CN115916965A

CN115916965A - Atp依赖性dna连接酶

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Publication number: CN115916965A
Application number: CN202180038971.3A
Authority: CN
Inventors: 贝恩德·克特尔森·斯特里伯尼; 特蕾莎·索尔斯塔德; 奥拉夫·拉纳斯
Original assignee: Aktixam Co ltd
Current assignee: Aktixam Co ltd
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2023-04-04
Also published as: US20230125232A1; CA3173175A1; JP2023520224A; KR20230026987A; EP4127147A1; WO2021198341A1

Abstract

本发明涉及连接酶领域。更具体地说，本发明涉及新的并且高效的ATP依赖性DNA连接酶，其具有独特的连接酶活性，使得该连接酶在各种分子生物学技术中特别有用。此外，本发明涉及包含所述DNA连接酶的组合物和试剂盒、其制造和使用方法。

Description

ATP依赖性DNA连接酶

技术领域

本发明涉及连接酶领域。更具体地，本发明涉及ATP依赖性DNA连接酶、包含该DNA连接酶的试剂盒和组合物、制造和使用方法。

背景技术

DNA连接酶催化正确对齐的DNA序列中5’-磷酰基和3’-羟基端基之间的DNA糖-磷酸骨架中磷酸二酯键的形成。体内连接酶在修复切口以及对DNA复制和修复至关重要的单链和双链断裂中发挥重要作用。

除了对DNA复制和修复很重要外，从噬菌体中分离的DNA连接酶，如T4 DNA连接酶，几十年来一直广泛用于分子生物学，用于将DNA片段插入载体中以用于重组质粒构建、下一代DNA测序文库构建和dsDNA环化中的衔接子连接，参见"Ligases",Enzyme ResourcesGuide.Promega Corporation.pp.8–14。

DNA连接酶催化一条DNA链的3’-羟基端基与另一条的相邻5’-磷酰基端基的共价连接，以及辅因子ATP或NAD的焦磷酸酯水解，Gumport,R.I.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1971),vol.68:2559-63。

基于底物偏好，连接酶可分类为DNA连接酶或RNA连接酶，即分别产生DNA或RNA的磷酸二酯键的酶，Tomkinson,A.E.et al,Location of the active site for enzyme-adenylate formation in DNA ligase,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,vol.88,p.400-404。

封闭双链核酸分子中的单链断裂，例如连接由不对称限制性酶消化产生的dsDNA分子中的预杂交粘性末端，比平端连接更有效，其中待连接的两个末端在溶液中是游离的。由模板依赖性连接酶(其在存在跨越连接点并从而使两末端靠近的互补核酸分子的情况下催化两个单链核酸分子的连接)催化的连接反应比平端连接远更快且更有效。

在过去的几十年中，从噬菌体T3、T4和T7中分离出的多种DNA连接酶和RNA连接酶已被分离和表征，Dunn,J.J.,et al.,J.Mal.Biol.,148:303-30(1981)；Armstrong,J.,etal.,Nucleic Acids Res.,11:.7145-56(1983)；和Schmitt,M.P.,et al.,J.Mal.Biol.,vol.193:479-95(1987)。使用质粒或寡核苷酸的体外实验表明，T4核酸连接酶以不同的效率和底物特异性连接双链核酸中的缺口，参见Bullard,D.R.,&Bowater,R.P,.Directcomparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases frombacteriophage T4,The Biochemical Journal,2006,398(1),135–144。研究表明，T4 RNA(T4RnL)连接酶和T4 DNA(T4DnL)连接酶能够连接多种DNA-RNA杂交体。据报道，从牛痘病毒或真核L细胞中分离的DNA连接酶可密封DNA-RNA杂交体中的缺口，参见Sekiguchi,J.andShuman,S.,Ligation of RNA-containing duplexes by Vaccinia DNA ligase,Biochemistry,1997,vol.36,9073-9079和Bedows,E.et al.,L cell DNA ligase joinsRNA to DNA on a DNA template,Biochemistry,1997,vol.16,no.10,2231-2235。

然而，在存在跨越连接点的互补DNA分子的情况下，DNA分子与RNA分子5’末端的高效连接迄今为止尚未在文献中描述，参见例如Bullard and Bowater,2006，Sekiguchi andShuman,1997以及Bedows et al.,1977。

尽管存在多种适用于重组DNA技术的核酸连接酶，但始终存在对具有独特底物特异性连接特性的附加高效连接酶的需求。

本发明人通过克隆以及重组表达和分离从噬菌体中分离出的新的ATP依赖性DNA连接酶家族解决了上述需要，生化表征表明所述连接酶能够在跨越连接点的互补单链DNA模板的存在下将单链DNA分子高效地连接到RNA分子的5’端。

根据本发明的连接酶除了上述独特的底物特异性外，还具有在在跨越连接点的互补单链DNA模板的存在下将单链DNA分子高效连接到RNA分子3’端的能力。

发明内容

根据第一方面，本发明提供了一种分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中所述DNA连接酶包含SEQ ID No.1的氨基酸序列或包含与SEQ ID No.1具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’-末端。

在第一方面的一个实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段包含与SEQ ID No.1具有至少75％同一性的氨基酸序列。

在第一方面的一个实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶活性片段包含与SEQ ID No.1具有至少80％、85％、90％、93％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在第一方面的一个进一步实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶由具有SEQ ID No.1的氨基酸序列组成。还提供了其酶促活性片段，其中所述DNA连接酶片段能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’末端。

在第一方面的一个进一步实施方式中，具有与SEQ ID No.1具有至少70％同一性的氨基酸序列的分离ATP依赖性DNA连接酶是从噬菌体分离的DNA连接酶。优选地来自克罗诺杆菌噬菌体、果胶杆菌噬菌体或不动杆菌噬菌体。

在根据本发明的另一个实施方式中，包含与SEQ ID No.1(L13)具有至少70％同一性的氨基酸序列的ATP依赖性DNA连接酶选自具有SEQ ID No.7、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.16的DNA连接酶的任何一种。

在一个进一步方面，提供了一种ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中所述DNA连接酶具有选自以下各项的氨基酸序列：

(a)SEQ ID No.1或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，

(b)SEQ ID No.7或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，

(c)SEQ ID No.10或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，或

(d)SEQ ID No.16或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且

其中所述DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’-末端。

在本发明该方面的优选实施方式中，所述ATP依赖性DNA连接酶具有与SEQ IDNO.1、7、10或16具有至少85％、90％或95％，例如至少98％或99％或99.5％的氨基酸序列。在第一方面的一个实施方式中，所述分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中所述DNA连接酶具有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.7、SEQ ID No.10和SEQ ID No.16中任一个的氨基酸序列。

在第一方面的一个实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其包含His-标签，其中所述DNA连接酶具有选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11和SEQ ID No.17中任一个的氨基酸序列。

在第一方面的一个实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的氨基酸序列。

在第一方面的一个实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶具有SEQ ID No.7或SEQ ID No.8的氨基酸序列。

在第一方面的一个实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶具有SEQ ID No.10或SEQ ID No.11的氨基酸序列。

在第一方面的一个实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶具有SEQ ID No.16或SEQ ID No.17的氨基酸序列。

根据第一方面的一个实施方式，ATP依赖性DNA连接酶是一种提供转化率的连接酶，该转化率在双链核酸分子中包含单链断裂的底物上提供连接产物，其中双链核酸分子包含3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和与跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子复合的5’-磷酰基核糖核酸分子，其中所述转化率为至少0.02、至少0.03、至少0.04、至少0.05或至少0.1，其中所述转化率测定为在25℃至30℃下，在包含ATP、Mg²⁺和0.2pmol至15pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

根据第一方面的一个实施方式，ATP依赖性DNA连接酶是一种提供转化率的连接酶，该转化率在双链核酸分子中包含单链断裂的底物上提供连接产物，其中双链核酸分子包含3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和与跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子复合的5’-磷酰基核糖核酸分子，其中所述转化率为至少0.15、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.8、至少1.0、至少1.5，其中所述转化率测定为在25℃至30℃下，在包含 ATP、Mn²⁺和0.2pmol至15pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

在第一方面的一个实施方式中，ATP依赖性DNA连接酶包含四肽基序KXaaDG，其中Xaa是脂肪族非极性氨基酸并且其中所述四肽基序对应于氨基酸位置159至162，编号与SEQID No.1中的氨基酸编号一致。

在一个进一步的实施方式中，所述脂肪族非极性氨基酸残基选自甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸。

在又一个进一步的实施方式中，所述脂肪族非极性氨基酸残基是甲硫氨酸。

在第一方面的另一个实施方式中，分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段来源于噬菌体。

在本发明的第二方面，提供了一种重组核酸分子，其编码根据第一方面的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段，或编码包含分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段的蛋白质。

在第二方面的一个实施方式中，所述重组核酸分子包含SEQ ID No.3的核酸分子或SEQ ID No.3的密码子优化的核酸序列，或由其组成。

在第二方面的一个实施方式中，所述重组核酸分子包含SEQ ID No.9的核酸分子或SEQ ID No.9的密码子优化的核酸序列，或由其组成。

在第二方面的一个实施方式中，所述重组核酸分子包含SEQ ID No.18的核酸分子或SEQ ID No.18的密码子优化的核酸序列，或由其组成。

在第二方面的一个实施方式中，所述重组核酸分子包含选自SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18中任一个的核酸分子或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的密码子优化的核酸序列，或由其组成。

在第二方面的一个实施方式中，所述重组核酸分子包含选自SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18中任一个的核酸分子或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的简并版本，或由其组成。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，其包含编码根据第一方面的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段的核酸分子，或包含根据第二方面的重组核酸分子的载体，其中所述载体为重组表达载体、克隆载体、质粒、病毒载体、粘粒、λ噬菌体或细菌人工染色体。

在第三方面的一个实施方式中，提供了一种包含核酸分子或由核酸分子组成的载体，该核酸分子：

a)编码ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中ATP依赖性DNA连接酶具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或

b)包含SEQ ID No.3的核酸分子或SEQ ID No.3的密码子优化的核酸序列，其编码a)中的ATP依赖性DNA连接酶，和

c)其中，a)或b)中的ATP依赖性DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下，将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’-末端。

a)编码ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中ATP依赖性DNA连接酶具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或

c)其中a)或b)中的ATP依赖性DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下，将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’-末端。

a)编码ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中ATP依赖性DNA连接酶具有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.7、SEQ ID No.10和SEQ ID No.16中任何一个的氨基酸序列，或

b)编码ATP依赖性DNA连接酶或其酶活性片段，其中ATP依赖性DNA连接酶具有选自以下各项的氨基氨基酸序列：SEQ ID No.1或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，SEQID No.7或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，SEQ ID No.10或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，或SEQ ID No.16或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，或

c)包含选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18中任一项的核酸分子或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的密码子优化的核酸序列，其编码a)中的ATP依赖性DNA连接酶，和

d)其中a)或b)中的ATP依赖性DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下，将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到5’-磷酸基-核糖核酸分子的5’-末端。

在第三方面的一个实施方式中，所述载体是重组表达载体、克隆载体、质粒、病毒载体、粘粒、λ噬菌体或细菌人工染色体。

在第三方面的一个实施方式中，所述载体是重组表达载体。

在第三方面的一个实施方式中，所述载体优选地是质粒。

在本发明的第四方面，提供了包含根据第三方面的载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞、昆虫细胞、人类细胞系或细菌细胞。

在第四方面的一个实施方式中，所述细菌细胞优选是大肠杆菌。

在本发明的第五方面，提供了一种用于分离和纯化根据第一方面及其实施方式的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段的方法，包含以下步骤：

a)在适合于表达根据第一方面及其实施方式的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段的条件下，培养根据第四方面的宿主细胞；和

b)从宿主细胞或从培养基或上清液中分离DNA连接酶或其酶促活性片段。

在本发明的第六方面，提供了一种包含根据第一方面的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段的组合物。

在第六方面的一个实施方式中，所述组合物还包含缓冲剂。

在一个实施方式中，所述缓冲剂可以是包含ATP和Mg²⁺或Mn²⁺的缓冲剂。

在一个实施方式中，所述缓冲剂可以是包含ATP和MgCl₂或MnCl₂的缓冲剂。

在一个实施方式中，所述缓冲剂可以是适合储存根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的缓冲剂，其中所述缓冲剂包含Tris-HCl、KCl、Mg²⁺、BSA和甘油。

在第六方面的一个实施方式中，所述组合物还包含至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子、至少一种5’磷酰基-核糖核酸分子和至少一种第二互补脱氧核糖核酸分子，其中所述DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下，将所述至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到所述至少一种5’磷酰基-核糖核酸分子的5’端。

在第六方面的一个实施方式中，所述至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子被固定在珠子上或还包含捕获标签(优选生物素)或衍生核苷酸(如染料，优选荧光染料)，其中所述珠子、捕获标签或衍生核苷酸附接到所述第一脱氧核糖核酸分子的5’端。

在第六方面的一个实施方式中，所述组合物还包含含有ATP的连接缓冲液。

在一个进一步的实施方式中，所述连接缓冲液的ATP的浓度为约0.01mM至约10mMATP，并且优选约0.05mM至约2.5mM ATP。

在一个进一步的实施方式中，所述连接缓冲液包含二价阳离子。

在一个进一步的实施方式中，所述连接缓冲液的二价阳离子是Mg²⁺或Mn²⁺，例如以MgCl₂或MnCl₂的形式，其中Mg²⁺或Mn²⁺的浓度为约1mM至约20mM，优选地约5mM至约10mM。

在一个进一步的实施方式中，连接缓冲液的二价阳离子是Mg²⁺，例如为MgCl₂的形式，并且其中Mg²⁺的浓度为约1mM至约20mM，优选约5mM至约10mM。

在一个进一步的实施方式中，连接缓冲液的二价阳离子是Mn²⁺，例如为MnCl₂的形式，并且其中Mn²⁺的浓度为约1mM至约20mM，优选约5mM至约10mM。

在一个进一步的实施方式中，连接缓冲液包含浓度为约0.01mM至约10mM的ATP且优选约0.05mM至约2.5mM ATP的ATP和例如MgCl₂形式的Mg²⁺，并且其中Mg²⁺的浓度为约1mM至约20mM，优选约5mM至约10mM。

