の酵素活性および基質特異性を有するさらなるＤＮＡリガーゼを同定した。

上記さらなるＤＮＡリガーゼは、配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９のｃＤＮＡ配列を有するＬ１３ｒｅｌ１である。
上記さらなるＤＮＡリガーゼは、配列番号１０配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬ１３ｒｅｌ２である。

上記さらなるＤＮＡリガーゼは、配列番号１６配列番号１８のアミノ酸配列を有するＬ１３ｒｅｌ４である。
本発明によるリガーゼは、上記の独自の基質特異性に加え、ライゲーション接合部にまたがる相補的な第２のデオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル末端基を含むＲＮＡ分子の３’末端にライゲーションされる５’ホスホリル末端基を含む第１のＤＮＡ分子を含む二本鎖核酸複合体中の一本鎖切断を高効率でライゲーションさせる性能も有する。

第２のデオキシリボ核酸とともにライゲーション反応において使用される第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子、５’ホスホリル－リボ核酸分子またはそれらの一部は、好ましくは一本鎖であり、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子および５’ホスホリル－リボ核酸分子は、ライゲーション接合部にまたがる第２のデオキシリボ核酸分子の少なくとも一部に対し、部分的にまたは全体として相補的であり得る。

「相補的な核酸配列が互いに結合する」というのは、ＤＮＡおよびＲＮＡの性質である。相補性は、核酸塩基：アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）または（ＲＮＡ中ではウラシル）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の間の特有の相互作用によって達成される。

「３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子」という用語は、その３’末端に遊離ヒドロキシル基（ＯＨ基）を有する。デオキシリボ核酸分子のヌクレオチドは、標準ならびに非標準ヌクレオチドであり得る。非標準ヌクレオチドの非限定的な例には、イノシン、キサントシン、イソグアノシン、イソシチジン、ジアミノピリミジン、およびデオキシウリジンが含まれる。デオキシリボ核酸分子は、修飾または誘導体化されたヌクレオチドを含み得る。デオキシリボースまたは塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）が含まれる。誘導体化ヌクレオチドの適切な例には、共有結合した色素、例えば、蛍光色素もしくは消光色素など、または他の分子、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、または磁性粒子を有するものが含まれる。図解は図６および図７を参照されたい。

３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子は、磁気ビーズ、ガラスまたはシリカ基材、あるいはマイクロ流体デバイスまたはほかの反応チャンバーの表面に、その５’末端で連結され得る。３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子が直接的または間接的に結合され得るさらなる固体状態の基材としては、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、または当業者に知られたほかの公知の基材が含まれる。

３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子の長さは、ライゲーション産物の長さおよびその所望の特徴に応じて変化し得、そして変化するであろう。通常、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子は、実施例２に示されるように、少なくとも約８ヌクレオチド長であるが、１５ヌクレオチド長から１００ヌクレオチド長までの範囲であり得る。

ＲＮＡの５’アダプターライゲーション
「相補的な第２のデオキシリボ核酸分子」または「相補的なライゲーションテンプレート」という用語は、ライゲーション反応の効率を改善するために使用されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子として理解されるものとする。第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子の５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端でのライゲーションは、上記のように、ライゲーションテンプレートとも呼ばれるこの第２のデオキシリボ核酸分子の存在下で実施される。この第２のデオキシリボ核酸分子は、２つの異なる領域：リボ核酸分子に相補的でありそれとハイブリダイズする５’領域、および第１のデオキシリボ核酸分子に相補的でありそれとハイブリダイズする３’領域を含む。図３ａを参照されたい。

「相補的な第２のデオキシリボ核酸分子」は、その２つの標的配列の正確な相補体であっても、ほぼ正確な相補体であってもよい。ライゲーションテンプレートは、第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子およびリボ核酸分子の両方にハイブリダイズするので、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端に近接させるように、ライゲーション接合部にまたがる。第２のデオキシリボ核酸分子はまた、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子について記載したのと同様の標準、非標準、修飾または誘導体化ヌクレオチドを含んでもよい。

通常、相補的な第２のデオキシリボ核酸分子は、少なくとも約１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長であり、ライゲーションテンプレートの約半分はリボ核酸分子に対する相補性を有し、残りの半分は第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子に対する相補性を有する。当業者は、相補的な第２のデオキシリボ核酸分子がより長く、例えば少なくとも約２５または３０または３５または４０または４５または最大約１００ヌクレオチドであってもよいことを理解できるであろう。

さらなる実施形態において、第２のデオキシリボ核酸分子は、各テンプレートが、異なるアレル由来のＲＮＡの集合中の個別のＲＮＡとハイブリダイズし得るように、第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子とハイブリダイズする３’領域、およびヌクレオチドのランダム混合物を含む縮重５’領域を含む、ＲＮＡの５’末端アダプターライゲーションにおける使用のための半縮重ライゲーションテンプレートであり得る。当業者は、縮重領域を含むヌクレオチドの数が、可能なテンプレートの組み合わせの数を決定し、したがってハイブリダイズされ得るＲＮＡの数を決定することを理解するであろう。５’ＲＮＡアダプターライゲーションの例示目的のために、テンプレートが半縮重している図４～図８を参照されたい。

ＲＮＡの３’アダプターライゲーション
一つの代替的な実施形態では、「相補的な第２のデオキシリボ核酸分子」または「相補的なライゲーションテンプレート」は、ライゲーション反応の効率を改善するために使用されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子として理解されるものとする。３’ヒドロキシル－リボ核酸分子の３’末端での第１の５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸分子のライゲーションは、上記のように、ライゲーションテンプレートとも呼ばれるこの第２のデオキシリボ核酸分子の存在下で実施される。この第２のデオキシリボ核酸分子は、２つの異なる領域：リボ核酸分子に相補的でありそれとハイブリダイズする３’領域、および第１のデオキシリボ核酸分子に相補的でありそれとハイブリダイズする５’領域を含む。

さらなる実施形態において、第２のデオキシリボ核酸分子は、各テンプレートが、異なるアレル由来のＲＮＡの集合中の個別のＲＮＡとハイブリダイズし得るように、第１の５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸分子とハイブリダイズする５’領域、およびヌクレオチドのランダム混合物を含む縮重３’領域を含む、ＲＮＡの３’末端アダプターライゲーションにおける使用のための半縮重ライゲーションテンプレートであり得る。当業者は、縮重領域を含むヌクレオチドの数が、可能なテンプレートの組み合わせの数を決定し、したがってハイブリダイズされ得るＲＮＡの数を決定することを理解するであろう。５’ＲＮＡアダプターライゲーションの例示目的のために、テンプレートが半縮重している図４～図８を参照されたい。

ある特定の実施形態において、第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子または５’ホスホリル－デオキシリボ核酸分子および第２のデオキシリボ核酸分子は、リボ核酸分子を含む試料を添加する前に、アダプター分子として本明細書に記載される二本鎖を形成するためプレハイブリダイズされる。５’ＲＮＡアダプターライゲーションの例示については、図４～図８を参照されたい。

「ハイブリダイズする」という用語は、この文脈において、結合されるべき５’第１デオキシリボ核酸および３’リボ核酸の２つの一本鎖領域に選択的に結合し並置するための、第２のデオキシリボ核酸の相補的またはほぼ相補的な塩基の特異的アニーリングに十分である、当技術分野で公知のハイブリダイズ条件の選択と理解されるものとする。

ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、候補リガーゼの検索においてメタゲノムヌクレオチド配列データを含む公的に利用可能なＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔＵｎｉＰｒｏｔリリース２０１５＿０６）をマイニングすることによって、本発明者らによって同定された。驚くべきことに、本発明者らは、クロノバクターサカザキバクテリオファージＣＲ９（ＮＣＢＩアクセッション番号およびＬｏｃｕｓｉｄｅｎｔｉｔｙ番号ＹＰ＿００９０１５２２６．１）から最初に単離された本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼをコードする配列が、上記の独自のリガーゼ活性を有することを発見した。クロノバクターファージＣＲ９の完全ゲノム配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＪＱ６９１６１１を有する。ＹＰ＿００９０１５２２６．１のアミノ酸配列は、ゲノム配列の概念的な翻訳によって推定的なリガーゼとして認識される。ＹＰ＿００９０１５２２６．１についてのＮＣＢＩヌクレオチドおよびタンパク質データベースにおける配列についての情報を参照されたい。データベースによれば、配列は検証されていない。したがって、本発明者らはまず、本発明によるＡＴＰ依存性リガーゼのための最適化された発現系をクローニングし開発した。

上記クロノバクターファージＣＲ９の起源の国は不明である。ＮＣＢＩデータベースのエントリーＪＱ６９１６１１の情報によると、クロノバクターサカザキバクテリオファージＣＲ９のゲノム配列は、ソウル国立大学食品・動物バイオテクノロジー学科、大韓民国、ソウル市１５１－９２１、冠岳区、冠岳路１によって提出された。

核酸分子をＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションさせる性能は、古典的クローニングおよびギブソンアプローチを用いたクローニング（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔａｌ．，ＥｎｚｙｍａｔｉｃａｓｓｅｍｂｌｙｏｆＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓｕｐｔｏｓｅｖｅｒａｌｍｉｌｌｉｂａｓｅｓ，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ，２００９，ｖｏｌ．６，ｐａｇｅ３４３－３４５）、ライブラリ調製中のアダプターライゲーション（例えば、ｉｌｌｕｍｉｎｅ，Ｈｅａｄ，Ｓ．Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｆｏｒｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｏｖｅｒｖｉｅｗｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０１４，ｖｏｌ．５６，ｎｏ．２，ｐ．１－３１）、ＤＮＡ合成、ライゲーションによる配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ）（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ，Ｋ．Ｖ．ｅｔａｌ．Ｎｅｘｔ－ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｆｒｏｍｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，ｖｏｌ．５５，ｎｏ．４，ｐ．６４１－６５８）、リガーゼ連鎖反応（Ｊ；Ｃｚａｊｋａ，Ｊ；Ｌｕｏ，Ｊ；Ｂａｒａｎｙ，Ｆ；Ｂａｔｔ，ＣＡ（Ｆｅｂ１９９４）、“Ｌｉｇａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）－ｏｖｅｒｖｉｅｗａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．３（４）：Ｓ５１－６４）、ＳＮＰ検出（Ｅｔｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．ｅｔａｌ．，ＳＮＰｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓｕｓｉｎｇＲＡＤｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１１，ｖｏｌ．７７２，ｐ．１５７－１７８）およびＲＮＡの５’末端標識など、多くの分子生物学技術において望ましい。

通常、ＲＮＡの５’－アダプターライゲーションは、５’－ＲＮＡ分子をライゲーションさせることによって、または例えばＴ４ＲＮＡリガーゼを使用してハイブリッドＤＮＡ－ＲＮＡ分子をＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションさせることによって実施される。しかしながら、ＲＮＡはより分解しやすいので、ＤＮＡと比較してＲＮＡを用いて作業することはあまり好ましくない。したがって、いくつかの状況において、ＤＮＡ分子をＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションさせることが所望され得る。

さらに、本発明によるリガーゼは、上記の独自の基質特異性に加えて、ライゲーション接合部にまたがる相補的ＤＮＡテンプレートの存在下でＲＮＡ分子の３’末端にＤＮＡ分子を高効率でライゲーションさせる性能も有する。したがって、１つの酵素がＲＮＡ分子の５’末端および３’末端の両方でＤＮＡアダプター分子をライゲーションさせることを可能にする。

ＲＮＡ分子の３’末端および５’末端でのアダプターライゲーションは、単一の工程または別々の工程で実施され得る。
したがって、本発明によるリガーゼは、「二重ライゲーションされた」ＲＮＡフラグメント（すなわち、５’末端および３’末端の両方でライゲーションされたアダプターを含有するＲＮＡ断片）を必要とするアダプターライゲーションプロセスにおいて使用され得る。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のためのライブラリ構築において通常使用されるプロセスは、例えば、広く使用されているＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームのために必要とされる。例えば、ＳｔｅｖｅｎＲ．ＨｅａｄらのＬｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｆｏｒｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎｌｉｎｅ２０１４Ｆｅｂ１，２０１４；５６（２）：６１，ｄｏｉ：１０．２１４４／０００１１４１３３を参照されたい。

３’末端および５’末端でのアダプターライゲーションが可能なＲＮＡフラグメントは、好ましくは、効率的なライゲーションが起こるように５’ホスホリル末端基および３’ヒドロキシル末端基を含むべきであり、本発明によるＲＮＡ分子の３’末端および５’末端におけるアダプターライゲーションの例示については、図．．．を参照されたい。

長いＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡおよびロングノンコーディングＲＮＡは、断片化される必要があり得る。ＲＮＡの断片化のためのプロセスは当業者に公知であり、例えば、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＲＮａｓｅＩＩＩＲＮＡ断片化モジュールおよびＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）マグネシウムＲＮＡ断片化モジュールを参照されたい。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＲＮａｓｅＩＩＩＲＮＡ断片化モジュールは、長い二本鎖ＲＮＡを５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を有するＲＮＡ断片に切断するリボエンドヌクレアーゼを使用し、これは５’および３’末端ライゲーション反応に直接使用してもよい。しかしながら、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）マグネシウムＲＮＡ断片化モジュールは、ＲＮＡを断片化するために二価の金属イオン（Ｍｇ^＋）および熱を使用し、これは５’ヒドロキシル末端および３’リン酸末端を有するＲＮＡ断片を作製する。この後者の場合、５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を含むフラグメントを得るために、ＲＮＡフラグメントの末端は改変されなければならない。

驚くべきことに、バクテリオファージ、より具体的にはクロノバクターファージから得られ本明細書に記載されるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰおよび二価の陽イオンの存在下かつライゲーション接合部にまたがる相補的ＤＮＡ分子の存在下で、一本鎖領域を有するＤＮＡ分子をＲＮＡの５’末端に高効率でライゲーションさせることが明らかとなった。

本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ほかの既知のリガーゼと低い配列同一性を有し、周知のＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素とは３０％未満の配列同一性を有する。図１を参照されたい。

上記のように、囲まれた（ｅｎｃｌｏｓｅｄ）ＤＮＡリガーゼの１つ特性として、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端に高効率でライゲーションさせる性能がある。

リガーゼが異なる基質のサブセットをライゲーションさせることが可能であることは文献に十分に記載されている。例えば、Ｂｕｌｌａｒｄ，Ｄ．Ｒ．とＢｏｗａｔｅｒ，Ｒ．Ｐ．によるＤｉｒｅｃｔｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｉｃｋ－ｊｏｉｎｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｌｉｇａｓｅｓｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４．ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２００６，３９８（１），１３５－１４４）を参照されたい。本発明によるＤＮＡリガーゼはまた、基質のサブセットを高効率でライゲーションさせることが可能である。図３ｂ（ＡＺＬ１３）を参照されたい。この図から、ＡＺＬ１３は高効率で基質１、６、７および８を、ならびにより低効率で基質３および５をライゲーションさせることが可能であることは明らかである。

高効率という用語は、当業者に公知の標準温度および緩衝液条件下で、二本鎖核酸分子中の一本鎖切断をライゲーションさせ、６時間未満以内、例えば１時間未満以内、例えば４５分未満以内、または好ましくは３０分以内または１５分以内にポリヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％のライゲーションを達成する酵素の性能に関する。標準緩衝液および温度条件の例は、表２ａおよび表２ｂならびに実施例２に記載されている。

