LT5263B - Grandines specifiškai nikuojančių endonukleazių konstravimo iš restrikcijos endonukleazių būdas - Google Patents
Grandines specifiškai nikuojančių endonukleazių konstravimo iš restrikcijos endonukleazių būdas Download PDFInfo
- Publication number
- LT5263B LT5263B LT2004109A LT2004109A LT5263B LT 5263 B LT5263 B LT 5263B LT 2004109 A LT2004109 A LT 2004109A LT 2004109 A LT2004109 A LT 2004109A LT 5263 B LT5263 B LT 5263B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- nicking
- endonuclease
- gene
- dna
- plasmid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 101710147059 Nicking endonuclease Proteins 0.000 title claims description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 112
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 105
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 56
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 55
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 46
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 45
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 27
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 27
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 21
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 claims 1
- 230000036319 strand breaking Effects 0.000 claims 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 abstract 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 84
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 83
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 83
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 27
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 25
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 17
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 5
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108010093801 endodeoxyribonuclease BstNBI Proteins 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 102220029238 rs72554332 Human genes 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 230000027151 SOS response Effects 0.000 description 2
- 241000187560 Saccharopolyspora Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 1
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108090000656 Annexin A6 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101150090405 Fi gene Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N Vesnarinone Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)N1CCN(C=2C=C3CCC(=O)NC3=CC=2)CC1 ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 108010052141 endodeoxyribonuclease SapI Proteins 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 235000019239 indanthrene blue RS Nutrition 0.000 description 1
- UHOKSCJSTAHBSO-UHFFFAOYSA-N indanthrone blue Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=C4NC5=C6C(=O)C7=CC=CC=C7C(=O)C6=CC=C5NC4=C3C(=O)C2=C1 UHOKSCJSTAHBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150009839 lacF gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000016434 protein splicing Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 102220050626 rs193920968 Human genes 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 108010040614 terminase Proteins 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Būdai, skirti konstravimui naujų grandinei specifinių nikuojančių endonukleazių, pasinaudojant plazmidžių bibliotekos, turinčios atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną, praturtinimu in vivo. Plazmidės turi gretimą genui skaldomą arba nikuojamą seką, skaldymui arba nikavimui geno endonukleazės produktu ir antrąją atpažinimo vietą antrajai endonukleazei. Plazmidžių biblioteka naudojama nemodifikuotų ląstelių-šeimininkių transformavimui. Plazmidės iš išaugintų transformuotų ląstelių gali būti analizuojamos in vitro būdu dėl nikavimo, nikuotos plazmidės surenkamos ir naudojamos transformuoti ląsteles-šeimininkes. Produktas po to surenkamas ir nustatomas endonukleazės viengrandis specifiškumas. Produktas arba klonuojamas po amplifikacijos, arba identifikuojamas, naudojant selektyvų markerį.
Description
Yra daugiau negu 240 II tipo restrikcijos endonukleazių su unikaliomis savybėmis, atrastų kaip iš bakterinių, taip ir iš virusinių šaltinių. Tačiau komerciškai yra gaunami tik septyni nikuojantys fermentai: N.BstNBI, N.AhvI, N.BbvCIA (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA); N.BpulOI (Fermentas Ine., Hanover, MD); ir N.CviQXI (CviNY2A) ir N.CviPII (CviNYSI) (Megabase Research Products, Lincoln, NE (www.cvienzymes.com). Yra tam tikras skaičius fago koduojamų nikuojančių fermentų, pavyzdžiui bakteriofago .fi II geno produktas (gpll), kuris yra būtinas virusinės DNR replikacijai. II geno produktas įveda trūkį (+) grandinėje, tuo inicijuodamas riedančio rato replikaciją. Jis taip pat dalyvauja perkeltosios (+) grandinės ligavime, generuojant viengrandę faginę DNR (Geider et ai., J. Biol. Chem. 257:6488-6493 (1982); Higashitani et ak, J. Mol. Biol 237:388-400 (1994). gpll baltymas ir egzonukleazė III gali būti bendrai naudojami viengrandės DNR gavimui, kuri naudojama mutagenezei ir kaip matrica naujos DNR grandinės sintezei in vitro.
Yra trys pagrindiniai specifiškai DNR grandines nikuojančių fermentų gavimo šaltiniai. Vienas iš jų - nikuojančių fermentų atrinkimas iš Chlorella algae viruso lizatų, iš kurių buvo pradžioje išskirtiN.CviQXI (CviNY2A) ir N.CviPII (CviNYSI) (Zhang Y. et ak Virology, 240:366-375 (1998); Xia Y. et ak Nucl. Acids Res. 16:9471-9487 (1988)). Antrasis šaltinis - bakterijos, kuriose atrasti natūraliai pasitaikantys nikuojantys fermentai N.BstNBI ir N.BstSEI (Morgan R.D. et ak Biol. Chem. 381:1123-5 (2000); Abdurashitov, et ak, Mol. Biol. (Mosk) 30:1261-1267 (1996). Trečiasis šaltinis - nikuojančių fermentų gavimas baltymų inžinerijos būdu iš egzistuojančių HA tipo restrikcijos fermentų.
Sekanti klasifikacija yra skirtingų II tipo restrikcijos endonukleazių potipių apibrėžtys (Roberts R. J. et ak Nucl. Acids Res. 31:1805-1812 (2003)):
HA tipo endonukleazėms būdingos asimetrinės DNR atpažinimo sekos. Kirpimo vieta gali būti atpažinimo sekos viduje arba išorėje (už) atpažinimo sekos. Pavyzdžiai yra BsmI (GAATGC 1/-1, viršutinė grandinė kerpama per vieną bazę už atpažinimo sekos, apatinė grandinė kerpama atpažinimo sekoje), AciI (CCGC -3/-1), BssSI (CACGAG -5/-1) ir SapI (GCTCTTC 1/4). Svarbiausiai, HA tipas apima IIG, IIH, IIS ir IIT restrikcijos endonukleazių tipus. Todėl daugelis fermentų patenka daugiau negu į vieną potipį. Pavyzdžiui, SapI gali būti identifikuotas kaip IIA arba IIS tipo fermentas.
IIS tipo restrikcijos endonukleazės turi asimetrines atpažinimo sekas ir DNR kerpa šių atpažinimo sekų išorėje, t.y. kerpa nuo 1 iki 20 bazių atpažinimo sekų išorėje. Pavyzdžiai yra BsmAI (GTCTC 1/5), &znBI (CGTCTC 1/5), Fokl (GGATG 9/13) ir SapI (GCTCTTC 1/4).
IIG tipo restrikcijos endonukleazės turi sulietus endonukleazės ir metilazės domenus. Tuo būdu, IIG tipo fermentai turi ir endonukleazinį ir metilazinį aktyvumus ir šie aktyvumai gali būti stimuliuojami pridedant S-adenozilmetionino. IIG tipo fermentų DNR atpažinimo sekos gali būti simetrinės arba asimetrinės. Pavyzdžiai yra Bpml (CTGGAG 16/14) ir BseRI (GAGGAG 10/8). IIG tipo fermentai gali taip pat priklausyti IIA arba IIS tipams.
IIH tipo restrikcijos endonukleazių genetinė organizacija panaši į I tipo restrikcijosmodifikacijos sistemą. Atpažinimo seka gali būti simetrinė arba asimetrinė. Pavyzdžiai yra Begi (10/12 CGAN5TGC 12/10) (SEQ ID NO:27) ir Bael (10/15 ACN4GTAYC 12/7) (SEQ ID NO:28).
IIT tipo restrikcijos endonukleazės yra heterodimerai arba tetramerai (2X heterodimerai). Atpažinimo sekos gali būti simetrinės arba asimetrinės. Pavyzdžiai yra BpulOI (CCTNAGC -5/-2) ir BslI (CCN7GG) (SEQ ID NO:29).
Būtų pageidautina sukonstruoti didelę įvairovę nikuojančiu endonukleazių, išvestų iš restrikcijos endonukleazių su asimetrinėmis atpažinimo sekomis, kurių daugiau kaip 79 IIA tipo endonukleazės žinomos su unikaliomis savybėmis, (http://rebase.neb.com/rebase/).
Dauguma šių IIA tipo restrikcijos-modifikacijos sistemų yra klonuotos ir ekspresuotos heterologiškuose šeimininkuose (Rebase). Tuo būdu daugumos IIA tipo restrikcijos fermentų baltymų seka yra žinoma, nors asimetrinio kirpimo mechanizmas paaiškintas tik nedideliam kiekiui fermentų, dalinai IIT tipui. Likusių IIA tipo fermentų (kur fermentai yra atviro skaitymo rėmelio produktai) dominuojantis kirpimo mechanizmas iki šiol yra neaiškus.
Racionaliai suprojektuoti metodai pritaikyti tam tikriems fermentams, kurių pradinės turimos žinios apie dimerizacijos domenus yra tokios, kad gali būti pasiektas domenų atskyrimas. Domenų atskyrimas priklauso nuo santykinai didelio aminorūgščių sekos panašumo tarp planinio fermento varianto ir natūraliai atsiradusio nikuojančio fermento. Pavyzdžiui, Xu et ai. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:12990-12995(2001) gavo nikuojantį fermentą N.AlvvI domenų atskyrimu tarp Alwl ir homologiško, natūraliai atsiradusio nikuojančio fermento N.BstNBI (GAGTCNNNNAN, (SEQ ID NO:30), A žymi trūkio poziciją). Sukonstruotas fermentas N.AiwI negali būti suformuotas iš homodimero ir vien tik nikuoja viršutinęDNR grandinę kaip monomeras.
Besnier et ai. EMBO Report 2:782-786 (2001); ir Kong et ai. U.S. Patentas Nr. 6395523 naudojo kryptingą mutagenezę Mly viršutinę grandinę nikuojančio varianto sukonstravimui, remdamasis aukštu panašumo laipsniu su natūraliai pasitaikančiu nikuojančių fermentu N.BstNBI.
Stahl F. et ai. Proc. Nathl. Acad. Sci. USA, 93:6175-80 (1996) išskyrė nikuojantį fermentą iš II tipo restrikcijos endonukleazės EcoRV (kurioje natyvus fermentas formuoja homodimerus ir atpažįsta simetrinę seką GAT/ATC). EcoRV nikuojantis fermentas buvo pagamintas sujungiant subvienetą, turintį neaktyvų katalitinį saitą, su antru subvienetu, turinčiu DNR prisirišimo defektą. Tačiau tokie EcoRV variantai yra nespecifiniai tuo atžvilgiu, kuri grandinė yra nikuojama ir tuo būdu tokių mutantų taikymas DNR manipuliacijoms yra labai apribotas. Priešingai, Heiter et ai. (U.S. patento paraiška 20030100094) ir Janulaitis et ai. (EP 1176204 Al) inaktyvavo heterodimerinio fermento vieno subvieneto katalitinį centrą, ko pasėkoje buvo gauta nikuojanti endonukleazė. Tačiau šis principas yra ribotas IIT tipo fermentams su aiškiai išreikštomis ir išsaugotomis katalitinėmis vietomis.
Priešingai aukščiau aprašytiems būdams, Heitman ir Model aprašė EcoRI restrikcijos endonukleazės atsitiktinę mutagenezę (Heitman J. And Model P., EMBO J. 9:3369-3378 (1990)), kad būtų nustatyta substrato atpažinimo liekamoji reikšmė . Be jokios nikuojančių variantų selekcijos Heitman et ai. atsitiktinai identifikavo nikuojančio aktyvumo variantą (Heitman J. And Model P., Proteins 7:185-197 (1990)).