在一个进一步的实施方式中，连接缓冲液包含浓度为约0.01mM至约10mM的ATP且优选约0.05mM至约2.5mM的ATP的ATP和例如MnCl₂形式的Mn²⁺，并且其中Mn²⁺的浓度为约1mM至约20mM，优选约5mM至约10mM。

在本发明的第七方面，提供了一种用于将脱氧核糖核酸分子连接到核糖核酸分子末端的试剂盒，其包含：

a.第一容器，其包含根据第一方面的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段，或根据第六方面的包含ATP依赖性DNA连接酶的组合物；

b.第二容器，其包含连接缓冲液，该连接缓冲液包含ATP和二价阳离子；

c.可选地第三容器，其包含待连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’端的至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和至少一种第二脱氧核糖核酸分子，其中所述至少一种第二脱氧核糖核酸分子包含3’区和5’区，其中所述3’区与第一脱氧核糖核酸分子互补，并且所述5’区是与包含已知序列的核糖核酸分子互补的序列或所述5’区是简并的序列以结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，其中所述第一脱氧核糖核酸分子和第二脱氧核糖核酸分子是预杂交复合物的形式；和

d.可选地使用该试剂盒的说明。

在第七方面的一个实施方式中，所述试剂盒包含第四容器，其包含待连接到3’-羟基-核糖核酸分子的3’端的至少一种第一5’-磷酰基-脱氧核糖核酸分子，和至少一种第二脱氧核糖核酸分子，其中所述至少一种第二脱氧核糖核酸分子包含3’区和5’区，其中所述5’区与所述第一脱氧核糖核酸分子互补并且所述3’区是与包含已知序列的核糖核酸互补的序列或所述3’区是兼并的序列以结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，并且其中所述第一5’-磷酰基-脱氧核糖核酸分子和第二脱氧核糖核酸分子可以为预杂交复合物的形式。

在一个实施方式中，连接缓冲液的ATP和二价阳离子的浓度为约0.01mM至约10mM的ATP且优选约0.05mM至约2.5mM的ATP，并且二价阳离子为例如MgCl₂或MnCl₂形式的Mg²⁺或Mn²⁺，并且其中Mg²⁺或Mn²⁺的浓度为约1mM至约20mM，优选约5mM至约10mM。优选地，二价阳离子是MnCl₂形式的Mn²⁺。

在本发明的进一步方面，提供了用于连接双链核酸分子中的单链断裂的方法，其中所述方法包括使所述包含单链断裂的双链核酸分子与根据第一方面的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段或根据第六方面的组合物接触。

在本发明的第八方面，提供了一种用于连接双链核酸分子中的单链断裂的方法，其中所述方法包括在允许3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到双链核酸分子中5’-磷酰基核糖核酸分子的5’端的条件下，使包含单链断裂的双链核酸分子与根据第一方面及其实施方式的分离的ATP-依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段接触，其中3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和5’-磷酰基核糖核酸与跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子复合。

在根据上述方法的一个实施方式中，3’-羟基-脱氧核糖核酸分子被固定在珠子上或还包含捕获标签(优选生物素)或衍生核苷酸(例如染料，优选荧光染料)，其中所述珠子、捕获标签或衍生核苷酸连接到所述3’-羟基-脱氧核糖核酸分子的5’端。

在根据上述方法的一个实施方式中，核糖核酸(RNA)分子是选自信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、重复相关siRNA(rasiRNA)的RNA分子。

在根据上述方法的一个实施方式中，还包含添加包含ATP和二价阳离子的连接缓冲液。

在根据上述方法的一个进一步实施方式中，ATP的浓度为约0.01mM至约10mM且优选约0.05mM至约2.5mM，并且其中二价阳离子为例如MgCl₂或MnCl₂形式的Mg²⁺或Mn²⁺，并且其中Mg²⁺或Mn²⁺的浓度为约1mM至约20mM，优选约5mM至约10mM。优选地，二价阳离子是MnCl₂形式的Mn²⁺。

在根据上述方法的一个实施方式中，还包含将ATP依赖性DNA连接酶与包含单链断裂的双链核酸分子一起温育少于6小时，例如在少于1小时内，例如在少于45分钟内或优选在30分钟内，更优选在15分钟内，以实现核酸片段至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的连接。

在根据上述方法的一个实施方式中，其中方法用于RNA 5’-末端衔接子连接以捕获已知或未知序列的RNA分子，将在包含启动子元件和/或翻译增强子元件的cDNA分子合成中用作模板的DNA元件连接至RNA分子的5’端以用于体外转录。

本发明的第九方面提供了根据第一方面的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段或根据第六方面的包含ATP依赖性DNA连接酶的组合物用于RNA 5’-末端衔接子连接的用途，以捕获已知或未知序列的RNA分子，将在包含启动子元件和/或翻译增强子元件的cDNA分子合成中用作模板的DNA元件连接到RNA分子的5’端以用于体外转录。

在本发明的第十方面，提供了一种将脱氧核糖核酸分子连接到核糖核酸分子的5’端和3’端的方法，该方法包括：

a.提供包含核糖核酸分子的群体的样品，其中所述核糖核酸分子中的一个或多个包含5’磷酰基-端基和3’-羟基-端基；

b.在至少一种第二脱氧核糖核酸存在下，将至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到核糖核酸分子的5’端，其中所述至少一种第二脱氧核糖核酸分子包含3’区和5’区，其中所述3’区与所述第一脱氧核糖核酸分子互补并且所述5’区是与包含已知序列的核糖核酸分子互补的序列或所述5’区是简并的序列以结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，其中所述第一脱氧核糖核酸分子和第二脱氧核糖核酸分子可以是预杂交复合物的形式；和

c.在至少一种包含3’区和5’区的附加第二脱氧核糖核酸的存在下，将至少一种其他5’磷酰基-脱氧核糖核酸分子连接到步骤b中的核糖核酸分子的3’-端，其中所述5’区与所述5’磷酰基-脱氧核糖核酸分子互补，并且所述3’区是与步骤b中包含已知序列的核糖核酸分子互补的序列或所述3’区是简并的序列以结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，并且其中所述5’磷酰基-脱氧核糖核酸和附加第二脱氧核糖核酸分子可以是预杂交复合物的形式；并且

其中由根据第一方面的ATP依赖性连接酶催化步骤b和c中的连接反应，并且其中步骤b和c中的连接反应同时或依次进行。

在第十方面的一个实施方式中，所述样品还包含ATP和二价阳离子，优选Mn²⁺或Mg²⁺。

本发明的进一步方面提供了第十方面的方法在RNA文库构建中的用途。

附图说明

图1：比较T4 DNA连接酶和本发明的L13连接酶的氨基酸序列的序列比对。

图2：根据本发明的源自不同噬菌体的DNA连接酶的多序列比对。所有序列都包含KXDG腺苷酸化位点，这是迄今为止鉴定的所有连接酶的共同基序。

图3a：示出了用于测量连接酶活性的一般实验设置，其基于Bullard andBowater,2006中描述的实验设置。

图3b：与其他已知连接酶相比，AZ L13的底物特异性。使用了一组八种不同的切口底物，以测试连接酶AZ L13和商业参考酶(AZ T4 DNA连接酶(ArcticZymes)、T4 Rnl 1(NEB)、T4 Rnl 2(NEB)、T3 DNA连接酶(NEB)、T7 DNA连接酶(NEB))的酶活性。使用的底物各自是三个寡核苷酸的组合，它们可以由仅由脱氧核糖核酸(DNA)寡核苷酸组成(底物S1)、仅由核糖核酸(RNA)寡核苷酸组成(底物S2)或由脱氧核糖核酸(DNA)寡核苷酸与核糖核酸(RNA)寡核苷酸的混合物组成(底物S3至S8)。如图1b所示，阳性连接酶活性导致荧光标记的核酸寡核苷酸长度增加。条带由作为未连接的单链8-聚体寡核苷酸产物的下条带和作为连接的单链20-聚体寡核苷酸产物的上条带表示。

图4：描述了本发明的一个方面，其中在DNA连接模板的存在下使用本发明的ATP依赖性DNA L13连接酶将DNA寡核苷酸连接到RNA的5’-端，其中所述DNA模板序列是半-简并的，因此包括序列的混合物。其中所述半简并DNA模板的一个区域与第一DNA寡核苷酸互补并且另一个区域包含一个或多个简并核苷酸，用于与不同的5’-单磷酸化RNA寡核苷酸进行非特异性杂交，以捕获未知序列的RNA分子或以捕获来自不同等位基因的RNA分子，其中所述RNA寡核苷酸中的一些核苷酸位置在不同等位基因中是不同的。等位基因是代表同一基因的基因变体。N表示A、C、G或T。

图5：描绘了图4中描述的方面的一个实施方式，其中RNA分子池包含单磷酸化RNA分子与包含5’-修饰(例如5’帽或三磷酸基团)的RNA分子的混合物。包含5’修饰的RNA分子将被排除在连接之外。

图6：描绘了图4中描述的本发明方面的替代实施方式，其中待连接至单磷酸化RNA分子的DNA分子包含5’标签，在该图中显示为生物素标签。例如，可以通过使用与柱或磁珠偶联的生物素标签和链霉亲和素进行捕获。

图7：描绘了图4中描述的本发明方面的替代实施方式，其中该方法捕获特异性mRNA种类。如上所述，DNA寡核苷酸仅选择性连接到mRNA的5’-单磷酸化末端。mRNA通常被加帽且未被磷酸化，这会阻止使用所述L13连接酶的连接。磷酸酶对所有含5’-磷酸酯的RNA物种进行去磷酸化，然后对mRNA进行脱帽，从而使mRNA 5’-端准备好与DNA的3’-端连接。可以使用生物素标签和链霉亲和素进行捕获。

图8：示出了本发明的一个方面的替代实施方式，其中将启动子标记到脱帽的mRNA上以用于引导无细胞ivTT(体外转录-翻译)。如图4所述，使用具有用于非特异性杂交的简并区域的DNA模板，在mRNA的5’-单磷化末端进行选择性连接DNA寡核苷酸。mRNA RNA物种的去磷酸化和mRNA的脱帽。用含有简并区域和启动子序列的5’-DNA衔接子标记5’-磷酸化的mRNA。第一链cDNA合成将导致mRNA的RNA聚合酶-可读拷贝，该mRNA包括RNA聚合酶结合位点，使得cDNA可以直接用于体外转录/翻译技术。

图9a：根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的野生型氨基酸序列(AZ L13)SEQ IDNo 1。

图9b：根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的带His标签的氨基酸序列(AZ L13)SEQID No 2。

图9c：编码图9a中氨基酸的野生型核苷酸序列(SEQ ID No 3)。

图10a：根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的氨基酸序列(L13rel1)SEQ ID No 7。

图10b：根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的带His标签的氨基酸序列(L13rel1)SEQ ID No 8。

图10c：编码图10a中氨基酸序列的野生型核苷酸序列(SEQ ID No 9)。

图11a：根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的氨基酸序列(L13rel2)SEQ ID No10。

图11b：根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的带His标签的氨基酸序列(L13rel2)SEQ ID No 11。

图11c：编码图11a中氨基酸序列的野生型核苷酸序列(SEQ ID No12)。

图12a：ATP依赖性DNA连接酶的氨基酸序列(L13rel3)SEQ ID No13。

图12b：图12a的ATP依赖性DNA连接酶的带His标签的氨基酸序列(L13rel3)SEQ IDNo 14。

图12c：编码图12a中氨基酸序列的野生型核苷酸序列(SEQ ID No15)。

图13a：根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的氨基酸序列(L13rel4)SEQ ID No16。

图13b：根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的带His标签的氨基酸序列(L13rel4)SEQ ID No 17。

图13b：编码图13a中氨基酸序列的野生型核苷酸序列(SEQ ID No18)。

图14：比较牛痘DNA连接酶和本发明的L13连接酶的氨基酸序列的序列比对。

具体实施方式

在以下描述中，阐述了本发明的各种示例和实施方式，以便为技术人员提供对本发明的更透彻的理解。在各种实施方式的上下文中并参考附图描述的具体细节不旨在被解释为限制。

除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与遗传学、生物化学和分子生物学领域的技术人员通常理解的含义相同。

如上所述，本发明人已经鉴定了一种新型ATP依赖性DNA连接酶(L13)，它能够在跨越连接点的互补第二脱氧核糖核酸分子的存在下连接双链核酸复合物中的单链断裂，该双链核酸复合物包含待连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’端的第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子，见图3a所示。

本发明人还鉴定了最初从噬菌体分离的进一步的DNA连接酶，其中进一步的DNA连接酶与具有SEQ ID No.1的L13连接酶的氨基酸序列具有至少70％(例如至少75％)同一性的氨基酸序列，其中进一步的DNA连接酶具有与L13相似的酶活性和底物特异性。

进一步的DNA连接酶是L13rel1，其具有SEQ ID No.7的氨基酸序列和SEQ ID No.9的cDNA序列。

进一步的DNA连接酶是L13rel2，其具有氨基酸序列SEQ ID No.10SEQ ID No.12。

进一步的DNA连接酶是L13rel4，其具有氨基酸序列SEQ ID No.16SEQ ID No.18。

根据本发明的连接酶除了具有上述独特的底物特异性外，还具有在跨越连接点的互补第二脱氧核糖核酸分子的存在下高效地连接双链核酸复合物中的单链断裂的能力，双链核酸复合物包含第一DNA分子，该第一DNA分子包含待连接至包含3’-羟基端基的RNA分子的3’端的5’磷酰基端基。

与第二脱氧核糖核酸一起用于连接反应的第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子、5’-磷酰基-核糖核酸分子或其部分优选是单链的，并且3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和5’磷酸-核糖核酸分子可以部分或全部与跨越连接点的第二脱氧核糖核酸分子的至少一部分互补。