本発明によるライゲーション効率またはライゲーション速度または変換率は、当業者に公知の様々な方法を使用して計算することができる。例えば、ライゲーション効率は、図３ｂに示されるようにライゲーション産物を検出することによって計算することができ、ここで、７０％効率は、（（ライゲーション産物）／（ライゲーション産物＋非ライゲーション産物））＊１００＝７０を意味する。ライゲーション産物＋非ライゲーション産物の７０％がライゲーション産物として存在する。これは、図３ｂに示すようにゲル上の異なるバンドの強度を測定し、記載のように効率を計算することによって実験的に検出し得る。ライゲーション産物および非ライゲーション産物を表すゲル上のバンドの強度は、イメージング技術、例えばＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ（商標）（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＨＰｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定することができる。

本発明のＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤｎＬ、ＳｐｌｉｎｔＲまたはワクシニアウイルス由来のＤＮＡリガーゼと比較して、ライゲーション接合部にまたがる相補的ＤＮＡテンプレートの存在下で、ＤＮＡ分子をＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションさせる性能において、改善されたライゲーション効率を有する。ここで改善されたライゲーション効率とは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤｎＬ、ＳｐｌｉｎｔＲまたはワクシニアウイルス由来のＤＮＡリガーゼのライゲーション効率と比較して、少なくとも２～１００倍である。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤｎＬ、ＳｐｌｉｎｔＲまたはワクシニアウイルス由来のＤＮＡリガーゼと比較して、本発明のＤＮＡリガーゼの向上したライゲーション効率は、少なくとも２倍より高く、少なくとも５倍より高く、少なくとも１０倍より高く、少なくとも１２倍より高く、少なくとも１５倍より高く、少なくとも２０倍より高く、または少なくとも１００倍より高い。

本発明による酵素活性の尺度としての変換率は、１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌのライゲーションされた基質として表され得る。
基質の変換率およびライゲーション％は、二本鎖核酸分子中の一本鎖切断を含む基質を使用して測定され、二本鎖核酸分子は、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子および５’－ホスホリルリボ核酸を、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子とともに複合体を成して含む（図３ｂによるＳ８基質）。

本発明によれば、上記の基質（Ｓ８）の変換率は、少なくとも０．０２、少なくとも０．０３、少なくとも０．０４、少なくとも０．０５または少なくとも０．１であり、ここで、変換率は、ＡＴＰ、Ｍｇ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１５ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で、１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

本発明によれば、上記基質（Ｓ８）の変換率は少なくとも０．０２であり、ここで、変換率は、ＡＴＰ、Ｍｇ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１０ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で、１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

本発明によれば、上記基質（Ｓ８）の変換率は０．０２～０．１であり、ここで変換率は、ＡＴＰ、Ｍｇ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１５ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で、１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

本発明によれば、上記の基質（Ｓ８）の変換率は０．０２～０．１であり、ここで変換率は、ＡＴＰ、Ｍｇ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１０ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

本発明によれば、上記基質（Ｓ８）の変換率は、少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．８、少なくとも１．０、少なくとも１．５であり、ここで、変換率は、ＡＴＰ、Ｍｎ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１５ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で、１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

本発明によれば、上記基質（Ｓ８）の変換率は少なくとも０．１５であり、ここで、変換率は、ＡＴＰ、Ｍｎ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１０ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で、１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

本発明によれば、上記の基質（Ｓ８）の変換率は、０．１５～２．０であり、ここで、変換率は、ＡＴＰ、Ｍｎ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１５ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で、１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

本発明によれば、上記基質（Ｓ８）の変換率は、０．１５～２．０であり、ここで、変換率は、ＡＴＰ、Ｍｎ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１０ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃～３０℃で、１分間あたり１ｐｍｏｌの酵素あたりのｐｍｏｌの基質として決定される。

本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１５ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃で１５分以内に、上記基質（Ｓ８）の少なくとも２５％をライゲーションさせることができる。

本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１０ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃で１５分以内に、上記基質（Ｓ８）の少なくとも２５％をライゲーションさせることができる。

本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰ、Ｍｎ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１５ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃で１５分以内に、上記基質（Ｓ８）の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％をライゲーションさせることができる。

本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰ、Ｍｎ^２＋および０．２ｐｍｏｌ～１０ｐｍｏｌの本発明によるＤＮＡリガーゼを含むライゲーション緩衝液中で、２５℃で１５分以内に、上記基質（Ｓ８）の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％をライゲーションさせることができる。

したがって、本発明の一態様によれば、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントが提供され、前記ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることができる。

ＤＮＡリガーゼの「その酵素フラグメント」という表現は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するリガーゼの触媒活性が、その切断された形態で維持されているＤＮＡリガーゼを意味すると理解されるべきである。実施例２では、リガーゼ活性を測定するための適切なアッセイを提供する。

一実施形態では、本発明によるＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントは、配列番号１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９８％または９９％または好ましくは少なくとも８５％または９４％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、以下を有する配列から選択され得る：
ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＲＢ１１６８７．１
ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００７３９２６４９．１
ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＡＢ３１７８４２０．１
ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００６３８３２６２．１
ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９０４２４８６．１
ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＴＳ９３６４４．１
ＮＣＢＩアクセッション番号ＱＥＧ１２３３８．１
ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＸＮ５７７７５．１または
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１３３６７０６４８．１。

一実施形態では、本発明によるＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントは、配列番号１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明による別の実施形態では、配列番号１（Ｌ１３）に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、表１のＤＮＡリガーゼのいずれかから選択される。

表１の上記配列のいずれかのその酵素フラグメントも包含される。
ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９８４６９５０．１を有するＬ１３ｒｅｌ３は、配列番号１（Ｌ１３）に対して３９％のみ同一であるアミノ酸配列を含む、エロモナスファージ４（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｐｈａｇｅ４）由来の推定的なＤＮＡリガーゼである。図１２ａ～図１２ｃおよび配列番号１３～配列番号１５に、アミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列を示す。Ｌ１３ｒｅｌ３は、本発明によるＤＮＡ依存性リガーゼのＬ１３クラスターに属しておらず、本発明によるＬ１３ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼと比較して、二本鎖核酸分子中の一本鎖切断を含む基質における酵素活性が低下しているリガーゼである。ここで前記二本鎖核酸分子は、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子および５’－ホスホリルリボ核酸を、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子とともに複合体を成して含む基質（図３ｂによるＳ８基質）である。

図２に、上記配列と比較した配列番号１の多重配列アラインメントを示す。図２から、これらの配列は、これまでに研究されたすべてのリガーゼに共通のＫＸａａＤＧモチーフを含むいくつかの保存されたドメインを共有することが明らかであり、ここでリジン残基は、後に核酸に結合するアデニル化酵素中間体の形成に関与する（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１９（１０）：８９３－９０１（１９９７）、Ｓｈｕｍａｎｒａ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１１（１）：７３－８３（１９９５），ｏｙｏｂｉＬｕｏｒａ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２４（１５）：３０７９－３０８５（１９９６））。

配列番号１の変異型は、配列番号１の前記アミノ酸の１つ以上のアミノ酸が保存的置換を受けたアミノ酸配列を含む。好ましくは、そのような置換は、本発明のＤＮＡリガーゼの改変された形態が非改変の形態と同じ酵素活性を有するという点でサイレント置換である。

本発明のＤＮＡリガーゼは、改変された形態、例えば、ＤＮＡリガーゼの単離、可溶化および／または精製または同定のためのプロセスにおいて有用なアミノ酸タグを有する融合タンパク質などで提供され得る。このようなアミノ酸タグとして、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグが挙げられるが、これに限定されない。本発明のポリヒスチジンタグ付きＤＮＡリガーゼの例は、配列番号２に記載される。本発明のほかのポリヒスチジンタグ付きＤＮＡリガーゼは、配列番号８、配列番号１１および配列番号１７に記載される。

さらに、本発明はまた、本発明のＤＮＡリガーゼおよびその酵素フラグメントをコードする核酸分子を提供する。配列番号１のアミノ酸配列に対応する核酸配列は、配列番号３に開示される。