IŠRADIMO SANTRAUKA
Išradimo įgyvendinime, grandinę specifiškai nikuojančių endonukleazių konstravimo būdui numatyti sekantys etapai: a) ląstelių- šeimininkių, neturinčių metilazinės apsaugos prieš restrikcijos endonukleazes, transformacija plazmidžių biblioteka, turinčia atsitiktinai mutuotą geną, koduojantį restrikcijos endonukleazę, plazmidės įskaitant sekos vietą išorėje geno, kurią skaldo geno koduojama endonukleazė, ir b) transformantų auginimą, plazmidžių išskyrimą iš jų ir fakultatyvaus in vitro atrinkimo, kurios plazmidės turi nikuotąDNR. Be to būdas apima plazmidžių skaldymą su iš anksto nustatyta grandinę specifiškai nikuojančia endonukleaze. Šios endonukleazės nikavimo vieta yra skirtinga seka, negu atsitiktinai mutagenizuotų restrikcijos endonukleazių kirpimo vieta. Kadangi nikuojančios endonukleazės kerpa priešingą grandinę, negu mutagenizuota restrikcijos endonukleazė, susidaro du lipnūs galai. Reversinis pradmuo, kuris komplementarūs lipniam galui šalia geno, arba yra identiškas lipnaus galo daliai arba visam lipniam galui, naudojamas geno amplifikavimui kartu su tiesioginiu pradmeniu, einančiu prieš geną. Amplifikuotas produktas po to klonuojamos. Arba kitaip, atrenkamas žymėtasis genas gali būti įterptas tarp dviejų lipnių galų plazmidės, kuri po to transformuojama į ląstelę ir identifikuojama selektyvioje terpėje. Sukonstruota nikuojanti endonukleazė taigi, yra gaunama abiem aukščiau aprašytais metodais.
Nikuojantis fermentas gali nikuoti vieną arba daugiau DNR dupleksų, RNR/DNR hibridą ir RNR dupleksą. Ląstelės-šeimininkės gali būti pasirinktos iš bet.kurių bakterijų, naudojamų rekombinantinių restrikcijos endonukleazių ekspresijai. Tinkami promotoriai yra parinkti tokie, kad būtų gaunamas norimas ekspresijos lygis. Plazmidžių biblioteka gali būti sudaryta iš vienos rūšies plazmidžių arba daugybės skirtingų plazmidžių. Kiekviena plazmidė gali turėti vieną atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną arba apimti daugiau negu vieną geną koduojančius daugybę fermentų arba subvienetų.
Metodo įgyvendinimas apima restrikcijos endonukleazės geno mutagenizavimą suformuojant delecįją ar inserciją arba vieno ar daugiau nukleotidų pakeitimą. Ypatingai, mutagenizuotas genas gali turėti vieną arba daugybę mutacijų. Mutagenizuotas genas gali turėti delecijąnuo 3 iki 600 nukleotidų ribose.
Išradimo įgyvendinimo metodas apima atrinkimą arba įterpimą restrikcijos endonukleazės kirpimo vietos sekos už geno plazmidėje. Po to kai ląstelės-šeimininkės, turinčios plazmidžių biblioteką išauginamos, transformantai bendrai sukaupiami ir plazmidės, išskirtos iš šios sankaupos, analizuojamos nustatant plazmidžių koduojamų nikuojančių endonukleazių specifiškumą grandinėms. Nikuojančių endonukleazių išskyrimo efektyvumas gali būti sustiprintas praturtinimo pakopa, kuria plazmidinė DNR išskiriama iš transformantų sankaupos, atskyrus nikuotąDNR nuo superspiralizuotos ir linijinės DNR. Šis atskyrimas gali būti vykdomas elektroforeze agarozės gelyje arba tankio centrifugavimu. Modifikuotos E. coli ląstelės transformuojamos nikuota plazmidinė DNR ir plazmidės iš šių transformantų arba patys transformantai padalinami į dvi sankaupas taip, kad vieną sankaupą būtų galima testuoti, nustatant viršutinės grandinės skilimo aktyvumą o kitą sankaupą nustatant apatinės grandinės skilimo aktyvumą
Nikuojančios endonukleazės kirpimo specifiškumo grandinei priklausomybę galima nustatyti liguojant viengrandžius adapterius su iš anksto nustatytais lipniais galais. Lipnus galas, prie kurio prisijungia adapteris, susiformuoja, jeigu antroji kirpimo vieta nustatyta iš anksto yra viršutinėje plazmidės grandinėje ir ekspresuotą nikuojanti endonukleazė nikuoja apatinę grandinę. Panašiai, jeigu antroji numatyta skilimo vieta yra apatinėje plazmidės grandinėje, gali būti atrinktos ekspresuotos nikuojančios endonukleazės, kurios nikuoja viršutinę grandinę.
DNR, atitinkanti geną, koduojantį nikuojančią endonukleazę su apibrėžtu viengrandžiu nikavimo aktyvumu, gali būti amplifikuota naudojant pradmenis, kurie hibridizuojasi su sekomis į kitą pusę nuo geno, pavyzdžiui su seka prieš geną ir viengrandžiu adapteriu arba kur pradmuo prieš geną yra iš esmės identiškas viengrandžio adapterio sekos daliai.
Įgyvendinant išradimą, pageidautina mutacija ūkuojančioje endonukleazėje, nustatoma sekvenuojant sukonstruotą nikuojančią endonukleazę pagal aukščiau aprašytą metodą, gali būti įvesta kryptingos mutagenezės būdu į restrikcijos endonukleazės izošizmerą arba neošizomerą, taip gaunant nikuojančią endonukleazę. Analogiškai sukonstruotos nikuojančios endonukleazės nikuojantis aktyvumas gali būti sustiprintas arba dvigrandės DNR skilimo aktyvumas sumažintas kryptingos mutagenezės būdu įvedant pageidautiną mutaciją.
Įgyvendinant išradimą, numatytas būdas, kuriame mutagenizuotas restrikcijos endonukleazės genas yra IIA tipo endonukleazės genas. Nikuojanti endonukleazė yra termostabili nikuojanti endonukleazė.
Įgyvendinant išradimą, numatytas būdas grandinei specifinės nikuojančios endonukleazės konstravimui, kuris apima: ląstelių-šeimininkių transformaciją plazmidėmis, turinčiomis atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną, ląsteles-šeiminikes stokojančias apsauginio metilinimo; viengrandžio adaptoriaus ligavimą su sukauptomis plazmidėmis, išskirtomis iš išaugusių transformantų nustatymui, kuri plazmidė koduoja restrikcijos endonukleazės viršutinės arba apatinės grandinės variantą; mutagenizuotos restrikcijos endonukleazės geno amplifikavimą ląstelių-šeiminikių transformavimui; nustatymą kuri ląstelė-šeimininkė turi nikuojantį aktyvumą ir jos nikuojantį fenotipą; gavimą sukonstruotos grandinei specifinės nikuojančios endonukleazės.
Įgyvendinant būdą, restrikcijos endonukleazė yra SapI, iš kurios išskirtos sukonstruotos nikuojančios endonukleazės yra Nt.SapI ir Nb.SapI.
Įgyvendinant išradimą, metodas numatytas įvedimui vieno arba daugiau vietos specifinių trūkių į iš anksto parinktas DNR duplekso grandines, metodas apima DNR duplekso hidrolizę su nikuojančią endonukleaze palankiomis nikavimo aktyvumui sąlygomis.
TRUMPAS FIGŪRŲ APRAŠYMAS
Fig. 1 parodyta ekspresijos vektoriaus pSAPV6, naudojamo nikuojančio fermento SapI klonų atrinkimui, polilinkerio seka. Pakopos apima: (a) atsitiktinai mutuotos SapI endonukleazės bibliotekos paruošimas pSAPV6, kurioje yra pACYCT7-ter su modifikuotu polilinkeriu; (b) E. coli kamieno transformacija, kuriame esminė laukinio tipo SapI klono ekspresija žudo ląsteles; (c) išaugusių kolonijų surinkimas ir plazmidinės DNR išskyrimas; (d) plazmidžių bibliotekos frakcionavimas elektroforeze agarozės gelyje ir nikuotų plazmidžių išskyrimas; (e) plazmidžių telkinio padalijimas į 2 grupes ir hidrolizė su N.BvbCI A arba SapI nikuotų plazmidžių ištiesinimas ir specifinių iškyšų gavimas B; (f) viengrandžio adapterio ligavimas su iškyša; ir (g) darbas su viršutinei ir apatinei grandinei specifiškos grandinės amplifikacijos strategija.
Fig. 2 parodyta amplifikavimo strategijos apatinei grandinei specifiškų SapI nikuojančio fermento klonų atrinkimo schema. Pakopos apima: (a) ligavimo adapterį su 4 bazių iškyša; (b) Klionovo užpildymo reakcijos panaudojimas; (c) nesuliguoto adapterio pašalinimas, naudojant Spin kolonėlę; (d) PGR amplifikacija; (e) amplifikacijos produkto klonavimas į pSAPV6; (f) T7 ekspresijos kamieno, apsaugoto SapI metilinimu, transformacija; ir (g) ekstraktų nikuojančio aktyvumo tyrimas.
Fig. 3 parodyta amplifikavimo strategijos viršutinei grandinei specifiškų SapI nikuojančio fermento klonų atrinkimo schema.
Fig. 4 parodyta pradinis Nb.SapI (33 variantas) išskyrimas. Nikuojantis aktyvumas yra parodomas inkubuojant ląstelių ekstraktą su superspiralizuota pUC19. M takelis yra lkb DNR diagrama, kurioje yra gerai matoma 3 kb juosta. Nikuota pUC19 forma migruoja aukščiau už 3 kb. 33 takelis turi žymų lygįnikuotos pUC19, išskirtos iš 33 varianto ekstrakto. Kiti takeliai turi tipišką lygį nikuotos pUC19, gautos nespecifiniu nikuojančiu aktyvumu. 39 variantas parodo dvigrandį kirpimo aktyvumą.
Fig. 5 parodyta išvalyto Nb.SapI (33 variantas) titravimas naudojant substratu superspiralizuotą pUC19. M takelis yra lkb DNR diagrama, kurioje 3 kb juosta yra gerai matoma. 1 takelyje yra neperkirpta pUC19. 2 takelyje pUC19 linearizuota SapI pagalba. 3-8 takeliuose buvo inkubuojama atitinkamai su 4, 2, 1, 0,5, 0,25 ir 0,125 vienetais Nb.SapI (33 variantas) 60 min 37°C temperatūroje.
Fig. 6 parodyta Nb.SapI (33 variantas) nikavimo vietos patvirtinimas “run-off’ sekvenavimo metodu. Substratas pUC19 buvo nikuotas su išvalyta 33 varianto dauguma. Nikuotas žiedinis DNR produktas buvo išvalytas iš gelio ir sekvenuotas, naudojant pradmenį, kuris susieina su SapI kirpimo vieta. Taq DNR polimerazė prideda adenino bazę (A) pradmens prailginimo produkto gale (DNR transferazinis aktyvumas, nepriklausomas nuo matricos).
Fig. 7 parodo Nt.SapI pradinio išskyrimo variantus, turinčius E250K pakeitimą. Nikuojamntis aktyvumas atskleidžiamas inkubuojant mažėjantį tūrį ląstelių ekstrakto su superspiralizuota pUC19. Klonai Nr. 2, 9, 11, 15 ir 18 buvo sekvenuoti, tam, kad būtų surasti dažni pakitimai K80E, E250K ir K273R. M takelyje yra 1 kb DNR diagrama, kurioje gerai matoma 3 kb juosta. Nikuota pUC19 forma juda > 3 kb.
Fig. 8 Nt.SapI (E250K) aktyvumo tyrimas. Nikuojantis aktyvumas parodomas inkubuojant mažėjantį ląstelių ekstrakto kiekį su superspiralizuota pUC19. M takelis yra 1 kb DNR diagrama, kurioje gerai matoma 3kb juosta. 1 takelyje yra neperkirpta pUC19. 2 takelyje - SapI linearizuota pUC19. 3-8 takeliuose buvo atitinkamai inkubuota su 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 ir 0.0625 μΐ Nt.SapI 60 min. 37° C temperatūroje.
Fig. 9. parodo “run-off” sekvenavimą, kuriuo nustatoma Nt.SapI (E250K) nikavimo vieta. pUC19 substratas buvo nikuojamas ląstelių ekstraktu, turinčiu E250K variantą. Nikuotos žiedinės DNR produktas buvo išvalytas iš gelio ir sekvenuotas, naudojant pradmenį, kuris susieina su SapI kirpimo vieta. Taq DNR polimerazė prideda adeniną (A) DNR gale (DNR transferazinis aktyvumas, nepriklausomas nuo matricos).
Fig. 10 parodyta laukinio tipo sapIR geno iš Saccharopolyspora rūšies nukleotidų seka (SEQ ID NO:23) ir atitinkama aminorūgščių seka (SEQ ID NO:24).
Fig. 11 parodyta Nb.SapI (33 variantas) aminorūgščių seka (SEQ ID NO:25).