“互补核酸序列相互结合”这一事实是DNA和RNA的特性。互补性是通过核碱基之间的不同相互作用实现的：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或(RNA中的尿嘧啶)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。

术语“3’-羟基-脱氧核糖核酸分子”在其3’末端具有游离羟基(OH-基团)。脱氧核糖核酸分子的核苷酸可以是标准核苷酸以及非标准核苷酸。非标准核苷酸的非限制性实例包括肌苷、黄苷、异鸟苷、异胞苷、二氨基嘧啶和脱氧尿苷。脱氧核糖核酸分子可以包含修饰的或衍生的核苷酸。对脱氧核糖或碱基部分进行修饰的非限制性实例包括添加(或去除)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基。衍生核苷酸的合适实例包括具有共价附接染料(例如荧光染料或淬灭染料)或其他分子(例如生物素、洋地黄毒苷或磁性颗粒)的那些，参见图6和图7图示。

3’-羟基-脱氧核糖核酸分子可以在其5’端连接到磁珠、玻璃或二氧化硅基板或微流体装置或其他反应室中的表面。3’-羟基-脱氧核糖核酸分子可以直接或间接偶联的附加固态基材包括丙烯酰胺、纤维素、硝化纤维素、玻璃或技术人员已知的其他众所周知的基材。

3’-羟基-脱氧核糖核酸分子的长度可以并且将取决于连接产物的长度及其所需特征而变化。一般而言，3’-羟基-脱氧核糖核酸分子为至少约8个核苷酸，如实施例2所示，但长度可以从15个核苷酸到至多100个核苷酸。

RNA的5’衔接子连接

术语“互补第二脱氧核糖核酸分子”或“互补连接模板”应理解为用于提高连接反应效率的脱氧核糖核酸(DNA)分子。如上所述，在该第二脱氧核糖核酸分子(也称为连接模板)的存在下，在5’磷酰基-核糖核酸分子的5’-端连接第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子。该第二脱氧核糖核酸分子包含两个不同的区域：与核糖核酸分子互补并杂交的5’区和与第一脱氧核糖核酸分子互补并杂交的3’区，见图3a。

“互补第二脱氧核糖核酸分子”可以是精确的互补物，或者它可以是其两个靶序列的几乎精确的互补物。由于连接模板与第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和核糖核酸分子都杂交，因此它跨越连接点，使得将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子拉近至与5’磷酰基-核糖核酸分子的5’端。第二脱氧核糖核酸分子还可以包含与3’-羟基-脱氧核糖核酸分子所述类似的标准、非标准、修饰或衍生的核苷酸。

通常，互补第二脱氧核糖核酸分子的长度可至少约10个核苷酸，优选至少约20个核苷酸，其中约一半的连接模板与核糖核酸分子具有互补性，并且另一半与第一3’-羟基-脱氧核糖核分子具有互补性。本领域技术人员将理解，互补第二脱氧核糖核酸分子可以更长，例如至少约25或30或35或40或45或至多约100个核苷酸。

在进一步实施方式中，第二脱氧核糖核酸分子可以是用于RNA的5’端衔接子连接的半简并连接模板，其包含与第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子杂交的3’区和简并5’区，该简并5’区包含核苷酸的随机混合，使得每个模板可以与来自不同等位基因的RNA群体中的离散RNA杂交。本领域技术人员将理解，包含简并区的核苷酸的数量决定了可能模板组合的数量，因此决定了可以杂交的RNA的数量。出于5’RNA衔接子连接的说明目的，参见图4至8，其中模板是半简并的。

3’RNA的衔接子连接

在替代实施方式中，“互补第二脱氧核糖核酸分子”或“互补连接模板”应理解为用于提高连接反应效率的脱氧核糖核酸(DNA)分子。如上所述，在该第二脱氧核糖核酸分子(也称为连接模板)的存在下，在3’羟基-核糖核酸分子的3’-端连接第一5’-磷酰基-脱氧核糖核酸分子。该第二脱氧核糖核酸分子包含两个不同的区域：与核糖核酸分子互补并杂交的3’区和与第一脱氧核糖核酸分子互补并杂交的5’区。

在进一步的实施方式中，第二脱氧核糖核酸分子可以是用于RNA的3’末端衔接子连接的半简并连接模板，其包含与第一5’-磷酰基-脱氧核糖核酸分子杂交的5’区和简并3’区，该简并3’区包含核苷酸的随机混合，使得每个模板可以与来自不同等位基因的RNA群体中的离散RNA杂交。本领域技术人员将理解，包含简并区的核苷酸的数量决定了可能模板组合的数量，并因此决定了可以杂交的RNA的数量。出于说明目的，请参见图4至8中描述的5’RNA衔接子连接，其中模板是半简并的。

在某些实施方式中，在添加包含核糖核酸分子的样品之前，第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子或5’磷酰基-脱氧核糖核酸分子以及第二脱氧核糖核酸分子被预杂交以形成本文描述为衔接子分子的双链体，对于5’RNA衔接子连接的说明，参见图4至8。

术语“杂交”在本文中应理解为本领域已知杂交条件的选择，其足以使第二脱氧核糖核酸上的互补或近似互补碱基特异性退火，以选择性结合和并置等接合的5’第一脱氧核糖核酸和3’核糖核酸的两个单链区域。

本发明人通过挖掘包含宏基因组核苷酸序列数据的公开可用的UniProt KB数据库(UniProtKB/Swiss-Prot UniProt release 2015_06)以寻找候选连接酶，从而鉴定ATP依赖性DNA连接酶。令人惊讶的是，他们发现了编码根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的序列，其最初是从阪崎克罗诺杆菌噬菌体CR9中分离出来的，NCBI登录号为和基因座标识号为YP_009015226.1，具有上述独特的连接酶活性。克罗诺杆菌噬菌体CR9的完整基因组序列具有NCBI登录号JQ691611。YP_009015226.1的氨基酸序列通过基因组序列的概念翻译被识别为推定的连接酶，参见YP_009015226.1的NCBI核苷酸和蛋白质数据库中的序列信息。根据数据库，序列尚未得到验证。因此，本发明人首先克隆并开发了用于根据本发明的ATP依赖性连接酶的优化表达系统。

上述克罗诺杆菌噬菌体CR9的原产国尚不清楚。根据NCBI数据库中条目JQ691611的信息，阪崎克罗诺杆菌噬菌体CR9的基因组序列由Department of Food and AnimalBiotechnology,Seoul National University,1Gwanak-ro,Gwanak-gu,Seoul 151-921,South Korea提交。

将核酸分子连接到RNA分子的5’端的能力在许多分子生物学技术中是可取的，例如经典克隆和使用Gibson方法的克隆(Gibson,D.G.et al.,Enzymatic assembly of DNAmolecules up to several hundred kilobases,Nature Methods,2009,vol.6,page 343-345)、文库制备过程中的衔接子连接(例如illumine,Head,S.R.et al.,Libraryconstruction for next-generation sequencing:overviews and challenges,Biotechniques,2014,vo..56,no.2,p.1-31)、DNA合成、连接测序(例如SOLiD)(Voelkerding,K.V.et al.Next-Generation Sequencing:from basic research todiagnostics,Clinical Chemistry,2009,vol55,no.4,p.641-658)、连接酶链式反应(J；Czajka,J；Luo,J；Barany,F；Batt,CA (Feb 1994)."Ligase chain reaction(LCR)--overview and applications".PCR Methods and Applications.3(4):S51–64)、SNP检测(Etter,P.D.et al.,SNP discovery and genotyping for evolutionary geneticsusing RAD sequencing,Methods Mol.Biol.,2011,vol.772,p.157-178)和RNA的5’-端标记。

通常，RNA的5’-衔接子连接是通过连接5’-RNA分子或通过使用例如T4 RNA连接酶将杂合DNA-RNA分子连接到RNA分子的5’端来进行的。然而，与DNA相比，使用RNA不太有利，因为RNA更容易降解。因此，在某些情况下，可能需要将DNA分子连接到RNA分子的5’端。

此外，根据本发明的连接酶除了具有上述独特的底物特异性外，还具有在跨越连接点的互补DNA模板的存在下将DNA分子高效连接到RNA分子3’端的能力。因此，使一种酶可以在RNA分子的5’端和3’端连接DNA衔接子分子。

RNA分子3’端和5’端的衔接子连接可以在单个步骤或分开的步骤中进行。

因此，根据本发明的连接酶可用于需要“双重连接”的RNA片段的衔接子连接过程中(即含有衔接子的RNA片段在5’和3’端都连接)。一种常用于下一代测序(NGS)用文库构建的过程，例如广泛使用的Illumina测序平台所需的过程，参见Steven R.Head et al.,Library construction for next-generation sequencing:Overviews and challenges,Biotechniques,Published online 2014Feb 1,2014；56(2):61,doi:10.2144/000114133。

准备在3’端和5’端进行衔接子连接的RNA片段应该优选地包含5’磷酸基端基和3’羟基端基，以进行有效连接，对于根据本发明在RNA分子的3’端和5’端的衔接子连接的说明，见附图。

长RNA分子，例如mRNA和长非编码RNA，可能需要进行片段化。RNA片段化的过程是本领域技术人员已知的，参见例如

RNase III RNA片段化模块和

镁RNA片段化模块。NEBNext RNase III RNA片段化模块使用核糖核酸内切酶，其将长双链RNA切割成具有5’磷酸和3’羟基末端的RNA片段，可直接用于5’和3’端连接反应。然而，

镁RNA片段化模块使用二价金属离子(Mg+)和热量来片段化RNA；创建具有5’羟基和3’磷酸末端的RNA片段。在后一种情况下，必须修饰RNA片段的末端以获得包含5’磷酸和3’羟基末端的片段。

已经发现，在存在跨越连接点的互补DNA分子的情况下，在存在ATP和二价阳离子的情况下，从噬菌体(更具体地从克罗诺杆菌噬菌体)获得且如本文所述的ATP依赖性DNA连接酶令人惊讶地且高效地将具有单链区的DNA分子连接到RNA的5’端。

根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶与其他已知连接酶的序列同一性较低，并且与众所周知的T4 DNA连接酶的序列同一性低于30％，见图1。

如上所述，封闭的DNA连接酶的一个特性是在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子存在的情况下将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子高效连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’端的能力。

文献中很好地描述了连接酶能够连接不同底物的子集，参见例如Bullard,D.R.,&Bowater,R.P.,Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acidligases from bacteriophage T4.The Biochemical Journal,2006,398(1),135–144。根据本发明的DNA连接酶也能够高效连接底物子集，参见图3b(AZ L13)，其中很明显，AZ L13能够高效地与底物1、6、7和8连接并且以较低效率与底物3和5连接。

术语高效率涉及在本领域技术人员已知的标准温度和缓冲液条件下，在少于6小时内，例如在少于1小时内，例如在少于45分钟内，或优选在30分钟内或在15分钟内，酶连接双链核酸分子中的单链断裂以实现至少至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％,至少95％或至少100％的多核苷酸连接的能力。表2a和表2b以及实施例2中描述了标准缓冲液和温度条件的示例。

根据本发明的连接效率或连接率或转化率可以使用技术人员已知的不同方法计算。例如，可以通过检测连接产物来计算连接效率，如图3b所示，其中70％效率的意思是((连接产物)/(连接产物+未连接产物))*100＝70。连接产物+非连接产物的70％作为连接产物存在。这可以通过测量如图3b所示凝胶上不同条带的强度并按照所述计算效率来实验地检测。凝胶上代表连接产物和未连接产物的条带的强度可以使用成像技术测量，例如阿尔法成像仪(AlphaImager HP system)。

与T4 DNA连接酶、T3DnL、SplintR或来自牛痘病毒的DNA连接酶相比，本发明的DNA连接酶在存在跨越连接点的互补DNA模板的情况下将DNA分子连接到RNA分子的5’端的能力方面具有改进的连接效率。其中与T4 DNA连接酶、T3DnL、SplintR或来自牛痘病毒的DNA连接酶的连接效率相比，改进的连接效率至少是2到100倍。使得与T4 DNA连接酶、T3DnL、SplintR或来自牛痘病毒的DNA连接酶相比，本发明的DNA连接酶的增加的连接效率至少大于2倍、至少大于5倍、至少大于10倍、至少大于12倍、至少大于15倍、至少大于20倍或至少大于100倍。

根据本发明作为酶活性量度的转化率可以表示为每分钟每pmol酶连接的pmol底物。

使用在双链核酸分子中包含单链断裂的底物测量底物的转化率和连接％，其中双链核酸分子包含3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和与跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子复合的5’-磷酰基核糖核酸(根据图3b的S8底物)。

根据本发明，在上述底物(S8)上的转化率是至少0.02、至少0.03、至少0.04、至少0.05或至少0.1，其中转化率被确定为在25℃至30℃下，在包含ATP、Mg²⁺和0.2pmol至15pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

根据本发明，在上述底物(S8)上的转化率至少为0.02，其中转化率确定为在25℃至30℃下，在包含ATP、Mg²⁺和0.2pmol至10pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

根据本发明，在上述底物(S8)上的转化率为0.02至0.1，其中转化率确定为在25℃至30℃下，在包含ATP、Mg²⁺和0.2pmol至15pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

根据本发明，在上述底物(S8)上的转化率为0.02至0.1，其中转化率确定为在25℃至30℃下，在包含ATP、Mg²⁺和0.2pmol至10pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

根据本发明，在上述基材(S8)上的转化率是至少0.15、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.8、至少1.0、至少1.5，其中转化率确定为在25℃到30℃下，在包含ATP、Mn²⁺和0.2pmol至15pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

根据本发明，在上述底物(S8)上的转化率至少为0.15，其中转化率确定为在25℃至30℃下，在包含ATP、Mn²⁺和0.2pmol至10pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

根据本发明，在上述底物(S8)上的转化率为0.15至2.0，其中转化率确定为在25℃至30℃下，在包含ATP、Mn²⁺和0.2pmol至15pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

根据本发明，在上述底物(S8)上的转化率为0.15至2.0，其中转化率确定为在25℃至30℃下，在包含ATP、Mn²⁺和0.2pmol至10pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，pmol底物每pmol酶每分钟。