配列番号７、配列番号１０、および配列番号１６のアミノ酸配列に対応するさらなる核酸分子は、配列番号９、配列番号１２、および配列番号１８に開示される。
本発明の核酸は、上記核酸分子または変異型核酸分子を含み得る。変異型核酸分子は、遺伝暗号が縮重しているために、構造的に異なるヌクレオチドが同じ機能または収率を発揮し得る分子を含む。遺伝暗号の縮重とは、核酸分子である配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８が、産生されるリガーゼの酵素活性に影響を及ぼすことのない、配列番号１、配列番号７、配列番号１０および配列番号１６によって提供されるアミノ酸分子をコードする多くの核酸分子のうちの１つにすぎないことを意味する。次いで、配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８に開示される核酸分子は、大腸菌宿主細胞における発現を最適化するためにコドン最適化をされ得る。

配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８の核酸を含むまたはそれらからなる核酸分子もまた開示される。これらの核酸分子は、核酸ベクター、例えばプラスミド、組換え発現ベクター、ウイルスベクター、コスミド、ラムダファージベクターまたは細菌人工染色体ベクターであってもよい。好ましいベクターは、細菌細胞におけるリガーゼのクローニングおよび／または発現に使用するためのプラスミドなどのベクターである。

さらに、本発明のほかの実施形態において、ＤＮＡリガーゼおよびＨｉｓタグを含むポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。Ｈｉｓタグをコードする核酸分子は、得られるＤＮＡリガーゼの活性に影響を与えることなく、本発明の核酸配列に付加され得る。

また、宿主細胞からのＤＮＡリガーゼ酵素の分泌をもたらすシグナルペプチドをコードする核酸分子もまた、本発明の核酸配列に連結され得る。
本明細書中で使用される場合、タンパク質および核酸分子またはそれらの断片の両方に関して、「配列同一性」に言及する際は、第２の配列に対して少なくともｘ％の同一性を有する配列とは、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の全長に対して両方の配列がグローバルアラインメントを介して最適にアライメントされる場合に、第２の配列のそれらのマッチしたアミノ酸またはヌクレオチドと同一である第１の配列中のアミノ酸またはヌクレオチドの数を、ｘ％と表すことを意味する。両方の配列は、ｘが最大である場合に最適にアライメントされる。アラインメントおよび同一性の割合の決定は、手動または自動で実施され得る。

当業者は、パーセント配列同一性を決定する目的のためのアラインメントが、様々な方法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアであるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔａｌ．，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，２２，ｐｐ４６７３－４６８０）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／またはＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），アメリカ、より提供される）をデフォルトパラメータで使用するなどして、達成され得ることを認識するであろう。

本発明のＤＮＡリガーゼの調製
本発明のＤＮＡリガーゼおよびその酵素フラグメント、または上記リガーゼをコードする核酸分子は、バクテリオファージ、例えばクロノバクターファージ、ペクトバクテリウムファージ、またはアシネトバクターファージなどの天然資源から単離することができる。

あるいは、この酵素は、宿主細胞において組換え的に産生され得、そこから単離および精製され得る。ここで、宿主細胞は、本発明のＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子を天然に発現しないか、または天然に発現する生物由来ではない。すなわち、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、ヒト細胞株または細菌細胞、好ましくは大腸菌などの異種宿主細胞である。

本発明によるＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントをコードする核酸配列は、ゲノムＤＮＡからＰＣＲを使用して増幅してもよく、ｃＤＮＡとして単離してもよく、またはＧＥＮＥＷＩＺ、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃもしくはＧｅｎｓｃｒｉｐｔなどの商業的供給業者に注文してもよい。

上記のように、ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントをコードする核酸配列は、異種宿主細胞におけるタンパク質産生の増加のためにコドン最適化をされ得る。コドン最適化を支援するための様々なソフトウェアプログラムが当該技術分野で公知である。ＣｏｄｏｎＷは、使用され得るオープンソースソフトウェアプログラムの一例である。好ましくは、Ｒａａｂ，Ｄ．，Ｇｒａｆ，Ｍ．，Ｎｏｔｋａ，Ｆ．，Ｓｃｈｏｄｅｌ，Ｔ．，＆Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．（２０１０）によって記載されたＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズムである。ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズム：スライディングウィンドーアプローチを用いることでマルチパラメータのＤＮＡ配列最適化において、広大な配列空間に対処する。ＳｙｓｔｅｍｓａｎｄＳｙｎｔｈｅｔｉｃＢｉｏｌｏｇｙ，４（３），２１５－２２５は、大腸菌宿主細胞における本発明のＤＮＡリガーゼの発現のためのコドン最適化ＤＮＡ配列を生成するために使用される。

周知の組換え遺伝子発現系を使用する様々な宿主細胞系における異種発現によるＤＮＡ配列からタンパク質を発現させるための種々の利用可能な分子技術が存在する。例えば、本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼをコードする、またはその酵素フラグメントをコードする核酸分子は、選択された宿主細胞に適した発現のために必要な転写および翻訳エレメントを含む、適切な発現ベクター中に挿入され得る。通常使用される発現ベクターの例としては、プラスミドまたはウイルスである。

目的の遺伝子の信頼できる転写を確実にする。発現ベクターは強力なプロモーターを含んでもよく、バクテリオファージＴ５およびＴ７は、大腸菌内の発現のための強力なプロモーターの例である。プロモーターは、化学スイッチを含むことによって調節され得る。大腸菌における使用のための誘導性プロモーターの例としては、一般的に使用されるイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導されるｌａｃプロモーター（ＨａｎｓｅｎＬＨ，ＫｎｕｄｓｅｎＳ，ＳｏｒｅｎｓｅｎＳＪ，“ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｌａｃＹｇｅｎｅｏｎｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ｓｔｕｄｉｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ”，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８，３６（６）：３４１－７）、またはトルイル酸で誘導可能なプロモーターを含むＸｙｌＳ／Ｐｍ発現カセットである（Ｇａｗｉｎ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＴｈｅＸｙｌＳ／Ｐｍｒｅｇｕｌａｔｏｒ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｙｓｔｅｍａｎｄｉｔｓｕｓｅｉｎｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１７，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．４，ｐ７０２－７１８）。このシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）に由来するＸｙｌＳ／Ｐｍ調節因子／プロモーター系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびほかの細菌における遺伝子および遺伝子クラスターの低レベルおよび高レベルに調節された組換え発現のために、広範に使用されている。

本発明のさらなる態様は、適切な異種細胞における、上記の本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントの発現の方法である。宿主細胞は、細菌または酵母細胞であり得る。好ましくは、酵素の発現は細菌宿主細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞においてである。

本発明のＤＮＡリガーゼを含む上記の発現ベクターの形質転換は、当業者に公知の方法によって、例えば化学的コンピテント細胞を使用することによって、実施され得る。
上記のように、本発明のＤＮＡリガーゼは、組換えＤＮＡ技術を用いて合成され得る。あるいは、ＤＮＡリガーゼは、セルフリー発現系またはＤＮＡリガーゼの化学合成を用いて産生され得る。

細胞培養培地への分泌のためのシグナルペプチドを含むリガーゼ酵素は、当技術分野において公知の、文献に十分に記載されている任意の技術を使用して、宿主細胞培養培地から単離および精製され得る。そのような技術または任意の組み合わせの例には、沈殿、限外濾過、異なるクロマトグラフィー技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティーカラムクロマトグラフィーおよび／または免疫吸着クロマトグラフィーが含まれ得る。

細胞内で産生された本発明のＤＮＡリガーゼ酵素は、当業者に公知の技術を用いて単離および精製されてもよい。大腸菌細胞から細胞溶解物を調製するための方法の例は、ホモジナイゼーション、超音波処理またはリゾチームを使用する酵素的溶解である。ＤＮＡリガーゼが溶解細胞から放出された後、酵素は、任意の精製方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティーカラムクロマトグラフィーおよび／または免疫吸着クロマトグラフィーの対象となる。