Fig. 12 parodyta Nt.SapI (E250K variantas) aminorūgščių seka (SEQ ID NO:26).
DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
Šio išradimo įgyvendinimas leidžia kvalifikuotam specialistui sukonstruoti sekai specifinius ir viršutinei ar apatinei grandinei specifinius DNR nikuojančius fermentus iš egzistuojančių HA tipo restrikcijos endonukleazių, turinčių asimetrines atpažinimo sekas.
Metodas apima sukūrimą plazmidžių bibliotekos, kurioje plazmidės turi vieną ar daugiau atsitiktinai mutagenizuotų restrikcijos endonukleazės genų, kur genas ar genai koduoja fermentus arba subvienetus. Biblioteka nebūtinai turi turėti plazmidžių tipų mišinį ir/arba daugybę atsitiktinai mutagenizuotų restrikcijos endonukleazių.
Bakterijos yra transformuotos plazmidžių biblioteka ir in vivo įvyksta griežta genetinė atranka, kuria restrikcijos endonukleazę ekspresuojančios plazmidės yra letalios (mirtinos) ląstelėms-šeimininkėms, jeigu įvestos į kamieną neturintį giminingos metilinimo apsaugos ir kame yra pasiekiamas atitinkamas ekspresijos lygis.
Genetinė atranka gali būti įvykdyta vienos arba daugiau in vitro atrankų metu, kad būtų pasiekta galutinė plazmidžių biblioteka, kurioje dominantis nikuojančių fermentų klonas yra praturtintas ir dėl to lengvai išskiriamas iš bibliotekos ribotu bibliotekos patikrinimu. Genetinė atranka teikia pirmenybę faktui, kad HA tipo fermentas yra toksiškas ląstelėmsšeimininkėms, nesant apsauginio metilinimo.
Nikuojančių endonukleazių griežta genetinė atranka yra galima čia, kadangi bakterinio genomo integralumas yra labiau išlaikomas po vienos grandinės perkirpimo nikuojančia endonukleaze, palyginus su dvigubos grandinės perkirpimu restrikcijos endonukleaze. Taigi, ląstelės, ekspresuojančios nikuojantį fermentą yra labiau gyvybingos (išlieka gyvos). Išlikusios ląstelės surenkamos ir iš jų išskiriamos plazmidės. Pirmoji fakultatyvi atranka in vitro atliekama plazmidės frakeionuojant elektroforezės agarozės gelyje būdu arba ultracentrifuguojant tankio gradiente.
Kadangi plazmidės yra konstruojamos turėti mažiausiai vieną strategiškai nustatytą substrato vietą gretimą restrikcijos arba nikuojančios endonukleazės vietai, tokie plazmidžių klonai, ekspresuojantys nikuojančius fermentus, gali būti nikuoti. Nikuotos DNR migracija agarozės gelyje yra žymiai sulėtėjusi, palyginus su nenikuota superspiralizuota forma. Arba kitaip, naudojant centrifugavimą cezio chlorido tankio gradiente nikuotos ir superspiralizuotos plazmidės po keleto valandų centrifugavimo migruos į skirtingas pozicijas. Nikuotų plazmidžių atskyrimas nuo superspiralizuotų pasiekiamas pirmajame plazmidžių bibliotekos praturtinimo in vitro etape.
Po to, kai išskiriama plazmidinė DNR atitinkanti nikuotą t.y. atvirą apskritimo formą DNR perkirpimui in vitro naudojama antroji endonukleazė. Antroji endonukleazė gali būti nikuojantis fermentas arba restrikcijos fermentas ir ši substrato vieta yra strategiškai lokalizuota gretimai pirmosios nikavimo vietos (dominančios substrato vietos).
Pirmiausiai, endonukleazės skėlimo reakcija in vitro linearizuoja plazmidinę DNR ir sukuria iš anksto numatytus lipnius galus, kurie tarnauja kaip rankenos. Galutinėje in vitro stadijoje šie lipnūs galai panaudojami specifiniam tokių DNR klonų atrinkimui, kurie ekspresuoja arba viršutinę arba apatinę grandinę nikuojančių fermentų variantus. Jeigu lipnūs galai yra per trumpi pradmens priklausomai amplifikacijai (mažiau negu 4 nukleotidai), gali būti prijungtas adaptorius. Tada DNR gali būti amplifikuojama bet kuria iš galimų amplifikavio techniką tokių kaip polimerazinės grandinės reakcija (PGR), helikazės priklausoma amplifikacija (HDA) arba grandinės priklausoma reakcija (SDA). Galiausiai, bibliotekos elementai transformuojami į bakterijas prieš tai modifikuotas apsauginiu metilinimu ir nikuojantys fermentai superekspresuojami taip, kad ląstelių ekstraktuose gali būti tiriamas nikuojantis aktyvumas. Kai nikuojantis variantas yra išskirtas, grandinės ir sekos specifiškumas patvirtintas ir nustatoma ištisa klono seka. Aminorūgščių pakeitimai, esantys kiekviename variante funkciškai analizuojami, nustatant jų poveikį į nikuojančios endonukleazės specifiškumą ir nikavimo aktyvumą.
Kai reikalinga, variantas optimizuojamas testuojant kitus pakeitimus pozicijose, manomai reikšmingus nikuojančiam fenotipui. Aminorūgščių pakeitimas endonukleazėje, gaunant nikuojantį aktyvumą gali būti įvestas į izošizomerą neošizomerą arba į fermentą su gimininga aminorūgščių seka.
Genų bibliotekos ekspresijos atitinkamas lygis yra paprastai optimizuojamas vadovaujantis preliminariu laukinio tipo endonukleazės klono tyrimu.
Dalinai metodas yra įgyvendinamas naudojant SapI (žr. pavyzdžius). IIS tipo endonukleazė SapI buvo modifikuota sukuriant grandines specifiškai nikuojančias endonukleazes. Buvo išskirtas SapI variantas, kuris daugiausia nikuoja apatinę grandinę ir pavadintas Nb.SapI 33 variantas. Be to, buvo išskirta keletas SapI variantą kurie išimtinai nikuoja viršutinę grandinę. Labiausiai aktyvus viršutinės variantas buvo nustatytas palyginimo būdu ir surastas aminorūgšties pakeitimas E250K ir pavadintas Nt.SapI.
Naujų nikuojančiu endonukleazių konstravimo metodo įgyvendinimas apima vieną arba daugiau sekančių žingsnių:
1. Ekspresijos vektoriaus (plazmides) modifikavimas
Atitinkamas ekspresijos vektorius yra parenkamas pagal tai, koks restrikcijos endonukleazės kirpimo vietų dažnis bus modifikuojamas bakterijos genome. Pavyzdžiui, restrikcijos endonukleazei, kuri yra dažnai kerpanti, pageidautina parinkti vektorių su sumažintu kopijų skaičiumi ir/arba santykinai silpnu promotoriumi, kadangi nikuojantis endonukleazės variantas, kuris yra atsitiktinės mutagenezės produktas, priešingu atveju gali sukelti toksinį efektą atsirandantį dėl didelio trūkių skaičiaus. Pavyzdžiui, T7 promotorius gali būti naudojamas šeimininke, kuris neturi T7 RNR polimerazės. Vėlesniame veiksmų plane, minimalaus ekspresijos lygio tikimasi iš ištisinio nuskaitymo transkripcijos nuo kitų promotorią esančių vektoriuose. Vis dėlto, gali būti pageidautina varijuoti vektoriausšeimininko derinį kad būtų gauta padidinta ekspresija. 2-ame pavyzdyje SapI ekspresija nuo T7 promotoriaus ne T7 šeimininke, buvo nepakankama genetinės selekcijos pakopai. Taigi, vektorius su T7 promotoriumi buvo ekspresuojamas šeimininke, turinčiame T7 RNR polimerazę.
Be T7 promotoriaus, yra daugybė promotorių ir plazmidžių, turinčių pasirinktinai promotorius, kurie yra publikuoti ir/arba komerciškai prieinami. Atitinkama plazmidė gali būti pasirinkta numatytų charakteristikų pagrindu, kad būtų sukonstruota norima nikuojanti endonukleazė ir jos nikuojantis aktyvumas. Tai gali būti nesunkiai apibrėžta be pernelyg didelių eksperimentinių tyrimų aprašytų dėl SapI, kuriuose atsitiktinai mutuota restrikcijos endonukleazė įterpiama į pasirinktą plazmidę transformacijai į ląsteles-šeimininkes. Ląstelės gali būti surenkamos ir ištiriamos nikuojančios formos ir nustatomas preliminarių pakopų lyginamasis efektyvumas.
Kita aplinkybė vektoriaus konstravime yra substrato kirpimo vietų skaičius ir išsidėstymas. Kad būtų maksimizuotas genetinės atrankos pakopos efektyvumas, vektorius neturi turėti substrato kirpimo vietos replikacijos srityje ir esminių vektoriaus funkcijų atviro skaitymo rėmeliuose. Pavyzdžiui, endonukleazės genas neturėtų turėti substrato kirpimo vietos, pavaldžios ekspresuojamos endonukleazės kirpimui. Substrato kirpimo vietos buvimas, kaip aprašyta aukščiau, gali interferuoti su informacinės RNR molekulių transkripcija.
Pateiktame įgyvendinime atitinkamas ekspresijos vektorius yra modifikuotas įterpiant restrikcijos endonukleazės atpažinimo seką (substrato kirpimo vietą) už genų bibliotekos klonavimo vietos. (Žiūr. fig. 1). Šios DNR substrato vietos strategine padėtimi ekspresijos vektoriuje sudaro sąlygas tokių klonų selekcijai, kurie ekspresuoja endonukleazės variantus, kurie yra pajėgūs nikuoti kiekvienas savo ekspresijos vektorių in vivo.
Antroji, alternatyvi nikavimo vieta gali būti įterpta šalia dominančios substrato sekos, kad skaldymas su antruoju nikuojančiu fermentu sukurtų dvigrandį trūkį su iš anksto numatytais lipniais galais. Šie nustatyti lipnūs galai tokiu būdu įgalina atranką in vitro tokių mutuotų endonukleazės genų, kurie ekspresuoja kirpimo vietai specifines ir grandinei specifines nikuojančias endonukleazes. Šie nustatyti lipnūs galai taip pat gali būti gaunami dvigrandžio skėlimo metu šalia dominančios nikavimo vietos. Šiuo atveju mažas viengrandis DNR fragmentas bus produkuojamas, linearizavus ekspresijos vektorių. Trumpas viengrandis DNR (ssDNR) fragmentas išsisklaido ir pašalinamas iš DNR bibliotekos, kad būtų išvengta trukdymų tolimesniuose molekulinės atrankos žingsniuose. Trumpos ssDNR pašalinimas gali būti atliktas gryninimu iš agarozės gelio arba spin kolonėlės procedūra, kaip aprašyta 1 ir 2 pavyzdžiuose.
2. Mutantinės endonukleazių bibliotekos sukūrimas
Mutantinė endonukleazės biblioteka yra sukuriama vienu iš žinomų metodų. Pavyzdžiui, endonukleazės geno mutagenezė gali būti atlikta:
(a) Turinti polinki i klaidas PGR (Leung, et ak, Technique 1:11-15 (1989), Cadwell and Joyce, PCR Methods Applic., 2:28-33 (1992)).