在包含ATP、Mg2⁺和0.2pmol至15pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，在25℃下在15分钟内，根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶能够连接上述底物(S8)的至少25％。

在包含ATP、Mg²⁺和0.2pmol至10pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，在25℃下在15分钟内，根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶能够连接上述底物(S8)的至少25％。

在包含ATP、Mn²⁺和0.2pmol至15pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，在25℃下在15分钟内，根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶能够连接上述底物(S8)的至少50％，优选至少60％。

在包含ATP、Mn²⁺和0.2pmol至10pmol根据本发明的DNA连接酶的连接缓冲液中，在25℃下在15分钟内，根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶能够连接上述底物(S8)的至少50％，优选至少60％。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中ATP依赖性DNA连接酶包含SEQ ID No.1的氨基酸序列或包含与SEQ ID No.1具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述DNA连接酶能够在存在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的情况下在5’磷酰基-核糖核酸分子的5’端连接3’-羟基-脱氧核糖核酸分子。

DNA连接酶的表述“其酶促片段”应理解为指这样的DNA连接酶，其中以截短形式保持了具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的连接酶的催化活性。实施例2提供了一种合适的测定法来测量连接酶活性。

在一个实施方式中，根据本发明的DNA连接酶或其酶促片段包含与SEQ ID No.1具有至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、98％或99％或优选至少85％或94％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，包含与SEQ ID No.1具有至少70％同一性的氨基酸序列的ATP依赖性DNA连接酶可选自具有以下的序列：

NCBI登录号ARB11687.1，

NCBI登录号YP_007392649.1，

NCBI登录号KAB3178420.1，

NCBI登录号YP_006383262.1，

NCBI登录号YP_009042486.1，

NCBI登录号ATS93644.1，

NCBI登录号QEG12338.1，

NCBI登录号AXN57775.1或

NCBI登录号WP_133670648.1。

在一个实施方式中，根据本发明的DNA连接酶或其酶促片段包含与SEQ ID No.1具有至少75％同一性的氨基酸序列。

在根据本发明的另一个实施方式中，包含与SEQ ID No.1(L13)具有至少70％同一性的氨基酸序列的ATP依赖性DNA连接酶选自表1中DNA连接酶中的任何一种：

表1

还附上表1的上述序列的任何一者的酶促片段。

具有NCBI登录号YP_009846950.1的L13Rel3是来自气单胞菌噬菌体4的推定DNA连接酶，包含与SEQ ID No.1(L13)仅具有39％同一性的氨基酸序列。图12a至12c和SEQ IDNo:13至15示出了氨基酸序列和cDNA序列。L13Rel3不属于根据本发明的DNA依赖性连接酶的L13-簇，并且与根据本发明的L13 ATP依赖性DNA连接酶相比，所述连接酶对在双链核酸分子中包含单链断裂的底物具有降低的酶活性，其中双链核酸分子包含3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和与跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子复合的5’-磷酰基核糖核酸(根据图3b的S8底物)。

图2示出了SEQ ID No.1与上述序列相比的多序列比对。从图2可以明显看出，所述序列共有多个保守结构域，包括迄今为止研究的所有连接酶共有的KXaaDG基序，其中赖氨酸残基参与形成腺苷酸化酶中间体，然后其结合核酸(Tomkinson,et al.,Bioessays,19(10):893-901(1997),Shuman,et al.,Virology,211(1):73-83(1995)和Luo,et al.,Nucleic Acids Res,24(15):3079-3085(1996))。

SEQ ID No.1的变体包括其中SEQ ID No.1中所述氨基酸的一个或多个氨基酸已经经历保守取代的氨基酸序列。优选地，此类取代是沉默取代，因为本发明的DNA连接酶的修饰形式具有与未修饰形式相同的酶活性。

本发明的DNA连接酶可以以修饰形式提供，例如具有氨基酸标签的融合蛋白，该氨基酸标签可用于DNA连接酶的分离、溶解和/或纯化或鉴定过程。这样的氨基酸标签包括但不限于聚组氨酸(His)标签。SEQ ID No.2中列举了本发明的聚组氨酸标记的DNA连接酶的实例。SEQ ID No.8、SEQ ID No.11和SEQ ID No.17中列举了本发明的其他聚组氨酸标记的DNA连接酶。

此外，本发明还提供了编码本发明的DNA连接酶的核酸分子及其酶促片段。SEQ IDNo.3中公开了对应于SEQ ID No.1的氨基酸序列的核酸序列。

SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18中公开了对应于SEQ ID No.7、SEQID No.10和SEQ ID No.16的氨基酸序列的其他核酸分子。

本发明的核酸可以包含上述核酸分子或变体核酸分子。由于遗传密码简并的事实，变体核酸分子包括其中核苷酸结构上不同但可以执行相同功能或收益的分子。遗传密码的简并性是指SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的核酸分子只是编码如由SEQ ID No.1、SEQ ID No.7、SEQ ID No.10和SEQ ID No.16所提供的氨基酸分子的众多核酸分子之一，而不会影响所得连接酶的酶活性。然后，可以对SEQ ID No.3、SEQID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18中公开的核酸分子进行密码子优化，以优化在大肠杆菌宿主细胞中的表达。

还公开了包含SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的核酸或由所述核酸组成的核酸分子。这些核酸分子可以是核酸载体，例如质粒、重组表达载体、病毒载体、粘粒、λ噬菌体载体或细菌人工染色体载体。优选的载体是用于在细菌细胞中克隆和/或表达连接酶的载体，例如质粒。

此外，在本发明的其他实施方式中，提供了编码包含DNA连接酶和His-标签的多肽的核酸分子。可以将编码His-标签的核酸分子添加到本发明的核酸序列中而不影响所得DNA连接酶的活性。

此外，编码提供DNA连接酶从宿主细胞分泌的信号肽的核酸分子也可以与本发明的核酸序列连接。

如本文所用，就蛋白质和核酸分子或其片段而言，当提及“序列同一性”时，与第二序列具有至少x％同一性的序列意味着，x％表示当两个序列通过全局比对进行最佳比对时，相对于第二氨基酸或核苷酸序列的总长度，第一序列中与其匹配的第二序列的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数量。当x最大时，两个序列是最佳比对的。可以手动或自动进行比对和同一性百分比的确定。

本领域技术人员将承认，可以通过多种方式实现用于确定百分比序列同一性的比对，例如使用公开可用的计算机软件，诸如Clustal W等公开可用的计算机软件Clustal W(Thomson et al.,1994,Nucleic Acid Res.,22,pp 4673-4680)https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/或NCBI BLAST(来自美国国家生物技术信息中心(NCBI))，使用默认参数。

本发明的DNA连接酶的制备

本发明的DNA连接酶及其酶促片段或编码所述连接酶的核酸分子可以从天然来源分离，例如噬菌体，例如克罗诺杆菌噬菌体、果胶杆菌属噬菌体或不动杆菌属噬菌体。

替代地，酶可以在宿主细胞中重组产生并从中分离和纯化。其中宿主细胞不是天然表达编码本发明的DNA连接酶的基因的生物体、或不是来自天然表达编码本发明的DNA连接酶的基因的生物体，即所述宿主细胞是异源宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、人类细胞系或细菌细胞，优选大肠杆菌。

编码根据本发明的DNA连接酶或其酶促片段的核酸序列可以使用PCR从基因组DNA扩增，作为cDNA分离，或可由商业供应商订购，例如GENEWIZ、Thermo Fisher Scientific的GeneArt或Genscript。

如上所述，可以对编码DNA连接酶或其酶促片段的核酸序列进行密码子优化以增加在异源宿主细胞中的蛋白质生产。用于帮助密码子优化的各种软件程序在本领域中是众所周知的。CodonW是可以使用的开源软件程序的一个示例。优选使用Raab,D.,Graf,M.,Notka,F.,

T.,&Wagner,R.(2010).The GeneOptimizer Algorithm:Using asliding window approach to cope with the vast sequence space inmultiparameter DNA sequence optimization.Systems and Synthetic Biology,4(3),215–225描述的GeneOptimizer算法来生成密码子优化的DNA序列，用于在大肠杆菌宿主细胞中表达本发明的DNA连接酶。

有多种可用的分子技术通过使用众所周知的重组基因表达系统在各种宿主细胞系统中通过异源表达来从DNA序列表达蛋白质。例如，可以将编码根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶或编码其酶促片段的核酸分子插入到合适的表达载体中，该表达载体包含适合于所选宿主细胞的表达所需的转录和翻译元件。常用表达载体的例子是质粒或病毒。

为了确保目标基因的可靠转录。表达载体可以包含强启动子，噬菌体T5和T7是用于在大肠杆菌中表达的强启动子的例子。可以通过包含化学开关来调节启动子。用于大肠杆菌中的诱导型启动子的例子是常用的由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子(Hansen LH,Knudsen S,

SJ,"The effect of the lacY gene on theinduction of IPTG inducible promoters,studied in Escherichia coli andPseudomonas fluorescens",Curr.Microbiol.1998,36(6):341–7)或包含可被甲苯酸诱导的启动子的XylS/Pm表达盒(Gawin,A.et al.,The XylS/Pm regulator/promoter systemand its use in fundamental studies of bacterial gene expression,recombinantprotein production and metabolic engineering,Microb.Biotechnol.,2017,Vol.10,No.4,p 702-718)。源自恶臭假单胞菌的XylS/Pm调节剂/启动子系统广泛用于调节大肠杆菌和其他细菌中基因和基因簇的低水平和高水平重组表达。

本发明的进一步方面是一种在合适的异源细胞中表达如上所述的根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段的方法。宿主细胞可以是细菌或酵母细胞。优选地，酶的表达在细菌宿主细胞中进行，更优选在大肠杆菌、BL21(DE3)细胞中进行。

包含本发明的DNA连接酶的上述表达载体的转化可以通过本领域技术人员熟知的方法进行，例如通过使用化学感受态细胞。

如上所述，可以使用重组DNA技术合成本发明的DNA连接酶。或者，可以使用无细胞表达系统或DNA连接酶的化学合成来产生DNA连接酶。

可以使用本领域已知和文献中充分描述的任何技术，从宿主细胞培养基中分离和纯化包含用于分泌到细胞培养基中的信号肽的连接酶。此类技术或任何组合的示例可包括沉淀、超滤、不同的色谱技术例如尺寸排阻色谱、固定化金属亲和柱色谱和/或免疫吸附色谱。

也可以使用技术人员熟知的技术分离和纯化细胞内产生的本发明的DNA连接酶。从大肠杆菌细胞制备细胞裂解物的方法的例子是匀浆、超声或使用溶菌酶的酶裂解。在DNA连接酶从裂解的细胞中释放出来后，所述酶可以经受任何纯化方法，例如尺寸排阻色谱法、固定化金属亲和柱色谱法和/或免疫吸附色谱法。

如上所述，本发明的DNA连接酶可以包含c-末端His-标签以方便酶的分离、纯化和/或鉴定。SEQ ID No.2、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11和SEQ ID No.17描绘了本发明的多组氨酸标记的DNA连接酶。

因此，根据本发明的另一方面，提供了一种用于分离和纯化根据本发明的DNA连接酶或其酶促活性片段的方法，包含步骤：a)在适合于表达根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶的条件下培养宿主细胞；b)从宿主细胞或从培养基或上清液中分离DNA连接酶。

根据本发明的纯化的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段最终可以储存在缓冲液中，该缓冲液包含例如10mM Tris-HCl pH 7.5(25℃)、0.3M KCl、5mM MgCl₂、0.2mg/ml BSA和50％。适用于储存连接酶的替代缓冲液是技术人员已知的。

包含本发明的DNA连接酶的组合物和试剂盒

还公开了组合物和试剂盒，其包含根据第一方面的ATP依赖性DNA连接酶以及一种或多种附加的进行连接步骤所必需的试剂，例如连接缓冲液。下表2a或2b中描述了用于进行连接的合适连接缓冲液和反应条件。

通常，将本发明的分离的ATP依赖性DNA连接酶置于水性缓冲液中，类似于包含本发明的分离的ATP依赖性DNA连接酶的组合物也将包含水性缓冲液。根据本发明的水性缓冲液包含标准缓冲液，例如pH为约7至约8.5，优选pH约7.5的Tris、MES Bis-Tris、磷酸盐或HEPES缓冲液。水性缓冲液可优选地还包含BSA和甘油以稳定酶。

本发明的DNA连接酶是利用ATP作为辅因子以进行连接步骤的ATP依赖性DNA连接酶，参见“背景”段落以了解酶促反应的概述。此外，反应的ATP依赖性表明该反应需要多个二价阳离子如Mg²⁺或Mn²⁺离子用于催化，并且需要基本的二价阳离子，优选Mg²⁺，更优选Mn²⁺。

因此，在一个实施方式中，连接缓冲液包含ATP。使得其中ATP的浓度为约0.01mM至约10mM，并且优选约0.05mM至约2.5mM，更优选约1mM。

在进一步实施方式中，连接缓冲液包含二价阳离子。使得其中二价阳离子为Mg²⁺或Mn²⁺，例如以MgCl₂或MnCl₂的形式。

在进一步实施方式中，连接缓冲液中二价阳离子的浓度为1mM至20mM，优选5mM至15mM，更优选约10mM。

连接缓冲液可还包含还原剂。合适的还原剂的非限制性例子包括二硫苏糖醇和β-巯基乙醇。

在进一步实施方式中，连接在20℃至35℃且优选25℃至30℃的温度下进行。

在进一步的方面，还公开了一种试剂盒，其包含根据本发明的任何分离的ATP依赖性DNA连接酶。该试剂盒可还包含用于最佳连接的连接缓冲液。该试剂盒还可以包含关于如何使用根据本发明的公开的ATP依赖性DNA连接酶进行连接步骤的书面描述。实施例2中描述了合适的条件，其可以在试剂盒中提供或与连接酶一起提供。表2a和2b提供了使用本发明的DNA连接酶进行最佳连接的反应混合物的例子。