上述したように、本発明のＤＮＡリガーゼは、酵素の単離、精製および／または同定を容易にするためにｃ末端のＨｉｓタグを含んでもよい。本発明のポリヒスチジンタグ付きＤＮＡリガーゼは、配列番号２、配列番号８、配列番号１１および配列番号１７に示される。

したがって、本発明の別の態様によれば、本発明によるＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントの単離および精製のための方法が提供され、この方法は：
ａ）本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを発現させるのに適した条件下で宿主細胞を培養する工程、
ｂ）宿主細胞から、または培養培地もしくは上清からＤＮＡリガーゼを単離する工程
を含む。

本発明による精製されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ酵素またはその酵素フラグメントは、最終的に、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５（２５℃）、０．３ＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび５０％グリセロールを含む緩衝液中で保存することができる。リガーゼを保存するのに適した代替緩衝液は、当業者に公知である。

本発明のＤＮＡリガーゼを含む組成物およびキット
第１の態様によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼおよび、ライゲーション工程を実施するための１つ以上の追加の必要な試薬、例えばライゲーション緩衝液を含む、組成物およびキットもまた開示される。ライゲーションをおこなうための適切なライゲーション緩衝液および反応条件は、以下の表２ａまたは表２ｂに記載されている。

典型的には、本発明の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、本発明の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを含む組成物が水性緩衝液も含むのと同様に、水性緩衝液中に置かれる。本発明による水性緩衝液は、約７～約８．５のｐＨ、好ましくは約７．５のｐＨを有するＴｒｉｓ、ＭＥＳＢｉｓ－Ｔｒｉｓ、リン酸またはＨＥＰＥＳ緩衝液などの標準緩衝液を含む。水性緩衝液は、好ましくは、酵素を安定化させるためにＢＳＡおよびグリセロールをさらに含み得る。

本発明のＤＮＡリガーゼは、ライゲーション工程をおこなうために補因子としてＡＴＰを利用するＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼであり、酵素反応の概要については「背景技術」の段落を参照されたい。さらに、反応のＡＴＰ依存性は、反応が触媒作用のためにＭｇ^２＋またはＭｎ^２＋イオンなどの複数の二価の陽イオンを必要とすること、および必須の二価の陽イオン、好ましくはＭｇ^２＋、より好ましくはＭｎ^２＋が必要とされることを示す。

したがって、一実施形態では、ライゲーション緩衝液はＡＴＰを含む。ここで、ＡＴＰの濃度は、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭ、好ましくは約０．０５ｍＭ～約２．５ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭであるようなものである。

さらなる実施形態において、ライゲーション緩衝液は二価の陽イオンを含む。二価の陽イオンは、例えば、ＭｇＣｌ_２またはＭｎＣｌ_２の形態のＭｇ^２＋またはＭｎ^２＋であるようなものである。

さらなる実施形態において、ライゲーション緩衝液中の二価の陽イオンの濃度は、１ｍＭ～２０ｍＭの間、好ましくは５ｍＭ～１５ｍＭの間、より好ましくは約１０ｍＭである。

ライゲーション緩衝液は、還元剤をさらに含み得る。適切な還元剤の非限定的な例には、ジチオスレイトールおよびβ－メルカプトエタノールが含まれる。
さらなる実施形態では、ライゲーションは、２０℃～３５℃の間、好ましくは２５℃～３０℃の間の温度で実施される。

さらなる態様において、本発明による単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼのいずれかを含むキットも開示される。キットは、最適なライゲーションのためのライゲーション緩衝液をさらに含んでもよい。キットはまた、本発明による開示されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーション工程をどのように実施するかについての書面による説明を含み得る。適切な条件は実施例２に記載されており、それはキット中で、またはリガーゼ酵素とともに提供されてもよい。表２ａおよび表２ｂでは、本発明のＤＮＡリガーゼを使用する最適なライゲーションのための反応混合物の例を提供する。

表２ａまたは表２ｂの反応混合物を３０℃で３０分間インキュベートする。あるいは、表２ａまたは表２ｂの反応混合物を２５℃で１５分間インキュベートする。表２ａまたは表２ｂの反応混合物は、ＭｎＣｌ_２またはＭｇＣｌ_２のいずれかを含んでもよい。

本発明のＤＮＡリガーゼの使用
本発明の別の態様では、二本鎖核酸中の一本鎖切断をライゲーションさせる方法が提供され、ここで前記方法は、第１のａｓｐｅｃｔｕｎｄｅｒ条件に従って一本鎖切断を含む二本鎖核酸分子を単離したＡＴＰ依存性リガーゼまたはその酵素活性フラグメントと接触させることを含み、これは３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子の、二本鎖核酸中の５’－ホスホリルリボ核酸分子の５’末端へのライゲーションを可能にし、ここで３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子および５’－ホスホリルリボ核酸は、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子と複合体をなしている。

一実施形態では、本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントは、Ｌ１３リガーゼである。
一実施形態では、本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントは、Ｌ１３ｒｅｌ１リガーゼである。

一実施形態では、本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントは、Ｌ１３ｒｅｌ２リガーゼである。
一実施形態では、本発明によるＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントは、Ｌ１３ｒｅｌ４リガーゼである。

本発明による一本鎖切断は、ニックおよびギャップの両方を含む。
５’－ホスホリル－リボ核酸分子は、５’末端にリン酸基を含むＲＮＡ分子である。一実施形態では、リボ核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リピート関連ｓｉＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）を含む群より選択されるリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。

本発明における使用に適切な低分子ＲＮＡ含有試料の供給資源は、用途に応じて変化し得、そして変化するであろう。成熟低分子ＲＮＡを含む試料は、動物、植物、真菌、原生生物、ウイルス、細菌、または古細菌に由来し得る。

前述の供給資源のいずれかに由来する試料は、本質的に純粋なＲＮＡ分子の調製物から細胞の粗抽出物までの範囲であり得る。一実施形態において、試料は、低分子ＲＮＡ分子の単離した調製物であってもよい。別の実施形態では、試料は、細胞から抽出されたトータルＲＮＡの単離した調製物であり得る。さらに別の実施形態において、試料は、核酸、タンパク質、脂質、および炭水化物を含む細胞基質細胞抽出物であってもよい。さらに別の実施形態では、試料は無処置の細胞であってもよい。さらに別の実施形態において、低分子ＲＮＡを含む試料は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応物または化学合成反応物であってもよい。トータルＲＮＡまたは低分子ＲＮＡは、市販のキットまたは当該分野で公知の技術を使用して、細胞、細胞抽出物、またはｉｎｖｉｔｒｏ反応物から単離および精製され得る。参考までに、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００３）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，ｏｒＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。

ライゲーション反応に添加される試料中の低分子ＲＮＡの量は、ＲＮＡ含有試料の供給資源に応じて変化し得、そして変化するであろう。通常、任意の量のＲＮＡが使用され得る。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、通常、５プライムキャップ（５’キャップ）を有し、これは、前駆体メッセンジャーＲＮＡなどの一部の一次転写物の５’末端の特別に改変されたヌクレオチドである。ｍＲＮＡキャッピングとして知られるこのプロセスは、高度に調節されており、タンパク質合成中に翻訳を受けることができる安定で成熟したメッセンジャーＲＮＡの生成に不可欠である。ミトコンドリアｍＲＮＡおよび葉緑体ｍＲＮＡはキャップ化されていない。ライゲーションを起こすためには、ｍＲＮＡは最初に脱キャップ化し、次いで５’末端でホスホリル化する必要があり得る。説明のために、図７を参照されたい。適切な脱キャップ酵素は、当業者に公知である。図６は、５’キャップを含むｍＲＮＡがライゲーションされていない状態を示す。

本方法を実施するための適切な条件の例は、上記の表２および実施例２に記載されている。
上記の方法による一実施形態では、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを、一本鎖切断を含む二本鎖核酸分子とともにインキュベートすることを含み、６時間未満、例えば１時間未満、例えば４５分未満、または好ましくは３０分以内、例えば１５分以内にポリヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％のライゲーションを達成する。