(b) Oligonukleotidų kryptinga mutagenezė. geriau PGR persidengiančio pratęsimo mutagenezės metodas (Morrison ir Desrosiers, Biotechniques 14:454-457 (1993)).
c) Surinkimo PGR. Terminas „surinkimo PGR“ remiasi procesu, kuris apima PGR produkto surinkimą iš mažų DNR fragmentų mišinio. Didelis skaičius skirtingų PGR reakcijų vyksta lygiagrečiai tame pačiame tūryje, su vienai reakcijai parengtais produktais su kitos reakcijos produktais.
d) Lytinė PGR mutagenezė. Šis terminas “lytinė PGR mutagenezė” (taip pat žinoma kaip “DNR purtymas”) remtasi homologine rekombinacija tarp skirtingų, bet labai susijusių DNR sekų in vitro, sukelta DNR molekulių atsitiktinio fragmentavimo, išplaukiančio iš sekų homologijos, paremta krosoverio fiksacija pradmens prailginimo PGR reakcijos metu.
e) Kasetės mutagenezė. Terminas “kasetės mutagenezė” nurodo bet kokį dvigrandės DNR molekulės mažos srities pakeitimo procesą sintetine oligonukleotido kasete, kuri skiriasi nuo natyvios sekos. Oligonukleotidas dažnai turi pilnai arba dalinai randomizuotą natyvią seką(Domer et ai., J. Mol. Biol. 285:1515-1523 (1999)).
f) Rekursinė visumos mutagenezė. Terminas “rekursinė visumos mutagenezė” nurodo į baltymų konstravimo algoritmą (baltymų mutagenezė), sukurtą skirtingų populiacijų fenotipiškai susijusių mutantų gavimui, kurių nariai skiriasi aminorūgščių seka. Šis metodas naudoja grįžtamojo ryšio mechanizmą kontroliuoti nuoseklius kasetinės mutagenezės ciklus (Arkin and Yuvan, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:7811-7815 (1992)).
g) Eksponentinė visumos mutagenezė. Terminas „eksponentinė visumos mutagenezė” nurodo į kombinatorinių bibliotekų, su dideliu unikalių ir funkcionalių mutantų procentingumu, sukūrimo procesą kur mažos liekanų grupės atsitiktinai parenkamos kad būtų kiekvienoje pakeistoje pozicijoje lygiagrečiai identifikuotos aminorūgštys, kurios yra svarbios baltymų funkcionalumui (Delegrave and Youvan, Biotechnology Res. 11:1548-1552 (1993)) ir atsitiktinei ar kryptingai mutagenezei (Amold, Curr. Opin. Biotecnol. 4:450-455 (1993)).
h) Cheminiai mutagenai: hidroksilamino, natrio bisulfato ar bet kurio kito mutageno veikimas (Sambrook, J., et ai., Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 15.10515.107(1989)).
i) Mutagenezė in vivo. Terminas “mutagenezė in vivo nurodo į atsitiktinių mutacijų atsiradimą bet kokioje klonuotoje DNR E. coli kamienuose, turinčiuose mutacijas vienoje arba keliose DNR reparacijos sistemose. Tokie mutantiniai kamienai turi aukštesnį atsitiktinės mutagenezės santykį, negu laikinio tipo kamienai. Dauginant plazmidinę DNR viename iš šių kamienų atsiras atsitiktinės DNR mutacijos (Long-McGie, et ak, Biotechnol. Bioeng. 68:121125 (2000)). Nekryptinga mutagenizuota endonukleazių biblioteka gali būti sukurta ekspresuojant giminingą metilazę in vivo mutagenezės pakopoje.
j) Atvirkštinė PGR mutagenezė, panaudojant tiesioginį ir atvirkštinį oligonukleotidų prijungimą atsitiktinai mutuoto geno viduje arba išorėje. Lokalizuotų nukleotidų randomizacija gali būti apsunkinta taikant oligonukleotidų valdymui atsitiktinius arba pusiau atsitiktinius segmentus.
3. Endonukleazės genų bibliotekos klonavimas ekspresijos vektoriuje
Jeigu endonukleazės genų biblioteka yra mutuota naudojant, pavyzdžiui, bet kurį iš (a)-(g) metodų, po to mutagenizuota genų biblioteka prieš transformaciją į genetiškai parinktą bakterijų kamieną klonuota modifikuotame ekspresijos vektoriuje. Jeigu naudojami (h)-(j) mutagenezės metodai, tuomet mutagenizuota plazmidžių biblioteka gali būti transformuojama tiesiai į genetiškai parinktą bakterijų kamieną apeinant klonavimo stadiją
Bakterijų kamienas genetinei selekcijai yra toks, kuriame konstitutyvinė arba indukuota laukinio tipo endonukleazės geno ekspresija baigiasi ląstelių letališkumu. Dauguma laboratorinių kamienų tenkins šį reikalavimą Kamienas gali ekspresuoti T7 RNR polimerazę genų bibliotekos ekspresavimui nuo T7 specifinio promotoriaus. Be to, konstitutyvinės ekspresijos iš T7 vektoriaus letalus lygmuo nereikalauja T7 RNR polimerazės buvimo.
Išgyvenusios bakterijų kolonijos surenkamos ir išskiriama plazmidinė DNR. Tokios ląstelės, turinčios funkcionaliai aktyvias restrikcijos endonukleazes, negali išgyventi, nesant metilazinės apsaugos. Išgyvenusios kolonijos gali paslėpti endonukleazės klonus, kurie neturės dvigrandės DNR skėlimo aktyvumo. Daugumoje atvejų, tik mažas procentas šiųklonų ekspresuos nikuojančius fermentus, kadangi dauguma klonų ekspresuos neaktyvius fermentus.
4. Plazmidžių analizė išgyvenusiose ląstelėse-šeimininkėse.
Plazmidžių biblioteka pajungiama elektroforezei preparatyviniame agarozės gelyje ir iš gelio išskiriama nikuota, turinti atvirą apskritimo formą DNR. Arba nikuotų plazmidžių išskyrimui gali būti naudojamas ultracentrifugavimas tankio gradiente. Įprastiniu būdu išskiriant plazmides iš E. coli, yra keletas nikuotų plazmidžių. Taigi, nikuotos bibliotekos plazmidžių išskyrimas negali garantuoti, kad kiekvienas endonukleazės genas koduos nikuojantį fermentą. Tačiau, šiuo požiūriu atrinkti klonai gali būti analizuojami pagal nikuojančiu fermentų variantų ekspresiją. Plazmidžių biblioteka, išskirta iš genetiškai parinkto šeimininko gali būti transformuota į šeiminiką, ekspresuojantį apsauginę metilazę ir gali būti ištirta atskirų endonukleazes variantų aktyvumas ir specifiškumas nepajungiant plazmidžių bibliotekos bet kokiai in vitro atrankos procedūrai.
5. Fakultatyvi plazmidžių molekulių, koduojančių nikuojančias endonukleazes atranka „in vitro
Plazmidžių biblioteka gali būti po to padalinta į dvi grupes. Vėlesnės manipuliacijos su kiekvienos iš grupių DNR yra nukreiptos į grandinės specifiškumo nustatymą. Atitinkamai, viršutinę arba apatinę grandinę nikuojančiu plazmidžių klonų nustatymas aprašytas žemiau. (Fig. 2 ir 3).
Kiekviena grupė hidrolizuojama su atitinkamu sekančiu nikuojančiu fermentu (arba restrikcijos fermentu) tam, kad linearizuotume plazmidės klonus, gautume dominančius iš anksto nustatytus lipnius galus. Jeigu restrikcijos fermentai naudojami linearizacijai, tuomet susidarę trumpi ssDNR fragmentai pašalinami.
Selekcija gali būti pasiekiama vienu iš keleto būdų. Keletas selekcijos metodologijos pavyzdžių yra pateikiama žemiau.
(a) Viengrandės DNR adapteris gali būti liguojamas su plazmidės lipniais galais ir dominantys mutantiniai genai yra amplifikuojami iš bibliotekos, naudojant, pavyzdžiui, PGR. Efektyviam ligavimui lipnus galas geriausiai turėtų būti apie 4-10 bazių. Jeigu ligavimo adapteris didesnis negu 4 nukleotidai, plazmidžių bibliotekos temperatūra galėtų būti pakelta, pavyzdžiui, iki 55°C, prieš pridedant adapterio perteklių ir po to ataušinant iki ligavimo temperatūros. Ligavimas atliekamas ir po to pašalinamas nesuliguotas adapteris valant per afininę kolonėlę. Apatinės grandinės atrinkimo procedūroje komplementarios suliguoto adapterio DNR grandinės susintetinimui naudojama užpildymo reakcija. Ši naujai suformuota grandinė naudojama matrica atrinktos genų bibliotekos PGR amplifikacijai. Užpildymo reakcija, einanti po adapterio suligavimo, gali būti atlikta , pavyzdžiui, naudojant Klionovo fragmentą. Ir viršutinės ir apatinės grandinių selekcijoje dominantys nikuojančiu fermentų genai gali būti amplifikuoti naudojant PGR. Tiesioginis PGR pradmuo turėtų būti anilinamas prieš geną. Reversinis PGR pradmuo planuojamas arba komplementarus adapteriui (viršutinė selekcija, Fig. 3), arba sutrumpinta adapterio versija (apatinė selekcija, Fig. 2). Norint sumažinti klaidingąamplifikaciją, reversinio pradmens sekos 3‘ galas geriau nerodytų žymaus bendrumo su bet kuria ekspresijos vektoriaus sritimi arba endonukleazės genu. Amplifikuota genų biblioteka klonuojama atgal į ekspresijos vektorių, transformuojama į iš anksto modifikuotą šeimininką (ekspresuojantį giminingą arba negiminingą DNR metilazę) ir individualios kolonijos auginamos bei tiriama dominančio nikuojančio fermento ekspresija.
(b) Jeigu plazmidės turi iš anksto žinomus lipnius galus, gali būti pridedamas prie linearizuotos plazmidžių bibliotekos kaip atrankos žymuo atsparus antibiotikui genas su tokiais pat lipniais galais. T4 DNR ligazė dedama nuo 10 minučių iki 16 valandų ir mišinys transformuojamas į iš anksto modifikuotas bakterijas, turinčias apsauginę DNR metiltransferazę. Transformacijos mišinys išsėjamas ant terpės, turinčios antibiotiką, atitinkantį įterptam atsparumo genui. Atsparios kolonijos auginamos individualiai ir tiriama dominančio nikuojančio fermento ekspresija.
(c) Jeigu plazmidžių biblioteka turi plazmidės su vietos ir grandinės specifiniu trūkiu, sukurtu in vivo ir yra inkubuojamos su antru, alternatyviu nikuojančių fermentu, siekiant gauti antros grandinės trūkį, dominančios linearizuotos plazmidės gali būti atskirtos nuo nikuotų plazmidžių elektroforeze agarozės gelyje. Po to gali būti pridedama T4 DNR ligazė mažoje koncentracijoje (2-4 ng/μΐ), kad būtų cirkuliarizuota kiekviena plazmidė. Ligavimo mišinys transformuojamas į iš anksto modifikuotą šeimininką ir individualios kolonijos auginamos bei tiriama dominančio nikuojančio fermento ekspresija.
6. Nikuojančių fermentų suradimas
Nikuojantys fermentai gali būti surasti tiriant iš indukuotų arba neindukuotų kultūrų gautų ląstelių ekstraktus. Atrinkti bibliotekos klonai transformuojami į iš anksto modifikuotą šeimininko kamieną ir auginami su atitinkamu antibiotiku plazmidžių atrinkimui. Baltymų ekspresija gali būti indukuotą vėlyvoje log fazėje. Ląstelių kultūros centrifuguotos ir ląstelių ekstraktas gautas ultragarsu suardytas ląsteles resuspendavus buferyje, kuris neturėtų įtakos fermento aktyvumui ir padėtų palaikyti baltymą tirpale (pavyzdžiui, tris-HCl arba fosfatinis buferis, turintis lOmM β-merkaptoetanolio ir 0,1 mM EDTA). Antraip, ližė gali būti atlikta veikiant lizocimu, veikiant detergentu arba šaldant-šildant. Tipinis bandymas susideda: 2-5μ1 ląstelių ekstrakto pridėjus 1 μΐ DNR substrato reakcijos buferyje optimaliame laukinio tipo endonukleazei. DNR substratas gali turėti vieną arba daugiau nikavimo vietų ir nikuotos formos judrumas turi neabejotinai atsiskirti nuo superspiralizuotos formos, jegu pajungiama elektroforezei agaroziniame gelyje (t.y. geriausiai maža, didelio kopijų skaičiaus plazmidė, tokia kaip pUC19). Kiekvieno nikuojančio varianto vietos ir grandinės specifiškumas nustatomas nikuotą DNR produktą sekvenuojant „run-off‘ metodu. Kiekviena dvigrandės plazmidės matrica sekvenuojama su dviem pradmenimis, kurie konverguoja menamoje nikavimo vietoje. Jeigu nikuojantis fermentas yra specifiškas grandinei, viena sekvenavimo reakcija turėtų sustoti trūkio vietoje. Jeigu naudojama Taq DNR polimerazė sekvenuojant didezoksi terminacijos metodu, adeninas (A) pridedamas prie pradmens prailginimo produkto galo nuo matricos nepriklausomo transferazinio aktyvumo.