表2a

	浓度/体积
		Tris/HCl(pH 7.4)	55mM
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>]]>	10mM
		DTT	10.5mM
KCl	25mM
		ATP	1mM
连接酶	70pmol
		包含缺口的双链核酸	45pmol
总容积	5μl

表2b

	浓度/体积
		Tris/HCl(pH 7.4)	50mM
<![CDATA[MnCl<sub>2</sub>]]>	10mM
		DTT	10mM
KCl	25mM
		ATP	0.1to 1mM
连接酶	0.2pmol to 15pmol
		包含缺口的双链核酸	5至45pmol
总体积	5μl至20μl

将表2a或表2b中的反应混合物在30℃温育30分钟。或者，将表2a或表2b中的反应混合物在25℃温育15分钟。表2a或表2b的反应混合物可以包含MnCl₂或MgCl₂。

本发明的DNA连接酶的用途

在本发明的另一方面，提供了一种用于连接双链核酸分子中单链断裂的方法，其中方法包括在允许3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到双链核酸分子中的5’-磷酰基核糖核酸分子的5’端的条件下，使所述包含单链断裂的双链核酸分子与根据第一方面的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶活性片段接触，其中3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和5’-磷酸核糖核酸与跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子复合。

在一个实施方式中，根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段是L13连接酶。

在一个实施方式中，根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段是L13rel1连接酶。

在一个实施方式中，根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段是L13rel2连接酶。

在一个实施方式中，根据本发明的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段是L13rel4连接酶。

根据本发明的单链断裂包括缺口和间隙。

5’-磷酰基-核糖核酸分子是在5’端包含磷酸基团的RNA分子。在一个实施方式中，核糖核酸分子可以是选自信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、重复相关siRNA(rasiRNA)中的核糖核酸(RNA)分子。

适用于本发明的含有小RNA的样品的来源可以取决于应用并且将根据应用而变化。包含成熟小RNA的样品可以来源于动物、植物、真菌、原生生物、病毒、细菌或古细菌。

源自任何上述来源的样品的范围可以从基本上纯RNA分子的制剂到细胞的粗提物。在一个实施方式中，样品可以是小RNA分子的分离制剂。在另一个实施方式中，样品可以是从细胞中提取的总RNA的分离制剂。在又另一个实施方式中，样品可以是包含核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物的胞质细胞提取物。在又另一个实施方式中，样品可以是完整细胞。在又另一个实施方式中，包含小RNA的样品可以是体外转录反应或化学合成反应。可以使用市售试剂盒或本领域熟知的技术从细胞、细胞提取物或体外反应中分离和纯化总RNA或小RNA，作为参考，参见Ausubel et al.(2003)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,NY,或Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)。

添加到连接反应中的样品中小RNA的量可以并且将根据含RNA样品的来源而变化。通常，可以使用任何量的RNA。

信使RNA(mRNA)通常具有一个5’端帽(five-prime cap，5’帽)，它是一些初级转录物(例如前体信使RNA)的5’端上的特殊改变的核苷酸。这个过程被称为mRNA加帽，在产生稳定和成熟的信使RNA时受到高度调节并且至关重要，该信使RNA能够在蛋白质合成过程中进行翻译。线粒体mRNA和叶绿体mRNA不加帽。为了进行连接，mRNA可能首先需要脱帽，然后在5’端磷酸化。图示见图7。合适的脱帽酶是本领域技术人员已知的。图6示出了包含5’帽的mRNA未连接的情况。

用于执行方法的合适条件的示例描述于上表2和实施例2中。

在根据上述方法的一个实施方式中，还包含将ATP依赖性DNA连接酶与包含单链断裂的双链核酸分子一起温育，以在少于6小时内，例如在少于1小时内，例如在少于45分钟内，或优选在30钟内，例如在15分钟内以，达到至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的多核苷酸的连接。

在上述方法的一个替代实施方式中，3’-羟基-脱氧核糖核酸分子被固定在珠子上或还包含捕获标签(优选生物素)或衍生核苷酸(例如染料，优选荧光染料)，其中所述珠子、捕获标签或者衍生化核苷酸连接到所述脱氧核糖核酸分子的5’端。

用于检测连接产物的测定是本领域技术人员已知的。检测连接产物的传统方法的例子包括变性凝胶电泳、序列扩增和解链曲线分析。

实施例

现在将参照上述图和表7的生物序列通过非限制性实施例来描述本发明。

本发明的ATP依赖性DNA连接酶(L13)是通过基于序列的宏基因组方法挖掘候选连接酶的公共数据库而发现的。如上所述，本发明的DNA连接酶最初分离自克罗诺杆菌噬菌体CR9，并且其DNA和蛋白质序列可从NCBI参考序列：YP_009015226.1获得。根据本发明的进一步优选的ATP依赖性DNA连接酶是DNA连接酶L13的同源DNA连接酶，其与L13连接酶具有至少70％的氨基酸序列同一性并且最初分离自：克罗诺杆菌噬菌体CR8并且其DNA和蛋白质序列可以获自NCBI参考序列：YP_009042486.1(L13rel1)；最初分离自果胶杆菌噬菌体phiTE并且其DNA和蛋白质序列获自NCBI参考序列：YP_007392649.1(L13rel2)；最初分离自不动杆菌噬菌体ABPH49并且其DNA和蛋白质序列可获自NCBI参考序列：AXN57775.1(L13rel4)。

实施例1克隆、表达和纯化

将选择的序列进行密码子优化以用于在大肠杆菌中表达，克隆到具有C-末端His-标签的表达载体pVB-1A0B1(Vectron Biosolutions)中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

克隆

使用GeneOptimizer algorithm(Raab,D.,Graf,M.,Notka,F.,

T.,&Wagner,R.(2010).The GeneOptimizer Algorithm:Using a sliding window approachto cope with the vast sequence space in multiparameter DNA sequenceoptimization.Systems and Synthetic Biology,4(3),215–225.http://doi.org/10.1007/s11693-010-9062-3)并使用来自Thermo Fisher Scientific的GeneArt基因合成服务订购，将L13的编码序列或L13rel1、L13rel2、L13rel3或L13rel4中任一项的编码序列进行密码子优化以用于在大肠杆菌中表达。在基因编码序列的两侧添加了编码C末端GSG接头和His标签的附加序列信息，然后是终止密码子、N末端PciI和NdeI限制性位点以及用于下游克隆方法的C末端XhoI限制性位点。NdeI和XhoI限制性位点用于克隆到表达载体pVB-1A0B1(Vectron Biosolutions,Trondheim,Norway)中。pVB载体家族由专有大肠杆菌表达载体骨架组成，该骨架基于具有XylS/Pm表达盒的RK2质粒，该表达盒包含可被甲苯酸诱导的启动子。源自恶臭假单胞菌TOL质粒pWW0的XylS/Pm调节剂/启动子系统被广泛用于调节大肠杆菌(E.coli)和其他细菌中基因和基因簇的低水平和高水平重组表达，并在Gawin,A.et al.,The XylS/Pm regulator/promoter system and its use in fundamentalstudies of bacterial gene expression,recombinant protein production andmetabolic engineering,Microb.Biotechnol.,2017,Vol.10,No.4,p 702-718中进行了描述。

DNA连接酶的表达和纯化

将选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15或SEQ ID No.18中的密码子优化的核酸分子克隆到来自Vectron Biosolutions的表达载体pVB-1A0B1中，并且转化到BL21(DE3)细胞中。使所述细胞在具有Terrific Broth(TB)培养基的2.5LUltra Yield(Thomson)烧瓶中生长；将1％过夜预培养物转移到含有100μg/ml氨苄青霉素的1L TB培养基中，并且在37℃、220rpm下温育，直到OD600达到5-6。使温度降至15℃，并且当温度≤20℃时，用2mM甲苯酸诱导细胞。将细胞温育过夜(ON)，通过离心收获并在-20℃冷冻。

向冷冻细胞沉淀物中加入裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(25℃下pH8.5)、10mM咪唑、0.5M NaCl、5mM MgCl₂、0.5％Tween 20、5％甘油、1mg/ml溶菌酶和400U/ml HL-SAN)至OD600为120，并在15℃下以90rpm温育过夜。将裂解物以20 000g离心20分钟并在纯化前过滤。

第一个纯化步骤是使用装有33.4ml Ni-琼脂糖6FF的HiScale 26/20柱进行的。在施用裂解物后，用IMAC洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl(在25℃下pH 7.5)、20mM咪唑、5mMMgCl₂和0.5M NaCl)洗涤柱，然后用增加浓度的咪唑进行洗脱。在第二个纯化步骤中，使用填充有34.5ml Q-琼脂糖FF树脂的HiScale 26/20柱。在施用来自第一个纯化步骤的稀释洗脱液后，用Q洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5(25℃)和50mM KCl)洗涤柱，并使用Q-洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5(25℃)、10mM MgCl₂和0.2M NaCl)从柱上洗脱His-标记的L13酶。将纯化的L13连接酶最终储存在10mM Tris-HCl pH 7.5(25℃)、0.3M KCl、5mMMgCl₂、0.2mg/ml BSA和50％甘油中。

实施例2A用于测量底物特异性的连接酶活性测定

实验装置

可以根据Bullard and Bowater(Bullard,D.R.,&Bowater,R.P.(2006).Directcomparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases frombacteriophage T4.The Biochemical Journal,398(1),135–144)的程序来测定连接酶对不同底物的活性。使用双链底物并基于Bullard and Bowater 2006中描述的修改设置进行了分析连接活性的体外测定。寡核苷酸购自Metabion(德国)。通过使用30μM每种寡核苷酸的溶液，将一个8-聚体核酸寡核苷酸和一个12-聚体核酸寡核苷酸退火至互补的20-聚体核酸模板寡核苷酸来产生双链底物。退火步骤在100μl TE缓冲液(10mM Tris/HCl,pH 8,和0.5mM EDTA)中进行，并且将包含三种寡核苷酸的缓冲液加热至95℃ 5分钟并在室温下冷却16小时。8-聚体寡核苷酸的5’核苷酸残基用荧光素染料分子6-FAM(IUPAC名称3′,6′-二羟基螺[异苯并呋喃-1(3H),9′-[9H]氧杂蒽]-3-酮；CAS号2321-07-5)，并且12-聚体寡核苷酸包含5’-单磷酸化核酸残基。每个双链底物仅由核糖核酸寡核苷酸或仅由脱氧核糖核酸寡核苷酸或者核糖核酸寡核苷酸和脱氧核糖核酸寡核苷酸的混合物表示，导致总共八种不同的双链底物组合物，如下表3和图3a和3b中所示。

8-聚体寡核苷酸*)

5’-GGCCAGTG-3’(SEQ ID No.4)

12-聚体寡核苷酸*)

5’-AATTCGAGCTCG-3’(SEQ ID No.5)

20-聚体寡核苷酸*)

5’-CGAGCTCGAATTCACTGGCC-3’(SEQ ID No.6)

RNA寡核苷酸中的T被U替代。

表3用于制备带缺口底物的寡核苷酸组合

将带缺口的双链20个碱基对(bp)底物用于测量如图3a所示每种酶的连接活性的体外测定终点。所有连接反应中使用的缓冲液包含55mM Tris/HCl(pH 7.4)、10mM MgCl₂、10.5mM DTT 25mM KCl和1mM ATP。终点连接反应如下进行：70pmol的连接酶、45pmol如上所述的双链寡核酸底物，总体积为5μl。将反应混合物在30℃下温育30分钟，然后使用5μl甲酰胺终止溶液(95％甲酰胺、10mM EDTA、溴酚蓝)终止。在实验结束时，将样品加热至95℃ 5分钟，并在变性条件下在20％聚丙烯酰胺-脲凝胶1X TBE(89mM Tris、89mM硼酸和2mM EDTA)上进行分析。使用Bio-Rad Pharos系统在凝胶上将反应产物可视化，见图3b。使用ImageLab(BioRad)进行量化。

如图1b所示，分析了L13 DNA连接酶与其他市售连接酶相比的连接活性。令人惊讶的是，L13 DNA连接酶是唯一能够高效连接底物8(S8)中的单链断裂的连接酶。底物S8对所测试的市售连接酶来说是一种较差的底物。

实施例2B对替代S8样底物的连接酶活性测定

测试了L13 DNA连接酶对另一种S8底物的连接活性。将包含具有SEQ ID No 19、20和21的序列的带有切口的双链43个碱基对(bp)底物用于测量L13连接活性的体外测定终点中。所有连接反应中使用的缓冲液包含50mM Tris/HCl(pH 7.5)、10mM MgCl₂、10mM DTT、<46mM KCl和0.1mM ATP。终点连接反应如下进行：不同量的L13连接酶、9pmol如上所述的双链寡核苷酸核酸底物，总体积为10μl。将反应混合物在25℃下温育15分钟，然后使用5μl甲酰胺终止溶液(95％甲酰胺，10mM EDTA，溴酚蓝)终止。在实验结束时，将样品加热至95℃ 5分钟，并在变性条件下在20％聚丙烯酰胺-脲凝胶1X TBE(89mM Tris、89mM硼酸和2mMEDTA)上进行分析。使用Bio-Rad Pharos系统在凝胶上将反应产物可视化。使用ImageLab(BioRad)进行量化。

下表3中描述了来自所述实验的结果，其清楚地表明，与实施例2A相比，L13连接酶也能够高效地连接包含不同核酸序列的双链DNA-RNA杂合体中的缺口。

替代的S8底物

20-聚体5’-FAM-标记的DNA寡核苷酸

5’-GGCCAGTGAATTCGAGCTCG-3’(SEQ ID No.19)

23-聚体RNA寡核苷酸5’-P

5'-P-ACUGAUAGAAGUUCCCGAAACAG-3’(SEQ ID No.20)

43-聚体DNA寡核苷酸

5’-CTGTTTCGGGAACTTCTATCAGTCGAGCTCGAATTCACTGGCC-3’(SEQ ID No.21)

表3

实施例3L13、L13rel1、L13rel2、L13rel3和L13rel4的连接酶活性

在这个实施例中，测试了本发明的不同连接酶的连接酶活性。结果如表4和表5所示，并且表明L13、L13rel1、L13rel2和L13rel4酶在S8底物上具有相似的连接效率，即在跨越连接点的DNA分子存在下将DNA分子连接到RNA分子的5’-端。