上記方法の一つの代替的な実施形態において、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子は、ビーズ上に固定化されるか、または捕捉標識、好ましくはビオチンまたは色素、好ましくは蛍光色素などの誘導体化ヌクレオチドをさらに含み、ここでビーズ、捕捉標識または誘導体化ヌクレオチドは、前記デオキシリボ核酸分子の５’末端に連結される。

ライゲーション産物を検出するためのアッセイは、当業者に公知である。ライゲーション産物を検出する古典的な方法の例には、変性ゲル電気泳動、配列増幅、および融解曲線分析が含まれる。

実施例
本発明は、ここで、上記の図および表７の生物学的配列を参照して、非限定的な例によって記載される。

本発明のＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ（Ｌ１３）は、配列に基づくメタゲノムアプローチによって発見され、候補リガーゼについて公的データベースをマイニングした。上述のように、本発明のＤＮＡリガーゼは、最初にクロノバクターファージＣＲ９から単離されたものであり、そのＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００９０１５２２６．１から取得することができる。本発明によるさらに好ましいＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、Ｌ１３リガーゼに対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＤＮＡリガーゼＬ１３の相同ＤＮＡリガーゼであり、最初は以下から単離された：クロノバクターファージＣＲ８であり、そのＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿００９０４２４８６．１（Ｌ１３ｒｅｌ１）から取得することができる；ペクトバクテリウムファージｐｈｉＴＥから最初に単離され、そのＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿００７３９２６４９．１（Ｌ１３ｒｅｌ２）から取得することができる；アシネトバクターファージＡＢＰＨ４９から最初に単離され、そのＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＡＸＮ５７７７５．１（Ｌ１３ｒｅｌ４）から取得することができる。

実施例１クローニング、発現および精製
大腸菌における発現のために、選択された配列のコドン最適化をし、Ｃ末端Ｈｉｓタグとともに発現ベクターｐＶＢ－１Ａ０Ｂ１（ＶｅｃｔｒｏｎＢｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。

クローニング
Ｌ１３か、Ｌ１３ｒｅｌ１、Ｌ１３ｒｅｌ２、Ｌ１３ｒｅｌ３もしくはＬ１３ｒｅｌ４のいずれかのコード配列を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズムを用いて大腸菌における発現のためにコドン最適化をし（Ｒａａｂ，Ｄ．，Ｇｒａｆ，Ｍ．，Ｎｏｔｋａ，Ｆ．，Ｓｃｈｏｄｌ，Ｔ．，＆Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．（２０１０）．ＴｈｅＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒＡｌｇｏｒｉｔｈｍ：ＵｓｉｎｇａｓｌｉｄｉｎｇｗｉｎｄｏｗａｐｐｒｏａｃｈｔｏｃｏｐｅｗｉｔｈｔｈｅｖａｓｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐａｃｅｉｎｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．ＳｙｓｔｅｍｓａｎｄＳｙｎｔｈｅｔｉｃＢｉｏｌｏｇｙ，４（３），２１５－２２５．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１６９３－０１０－９０６２－３）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃの提供するＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成サービスを用いて発注した。遺伝子コード配列に隣接して、Ｃ末端ＧＳＧリンカーおよびＨｉｓタグ、続いて停止コドン、Ｎ末端ＰｃｉＩおよびＮｄｅＩ制限部位、および下流クローニングアプローチのためのＣ末端ＸｈｏＩ制限部位をコードするさらなる配列情報を付加した。ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を、発現ベクターｐＶＢ－１Ａ０Ｂ１（ＶｅｃｔｒｏｎＢｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｔｒｏｎｄｈｅｉｍ，Ｎｏｒｗａｙ）へのクローニングのために使用した。ｐＶＢベクターファミリーは、トルイル酸で誘導可能なプロモーターを含むＸｙｌＳ／Ｐｍ発現カセットを有するＲＫ２プラスミドに基づく独自の大腸菌発現ベクター骨格から成る。シュードモナス・プチダＴＯＬプラスミドｐＷＷ０に由来するＸｙｌＳ／Ｐｍ調節因子／プロモーター系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびほかの細菌における遺伝子および遺伝子クラスターの調節された低レベルおよび高レベルの組換え発現のために広く使用されており、Ｇａｗｉｎ，Ａら、ＴｈｅＸｙｌＳ／Ｐｍｒｅｇｕｌａｔｏｒ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｙｓｔｅｍａｎｄｉｔｓｕｓｅｉｎｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１７，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．４，ｐ７０２－７１８に記載されている。

ＤＮＡリガーゼの発現および精製
配列番号３、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８から選択されるコドン最適化核酸分子を、ＶｅｃｔｒｏｎＢｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ製の発現ベクターｐＶＢ－１Ａ０Ｂ１にクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。細胞を、ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（ＴＢ）培地を含む２．５ＬのＵｌｔｒａＹｉｅｌｄ（商標）（Ｔｈｏｍｓｏｎ）フラスコ中で増殖させた；１％の一晩前からの培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１ＬのＴＢ培地に移し、３７℃、２２０ｒｐｍで、ＯＤ６００が５～６に達するまでインキュベートした。温度を１５℃に低下させ、温度が２０℃以下になった際に細胞を２ｍＭのトルイル酸で誘導した。細胞を一晩（ＯＮ）インキュベートし、遠心分離によって回収し、－２０℃で凍結した。

凍結細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、１０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、５％グリセロール、１ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび４００Ｕ／ｍｌＨＬ－ＳＡＮ）に加え、ＯＤ６００を１２０とし、９０ｒｐｍで１５℃で一晩インキュベートした。溶解物を２０，０００ｇで２０分間遠心分離し、精製前に濾過した。

最初の精製工程は、３３．４ｍｌのＮｉ－セファロース６ＦＦを充填したＨｉＳｃａｌｅ（登録商標）２６／２０カラムを用いて実施した。溶解物の適用後、カラムをＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭＭｇＣｌ_２および０．５ＭＮａＣｌ）で洗浄した後、漸増濃度のイミダゾールで溶出した。第２の精製の工程では、３４．５ｍｌのＱ－セファロースＦＦ樹脂を充填したＨｉＳｃａｌｅ（登録商標）２６／２０カラムを使用した。第１の精製の工程からの希釈溶出液の適用後、カラムをＱ洗浄緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５（２５℃）および５０ｍＭＫＣｌ）で洗浄し、Ｑ溶出緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５（２５℃）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２および０．２ＭＮａＣｌ）を用いてカラムからＨｉｓタグ付きＬ１３酵素を溶出した。精製したＬ１３リガーゼ酵素を、最終的に１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５（２５℃）、０．３ＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび５０％グリセロール中に保存した。