7. Mutacijos identifikavimas endonukleazėje
Dominantys mutantiniai klonai sekvenuojami aminorūgščių pakeitimų nustatymui. Jeigu yra daugiau negu vienas aminorūgšties pakeitimas(i), tuomet tikslingas pakeitimas(i) patvirtinamas kryptingos mutagenezės būdu.
8. Nikuojančio fermento aktyvumo optimizavimas
Nikuojančio fermento aktyvumo optimizavimas gali būti baigtas vykdyti aminorūgšties liekanos, identifikuotos 7 pakopoje, kryptinga mutageneze. Kai kuriais atvejais, variantai su DNR nikuojančių aktyvumu taip pat rodo silpną dvigrandės DNR skėlimo aktyvumą. Siekiant optimizuoti nikuojantį aktyvumą, identifikuota aminorūgšties liekana gali būti pajungiama kryptingai prisotinimo mutagenezei, išskiriant likusių aminorūgščių pakeitimus (pavyzdžiui 18 mutacijų). Tuomet nikuojantis DNR aktyvumas palyginamas tarp visų mutantų. Atrenkamas geriausiai nikuojantis variantas su minimaliu dvigrandės DNR kirpimo aktyvumu. Variantai, turintys skirtingus aminorūgščių pakeitimus toje pačioje pozicijoje, gali būti išskirti tam kad parodyti optimalų nikuojančio fermento aktyvumą. Aminorūgšties liekanos, paveikusios nikuojantį aktyvumą gali būti atskirtos arba sujungtos tam, kad būtų gautas geresnės kokybės nikuojantis fermentas. Aminorūgšties pakeitimai, duodantys nikuojantį aktyvumą gali būti įvesti į izošizomerus arba neošizomerus arba į fermentus su gimininga atpažinimo seka ar panašia aminorūgščių seka (nuo 15% iki 99% aminorūgščių sekos panašumas).
9. Vietos specifiniu nikuojančių endonukleazių gryninimas
Baltymo gryninimo palengvinimui, tag baltymas (peptidas), toks kaip His-tag, chitiną surišantis domenas ar maltozę surišantis domenas gali būti pridedamas prie nikuojančio fermento N- arba C- galo. Po išgryninimo, tag gali būti pašalinamas veikiant proteaze arba baltymų kirpimu (splicing).
10. Fermento variantų atrinkimo šeimininkų kamienai
Nikuojančių fermentų variantų atrinkimo bakteriniai šeimininkai neapsiriboja E. coli. Kiti bakteriniai šeimininkai, kaip Bacillus ir Pseudomonas taip pat gali būti naudojami iš anksto tikintis atitinkamo klonavimo/ekspresijos vektoriaus turėjimo ir gana didelio DNR transformacijos ar elektroporacijos efektyvumo. Termofiliniams fermentams gali būti naudojami Thermus thermojhilus šeimininkas ir Thermus-E. coli purtymo (shuttle) vektorius (Wayne et ai. Gene 195:321-328 (1997)). Šis genetinės atrankos nikuojančių fermentų išskyrimo metodas gali būti pritaikytas ir DNR skaldantiems fermentams, tokiems kaip fago terminazė, transpozazė, rekombinazė, integrazė, introno koduojama endonukleazė arba inteino koduojama endonukleazė.
Aukščiau aprašytas baltymų inžinerijos metodas gali būti pritaikytas HA tipo fermentuose viršutinę arba apatinę grandinę nikuojančių endonukleazių gavimui. Pavyzdžiuose IIS tipo restrikcijos endonukleazė SapI buvo modifikuota siekiant suformuoti SapI variantą kuris daugiausia nikuoja apatinę grandinę buvo pavadintas kaip Nb.SapI 33 variantas. Be to, buvo išskirti kai kurie SapI variantai išimtinai nikuojantys viršutinę grandinę. Labiausiai aktyvus viršutinės grandinės variantas turintis aminorūgšties pakeitimą E250K ir buvo pavadintas Nt.SapI (E250K).
Yra daugeriopi nikuojančių endonukleazių pritaikymai. Jie apima:
1) Grandinės perkėlimo DNR amplifikacija. Nikuojančių fermentu gali būti įvestas specifinis trūkis į DNR matricą. Bst DNR polimerazė arba kitos DNR polimerazės gali inicijuoti naujos grandinės sintezę nuo trūkio ir perkelti nikuotą grandinę, susidarant linijiniam DNR amplifikacijos produktui.
2) Geno fragmentų surinkimo rekombinantinė technologija. Išskirstyti trūkiai gali būti įvesti į viršutinę ir apatinę grandines tam, kad susidarytų dideli lipnūs galai (8-20 bp ilgio). Komplementarūs lipnūs galai gali būti atkaitinti kartu ir taip išvengta ligavimo pakopos atkaitinta DNR gali būti naudojama tiesiog transformacijoje, elektroporacijoje ar transfekcijoje. Nikuojantys fermentai gali būti naudojami gaminant ssDNR galus DNR fragmentų surinkimui linijinėje ar apskritimo formoje. Grandinei specifiniai DNR nikuojantys fermentai yra naudojami viengrandžių sričių formavimui, nikuojant prie viengrandės srities ribos, arba priešingoje DNR grandinėje (sukuriant galines viengrandes sritis) arba toje pačioje grandinėje (sukuriant viengrandžius plyšius) (U.S. patentas Nr. 6660475).
3) Genetinio polimorfizmo nustatymas. Maži PGR fragmentai gali būti amplifikuoti nuo genominės DNR. Nikuojančių fermentu gali būti įvestas trūkis į taikinį. Po denatūravimo HPLC, nikuotas produktas gali būti „perskaitytas“ masių spektrometru siekiant nustatyti genetinius pakitimus (alteracijas). Nikuojantys fermentai gali būti naudojami onkogeninių mutacijų pašalinimui, bakterinių ar virusinių patogenų nustatymui.
4) Specifinis genomo taikinys. Nikuojantys fermentai, turintys ilgą atpažinimo seką arba pastarąją konjuguotą su PNA gali nutaikyti specifinę sritį genome.
5) DNR dupleksas, turintis vieną trūkį, rodo pakeistą migraciją judrumo gelyje bandymuose. Ši charakteristika gali būti naudojama tiriant skirtingą bazių išsidėstymą ir artimiausių kaimynų energetiką.
6) Nikuotų DNR dupleksų arba DNR su plyšiais ruošimas, tiriant DNR ekscizijų atitaisymą.
Šie išradimo įgyvendinimai toliau iliustruoti sekančiais pavyzdžiais. Pavyzdžiai pateikti tam, kad padėtų suprasti išradimą ir neinterpretuojami kaip jo apribojimas. Yra susitarta, kad patyrę tyrinėtojai gali su šiuo išradimu daryti nedideles modifikacijas ir variacijas ir pasiekti tą patį rezultatą. Nuorodos pacituotos aukščiau ir žemiau čia yra įtrauktos į nuorodas.
PAVYZDŽIAI pavyzdys. Grandinę specifiškai nikuojančio fermento Nb.SapI konstravimas iš restrikcijos endonukleazės SapI
1. Ekspresijos vektoriaus, turinčio strategiškai fiksuota SapI kirpimo vieta, projektas ir konstravimas.
Ekspresijos vektoriaus pACYCT7-ter (Xu et ai, Mol. Gen. Genet. 260:226-231 (1998)) polilinkeris buvo modifikuotas, įvedant SapI kirpimo vietą. Du komplementarūs fosforilinti oligonukleotidai (25 nukleotidai) išvalyti poliakrilamido gelyje, atkaitinti ir liguoti į pACYCT7-ter BamHI kirpimo vietą. Iš tinkamo įterpimo, sukurto vienoje BamHI kirpimo vietoje išplaukia SapI, Salį ir BbvCI kirpimo vietos (žr. Fig. 1). Modifikuotas polilinkeris buvo patvirtintas sekvenuojant su T7 universaliu pradmeniu iš NEB Nr. S1248S, New England Biolabs, Ine,. Beverly, MA. Modifikuotas vektorius pavadintas pSAPV6.
5‘ P-GATCCGCTCTTCGTCGACCCTCAGC 3‘viršutinis įterptas polilinkeris (296-332) (SEQ ID NO:1)
5‘ P-GATCGCTGAGGGTCGACGAAGAGCG 3‘ apatinis įterptas polilinkeris (296-333) (SEQ ID NO:2)
2. Klaidas sąlygojanti sapIR geno PGR mutagenezė ir mutantinės plazmidžiu bibliotekos išskyrimas.
sapIR genas (1299 bp) buvo PGR amplifikuotas nuo Saccharopolyspora rūšies DNR (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA), naudojant 0,4μΜ oligonukleotidų pradmenį, turintį Ndel ir BamHI kirpimo vietas:
5‘ AGAGTCTTGCATATGCGGAGGCTTGCTACAC 3‘ tiesioginis (298-022) (SEQ ID NO:3)
Ndel kirpimo vieta pabraukta.
5‘ TGGTTTGGATCCCCTGAAATGGGTTAGGGC 3‘ reversinis (298-023) (SEQ ID NO:4) BamHI kirpimo vieta pabraukta.
Termociklinimas buvo atliktas per 30 ciklų (94°C 30 s , 56 °C 30 s ir 72 °C 90 s) esant NEB ThermoPol buferio (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA), turinčio 7 mM MgSCL ir penkis vienetus Taq DNR polimerazės. Kad būtų įtakojamas mutacijos dažnumas, buvo dedama nevienoda dNTP koncentracija: 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 1.0 mM dCTP ir 1.0 mM dTTP. Termociklinimas buvo atliekamas naudojant Gene Amp® 2700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). PGR produktas buvo išvalytas , naudojant Qiagen spin kolonėlę, hidrolizuotas su Ndel/BamHI ir išvalytas iš agarozės gelio. Išvalyta genų biblioteka buvo liguota į pSAPV6, paruoštą hidrolizuojant Ndel/BamHI ir veikiant CIP. Inkubavus per naktį 16°C temperatūroje, ligavimo mišinys buvo kaitinamas 10 min 65°C temperatūroje ir 4 valandas dializuojamas prieš distiliuotą vandenį. Pabaigoje ligavimo mišinys buvo elektroporacijos arba cheminės transformacijos būdu transformuotas į ER1992 ląsteles ir išsėtas ant LB agaro, turinčio 30pg/ml chloramfenikolo ir 80 pg/ml X-gal. ER1992 yra DNR pakenktas indikatorinis kamienas, turintis dinDl:lacZ genų suliejimą (U.S. patentas Nr. 5498535). Jeigu ląstelės yra išsėjamos ant terpės, turinčios X-gal, mėlynos spalvos išsivystymas žymi SOS atsako indukciją. Buvo padaryta prielaida, kad pilnai nikuojantis endonukleazės klonas gali indukuoti SOS atsaką E. coli ląstelėse. Todėl 120 vidutiniškai mėlynų išaugusių kolonijų buvo sutelkta į dvi grupes. Dvi sankaupos po lOml buvo auginama iki prisotinimo 37°C temperatūroje ir išskiriama plazmidinė DNR.
3. SapI klonu, pasirinktinai nikuoiančiu dvigrande DNR, atranka in vitro.
Kiekviena grupė buvo kryptingai nikuojama arba su N.BbvCIA arba N.BvbCIB 37°C temperatūroje 60 min. N.BbvCIA buvo taikomas viršutinės grandinės nikuotų SapI klortų atrinkimui (Fig, 3) ir N.BvbCIB buvo taikomas apatinės grandinės nikuotų SapI klonų atrinkimui (Fig. 2). Paskui nikuojantys fermentai buvo pašalinti naudojant Qiagen centrifugavimo kolonėlę ir sudėtos adapterio ligavimo reakcijos. N.BbvCIA nikuota DNR buvo liguota su 10 pmol fosforilinto 296-334 adapterio per naktį 16°C temperatūroje. N.BbvCIB nikuota DNR buvo liguota su 10 pmol fosforilinto 296-335 adapterio per naktį 16°C temperatūroje:
5’ P-TCGACCCTCACTACGTTAGTTCGCATCTGC 3’ (296-334) (SEQ ID NO:5)
5’ GCAGATGCGAACTAACGTAGGGGT 3’ (296-335) (SEQ ID NO:6)
Klionovo fragmentas (0.5 vieneto) ir 30 μΜ dNTP buvo pridėta prie “B ligavimo”, viršutinės DNR grandinės, komplementarios suliguotam adapteriui, gavimui. Ši pakopa yra būtina, norint gauti matricą apačiai specifinės amplifikacijos strategijai (Fig. 2). Po užpildymo Klionovo fragmentu, polimerazė ir adapterio perteklius pašalinti Qiagen centrifugavimo kolonėle. Užbaigiant, “A ligavimo” ir “B ligavimo” produktai buvo amplifikuoti PGR, naudojant tą pačią porą pradmenų (298-024 ir 275-224):
5’ P-GGGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACG 3’ (298-024) (SEQ ID NO:7) yra tiesioginis pradmuo, kuris leidžia klonuoti į SmaI kirpimo vietą priešais T7 promotorių.