表4

测定条件1：50mM Tris/HCl pH 7.5，10mM MgCl₂，10mM DTT，25mM KCl，1mM ATP，11.4pmol连接酶，9pmol S8底物，总体积为20μl。在30℃下温育30分钟。

测定条件2：50mM Tris/HCl pH 7.5，10mM MgCl₂，10mM DTT，25mM KCl，1mM ATP，7pmol连接酶，18pmol S8底物，总体积为20μl。在25℃下温育15分钟。

表5

	％连接	pmol连接的底物
			阴性对照	1.8	0.32
L13	73.0	13.2
			L13rel1	65.2	11.7
L13rel2	71.2	12.8
			L13rel3	24.5	4.4
L13rel4	69.8	12.6

测定条件：50mM Tris/HCl pH 7.5，10mM MnCl₂，10mM DTT，25mM KCl，1mM ATP，11.4pmol连接酶，18pmol S8底物，总体积为20μl。在25℃下温育15分钟。

实施例4与牛痘DNA连接酶相比，L13 DNA连接酶的连接酶活性

将本发明的L13 DNA连接酶的功效与来自现有技术的牛痘病毒的DNA连接酶进行比较(牛痘DNA连接酶的蛋白质序列描述于NCBI数据库登录号YP_233058.1中)。表6描述了实验的结果。使用18pmol根据实施例2a的S8底物；包含MnCl₂或MgCl₂的连接缓冲液和20μl的反应体积测试了酶活性。连接在25℃下进行15分钟，并且计算了％连接的底物和转化率。

表6

表6中提供的数据清楚地表明，与牛痘DNA连接酶相比，在跨越连接点的DNA分子存在下，在将DNA分子连接到RNA分子的5’端方面，L13是更有效的连接酶(对于底物S8，参见实施例2)。

表7

序列表

<110> 阿克蒂克塞姆股份有限公司(ArcticZymes)

<120> 连接酶

<130> P27155PC00

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 458

<212> PRT

<213> L13野生型氨基酸序列

<400> 1

Met Ser Asn Val Thr Ser Ile Leu Ala Glu Leu Ser Ala Thr Arg Ser

1 5 10 15

Leu Lys Glu Lys Glu Ala Ile Leu Arg Ala Asn Ala Asp Asn Asp Gly

20 25 30

Leu Lys Gln Ala Phe Gln Ile Ala Tyr Ser Lys Glu Leu Asn Phe Phe

35 40 45

Val Arg Gly Leu Lys Val Gln Ser Leu Pro Gly Leu Arg Ser Leu Ser

50 55 60

Glu Ser Val Glu Met Leu Val Lys Asn Ile Ala Gly Arg Val Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Asp Asp Ala Lys Ser Tyr Met Thr Gln Leu Val Gln Thr Cys Glu

85 90 95

Glu Pro Asp Thr Leu Leu Lys Ile Ile Asn Arg Asp Leu Glu Cys Gly

100 105 110

Ile Gln Thr Thr Leu Thr Asn Lys Val Trp Lys Asp Leu Ile Thr Glu

115 120 125

Pro Pro Tyr Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Lys Glu Asp Leu Leu Arg Lys

130 135 140

Phe Asn Tyr Lys Gly Ala Phe Ser Asp Glu Lys Met Asp Gly Leu Tyr

145 150 155 160

Ala Asp Ile Met Val Trp Pro Glu Gln Val Ile Tyr Arg Ser Arg Ser

165 170 175

Gly Lys Glu Leu Asn Phe Arg Ala Pro Glu Asn Val Glu Arg Ala Leu

180 185 190

Met Lys Ala Ala Val Ala Glu Asp Gly Thr Ala Lys Pro Tyr Val Ala

195 200 205

His Gly Glu Gly Leu Val Ile Asp Pro Asp Gly Leu His Gly Val Met

210 215 220

Glu Arg Ala Glu Gly Asn Gly Tyr Leu Asn Gln Asp Pro Glu Asp Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Arg Val Arg Leu Val Ile Trp Asp Arg Val Thr Met Asp

245 250 255

Glu Tyr Ile Ala Arg Lys Ser Lys Arg Pro Tyr Ser Glu Arg Arg Leu

260 265 270

Ser Ala Gln Gly Leu Ala Trp Trp Val Glu Asp Pro Asp His Met Gln

275 280 285

Phe Val Lys Gly Arg Gln Ile Asn Ser Leu Lys Glu Ala Ile Asp His

290 295 300

Phe Ile Glu Met Arg Leu Gln Lys Lys Glu Gly Thr Val Leu Lys Glu

305 310 315 320

Ala Glu Met Pro Trp Gly Asp Asn Lys Thr Lys Lys Gly Val Lys Leu

325 330 335

Lys Asn Glu Phe Asp Val Asp Leu Val Val Val Gly Thr Thr Pro His

340 345 350

Lys Lys Asp Pro Ala Leu Ile Gly Ser Leu Ile Cys Gln Thr Arg Asp

355 360 365

Gly Leu Leu Glu Val Gly Val Gly Ser Gly Leu Thr Asp Ala Leu Arg

370 375 380

Lys Lys Pro Ala Glu Tyr Phe Ile Gly Gln Ile Ile Thr Ile Lys Ala

385 390 395 400

Asn Asp Ile Thr Lys Ser Glu Thr Lys Glu Leu Gln Ser Leu Phe Leu

405 410 415

Pro Arg Leu Asn Tyr Lys Phe Val Glu Ile Arg Met Asp Lys Thr Val

420 425 430

Ala Asn Ser Leu Pro Glu Val Ile Glu Ala Ser Asp Ser Leu Leu Asp

435 440 445

Leu Leu Arg Ala Ile Ala Glu Asp Leu Glu

450 455

<210> 2

<211> 467

<212> PRT

<213> 包含His-标签的L13氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Asn Val Thr Ser Ile Leu Ala Glu Leu Ser Ala Thr Arg Ser

1 5 10 15

Leu Lys Glu Lys Glu Ala Ile Leu Arg Ala Asn Ala Asp Asn Asp Gly

20 25 30

Leu Lys Gln Ala Phe Gln Ile Ala Tyr Ser Lys Glu Leu Asn Phe Phe

35 40 45

Val Arg Gly Leu Lys Val Gln Ser Leu Pro Gly Leu Arg Ser Leu Ser

50 55 60

Glu Ser Val Glu Met Leu Val Lys Asn Ile Ala Gly Arg Val Tyr Thr

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Gly Asp Asp Ala Lys Ser Tyr Met Thr Gln Leu Val Gln Thr Cys Glu

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Ile Gln Thr Thr Leu Thr Asn Lys Val Trp Lys Asp Leu Ile Thr Glu

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Pro Pro Tyr Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Lys Glu Asp Leu Leu Arg Lys

130 135 140

Phe Asn Tyr Lys Gly Ala Phe Ser Asp Glu Lys Met Asp Gly Leu Tyr

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Ala Asp Ile Met Val Trp Pro Glu Gln Val Ile Tyr Arg Ser Arg Ser

165 170 175

Gly Lys Glu Leu Asn Phe Arg Ala Pro Glu Asn Val Glu Arg Ala Leu

180 185 190

Met Lys Ala Ala Val Ala Glu Asp Gly Thr Ala Lys Pro Tyr Val Ala

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210 215 220

Glu Arg Ala Glu Gly Asn Gly Tyr Leu Asn Gln Asp Pro Glu Asp Ile

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Asp Arg Asn Arg Val Arg Leu Val Ile Trp Asp Arg Val Thr Met Asp

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Ser Ala Gln Gly Leu Ala Trp Trp Val Glu Asp Pro Asp His Met Gln

275 280 285

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Phe Ile Glu Met Arg Leu Gln Lys Lys Glu Gly Thr Val Leu Lys Glu

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Lys Asn Glu Phe Asp Val Asp Leu Val Val Val Gly Thr Thr Pro His

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ggaacagcga agccatacgt tgctcacggc gaaggtctgg ttattgatcc ggacggcctg 660

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<212> DNA

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<212> RNA

<213> 12-mer RNA寡核苷酸

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<212> DNA

<213> 20-mer DNA寡核苷酸

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<211> 455

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Leu Lys Gln Ala Phe Ala Val Ala Tyr Ser Lys Glu Leu Asn Phe Phe

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Ala Ile Ala Glu Asp Leu Glu

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<210> 8

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<212> PRT

<213> 具有His-标签的L13Rel1氨基酸序列

<400> 8

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Leu Lys Glu Lys Glu Ala Ile Leu Arg Ala Asn Ala Asp Asn Asp Gly

20 25 30

Leu Lys Gln Ala Phe Ala Val Ala Tyr Ser Lys Glu Leu Asn Phe Phe

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165 170 175

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180 185 190

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Leu Val Arg Leu Val Ile Trp Asp Ile Val Thr Met Glu Glu Tyr Ile

245 250 255

Ala Arg Lys Ser Lys Thr Asp Tyr Ala Asp Arg Arg Ile Glu Ala Asp

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Leu Leu Val Gln Glu Val Asp Arg Arg Tyr Asn Phe Arg Met Val Thr

275 280 285

Gly Arg Lys Ile Asn Ser Leu Lys Glu Ala Ile Asp His Phe Ile Glu

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Pro Trp Gly Asp Asn Lys Thr Lys Lys Gly Val Lys Leu Lys Asn Glu

325 330 335

Phe Asp Val Asp Leu Glu Val Val Ala Thr Thr Pro His Lys Lys Asp

340 345 350

Pro Ser Leu Val Gly Ala Leu Ile Cys Arg Thr Arg Asp Gly Leu Leu

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Thr Lys Ser Glu Thr Lys Glu Leu Gln Ser Leu Phe Leu Pro Arg Leu

405 410 415

Asn Tyr Lys Phe Val Glu Ile Arg Met Asp Lys Thr Lys Ala Asn Ser

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Leu Glu Glu Val Ile Glu Ala Ser Asp Ser Leu Leu Asp Leu Leu Arg

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Ala Ile Ala Glu Asp Leu Glu Gly Ser Gly His His His His His His

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<212> DNA

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<210> 10

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Leu Lys Glu Lys Glu Ala Ile Leu Arg Ala Asn Ala Asp Asn Asp Gly

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Leu Lys Gln Ala Phe Ala Val Ala Tyr Ser Lys Glu Leu Asn Phe Phe

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Thr Gly Asp Asp Ala Lys Ser Tyr Met Thr Gln Leu Val Gln Thr Cys

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Lys Phe Asn Tyr Lys Gly Ala Phe Ser Asp Glu Lys Met Asp Gly Leu

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Tyr Ala Asp Ile Met Val Trp Pro Glu Gln Val Ile Tyr Arg Ser Arg

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Asp Gly Lys Glu Leu Asn Phe Arg Ala Pro Glu Asn Val Glu Arg Ala

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Leu Met Gln Ala Ala Val Asp Asp Asp Gly Thr Ala Lys Pro Tyr Val

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Ile Asp Arg Asn Arg Val Arg Leu Val Ile Trp Asp Tyr Val Thr Met

245 250 255

Asp Glu Tyr Ile Val Arg Lys Ser Lys Arg Pro Tyr Ile Ser Arg Arg

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Leu Ser Ala Gln Gly Leu Ala Ala Trp Val Glu Asp Lys Glu His Met

275 280 285

Gln Phe Val Lys Gly Arg Lys Ile Asn Ser Leu Lys Glu Ala Ile Asp

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His Phe Ile Glu Val Arg Leu Gln Lys Lys Glu Gly Thr Val Leu Lys

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Glu Ala Asp Met Pro Trp Gly Asp Asn Lys Thr Lys Lys Gly Val Lys

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Leu Lys Asn Glu Phe Asp Val Asp Leu Glu Val Val Gly Thr Ile Arg

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His Lys Lys Asp Pro Ala Leu Ile Gly Ser Leu Ile Cys Gln Thr Arg

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<210> 11

<211> 468

<212> PRT

<213> 具有His-标签的L13Rel2氨基酸序列

<400> 11

Met Ser Asn Val Thr Ser Ile Leu Ala Glu Leu Ser Ala Thr Arg Ser

1 5 10 15

Leu Lys Glu Lys Glu Ala Ile Leu Arg Ala Asn Ala Asp Asn Asp Gly

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Leu Lys Gln Ala Phe Ala Val Ala Tyr Ser Lys Glu Leu Asn Phe Phe

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His Phe Ile Glu Val Arg Leu Gln Lys Lys Glu Gly Thr Val Leu Lys

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Glu Ala Asp Met Pro Trp Gly Asp Asn Lys Thr Lys Lys Gly Val Lys

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Leu Lys Asn Glu Phe Asp Val Asp Leu Glu Val Val Gly Thr Ile Arg

340 345 350

His Lys Lys Asp Pro Ala Leu Ile Gly Ser Leu Ile Cys Gln Thr Arg

355 360 365

Asp Gly Leu Leu Glu Val Gly Val Gly Ser Gly Leu Thr Asp Ser Leu

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Arg Lys Lys Pro Ala Glu Phe Phe Ile Gly Gln Ile Ile Thr Ile Lys

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Ala Asn Asp Ile Thr Lys Ser Glu Thr Lys Glu Leu Gln Ser Leu Phe

405 410 415

Leu Pro Arg Leu Asn Tyr Lys Phe Val Glu Ile Arg Met Asp Lys Thr

420 425 430

Val Ala Asn Ser Leu Pro Glu Val Ile Glu Ala Ser Asp Ser Leu Leu

435 440 445

Gly Leu Leu Arg Ala Ile Ala Glu Asp Leu Glu Gly Ser Gly His His

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His His His His

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<212> DNA

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atgtcaaacg taacgagtat tctcgcagag ttgtctgcaa cccgatccct gaaggagaag 60