実施例２Ａ基質特異性を測定するためのリガーゼ活性アッセイ
実験のセットアップ
異なる基質に対するリガーゼ活性は、ＢｕｌｌａｒｄおよびＢｏｗａｔｅｒの手順に従ってアッセイされ得る（Ｂｕｌｌａｒｄ，Ｄ．Ｒ．，＆Ｂｏｗａｔｅｒ，Ｒ．Ｐ．（２００６）Ｄｉｒｅｃｔｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｉｃｋ－ｊｏｉｎｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｌｉｇａｓｅｓｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４．ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，３９８（１），１３５－１４４）。ライゲーション活性を分析するｉｎｖｉｔｒｏアッセイを、二本鎖基質を使用して実施し、これは、ＢｕｌｌａｒｄとＢｏｗａｔｅｒ（２００６）の記載に変更点を加えた設定に基づいた。オリゴヌクレオチドは、Ｍｅｔａｂｉｏｎ（ドイツ）から購入した。３０μＭ溶液の各オリゴを使用して、１本の８－ｍｅｒ核酸オリゴおよび１本の１２－ｍｅｒ核酸オリゴを相補的な２０－ｍｅｒ核酸テンプレートオリゴにアニーリングすることによって、二本鎖基質を生成した。アニーリングの工程を１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８、および０．５ｍＭＥＤＴＡ）中で実施し、３種のオリゴを含む緩衝液を９５℃で５分間加熱し、室温で１６時間冷却した。８－ｍｅｒオリゴの５’ヌクレオチド残基は、フルオレセイン色素分子６－ＦＡＭ（ＩＵＰＡＣ名３’，６’－ジヒドロキシスピロ［イソベンゾフラン－１（３Ｈ），９’－［９Ｈ］キサンテン］－３－オン；ＣＡＳ番号２３２１－０７－５）で標識され、１２－ｍｅｒオリゴは、５’－モノホスホリル化核酸残基を含む。各二本鎖基質は、リボ核酸オリゴヌクレオチドのみまたはデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチドのみ、またはリボ核酸オリゴヌクレオチドとデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチドとの混合物のいずれかに相当し、以下の表３ならびに図３ａおよび図３ｂに示されるような合計８種の異なる二本鎖基質の組成物をもたらした。

８－ｍｅｒオリゴ＊）
５’－ＧＧＣＣＡＧＴＧ－３’（配列番号４）
１２－ｍｅｒオリゴ＊）
５’－ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧ－３’（配列番号５）
２０－ｍｅｒオリゴ＊）
５’－ＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣ－３’（配列番号６）
ＲＮＡオリゴではＴがＵに置き換えられる。

ニックの入った二本鎖２０塩基対（ｂｐ）基質を、図３ａに示すように、各酵素のライゲーション活性を測定するエンドポイントｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用した。すべてのライゲーション反応において使用される緩衝液は、５５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０．５ｍＭＤＴＴ、２５ｍＭＫＣｌおよび１ｍＭＡＴＰを含む。エンドポイントライゲーション反応を以下のように実施した：７０ｐｍｏｌのリガーゼ、４５ｐｍｏｌの上記の二本鎖オリゴ核酸基質を、５μｌの総体積で含む。反応混合物を３０℃で３０分間インキュベートした後、５μｌのホルムアミド停止溶液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭＥＤＴＡ、ブロモフェノールブルー）を用いて停止させた。実験の最後に、試料を９５℃で５分間熱し、変性条件下で２０％ポリアクリルアミド尿素ゲル１×ＴＢＥ（８９ｍＭＴｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡ）で分析した。反応生成物（図３ｂを参照）を、Ｂｉｏ－ＲａｄＰｈａｒｏｓシステムを用いてゲル上で可視化した。定量は、ＩｍａｇｅＬａｂ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実施した。

ほかの市販のリガーゼと比較したＬ１３ＤＮＡリガーゼのライゲーション活性を、図１ｂに示されるように分析した。驚くべきことに、Ｌ１３ＤＮＡリガーゼは、基質８（Ｓ８）中の一本鎖切断を高効率でライゲーションさせることができる唯一のリガーゼであった。基質Ｓ８は、試験した市販のリガーゼ酵素には不十分な基質であった。

実施例２Ｂ代替Ｓ８様基質に対するリガーゼ活性のアッセイ
代替のＳ８基質に対するＬ１３ＤＮＡリガーゼのライゲーション活性を試験した。配列番号１９、２０および２１を有する配列を含むニックの入った二本鎖４３塩基対（ｂｐ）基質を、Ｌ１３のライゲーション活性を測定するエンドポイントｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用した。すべてのライゲーション反応において使用される緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＤＴＴ、＜４６ｍＭＫＣｌおよび０．１ｍＭＡＴＰを含む。エンドポイントライゲーション反応を以下のように実施した：異なる量のＬ１３リガーゼ、９ｐｍｏｌの上記の二本鎖オリゴ核酸基質を、１０μｌの総体積で含む。反応混合物を２５℃で１５分間インキュベートした後、５μｌのホルムアミド停止溶液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭＥＤＴＡ、ブロモフェノールブルー）を用いて停止させた。実験の最後に、試料を９５℃で５分間加熱し、変性条件下で２０％ポリアクリルアミド尿素ゲル１×ＴＢＥ（８９ｍＭＴｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡ）で分析した。反応生成物を、Ｂｉｏ－ＲａｄＰｈａｒｏｓシステムを用いてゲル上で可視化した。定量は、ＩｍａｇｅＬａｂ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実施した。

実験の結果を以下の表３に示す。これは、Ｌ１３リガーゼが、実施例２Ａと比較して様々な核酸配列を含む二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド中のニックを高効率でライゲーションさせることもできることを明確に実証している。

代替Ｓ８－基質
２０－ｍｅｒ５’－ＦＡＭ標識ＤＮＡオリゴ
５’－ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧ－３’（配列番号１９）
２３－ｍｅｒＲＮＡオリゴ５’－Ｐ
５’－Ｐ－ＡＣＵＧＡＵＡＧＡＡＧＵＵＣＣＣＧＡＡＡＣＡＧ－３’（配列番号２０）
４３－ｍｅｒＤＮＡオリゴ
５’－ＣＴＧＴＴＴＣＧＧＧＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣ－３’（配列番号２１）

実施例３Ｌ１３、Ｌ１３ｒｅｌ１、Ｌ１３ｒｅｌ２、Ｌ１３ｒｅｌ３およびＬ１３ｒｅｌ４のリガーゼ活性
本実施例では、本発明の様々なリガーゼのリガーゼ活性を試験した。結果を表４および表５に示し、Ｌ１３、Ｌ１３ｒｅｌ１、Ｌ１３ｒｅｌ２およびＬ１３ｒｅｌ４酵素がＳ８基質に対して同様のライゲーション効率を有すること、すなわち、ライゲーション接合部にまたがるＤＮＡ分子の存在下でＤＮＡ分子をＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションさせることを示す。

アッセイ条件１：５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、２５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＡＴＰ、１１．４ｐｍｏｌリガーゼ、９ｐｍｏｌＳ８基質、総体積２０μｌ。３０℃で３０分間インキュベーション。

アッセイ条件２：５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＤＴＴ、２５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＡＴＰ、７ｐｍｏｌリガーゼ、１８ｐｍｏｌＳ８基質、総体積２０μｌ。２５℃で１５分間インキュベーション。

アッセイ条件：５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭＭｎＣｌ_２、１０ｍＭＤＴＴ、２５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＡＴＰ、１１．４ｐｍｏｌリガーゼ、１８ｐｍｏｌＳ８基質、総体積２０μｌ。２５℃で１５分間インキュベーション。

実施例４ワクシニアＤＮＡリガーゼと比較したＬ１３ＤＮＡリガーゼのリガーゼ活性
本発明のＬ１３ＤＮＡリガーゼの有効性を、先行技術のワクシニアウイルス由来のＤＮＡリガーゼと比較した（ワクシニアＤＮＡリガーゼのタンパク質配列は、アクセッション番号ＹＰ＿２３３０５８．１でＮＣＢＩデータベースに示されている）。表６は、実験の結果を示す。実施例２ａに従って１８ｐｍｏｌのＳ８基質を用いて、酵素活性を試験した；ＭｎＣｌ_２またはＭｇＣｌ_２のいずれかを含む２０μｌの反応体積のライゲーション緩衝液を使用した。ライゲーションを２５℃で１５分間おこない、ライゲーションされた基質の％および変換率を計算した。

表６に示されるデータは、Ｌ１３が、ライゲーション接合部にまたがるＤＮＡ分子の存在下で、ＲＮＡ分子の５’末端へのＤＮＡ分子のライゲーションにおいて、ワクシニアＤＮＡリガーゼと比較してより効率的なリガーゼであることを明確に実証する（基質Ｓ８については、実施例２を参照されたい）。