5’ GCAGATGCGAACTAACGTAG 3’ (275-224) (SEQ ID NO:8) yra strateginis reversinis pradmuo.
PGR amplifikacija buvo atlikta per 33 ciklus (94°C 30 s, 56°C 30 s ir 72°C 90 s) esant TermoPol buferiui, 0.2 μΜ kiekvieno dNTP, 0.4 μΜ kiekvieno pradmens ir Taę/Vent polimerazių mišiniui (5/0.1 vieneto). Laukiamas 1493 bp produktas buvo stebimas abiejose A ir B matricose, į kurias ligavimo metu buvo įdėtas adapteris. Matricos iš tariamo ligavimo (į kurį nebuvo įdėtas adapteris) nedavė norimo PGR produkto. Pakankamam produkto kiekiui gauti, reikalingam perklonavimui į pSAPV6, buvo pravestos papildomos PGR reakcijos per 35 ciklus, naudojant 58°C anilinimo temperatūrą PGR produktai išvalyti per kolonėlę, sukarpyti BamHI ir suliguoti su pSAPV6, paruošta su Smal/BamHI ir paveikta CIP. Ligavimo reakcijos mišinys transformuotas įT7 ekspresijos šeimininką ER2744 [fhuA2 lacZ::T7 genel glnV44el4-rfbDl? RelAl? EndAl spoTl? Thy-1 (mcrC-mrr)l 14::IS10], turintį dvigubą metilazės klonąpBR322-SapIMlM2 (U.S. patentas Nr. 5663067).
4. Nikuojančių fermentu atranka iš ląstelių ekstraktu.
Fermento superprodukavimas buvo atliktas inokuliuojant atskirus transformantus į 10 ml LB, turinčios 30 pg/ml chloramfenikolo ir 100 pg/ml ampicilino, auginant iki vėlyvosios log fazės ir indukuojant su 0.1 mM IPTG 37°C temperatūroje per naktį. Ląstelės buvo išsodintos centrifuguojant ir 1.0 ml ląstelių ekstrakto buvo gauta dalinai suardžius ultragarsu 10 mM Tris-HCL (pH 7.8), 10 mM β-merkaptoetanolio ir 0.1 mM EDTA. Nikuojantis aktyvumas buvo tiriamas inkubuojant pUC19 (viena SapI kirpimo vieta) su 3 μΐ ląstelių ekstrakto 45 min. 37°C temperatūroje, esant 1ΧΝΕΒ buferio 4 (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA). Iš 16 spėjamų apatinei grandinei specifinių klonų vienas ląstelių ekstraktas parodė žymų nikuojantį aktyvumą (Fig. 4). Šis klonas nuo pat pradžių buvo pavadintas N.33. Iš 32 spėjamų viršutinei grandinei specifinių klonų, nė vienas ląstelių ekstraktas nerodė nikuojančio aktyvumo. Sekvenuojant N.33 klono sapIR geną parodytos mutacijos atskleidžiančios 4 aminorūgščių pakeitimus: D34Y/182V/P168L/R420I.
5. SapI N.33 varianto specifiškumo grandinei nustatymas.
pUC19 DNR substratas buvo inkubuojamas arba su N.33 ląstelių ekstraktu, arba dalinai išvalytu baltymu. Nikuotas DNR produktas buvo valomas iš 1% žemos lydymosi temperatūros agarozės gelio. Nikuota matrica buvo identifikuota sekvenuojant dvigrandę matricą su dviem pradmenimis, kurie susilieja SapI atpažinimo vietoje: (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA).
5’GGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACG 3’ (266-113) (SEQ ID NO:9) anilinamas prie pUC transkripcijos pradžios taško.
5’ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’ (SEQ ID NO: 10) (Nr. S1224S) M13/pUC sekvenavimo pradmuo.
Sekvenavimo reakcija, naudojant Nr. S1224S pradmenį sustoja ties GCTCTTCCGCTA (SEQ ID NO: 11) (Fig. 6). Ši sutrumpintra seka yra nikuotos apatinės grandinės panaudojimo matrica produktas. Apatinė grandinė nikuojama tarp 4-to ir 5-to nukleotido už SapI atpažinimo sekos. Galinis adeninas (A) yra klaidingas, kadangi jis yra pridedamas Tag DNR polimerazės transferazinio aktyvumo. Patvirtinus grandinės specifiškumą, N.33 buvo pervadintas Nb.SapI (33 variantas).
6. Nb.SapI (33 variantas) išvalymas ir charakterizavimas.
N.33 klonas buvo transformuotas į iš anksto modifikuotas ER2848 [Er2744 su lacF su F’ (TetR)] su pBR322-SaplMlM2. Išankstinė modifikacija yra atliekama transformuojant į ER2848 metilazinę plazmidę ir po to gaminant kompetentines ląsteles CaCb metodu. ER2848[pACYCT7ter-N.33, pBR322-Sap!M!M2] buvo auginamos prie 30°C galutiniame 3 litrų tūryje. Nikuojančio fermento superprodukcija buvo indukuojama pridedant 0.5 mM IPTG per paskutines 5 augimo valandas. Ląstelės išsodinamos centrifuguojant ir šaldomos prie -20°C. Valymo procedūra buvo numatyta atitinkamai pagal laukinio tipo SapI restrikcijos endonukleazės valymo procedūrą. Ląstelių nuosėdos buvo resuspenduojamos, pridedant 60 mL HEPES skaldymo buferio: 20 mM HEPES (pH 7,7), 200 mM NaCįl mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glicerolio. Ląstelės buvo lizuojamos suardant ultragarsu, kuris buvo kontroliuojamas Bradfordo būdu matuojant išsiskyrusį baltymą. Ląstelių lizatas buvo centrifuguojamas prie 15000 aps ir nuskaidrėjęs lizatas buvo užneštas ant DEAE-Sefarozės kolonėlės prieš tai ekvilibruotos su HEPES skaldymo buferiu. Pratekėjęs skystis buvo surenkamas ir užnešamas ant heparino-sacharozės FF kolonėlės, prieš tai ekvilibruotos su HEPES skaldymo buferiu (be EDTA). Buvo surinkta trisdešimt frakcijų, suformuojant 0,2-1,0 M NaCl eliucijos gradientą. Iš jų 3-16 frakcijos, ištyrus su pUC19, turėjo žymų nikuojantį aktyvumą. Aktyvusis telkinys buvo užneštas ant hidroksiapatito biogelio HTP kolonėlės, prieš tai ekvilibruotos su HEPES skaldymo buferiu (be EDTA). A fosfato gradientas tarnavo baltymo išplovimui iš hidroksiapatito dervos. A menzūra su HEPES buferiu (be EDTA), tuo tarpu B buferis turi 0,9 M kalio fosfato (pH 7,7), 200 mM NaCį 1 mM DTT ir 10% glicerolio. Iš dvidešimt aštuonių išplautų frakcijų, 9-14 rodė nikuojantį aktyvumą. Aktyvusis telkinys buvo praleistas per antrą DEAE pakopą kad būtų atliktas nukleorūgšties pašalinimas. Antroji DEAE kolonėlė buvo ekvilibruota su 20 mM HEPES (pH 7,7), 200 mM NaCį 0,3 mM EDTA, 1 mM DTT ir 10% glicerolio. Paskutinėje kolonėlėje buvo frakcionuojama heparin sefaroze FF, naudojant 0,2-1,0 M NaCl HEPES skaldymo buferyje (turinčiame 1 mM EDTA). Paskutinioji 15 ml sankaupa buvo dializuota per naktį SapI saugojimo buferyje (be BSA): 10 mM Tris-HCL (pH7,5), 300 mM NaCį 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT ir 50% glicerolio. Po dializės tūris buvo sumažintas iki 5,5 ml.
Išvalyta Nb.SapI (33 variantas) partija buvo titruojama 50 μΐ reakcijos tūryje, turinčiame 4xNEB buferį (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA), 1 μg pUC19 ir 2 μΐ praskiesto fermento (Fig. 5). 4-kartinis fermento praskiedimas po 60 min prie 37°C pašalina visas superspiralizuotas pUC19 formas. Tuo būdu, išvalyta 33 varianto partija turi 2 vienetus/μΙ. (Vienas vienetas apibrėžiamas kaip fermento kiekis, reikalingas 1 pg pUC19 paversti į atviro apskritimo formą per 60 min, esant optimaliai reakcijos temperatūrai.)
Po išgryninimo ER2848 [pACYCT7ter-Nb.SapI33, pBR322-SapIMlM2] kamienas išskiria 1100 vienetų Nb.SapI (33 variantas) iš ląstelių gramo.
7. Individualių aminorūgščių pakaitu, rastu 33 variante, reikšmės analizavimas kryptingos mutagenezės būdu.
Prisotinimo mutagenezei buvo pasirinktos 34, 168 ir 420 pozicijos. Buvo rasti daugybiniai pakeitimai 420 padėtyje fermentuose, geriausiai nikuojančiuose pUC19. Analizuojant variantus iš ląstelių ekstrakto, 420 pozicijoje buvo patvirtintos, leidžiančios didžiausią konversiją į nikuojančią formą, sekančios liekanos: asparaginas, serinas, treoninas, leucinas, izoleucinas, valinas, alaninas ir glicinas.
5‘GCGGGATCCGTTCAGTCCAGTGGTAGTGCTTCATCGAGAAGTGCGTCTGGNNNT TCCTTCAACTTCTC 3‘ (300-045) (SEQ ID NO: 12) reversinis pradmuo dėl 420 randomizacijos
N = tolygus A, C, G, T mišinys
Molekulinės biologijos metodikos, pritaikytos šiame darbe:
Plazmidinės DNR išskyrimo metodika: Qiagen centrifugavimo kolonėlės buvo naudojamos plazmidinės DNR išskyrimui. Ląstelių ližė, baltymų ir ląstelinės DNR denatūracija buvo atliekama pridedant PI, P2 ir N3 buferius. Nuskaidrintas supematantas, turintis plazmidinę DNR, buvo užnešamas ant Qiagen centrifugavimo kolonėlių ir plaunamas PE buferiu. Plazmidinė DNR išplaunama distiliuotu vandeniu.
Transformacijos atlikimo metodika: Chemiškai kompetentinės ląstelės buvo paruoštos veikiant eksponentinės fazės E. coli ląsteles ledo šaltumo 70 mM CaCb 30 min. Kompetentinės ląstelės sumaišytos su plazmidinė DNR buvo inkubuotos lede 30 min. Po 3-5 min. temperatūrinio veikimo 37°C, buvo pridedamas vienodas tūris LB terpės ir ląstelės inkubuojamos 37°C temperatūroje vieną valandą. Plazmidžių atrinkimui transformantai išsėjami ant LB agaro lėkštelių su atitinkamu antibiotiku.