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tattccaaag aactgaactt tttcgtccga ggactgcggg ttcccttctt cacggctggt 180

cttactccgc tgtctgaaag cgtggatctg ctggtgaaga acatcgcagg gcgagtttac 240

acgggcgatg atgcgaagtc gtacatgact caactggtac agacctgcga ggagccgggc 300

acacttctga agatcatcaa ccgagatctg gagtgcggca tccagacaac tctgaccaac 360

aaggtgtgga aggatctggt cacggagcct ccgtaccaga gctataccct gttcaaagag 420

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gatggcacag caaaaccata cgtagctcac ggtgaaggtc tggttattga tccgaatggc 660

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gtccgtaagt ccaagcgacc gtacatcagt cgtcgtctgt cagcgcaggg cctcgccgca 840

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gaggcaatcg accacttcat cgaggtgcgt ctccagaaga aagaggggac ggtcctcaaa 960

gaggcagaca tgccgtgggg cgacaacaag acgaagaaag gtgtcaagtt gaagaatgag 1020

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ggatccctaa tctgccaaac tcgtgatggg ttattggagg ttggtgttgg ttctggactt 1140

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gcaaacgaca tcacgaagtc ggagactaaa gagcttcagt cgctgttcct gccccgcctc 1260

aactacaagt tcgttgagat ccgcatggac aagaccgttg caaacagcct accggaagtg 1320

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<211> 457

<212> PRT

<213> L13Rel3氨基酸序列

<400> 13

Met Lys Lys Val Val Asp Ile Ile Lys Glu Leu Arg Ser Thr Ser Ser

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Arg Asn Glu Lys Glu Ala Ile Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asn Glu Thr

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Leu Lys Lys Val Phe Tyr Leu Ala Tyr Asp Pro Ser Ile Asn Phe Tyr

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Ile Lys Ser Ile Pro Tyr Glu Asp Asn Trp Lys His Gly Glu Tyr Phe

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Glu Tyr Asp Glu Asn Asp Glu Phe Glu Ile Leu Phe Asp Val Leu Glu

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Thr Ile Tyr Ser Arg Glu Leu Thr Gly Asn Lys Ala Ile Ser Phe Leu

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Thr Gly Val Leu Ser Glu Arg Ser Thr Glu Met Gln Glu Leu Ile Cys

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Leu Pro Asp Asn Val Glu Glu Lys Leu Leu Asn Leu Ser Gln Phe Ser

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210 215 220

Ser Phe Thr Glu Phe Glu Glu Arg Lys Ile Gly Asn Gly Tyr Leu Asn

225 230 235 240

Ser Asp Glu Ser Asp Pro Gly Lys Val Val Ile Val Ile Trp Asp Val

245 250 255

Val Gly Ile Asp Glu Tyr Asn Asn Arg Lys Ser Thr Glu Asp Tyr Ser

260 265 270

Glu Arg Phe Asn Leu Val Glu Lys Ile Val Glu Tyr Val Asp Thr Pro

275 280 285

His Val Gln Met Val Glu Ser Arg Phe Cys Asn Ala Thr Gln Asp Val

290 295 300

Ile Asp His Phe Val Glu Ser Arg Ser Lys Gly Met Glu Gly Thr Val

305 310 315 320

Ile Lys Ser Pro Lys Leu Lys Trp Lys Asp Gly Lys Val Lys Asp Gly

325 330 335

Leu Lys Leu Lys Asn Glu Phe Val Val Glu Met Lys Ile Ile Gly Phe

340 345 350

Gln Glu His Ser Lys Arg Ser Gly Gln Ile Gly Ala Ile Phe Val Glu

355 360 365

Ser Glu Asp Gly Val Val Lys Cys Lys Val Gly Ser Gly Leu Thr Asp

370 375 380

Ala Gln Arg Lys Lys Phe Phe Leu Thr Gln Asp Glu Met Ile Gly Lys

385 390 395 400

Ile Val Thr Val Lys Gly Asn Asp Leu Val Thr Asn Glu Leu Lys Gln

405 410 415

Asp Arg His Ser Val Phe Leu Pro Arg Phe Val Glu Val Arg Asp Asp

420 425 430

Lys Thr Val Ala Asp Met Phe Asp Lys Ile Met Ala Thr Lys Asp Ser

435 440 445

Ile Ile Asp Leu Leu Lys Asn Ile Lys

450 455

<210> 14

<211> 466

<212> PRT

<213> 具有His-标签的L13Rel3氨基酸序列

<400> 14

Met Lys Lys Val Val Asp Ile Ile Lys Glu Leu Arg Ser Thr Ser Ser

1 5 10 15

Arg Asn Glu Lys Glu Ala Ile Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asn Glu Thr

20 25 30

Leu Lys Lys Val Phe Tyr Leu Ala Tyr Asp Pro Ser Ile Asn Phe Tyr

35 40 45

Ile Lys Ser Ile Pro Tyr Glu Asp Asn Trp Lys His Gly Glu Tyr Phe

50 55 60

Glu Tyr Asp Glu Asn Asp Glu Phe Glu Ile Leu Phe Asp Val Leu Glu

65 70 75 80

Thr Ile Tyr Ser Arg Glu Leu Thr Gly Asn Lys Ala Ile Ser Phe Leu

85 90 95

Thr Gly Val Leu Ser Glu Arg Ser Thr Glu Met Gln Glu Leu Ile Cys

100 105 110

Asn Ile Val Lys Lys Asp Leu Asp Cys Gly Val Gln Thr Thr Thr Ile

115 120 125

Asn Lys Ile Trp Lys Gly Leu Ile Thr Asp Pro Pro Tyr Met Gly Tyr

130 135 140

Gln Leu Phe Ser Glu Lys Leu Ile Lys Ser Phe Lys Leu Pro Cys Tyr

145 150 155 160

Ser Gln Ile Lys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Asp Val Phe Val Met Lys

165 170 175

Asp Ser Val Ser Tyr Arg Ser Arg Ser Gly Ile Asn Cys Lys Phe Lys

180 185 190

Leu Pro Asp Asn Val Glu Glu Lys Leu Leu Asn Leu Ser Gln Phe Ser

195 200 205

Asp Val Glu Phe Val Leu His Cys Glu Ala Leu Val Arg Lys Gly Glu

210 215 220

Ser Phe Thr Glu Phe Glu Glu Arg Lys Ile Gly Asn Gly Tyr Leu Asn

225 230 235 240

Ser Asp Glu Ser Asp Pro Gly Lys Val Val Ile Val Ile Trp Asp Val

245 250 255

Val Gly Ile Asp Glu Tyr Asn Asn Arg Lys Ser Thr Glu Asp Tyr Ser

260 265 270

Glu Arg Phe Asn Leu Val Glu Lys Ile Val Glu Tyr Val Asp Thr Pro

275 280 285

His Val Gln Met Val Glu Ser Arg Phe Cys Asn Ala Thr Gln Asp Val

290 295 300

Ile Asp His Phe Val Glu Ser Arg Ser Lys Gly Met Glu Gly Thr Val

305 310 315 320

Ile Lys Ser Pro Lys Leu Lys Trp Lys Asp Gly Lys Val Lys Asp Gly

325 330 335

Leu Lys Leu Lys Asn Glu Phe Val Val Glu Met Lys Ile Ile Gly Phe

340 345 350

Gln Glu His Ser Lys Arg Ser Gly Gln Ile Gly Ala Ile Phe Val Glu

355 360 365

Ser Glu Asp Gly Val Val Lys Cys Lys Val Gly Ser Gly Leu Thr Asp

370 375 380

Ala Gln Arg Lys Lys Phe Phe Leu Thr Gln Asp Glu Met Ile Gly Lys

385 390 395 400

Ile Val Thr Val Lys Gly Asn Asp Leu Val Thr Asn Glu Leu Lys Gln

405 410 415

Asp Arg His Ser Val Phe Leu Pro Arg Phe Val Glu Val Arg Asp Asp

420 425 430

Lys Thr Val Ala Asp Met Phe Asp Lys Ile Met Ala Thr Lys Asp Ser

435 440 445

Ile Ile Asp Leu Leu Lys Asn Ile Lys Gly Ser Gly His His His His

450 455 460

His His

465

<210> 15

<211> 1374

<212> DNA

<213> L13Rel3 cDNA

<400> 15

atgaaaaagg ttgtagatat tattaaagaa cttcgttcga cttcttctcg taatgagaag 60

gaagcaatct tgactacaaa taaagacaat gaaaccctaa agaaagtttt ctaccttgct 120

tatgacccga gtatcaactt ttatattaaa agtattccat atgaagataa ttggaaacac 180

ggggaatatt ttgagtatga tgagaatgat gagtttgaga ttttgtttga tgttcttgaa 240

acaatttact ctcgtgaact gacagggaat aaagcaattt cttttttgac tggtgttttg 300

tcagaacggt caactgagat gcaagaacta atttgcaata ttgtcaagaa agatttggat 360

tgtggtgtcc agacaactac aattaataaa atatggaaag gcttgattac cgatccgcca 420

tatatgggtt atcagttgtt cagtgaaaaa ctaattaaaa gtttcaaact tccgtgttac 480

tcacaaatta aacttgatgg tctgtatgct gacgtatttg taatgaaaga ttctgttagt 540

tatcgttcac gaagtggtat taattgcaag ttcaaacttc cagataatgt agaagaaaaa 600

cttcttaatt tgtcacagtt cagcgatgtt gaatttgtcc tacactgcga ggctcttgtc 660

cgcaaaggtg agagttttac agagtttgag gaacgcaaaa ttggcaatgg atacttgaat 720

agtgatgaat ctgatccagg gaaagttgtt attgttatct gggatgttgt tggtattgat 780

gaatataaca atcgtaagtc aacagaagat tatagtgaac gttttaatct tgtagaaaag 840

attgtagaat acgttgacac accgcatgtt cagatggtag aatctcgttt ctgcaatgca 900

acacaagacg tcattgatca ttttgtagaa tcacgttcta aaggcatgga aggaactgta 960

atcaaatcac ctaaacttaa atggaaagat ggtaaagtta aagatggttt gaagctcaaa 1020

aatgaatttg tagttgagat gaaaattatt ggtttccaag aacatagtaa aagatctgga 1080

cagattggtg caatctttgt agaatctgaa gatggtgttg ttaagtgtaa agttggtagt 1140

ggtttgactg atgcacaacg caaaaaattc ttcttgacac aagatgaaat gattggtaag 1200

attgtaacag tgaaaggaaa tgatttggta actaacgaat tgaaacaaga tcgacatagt 1260

gtcttcttgc cacgttttgt tgaagtccgt gatgataaaa ctgttgctga tatgtttgac 1320

aaaattatgg caacaaaaga cagtattatt gatttgttga aaaatattaa ataa 1374

<210> 16

<211> 457

<212> PRT

<213> L13Rel4氨基酸序列

<400> 16

Met Thr Lys Ser Val Thr Glu Ile Leu Asn Glu Leu Arg Ala Thr Ser

1 5 10 15

Ser Lys Asn Glu Lys Glu Arg Ile Ile Arg Glu Asn Ala Asp His Asp

20 25 30

Gly Leu Arg Glu Ala Phe Arg Val Ala Tyr Ser Lys Glu Leu Asn Phe

35 40 45

Phe Val Arg Gly Val Lys Asn Thr Tyr Gln Asn Pro Gly Leu Arg Pro

50 55 60

Leu Ser Asp Ser Ile Asn Asp Leu Val Thr Asn Ile Ala Gly Arg Leu

65 70 75 80

Tyr Thr Gly Asp Glu Ala Lys Ser Tyr Met Gln Gln Leu Ile Gly Leu

85 90 95

Cys Glu Glu Pro Asp Thr Leu Val Ala Ile Ile Asn Arg Asp Leu Glu

100 105 110

Cys Gly Val Gln Thr Thr Ile Thr Asn Lys Val Trp Lys Asp Leu Ile

115 120 125

Thr Glu Pro Pro Tyr Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Thr Glu Lys Leu Leu

130 135 140

Arg Lys Phe Asn Phe Lys Gly Ala Phe Ser Asp Glu Lys Met Asp Gly

145 150 155 160

Leu Tyr Ala Asp Ile Met Val Trp Pro Asp Gln Val Ile Tyr Arg Ser

165 170 175

Arg Ser Gly Lys Glu Leu Asn Phe Arg Ala Pro Gln Ala Val Glu Asp

180 185 190

Ala Leu Met Ser Ala Ala Cys Thr Arg Gly Pro Phe Val Ala His Gly

195 200 205

Glu Gly Leu Val Ile Asp Pro Thr Ala Arg His Gly Val Met Glu Arg

210 215 220

Ala Glu Gly Asn Gly Tyr Leu Asn Gln Asp Pro Glu Asp Ile Asp Arg

225 230 235 240

Asn Arg Val Arg Leu Val Val Trp Asp Met Val Asp Met Asp Asp Tyr

245 250 255

Ile Ala Arg Lys Ser Lys Val Glu Tyr Tyr Ile Arg Arg Asp Asn Thr

260 265 270

Ser Phe Leu Val Ala Glu Val Asp Val Leu Glu His Phe Gln Met Val

275 280 285

Arg Gly Arg Lys Ile Asn Ser Leu Lys Glu Ala Ile Asp His Phe Ile

290 295 300

Glu Met Arg Gln Gln Lys Lys Glu Gly Thr Val Leu Lys Glu Ala Asp

305 310 315 320

Met Leu Trp Gly Asp Asn Lys Thr Lys Lys Gly Ile Lys Leu Lys Asn

325 330 335

Glu Phe Asp Val Asp Leu Glu Val Val Ala Thr Thr Pro His Lys Lys

340 345 350

Lys Glu Gly Trp Val Gly Ala Leu Ile Cys Gln Thr Arg Asp Gly Leu

355 360 365

Leu Glu Val Gly Ala Gly Ser Gly Leu Thr Asp Ala Leu Arg Gly Lys

370 375 380

Ser Pro Asp Tyr Phe Val Gly Gln Ile Ile Thr Ile Lys Ala Asn Asp

385 390 395 400

Ile Thr Lys Ser Glu Thr Lys Glu Leu Gln Ser Leu Phe Leu Pro Arg

405 410 415

Leu Asn Tyr Lys Phe Val Glu Ile Arg Arg Asp Lys Ser Ile Ala Asn

420 425 430

Ser Leu Glu Glu Val Ile Gln Ala Ala Asp Ser Leu Leu Glu Leu Leu

435 440 445

Arg Lys Ile Ala Glu Asp Val Asp Lys

450 455

<210> 17

<211> 466

<212> PRT

<213> 具有His-标签的L13Rel4氨基酸序列

<400> 17

Met Thr Lys Ser Val Thr Glu Ile Leu Asn Glu Leu Arg Ala Thr Ser

1 5 10 15

Ser Lys Asn Glu Lys Glu Arg Ile Ile Arg Glu Asn Ala Asp His Asp

20 25 30

Gly Leu Arg Glu Ala Phe Arg Val Ala Tyr Ser Lys Glu Leu Asn Phe

35 40 45

Phe Val Arg Gly Val Lys Asn Thr Tyr Gln Asn Pro Gly Leu Arg Pro

50 55 60

Leu Ser Asp Ser Ile Asn Asp Leu Val Thr Asn Ile Ala Gly Arg Leu

65 70 75 80

Tyr Thr Gly Asp Glu Ala Lys Ser Tyr Met Gln Gln Leu Ile Gly Leu

85 90 95

Cys Glu Glu Pro Asp Thr Leu Val Ala Ile Ile Asn Arg Asp Leu Glu

100 105 110

Cys Gly Val Gln Thr Thr Ile Thr Asn Lys Val Trp Lys Asp Leu Ile

115 120 125

Thr Glu Pro Pro Tyr Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Thr Glu Lys Leu Leu