Claims

単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントであって、前記ＤＮＡリガーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＤＮＡリガーゼが、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることが可能な、単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメント。
前記ＤＮＡリガーゼが、配列番号１に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメント。
前記ＤＮＡリガーゼが、以下から選択されるアミノ酸配列、
（ａ）配列番号１またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１０またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｄ）配列番号１６またはそれに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列
を有し、前記ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることが可能な、請求項１に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメント。
前記ＤＮＡリガーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６および配列番号１７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメント。
請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントをコードするか、または前記単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントを含むタンパク質をコードする、組換え核酸分子。
前記核酸分子が、配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８、または配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８のコドン最適化配列を含むか、またはそれからなる、請求項５に記載の組換え核酸分子。
前記核酸分子が、配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８、または配列番号３、配列番号９、配列番号１２および配列番号１８の縮重バージョンのいずれか１つから選択される核酸分子を含むか、またはそれからなる、請求項５に記載の組換え核酸分子。
請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントをコードする核酸分子を含むか、もしくは請求項５～７のいずれか一項に記載の核酸分子を含むかまたはそれからなるベクターであって、組換え発現ベクター、クローニングベクター、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、ラムダファージまたは細菌人工染色体である、ベクター。
請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞であって、酵母細胞、昆虫細胞、ヒト細胞株または細菌細胞である、宿主細胞。
請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメントを含む組成物。
前記組成物は緩衝液をさらに含み、好ましくは前記緩衝液がＡＴＰおよび二価の陽イオンを含み、前記二価の陽イオンは好ましくはＭｎ^２＋またはＭｇ^２＋である、請求項１０に記載の組成物。
前記組成物はライゲーションされる核酸分子を含む試料に適用するための溶液である、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
前記組成物が、少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子、少なくとも１つの５’ホスホリル－リボ核酸分子、および少なくとも１つの第２の相補的デオキシリボ核酸分子をさらに含み、前記ＤＮＡリガーゼが、ライゲーション接合部にまたがる少なくとも１つの相補的デオキシリボ核酸分子の存在下で、前記の少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を、前記の少なくとも１つの５’ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることが可能な、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組成物。
デオキシリボ核酸分子をリボ核酸分子の末端にライゲーションさせるためのキットであって：
ａ．請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素フラグメント、または請求項１０に記載の組成物を含む第１の容器；
ｂ．ＡＴＰおよび二価の陽イオンを含むライゲーション緩衝液を含む第２の容器；
ｃ．および任意選択で、５’－ホスホリル－リボ核酸分子の５’末端にライゲーションされる少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子と、少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子とを含む第３の容器であって、前記少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子は３’領域および５’領域を含み、前記３’領域が前記第１のデオキシリボ核酸分子に相補的であり、前記５’領域が既知の配列を含むリボ核酸分子に相補的な配列であるか、または前記５’領域が未知の配列を有するかもしくは様々な配列を含むリボ核酸分子に結合するために縮重した配列であるかのいずれかであり、前記第１のデオキシリボ核酸分子および前記第２のデオキシリボ核酸分子がプレハイブリダイズした複合体の形態であってもよい、第３の容器、
ｄ．任意選択で、前記キットを使用するための説明書
を含むキット。
前記キットが、３’－ヒドロキシル－リボ核酸分子の３’末端にライゲーションされる少なくとも１つの第１の５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸分子、および少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子を含む第４の容器を含み、前記少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子が３’領域および５’領域を含み、前記５’領域が前記第１の５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸分子に相補的であり、前記３’領域が既知の配列を含むリボ核酸分子に相補的な配列であるか、または前記３’領域が未知の配列を有するかもしくは様々な配列を含むリボ核酸分子に結合するために縮重した配列であるかのいずれかであり、前記第１の５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸および前記第２のデオキシリボ核酸分子がプレハイブリダイズした複合体の形態であってもよい、請求項１４に記載のキット。
一本鎖切断を含む二本鎖核酸分子を、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントもしくは請求項１０または請求項１１に記載の組成物と接触させることを含む、二本鎖核酸分子における一本鎖切断をライゲーションさせる方法。
二本鎖核酸分子における一本鎖切断をライゲーションさせる方法であって、前記方法は、前記二本鎖核酸分子中の５’－ホスホリルリボ核酸分子の５’末端への３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子のライゲーションを可能にする条件下で、一本鎖切断を含む前記二本鎖核酸分子を、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントまたは請求項１０に記載の組成物と接触させることを含み、前記３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子および前記５’－ホスホリルリボ核酸はライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子と複合体を成している、方法。
二本鎖核酸分子における一本鎖切断をライゲーションさせる方法であって、前記方法は、前記二本鎖核酸分子中のリボ核酸分子の３’末端への５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸分子のライゲーションを可能にする条件下で、一本鎖切断を含む前記二本鎖核酸分子を、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントまたは請求項１０に記載の組成物と接触させることを含み、前記５’－ホスホリル－デオキシリボ核酸分子および前記リボ核酸分子は、ライゲーション接合部にまたがる相補的デオキシリボ核酸分子と複合体を成している、方法。
一本鎖切断を含む前記二本鎖核酸分子が試料中に含まれ、前記試料がＡＴＰおよび二価の陽イオン、好ましくはＭｎ^２＋またはＭｇ^２＋をさらに含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
ＲＮＡの５’末端アダプターライゲーションのため、既知または未知の配列のＲＮＡ分子を捕捉するため、プロモーターエレメントおよび／または翻訳エンハンサーエレメントを含むｃＤＮＡ分子合成のテンプレートとして機能するＤＮＡエレメントをｉｎｖｉｔｒｏ転写の目的でＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションさせるための、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼまたはその酵素活性フラグメントまたは請求項１０に記載の組成物の使用。
リボ核酸分子の５’末端および３’末端にデオキシリボ核酸分子をライゲーションさせる方法であって、
ａ．リボ核酸分子のうちの１つ以上が、５’ホスホリル末端基および３’－ヒドロキシル末端基を含む、リボ核酸分子の集合を含む試料を提供すること；
ｂ．少なくとも１つの第１の３’－ヒドロキシル－デオキシリボ核酸分子を、少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸の存在下で前記リボ核酸分子の５’末端にライゲーションさせることであって、前記少なくとも１つの第２のデオキシリボ核酸分子が３’領域および５’領域を含み、前記３’領域が前記第１のデオキシリボ核酸分子に相補的であり、前記５’領域が、既知の配列を含むリボ核酸分子に相補的な配列であるか、または前記５’領域が、未知の配列を有するかもしくは様々な配列を含むリボ核酸分子に結合するために縮重した配列であるかのいずれかであり、前記第１のデオキシリボ核酸分子および前記第２のデオキシリボ核酸分子がプレハイブリダイズした複合体の形態であり得ること；および、
ｃ．３’領域および５’領域を含む少なくとも１つのさらなる第２のデオキシリボ核酸の存在下で、ステップｂにおけるリボ核酸分子の３’末端に少なくとも１つの他の５’ホスホリル－デオキシリボ核酸分子をライゲーションさせることであって、前記５’領域は前記５’ホスホリル－デオキシリボ核酸分子に相補的であり、前記３’領域は、ステップｂにおける既知の配列を含むリボ核酸分子に相補的な配列であるか、または前記３’領域は、未知の配列を有するかもしくは様々な配列を含むリボ核酸分子に結合するために縮重した配列であるかのいずれかであり、前記５’ホスホリル－デオキシリボ核酸および前記さらなる第２のデオキシリボ核酸分子は、プレハイブリダイズした複合体の形態であり得ること；を含み、
ステップｂおよびｃにおけるライゲーション反応は、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＴＰ依存性リガーゼまたは請求項９もしくは請求項に記載の組成物によって触媒され、ステップｂおよびｃにおけるライゲーション反応は、同時にまたは逐次的に実施される方法。
前記試料が、ＡＴＰおよび二価の陽イオン、好ましくはＭｎ^２＋またはＭｇ^２＋をさらに含む、請求項２１に記載の方法。