Elektroporacijos atlikimo metodika: Elektrokompetentinės ląstelės buvo paruoštos dukart paveikiant eksponentinės fazės E. coli ląsteles su ledo šaltumo 10% gliceroliu (500 ml 10% glicerolio ląstelių nuosėdoms iš 500 ml ląstelių kultūros). Sumaišius 50mL ląstelių su DNR, atliekama elektroporacija , esant sekančioms sąlygoms: 1.8 kV, 200 Ώ, 25 mF, 0.1 cm kiuvetė. Į ląsteles pridedama SOC terpės (0.5 ml) ir inkubuojama 1 vai. transformantų išdauginimui. Plazmidžių atrinkimui transformantai išsėjami ant LB agaro lėkštelių su atitinkamu antibiotiku. __ “Run-off’ sekvenavimas ir DNR sekvenavimas: “Run-off’ sekvenavimui buvo naudojami nikuoti produktai arba iš gelio išvalyti nikuoti produktai. Sekvenavimo reakcijose buvo naudojama Big dye AmpliTag didezoksi terminatorinis sekvenavimo rinkinys (Applied Biosystems, Foster City, CA). DNR seka buvo nustatyta automatiniu sekvenatoriumi AB1373A. DNR seka buvo redaguojama ir analizuojama su DNASTAR Lasergene ir GCG programomis.
pavyzdys. Viršutinę grandinę specifiškai nikuojančio fermento Nt.SapI konstravimas iš restrikcijos endonukleazes SapI
Nepasisekimas tiesiogiai išskirti viršutinę grandinę nikuojantį variantą buvo labiausiai tikėtinas padarant riboto dydžio pradinę biblioteką (tik 120 klonų). Be to, vėliau buvo nustatyta, kad genetinė atranka ER1992 kamiene buvo nepakankamai griežta tiksliam variantų su dvigubos grandinės skėlimo aktyvumu išskyrimui. Retai kerpančio fermento atvejais (t.y. SapI) buvo naudinga genetinės selekcijos stadiją atlikti su kamienu, koduojančiu T7 RNR polimerazę, kad būtų sumažinta konstitutyvimė SapI ekspresija iš pSAPV6.
1. Mutantinės plazmidžių bibliotekos išskyrimas genetine atranka iš ER2848.
Toks pat mutagenizuotas sapIR genas, aprašytas 1 pavyzdyje, buvo liguotas į pSAPV6 ir transformuotas į ER2848 elektroporacijos būdu. Transformacijos mišinys buvo išsėtas ant LB agaro su Km ir inkubuotas per naktį 30 °C ir 37 °C temperatūrose. Prie abiejų inkubavimo temperatūrų buvo vienodas kolonijų skaičius. Vidutiniškai 600 išaugusių kolonijų buvo surinkta į 500 ml LB terpės su Km. Kultūra auginama iki vėlyvos log fazės 37 °C temperatūroje, išsodinama centrifuguojant ir plazmidinė DNR išskiriama naudojant Qiagen Maxiprep.
2. Nikuotos plazmidžių bibliotekos atranka in vitro elektroforeze agarozės gelyje.
Mažas mėginys (2 iš 150 μΐ) ER2848 plazmidžių bibliotekos buvo pajungta elektroforezei agarozės gelyje (0.7% agarozė, 150 mV 90 min). Lėčiau migruojanti DNR buvo išpjautra iš gelio ir išvalyta adsorbcija prie silicio dioksido (Compass DNA purification kit, American Bioanalytical, Natick, MA). Ši stadija pašalina daugumą superspiralizuotos plazmidinės DNR ir tarnauja bibliotekos praturtinimui nikuota plazmidinė DNR.
3. SapI klonu, kurie pasirinktinai nikuoia dvigrandės DNR viršutine grandine, atranka in vitro.
Praturtinta plazmidžių biblioteka buvo inkubuojama su N.BbvCIA 60 min prie 37 °C, kad būtų linearizuoti plazmidžių klonai, prieš tai nikuoti viršutinėje grandinėje SapI kirpimo vietoje in vivo. Tokiu atveju, apatinės grandinės nikavimas N.BbvCIA sukuria 10-ties bazių lipnų galą (Fig. 3). Po to, N.BbvCIA buvo pašalintas su Qiagen centrifugavimo kolonėle ir atlikta adapterio ligavimo reakcija. Su N.BbvCIA nikuota DNR buvo liguota su fosforilintu adapteriu 296-334 pernakt 16 °C temperatūroje. Adapterio pridėjimas atliekamas po nikuotos
DNR kaitinimo 65 °C temperatūroje, kad būtų garantuotas 10-ties bazių lipnaus galo atskyrimas. T4 DNR ligazė (1000 vienetų) pridedama atšaldžius iki kambario temperatūros. Taip pat buvo sudedamas kontrolinis ligavimas be adapterio.
5’ P-TCGACCCTCACTACGTTAGTTCGCATCTGC 3’ (296-334) (SEQ ID NO: 13)
Po ligavimo per naktį 16 °C temperatūroje adapterio perteklius pašalinamas Qiagen centrifugavimo kolonėle. “A ligavimo” produktas PGR amplifikuojamas, naudojant pradmenų 298-024 ir 275-224 porą. Matrica, turinti suliguotą adapterį, davė numatyto dydžio (1493 bp) PGR produktą, tuo tarpu kai matrica iš kontrolinio ligavimo produkto nedavė. “A ligavimo” produktai buvo surinkti (400 ml), išvalyti per Qiagen centrifugavimo kolonėlę ir hidrolizuoti su NdeI ir BamHI. Po išvalymo iš gelio, genų biblioteka buvo liguojama įpSAPV6. Ligavimo reakcijos mišinys transformuotas į ER2744 [pBR322-SapMlM2] elektroporacijos būdu ir, inkubavus per naktį 37 °C temperatūroje, išsėtas ant LB agaro lėkštelių su Am ir Km.
4. Nikuojančio fermento variantu atranka iš ląstelių ekstraktu.
Keturiasdešimt astuonios kolonijos buvo individualiai inokuliuotos į 10 ml LB kultūros su Am ir Km. Kultūros buvo auginamos 37 °C temperatūroje iki vėlyvosios log-fazės ir per naktį indukuotos 0.1 mM IPTG. Kultūros buvo centrifuguojamos ir ląstelių nuosėdos resuspenduojamos 1 ml ultragarsinimo buferio: 10 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM βmerkaptoetanolio ir 0.1 mM EDTA. Ultragarsinimas buvo atliekamas naudojant Ultrasonic Cell Disruptor. Nikuojantis aktyvumas buvo tiriamas inkubuojant pUC19 (su viena SapI kirpimo vieta) su 3 μΐ ląstelių ekstrakto 60 min 37 °C temperatūroje, esant 1ΧΝΕΒ buferio 4 (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA). Penki iš 48 ląstelių ekstraktų rodė žymų nikuojantį aktyvumą (Fig. 7). Visi penki klonai (Nr. 2, Nr. 11, Nr. 9, Nr. 15 ir Nr. 18) atsakingų aminorūgščių pakeitimų nustatymui buvo sekvenuoti. Du aktyviausiai nikuojantys variantai (Nr. 11 ir Nr. 15) turėjo tris dažniausius pakeitimus: K80E, E250K ir K273R. Kryptinga PGR mutagenezė (persidengiančio prailginimo metodas) buvo atlikta nustatyti kuris pakaitas(i) atsakingas už nikuojantį fenotipą. Iš šių tyrinėjimų nustatyta, kad abu viengubi E250K ir K273R variantai produkuoja išimtinai viršutinę grandinę nikuojantį pUC19 produktą, kadangi K80E variantas buvo negatyvus nikuojančiam aktyvumui. Kituose tyrimuose Q240R ir G271R irgi rodė viršutinę grandinę nikuojantį aktyvumą, kai buvo tiriama su pUC19. Keturi viršutinę grandinę nikuojantys variantai buvo pavadinti Nt.SapI (E250K), Nt.SapI (K273R), Nt.SapI (Q240R) ir Nt. SapI (G271R). Visų keturių viršutinę grandinę nikuojančių variantų palyginamoji analizė parodė, kad E250K pakeitimo rezultate gautas aktyviausias viršutinę grandinę nikuojantis SapI variantas.
E250K mutagenezės pradmenys:
5‘ GCACTTATCACACGTAAGCGAAAGATATTCCTG 3‘ (304-120 tiesioginis) (SEQ ID NO: 14)
5‘ CAGGAATATCTTTCGCTTACGTGTGATAAGTGC 3‘ (304-121 atvirkštinis) (SEQ ID NO: 15)
5. Nt.SapI (E250K-) grandinės specifiškumo nustatymas.
pUC19 (1 pg) DNR substrato buvo inkubuojama su 5 pi E250K ląstelių ekstrakto. Nikuotas DNR produktas išvalytas iš 1% žemos lydymosi temperatūros agarozės gelio. Nikuota matrica buvo identifikuota sekvenuojant dvigrandę matricą su dviem pradmenimis, kurie susieina SapI kirpimo vietoje: (266-113 ir New England Biolabs, Ine., Beverly, MA, katalogo Nr. S1224S). Naudojant 266-113 pradmenį sekvenavimo reakcija baigiasi ties GGAAGCA (Fig. 9). Ši sutrumpinta seka gaunama naudojant matrica viršutinę nikuotą grandinę. Viršutinė grandinė nikuojama tarp 1-mo ir 2-ro nukleotidų už SapI atpažinimo sekos. Galinis adeninas (A) yra klaidingas, kadangi jis prijungiamas Taq DNR polimerazės transferazinio aktyvumo.
6. Nt.SapI (E250K) superprodukavimas.
Nt.SapI buvo superprodukuotas ER2848[pACYCT7ter-Nt.SapI, pBR322-SapIMlM2, pSYX33-EarIMlM2] kamiene, auginant LB terpėje su Km/Am/Kn 30 °C temperatūroje iki vėlyvosios log fazės ir po to 5 vai. indukuojant 0,5 mM IPTG 30 °C temperatūroje. Ląstelių ekstraktas iš 10 ml Nt.SapI (E250K) buvo titruotas 50-yje pi reakcijos, turinčios 4NEB buferio (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA), 1 pg pUC19 ir 2 pi ekstrakto arba praskiesto ekstrakto (Fig. 8). Reakcija su 2 pi nepraskiesto ekstrakto po 60 min 37 °C temperatūroje iš esmės pašalina superspiralizuotąpUC19 formą. Taigi, Nt.SapI produkavimo lygis iš ER2848 [pACYCT7ter-Nt.SapI, pBR322-SapIMlM2, pSYX-EarIMlM2] nustatytas 10000 vienetų/gramo šviežių ląstelių.
Claims (26)
- Išradimo apibrėžtis1. Grandinei specifinių nikuojančių endonukleazių konstravimo būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima:a) ląstelių-šeimininkių, stokojančių metilazinės apsaugos prieš restrikcijos endonukleazes, transformavimą plazmidžių biblioteka, turinčia atsitiktinai mutuotą geną, koduojantį restrikcijos endonukleazę, plazmidės be to dar apimančias sekos vietą išorėje geno, kuris yra skaldomas arba nikuojamas geno ekspresuojama endonukleaze;(b) auginimą (a) pakopos transformantų, išskyrimą iš jų plazmidžių ir atlikimą fakultatyvios atrankos in vitro, nustatant, kuri plazmidė yra nikuota in vivo;(c) skaldymą (b) pakopos plazmidžių su iš anksto nustatyta grandinei specifine nikuojančia endonukleaze, turinčia skirtingą skėlimo vietą negu atsitiktinai mutagenizuotos restrikcijos endonukleazės skėlimo vieta ir iš anksto paruoštus priešingoje grandinėje pirmą ir antrą lipnius galus plazmidėje;(d) atsitiktinai mutagenizuoto endonukleazės geno lipnių galų naudojimą amplifikacijai plazmidėse ir po to klonavimą amplifikuoto geno ląstelėse-šeimininkėse arba selektyvaus markerio ligavimą į plazmidę tarp pirmo ir antro lipnių galų ir geno klonavimas selektyvioje terpėje; ir (e) žinomo grandinės specifiškumo nikuojančios endonukleazės gavimą iš (d) pakopos DNR klono.
- 2. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad restrikcijos endonukleazės skėlimo vieta yra lokalizuota transkripcijos kryptimi už geno.
- 3. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad (b) pakopa be to apima: transformantų surinkimą prieš išskiriant plazmidės.
- 4. Būdas pagal 3 punktą besiskiriantis tuo, kad (b) pakopa be to apima: surinktų transformantų praturtinimą genais, ekspresuojančiais nikuojančią endonukleazę.
- 5. Būdas pagal 4 punktą besiskiriantis tuo, kad praturtinimo punktas apima: plazmidinės DNR išskyrimą iš surinktų transformantų, plazmidžių analizavimą atskyrimo būdais, atskiriant nikuotąDNR nuo superspiralizuotos ir linijinės DNR, ir retransformavimą iš anksto modifikuotų E. coli ląstelių-šeimininkių nikuota plazmidinė DNR.