130 135 140

Arg Lys Phe Asn Phe Lys Gly Ala Phe Ser Asp Glu Lys Met Asp Gly

145 150 155 160

Leu Tyr Ala Asp Ile Met Val Trp Pro Asp Gln Val Ile Tyr Arg Ser

165 170 175

Arg Ser Gly Lys Glu Leu Asn Phe Arg Ala Pro Gln Ala Val Glu Asp

180 185 190

Ala Leu Met Ser Ala Ala Cys Thr Arg Gly Pro Phe Val Ala His Gly

195 200 205

Glu Gly Leu Val Ile Asp Pro Thr Ala Arg His Gly Val Met Glu Arg

210 215 220

Ala Glu Gly Asn Gly Tyr Leu Asn Gln Asp Pro Glu Asp Ile Asp Arg

225 230 235 240

Asn Arg Val Arg Leu Val Val Trp Asp Met Val Asp Met Asp Asp Tyr

245 250 255

Ile Ala Arg Lys Ser Lys Val Glu Tyr Tyr Ile Arg Arg Asp Asn Thr

260 265 270

Ser Phe Leu Val Ala Glu Val Asp Val Leu Glu His Phe Gln Met Val

275 280 285

Arg Gly Arg Lys Ile Asn Ser Leu Lys Glu Ala Ile Asp His Phe Ile

290 295 300

Glu Met Arg Gln Gln Lys Lys Glu Gly Thr Val Leu Lys Glu Ala Asp

305 310 315 320

Met Leu Trp Gly Asp Asn Lys Thr Lys Lys Gly Ile Lys Leu Lys Asn

325 330 335

Glu Phe Asp Val Asp Leu Glu Val Val Ala Thr Thr Pro His Lys Lys

340 345 350

Lys Glu Gly Trp Val Gly Ala Leu Ile Cys Gln Thr Arg Asp Gly Leu

355 360 365

Leu Glu Val Gly Ala Gly Ser Gly Leu Thr Asp Ala Leu Arg Gly Lys

370 375 380

Ser Pro Asp Tyr Phe Val Gly Gln Ile Ile Thr Ile Lys Ala Asn Asp

385 390 395 400

Ile Thr Lys Ser Glu Thr Lys Glu Leu Gln Ser Leu Phe Leu Pro Arg

405 410 415

Leu Asn Tyr Lys Phe Val Glu Ile Arg Arg Asp Lys Ser Ile Ala Asn

420 425 430

Ser Leu Glu Glu Val Ile Gln Ala Ala Asp Ser Leu Leu Glu Leu Leu

435 440 445

Arg Lys Ile Ala Glu Asp Val Asp Lys Gly Ser Gly His His His His

450 455 460

His His

465

<210> 18

<211> 1371

<212> DNA

<213> L13Rel4 cDNA

<400> 18

atgaccaagt cagtaactga gatccttaac gagctgcgtg caacctcgtc taagaacgaa 60

aaagagcgaa tcatccgtga gaatgctgat catgacggcc tgcgtgaagc atttcgtgta 120

gcttactcga aagagttgaa cttctttgtg cgtggcgtga agaacaccta ccagaacccg 180

ggcctgcgcc ctctttcgga cagcatcaac gatctggtaa cgaacatcgc tggccgcctg 240

tacaccggcg acgaagccaa gtcgtacatg cagcagctga tcggcttgtg tgaagagcct 300

gatacgctgg tggcgatcat caaccgcgat ctggagtgtg gtgtacagac aaccatcacc 360

aacaaagtgt ggaaggacct gatcaccgag cctccgtacc agagctacac gctgttcacc 420

gagaagttgc tgcgtaagtt caacttcaag ggcgctttct ccgatgagaa aatggacggt 480

ctgtatgcag acatcatggt atggcctgat caggttatct atcgctcacg atctggtaaa 540

gagctgaact tccgtgcccc acaggcagtg gaagatgcgc tgatgtcggc ggcctgcact 600

cgaggcccat tcgtggcaca cggtgaaggt ctggttatcg atccgacagc acgtcatggt 660

gttatggaac gtgcagaggg taacggctat ctgaaccaag atcctgaaga catcgaccga 720

aaccgggtcc gacttgttgt ctgggacatg gttgacatgg acgattacat cgcccgcaag 780

tcgaaagtcg aatattacat tcgtcgtgac aacaccagct tcttggttgc agaggtggat 840

gttcttgagc atttccagat ggttcgtggt cgtaagatca acagcctgaa agaggcgatc 900

gaccacttca tcgaaatgcg acagcagaag aaggaaggga cggtactcaa agaagctgat 960

atgttgtggg gtgacaacaa gaccaagaag ggtatcaaac tgaagaatga gtttgacgtc 1020

gatctggaag ttgttgcgac gacacctcac aagaagaagg aaggttgggt gggcgctctg 1080

atctgtcaga cacgtgatgg tctgcttgag gttggtgccg gttctggatt gacagatgca 1140

ctgcgtggca agtcaccaga ctacttcgtc ggccagatca tcacgatcaa ggcgaacgac 1200

atcacgaaat ctgagacgaa agaactccag tctctgttcc tgccacgact caactacaag 1260

tttgttgaga tccgccggga caagagcatc gccaacagtc tggaagaagt tatccaagct 1320

gctgactcac tgctggaact gctgcgtaaa attgcggagg atgtggataa a 1371

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 20-mer DNA寡核苷酸

<400> 19

ggccagtgaa ttcgagctcg 20

<210> 20

<211> 23

<212> RNA

<213> 23-mer RNA寡核苷酸

<400> 20

acugauagaa guucccgaaa cag 23

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 43-mer DNA寡核苷酸

<400> 21

ctgtttcggg aacttctatc agtcgagctc gaattcactg gcc 43

Claims

1.一种分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶活性片段，其中，所述DNA连接酶包含SEQ IDNo.1的氨基酸序列或包含与SEQ ID No.1具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’-端。

2.根据权利要求1所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中，所述DNA连接酶包含与SEQ ID No.1具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中，所述DNA连接酶具有选自以下各项的氨基酸序列：

(a)SEQ ID No.1或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，

(b)SEQ ID No.7或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，

(c)SEQ ID No.10或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，或

(d)SEQ ID No.16或与其至少80％同一性的氨基酸序列，并且

其中所述DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子存在下将3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到5’磷酰基-核糖核酸分子的5’-端。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中，所述DNA连接酶具有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.16和SEQ ID No.17中任一项的氨基酸序列。

5.一种重组核酸分子，编码根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段，或编码包含所述分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段的蛋白质。

6.根据权利要求5所述的重组核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQID No.18的密码子优化序列，或者由SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ IDNo.18或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的密码子优化序列组成。

7.根据权利要求5所述的重组核酸分子，其中，所述核酸分子包含从SEQ ID No.3、SEQID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的简并版本中任一项选择的核酸分子或者由该核酸分子组成。

8.一种载体，包含编码根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段的核酸分子，或者包含根据权利要求5至7中任一项所述的核酸分子或由该核酸分子组成，其中所述载体是重组表达载体、克隆载体、质粒、病毒载体、粘粒、λ噬菌体或细菌人工染色体。

9.一种宿主细胞，包含根据权利要求8所述的载体，其中所述细胞是酵母细胞、昆虫细胞、人类细胞系或细菌细胞。

10.一种组合物，包含根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物还包含缓冲剂，优选所述缓冲剂包含ATP和二价阳离子，其中所述二价阳离子优选为Mn²⁺或Mg²⁺。

12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中，所述组合物是用于施用到包含待连接的核酸分子的样品的溶液。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子、至少一种5’磷酰基-核糖核酸分子和至少一种第二互补脱氧核糖核酸分子，其中所述DNA连接酶能够在跨越连接点的所述至少一种互补脱氧核糖核酸分子存在下将所述至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接至所述至少一种5’磷酰基-核糖核酸分子的5’端。

14.一种用于将脱氧核糖核酸分子连接到核糖核酸分子末端的试剂盒，包含：

a.第一容器，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段、或根据权利要求10所述的组合物；

b.第二容器，其包含包含连接缓冲液，所述连接缓冲液包含ATP和二价阳离子；

c.和可选地第三容器，其包含待连接到5’-磷酰基-核糖核酸分子的5’端的至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子以及至少一种第二脱氧核糖核酸分子，其中所述至少一种第二脱氧核糖核酸分子包含3’区和5’区，其中所述3’区与第一脱氧核糖核酸分子互补，并且所述5’区是与包含已知序列的核糖核酸分子互补的序列或所述5’区是简并的序列以便结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，并且其中所述第一脱氧核糖核酸分子和所述第二脱氧核糖核酸分子可以是预杂交复合物的形式；

d.可选地使用该试剂盒的说明。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含第四容器，其包含待连接到3’-羟基-核糖核酸分子的3’端的至少一种第一5’-磷酰基-脱氧核糖核酸分子，以及至少一种第二脱氧核糖核酸分子，其中所述至少一种第二脱氧核糖核酸分子包含3’区和5’区，其中所述5’区与所述第一5’-磷酰基-脱氧核糖核酸分子互补，并且所述3’区是与包含已知序列的核糖核酸分子互补的序列或所述3’区是兼并的序列以便结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，并且其中所述第一5’-磷酰基-脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核分子可以是预杂交复合物的形式。

16.一种用于连接双链核酸分子中单链断裂的方法，其中，所述方法包括使所述包含单链断裂的双链核酸分子与根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段或根据权利要求10或11所述的组合物接触。

17.一种用于连接双链核酸分子中单链断裂的方法，其中，所述方法包括在允许3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到双链核酸分子中5’-磷酰基核糖核酸分子的5’端的条件下，使所述包含单链断裂的双链核酸分子与根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段或根据权利要求10所述的组合物接触，其中所述3’-羟基-脱氧核糖核酸分子和所述5’-磷酰基核糖核酸与跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子复合。

18.一种用于连接双链核酸分子中单链断裂的方法，其中，所述方法包括在允许5’磷酰基-脱氧核糖核酸分子连接到双链核酸分子中核糖核酸分子的3’-端的条件下，使所述包含单链断裂的双链核酸分子与根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段或根据权利要求10所述的组合物接触，其中所述5’磷酰基-脱氧核糖核酸分子和所述核糖核酸分子与跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子复合。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中，所述包含单链断裂的双链核酸分子包含在样品中，其中所述样品还包含ATP和二价阳离子，优选Mn²⁺或Mg²⁺。

20.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段或根据权利要求10所述的组合物的用途，其用于RNA 5’-端衔接子连接，用于捕获已知或未知序列的RNA分子，用于将在包含启动子元件和/或翻译增强子元件的cDNA分子合成中用作模板的DNA元件连接到RNA分子5’端以进行体外转录。

21.一种将脱氧核糖核酸分子连接到核糖核酸分子的5’端和3’端的方法，其中，所述方法包括：

a.提供包含核糖核酸分子的群体的样品，其中所述核糖核酸分子中的一个或多个包含5’-磷酰基-末端基团和3’-羟基-末端基团；

b.在至少一种第二脱氧核糖核酸存在下，将至少一种第一3’-羟基-脱氧核糖核酸分子连接到核糖核酸分子的5’端，其中所述至少一种第二脱氧核糖核酸分子包含3’区和5’区，其中所述3’区与第一脱氧核糖核酸分子互补并且所述5’区是与包含已知序列的核糖核酸分子互补的序列或所述5’区是简并的序列以便结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，并且其中所述第一脱氧核糖核酸分子和所述第二脱氧核糖核酸分子可以是预杂交复合物的形式；和

c.在包含3’区和5’区的至少一种附加第二脱氧核糖核酸存在下，将至少一种其他5’磷酰基-脱氧核糖核酸分子连接到步骤b中核糖核酸分子的3’-端，其中所述5’区与所述5’磷酰基-脱氧核糖核酸分子互补，并且所述3’区是与步骤b中包含已知序列的核糖核酸分子互补的序列，或者所述3’区是简并的序列以便结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，并且其中所述5’磷酰基-脱氧核糖核酸和所述附加第二脱氧核糖核酸分子可以是预杂交复合物的形式；并且

其中，步骤b和c中的连接反应由根据权利要求1至3中任一项所述的ATP依赖性连接酶或权利要求9或权利要求中的组合物催化，并且其中步骤b和c中的连接反应同时或依次进行。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述样品还包含ATP和二价阳离子，优选Mn²⁺或Mg²⁺。