- 6. Būdas pagal 5 punktą besiskiriantis tuo, kad atskyrimo priemonės yra parinktos iš gelio elektroforezės ir tankio centrifugavimo.
- 7. Būdas pagal 3, 4, ir 5 punktus , besiskiriantis tuo, kad be to apima dviejų auginamų transformantų telkinių formavimą kad vienas telkinys būtų testuojamas viršutinės grandinės skėlimo aktyvumui nustatyti, o kitas telkinys apatinės grandinės skėlimo aktyvumui nustatyti.
- 8. Budas pagal 7 punktą besiskiriantis tuo, kad (d) pakopa be to apima viengrandžio DNR adaptoriaus ligavimą su iš anksto nustatytu lipniu galu geno amplifikavimui.
- 9. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad antra iš anksto nustatyta skėlimo vieta yra fiksuota viršutinėje plazmidės grandinėje, apatinės grandinės trūkio vietos nustatymui.
- 10. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad antra iš anksto nustatyta skėlimo vieta yra fiksuota apatinėje plazmidės grandinėje, viršutinės grandinės trūkio vietos nustatymui.
- 11. Būdas pagal 9 punktą besiskiriantis tuo, kad (c) pakopa be to apima viengrandžio adaptoriaus ligavimą su pirmu lipniu galu, kur pirmas lipnus galas yra gretimas genui.
- 12. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad mutagenizuotas restrikcijos endonukleazės genas turi vieno ar daugiau nukleotidų deleciją insercijąar pakeitimą
- 13. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad mutagenizuotas genas turi daugybę mutacijų.
- 14. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutagenizuotas genas turi vieną mutaciją.
- 15. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutagenizuotas genas turi· deleciją nukleotidų srityje nuo 3 iki 600.
- 16. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad (a) pakopos ląstelėsšeimininkės paruošimas yra parinktas iš gramneigiamų arba gramteigiamų bakterijų.
- 17. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad be to apima: mutacijos identifikavimą nikuojančioje endonukleazėje, palyginus su laukinio tipo restrikcijos endonukleaze, iš kurios ji yra gauta ir ekvivalentinės mutacijos įvedimą kryptingos mutagenezės būdu į restrikcijos endonukleazės izošizomerą arba neošizomerą
- 18. Būdas pagal 1 punktą be to apimantis papildomos mutacijos įvedimą į (f) pakopos nikuojančią endonukleazę kryptingos mutagenezės būdu nikuojančio aktyvumo sustiprinimui arba dvigrandės DNR skėlimo minimizavimui, arba abiems variantams.
- 19. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutagenizuotas restrikcijos endonukleazės genas yra HA tipo endonukleazės genas.
- 20. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad nikuojanti endonukleazė yra termostabili nikuojanti endonukleazė.
- 21. Grandinei specifinės DNR nikuojančios endonukleazės konstravimo būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima:(a) ląstelių-šeimininkių trasformavimą plazmidėmis, turinčiomis atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną, ląstelės-šeimininkės stokoja apsauginio metilinimo;(b) viengrandžio adaptoriaus ligavimą su sutelktomis plazmidėmis, išskirtomis iš išaugusių (a) pakopos transformantų, nustatymui kuri plazmidė koduoja viršutinę grandinę arba apatinę grandinę nikuojančius restrikcijos endonukleazės variantus;(c) mutagenizuoto restrikcijos endonukleazės geno amplifikavimą ląstelių-šeimininkių transformacijai;(d) nustatymą kurios ląstelės-šeimininkės turi nikuojantį aktyvumą ir jų nikuojantį fenotipą; ir (e) sukonstruotų nikuojančiu endonukleazių gavimą.
- 22. Būdas pagal 1 arba 21 punktą besiskiriantis tuo, kad restrikcijos endonukleazė yra SapI.
- 23. Nikuojanti endonukleazė apimanti Nt.SapI.
- 24. Nikuojanti endonukleazė apimanti Nb.SapI.
- 25. Nikuojanti endonukleazė pagaminta pagal 1 punktą.
- 26. Vieno arba daugiau vietos specifinių trūkių įvedimo į iš anksto parinktas DNR duplekso grandines būdas, besiskiriantis tuo, kad būdas apima: DNR duplekso hidrolizę nikuojančia endonukieaze, pagaminta pagal 1 punktą palankiomis nikuojančiam aktyvumui sąlygomis.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53075403P | 2003-12-18 | 2003-12-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2004109A LT2004109A (lt) | 2005-06-27 |
| LT5263B true LT5263B (lt) | 2005-09-26 |
Family
ID=34633011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2004109A LT5263B (lt) | 2003-12-18 | 2004-12-17 | Grandines specifiškai nikuojančių endonukleazių konstravimo iš restrikcijos endonukleazių būdas |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7943303B2 (lt) |
| LT (1) | LT5263B (lt) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004067764A2 (en) * | 2003-01-29 | 2004-08-12 | Keck Graduate Institute | Nucleic acid sequencing using nicking agents |
| WO2008127901A1 (en) * | 2007-04-13 | 2008-10-23 | President And Fellows Of Harvard College | Region-specific hyperbranched amplification |
| EP2392653B1 (en) | 2007-07-12 | 2014-03-19 | New England Biolabs, Inc. | High fidelity restriction endonucleases |
| US11198910B2 (en) | 2016-09-02 | 2021-12-14 | New England Biolabs, Inc. | Analysis of chromatin using a nicking enzyme |
| EP3710596B1 (en) | 2017-11-16 | 2023-08-02 | New England Biolabs, Inc. | Mapping the location, type and strand of damaged nucleotides in double-stranded dna |
| US11021701B2 (en) | 2017-11-22 | 2021-06-01 | New England Biolabs, Inc. | Method for fragmenting DNA by nick translation |
| EP3999646A4 (en) * | 2019-07-17 | 2023-08-30 | Generation Bio Co. | COMPOSITIONS AND PRODUCTION OF NICKEL-CLOSED CLOSED-END DNA VECTOR |
| AU2020315444A1 (en) | 2019-07-17 | 2021-12-23 | Generation Bio Co. | Synthetic production of single-stranded adeno associated viral DNA vectors |
| US20230123635A1 (en) | 2020-06-12 | 2023-04-20 | New England Biolabs, Inc. | Compositions and Methods for Detecting Molecular Targets on Chromosomal DNA |
| CN116234917A (zh) | 2020-07-27 | 2023-06-06 | 安杰瑞姆生物科学公司 | Dna分子组合物及其制备方法和使用方法 |
| AU2022260111A1 (en) | 2021-04-20 | 2023-11-30 | Anjarium Biosciences Ag | Compositions of dna molecules encoding amylo-alpha-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase, methods of making thereof, and methods of use thereof |
| US11667968B2 (en) | 2021-05-27 | 2023-06-06 | New England Biolabs, Inc. | Fragmentation of DNA |
| WO2022261281A1 (en) | 2021-06-09 | 2022-12-15 | New England Biolabs, Inc. | Target initiation and amplification of long dna with nuclease and replisome enzymes |
| JP2025504404A (ja) | 2022-01-14 | 2025-02-12 | アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー | Ｖｉｉｉ因子をコードするｄｎａ分子の組成物、それを作製する方法、及びその使用方法 |
| EP4665865A1 (en) | 2023-02-17 | 2025-12-24 | Anjarium Biosciences AG | Methods of making dna molecules and compositions and uses thereof |
| WO2025104680A1 (en) | 2023-11-17 | 2025-05-22 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Dna accessibility for the assessment of male fertility |
| CN118879682A (zh) * | 2024-07-16 | 2024-11-01 | 上海交通大学 | 一种制备长单链dna的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1176204A1 (en) | 2000-07-24 | 2002-01-30 | Fermentas AB | Nuclease |
| US6395523B1 (en) | 2001-06-01 | 2002-05-28 | New England Biolabs, Inc. | Engineering nicking endonucleases from type IIs restriction endonucleases |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6660475B2 (en) * | 2000-12-15 | 2003-12-09 | New England Biolabs, Inc. | Use of site-specific nicking endonucleases to create single-stranded regions and applications thereof |
| AU2002365122A1 (en) | 2001-08-23 | 2003-07-15 | New England Biolabs, Inc. | A method for engineering strand-specific, sequence-specific, dna-nicking enzymes |
-
2004
- 2004-12-15 US US11/013,260 patent/US7943303B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-12-17 LT LT2004109A patent/LT5263B/lt not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1176204A1 (en) | 2000-07-24 | 2002-01-30 | Fermentas AB | Nuclease |
| US6395523B1 (en) | 2001-06-01 | 2002-05-28 | New England Biolabs, Inc. | Engineering nicking endonucleases from type IIs restriction endonucleases |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GEIDER K. ET AL.: "Intermediate stages in enzymatic replication of bacteriophage fd duplex DNA", J. BIOL. CHEM., 1982, pages 6488 - 6493 |
| MORGAN RD ET AL.: "Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI.", BIOL CHEM., 2000, pages 1123 - 1125, XP001009735, DOI: doi:10.1515/BC.2000.137 |
| ROBERTS RJ ET AL.: "A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes.", NUCLEIC ACIDS RES, 2003, pages 1805 - 1812, XP002383227, DOI: doi:10.1093/nar/gkg274 |
| XIA Y. ET AL.: "A site-specific single strand endonuclease activity induced by NYs-1 virus infection of a Chlorella-like green alga", NUCLEIC ACID RESEARCH, 1988, pages 9477 - 9487 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7943303B2 (en) | 2011-05-17 |
| US20050158834A1 (en) | 2005-07-21 |
| LT2004109A (lt) | 2005-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4817587B2 (ja) | Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ切断エンドヌクレアーゼのクローニング及び産生並びに一本鎖置換増幅における切断エンドヌクレアーゼ使用に関する方法 | |
| US20250327048A1 (en) | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof | |
| JP2022166170A (ja) | 熱安定性ｃａｓ９ヌクレアーゼ | |
| US8507239B2 (en) | Restriction endonucleases and their applications | |
| LT5263B (lt) | Grandines specifiškai nikuojančių endonukleazių konstravimo iš restrikcijos endonukleazių būdas | |
| US20030100094A1 (en) | Method for engineering strand-specific, sequence-specific, DNA-nicking enzymes | |
| Zhu et al. | Engineering strand-specific DNA nicking enzymes from the type IIS restriction endonucleases BsaI, BsmBI, and BsmAI | |
| US6395523B1 (en) | Engineering nicking endonucleases from type IIs restriction endonucleases | |
| US20030211506A1 (en) | N. bstnbi nicking endonuclease and methods for using endonucleases in single-stranded displacement amplification | |
| US5405768A (en) | Method for cloning and producing the AATII and ALUI restriction endonuclease and methylase and related method for overexpressing restriction endonucleases | |
| US6245545B1 (en) | Method for cloning and producing the SwaI restriction endonuclease | |
| US20050136462A1 (en) | Method for engineering nicking enzymes | |
| US5945288A (en) | Method for cloning and producing the PmeI restriction endonuclease | |
| US7186538B2 (en) | Type II restriction endonuclease, CstMI, obtainable from Corynebacterium striatum M82B and a process for producing the same | |
| US6893854B2 (en) | Nuclease | |
| JP3963971B2 (ja) | ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの産生方法 | |
| US7795408B2 (en) | Method for cloning and expression of Acc65I restriction endonuclease and Acc65I methylase in E. Coli | |
| US5731185A (en) | Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same | |
| US5849558A (en) | Discovery of and method for cloning and producing the PspGI restriction endonuclease | |
| US20050003420A1 (en) | Recycled mutagenesis of restriction endonuclease toward enhanced catalytic activity | |
| JP4115248B2 (ja) | Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍｂｉ制限エンドヌクレアーゼとｂｓｍｂｉメチラーゼのクローニング及び発現の方法、並びにｂｓｍｂｉエンドヌクレアーゼの精製方法 | |
| US5824529A (en) | Method for cloning and producing the PshAI restriction endonuclease | |
| Palis et al. | A simple and efficient method for in vitro site-directed mutagenesis | |
| WO1999064632A1 (en) | Restriction enzyme gene discovery method | |
| JP2007530046A (ja) | 新規モジュラーＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＣｓｐＣＩ、および新規特異性を有するエンドヌクレアーゼを製造するためのモジュラーエンドヌクレアーゼの用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TK9A | Rectifications: patents | ||
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20221217 |