JP2007530046A - 新規モジュラーＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＣｓｐＣＩ、および新規特異性を有するエンドヌクレアーゼを製造するためのモジュラーエンドヌクレアーゼの用途 - Google Patents

Abstract

新規制限エンドヌクレアーゼおよびその製造方法がシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）または組換え株大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮＥＢ＃１５５４（これは二本鎖ＤＮＡ分子内のｎｔ配列５’−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−３’（配列番号１４）において切断する）から入手可能である。該新規制限エンドヌクレアーゼは、特異性部分が、制限−修飾モジュールから独立したモジュールである、モジュラータンパク質である。

Description

制限エンドヌクレアーゼは、ある単細胞微生物（主に細菌および古細菌）に天然に存在する、ウイルスおよび他の寄生性ＤＮＡ要素による感染からそれらの生物を防御するように機能する酵素である。制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）内の特異的ヌクレオチド配列（「認識配列」）に結合し、これらの配列内またはこれらの配列の近傍で該ＤＮＡを切断し、該ＤＮＡを分裂させ、その破壊を誘発する。制限エンドヌクレアーゼは、通常、修飾メチルトランスフェラーゼと称される１以上の付随酵素と共に見出される。メチルトランスフェラーゼは、それが付随している制限エンドヌクレアーゼと同じ、ｄｓＤＮＡ内の配列に結合するが、該ＤＮＡを切断する代わりに、該配列内の塩基の１つへのメチル基の付加によりそれを改変する。この修飾（「メチル化」）は、制限エンドヌクレアーゼがその部位を生産的に認識するのを妨げ、ついで切断に対して該部位を抵抗性にする。メチルトランスフェラーゼは、それが付随する制限エンドヌクレアーゼに対する細胞性アンタゴニストとして機能して、その細胞自身のＤＮＡをその制限エンドヌクレアーゼによる破壊から防ぐ。制限エンドヌクレアーゼおよびそれに付随する修飾メチルトランスフェラーゼは、一緒になって、制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系を形成する。これは、いくつかの点で多細胞生物の免疫系が成し遂げることを微生物に成し遂げさせる、酵素の協力関係である。

大きな多様なクラスの制限エンドヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼの「ＩＩ型」クラスとして分類されている。これらの酵素はＤＮＡを一定の位置で切断する。該酵素は、精製されると、遺伝子のクローニングおよび分析のためにＤＮＡ分子を正確な断片に切断するために使用されうる。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの生化学的正確さは、化学的方法により達成されうるものを遥かに凌ぎ、これらの酵素を、分子生物学実験室における不可欠な試薬にする。遺伝子の切断のための分子的手段としてのこの能力において、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは過去２５年間においてライフサイエンスおよび医学に対して著しい影響を及ぼしており、学術的領域においても商業的領域においても変革をもたらしている。それらの有用性は新規制限エンドヌクレアーゼの絶えざる探索に拍車をかけており、多数の制限エンドヌクレアーゼが既に見出されている。現在のところ、２５０種を超えるＩＩ型エンドヌクレアーゼが公知であり、それぞれは、異なるＤＮＡ切断特性を有する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３０−Ｄ２３２（２００５））（Ｒｅｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅ）。これらの酵素の製造および精製は、通常は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような非天然宿主細胞の環境中での、それらをコードする遺伝子のクローニングおよび過剰発現によっても改善されている。

種々の制限酵素は類似した生物学的役割を果たしており、ｄｓＤＮＡの切断を引き起こす生化学的特徴を共有しているらしいため、それらはアミノ酸配列において互いに酷似していると考えられうるであろう。しかし、これは真実でないことが経験から示されている。驚くべきことに、互いに対する有意なアミノ酸類似性を有するどころか、ほとんどの酵素は特有のものであり、それらのアミノ酸配列は他の制限酵素にもいずれの他の公知種類のタンパク質にも類似していない。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、大部分は、進化中に互いに独立して、何百回も生じたらしく、今日の酵素は、共通の祖先に由来する異なるファミリーではなく、異質な集団に相当する。制限エンドヌクレアーゼは体制および作用において生化学的に多様である。すなわち、ホモ二量体として作用するものもあれば、単量体として作用するものもあり、ヘテロ二量体として作用するものもある。対称配列に結合するものもあれば、非対称配列に結合するものもある。連続的配列に結合するものもあれば、不連続的配列に結合するものもある。特有の配列に結合するものもあれば、複数の配列に結合するものもある。単一のメチルトランスフェラーゼに付随するものもあれば、２つのメチルトランスフェラーゼに付随するものもあり、さらには、メチルトランスフェラーゼには全く付随しないものもある。２つのメチルトランスフェラーゼが存在する場合には、それらは分離したタンパク質であることもあり、また、それらは融合していることもある。制限遺伝子および修飾遺伝子の順序および配向は様々であり、考えられうるあらゆる体制が生じうる。いくつかの種類のメチルトランスフェラーゼが存在し、アデニンをメチル化するものもあれば、Ｎ−４位または５位でシトシンをメチル化するものもある。どの修飾が特定の制限エンドヌクレアーゼを遮断するのか、どの種類のメチルトランスフェラーゼが任意の特定の場合にその制限エンドヌクレアーゼに付随するのか、あるいはそれらの遺伝子の順序または配向はどのようなものであるのかを演繹的に予測する方法は通常は存在しない。

ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼのクローニングの観点からは、実験目的の場合には、Ｒ−Ｍ系に存在する著しい可変性は、それぞれが特有のものであることを意味する。各酵素はアミノ酸配列および触媒挙動において特有であり、それぞれは、特有の微生物的環境に適合化された特有の酵素的関連性で存在し、それぞれは実験者に対して特有の課題を課す。制限エンドヌクレアーゼが直接的にクローニングされ過剰発現されうることもあるが、たいていは、それは不可能であり、１つの酵素に対してうまく働くことが別の酵素に対しては全く働かないことがある。１つのものでの成功は別のものでの成功を保証しないのである。

新規エンドヌクレアーゼは革新的な遺伝子工学のための機会を提供する。

本発明の１つの実施形態において、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）（ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−５８４６）から入手可能な実質的に純粋なＩＩＧ型制限エンドヌクレアーゼおよび単離されたＤＮＡを得た。該シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種からの該酵素の組換えＤＮＡおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮＥＢ＃１５５４（ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−５８８７）からのそのクローン化産物を提供する。

前記制限エンドヌクレアーゼのもう１つの特徴は、それが二本鎖デオキシリボ核酸分子内の以下の塩基配列：

を認識し、矢印で示されている選択的位置において該認識配列の両側で該ＤＮＡを切断することである。

前記の制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは、エンドヌクレアーゼおよびメチルトランスフェラーゼ触媒機能を発現する第１ＤＮＡセグメントと、該制限エンドヌクレアーゼの配列特異性機能をコードする第２ＤＮＡセグメントとを含むことが可能であり、この場合、第１ＤＮＡセグメントおよび第２ＤＮＡセグメントは１以上のＤＮＡ分子内に含有されている。

前記ＤＮＡはベクター内に挿入されうる。該ベクターは、ＣｓｐＣＩ制限エンドヌクレアーゼの制限および修飾ドメインをコードする第１ＤＮＡセグメントと該制限エンドヌクレアーゼの特異性ドメインをコードする第２セグメントとの少なくとも１つを含みうる。

本発明の１つの実施形態においては、ＣｓｐＣＩ制限エンドヌクレアーゼの制限および修飾ドメインをコードする第１ＤＮＡセグメントならびに該制限エンドヌクレアーゼの特異性ドメインをコードする第２セグメントにより形質転換された宿主細胞を提供する。第１ＤＮＡセグメントおよび第２ＤＮＡセグメントは１以上のＤＮＡベクター内に含有されうる。

本発明の１つの実施形態においては、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）のサンプルまたは前記宿主細胞を、制限エンドヌクレアーゼの産生に好ましい条件下で培養し、それより該エンドヌクレアーゼを精製する工程を含む、制限エンドヌクレアーゼを入手するための方法を提供する。

本発明の１つの実施形態において、改変された特異性を有するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの製造方法は、（ａ）酵素のセットから制限エンドヌクレアーゼを選択し（ここで、該セット内の各酵素は、特異性サブユニットおよび触媒サブユニットを有するモジュラー構造により特徴づけられ、該特異性サブユニットは更に、二成分認識配列の半分の部位に結合するＮ末端ドメイン、および該二成分認識配列の残りの半分の部位に結合するＣ末端ドメインを含む）、（ｂ）該特異性サブユニットを修飾し、（ｃ）改変された特異性を有する制限エンドヌクレアーゼを得ることを含む。

制限エンドヌクレアーゼがＣｓｐＣＩである場合には、半分の部位はＣＡＡであり、残りの半分の部位はＧＴＧＧである。

この方法においては、該特異性サブユニットを修飾する工程は更に、（ａ）該Ｎ末端ドメインを該Ｃ末端ドメインの第２のコピーで置換し、または該Ｃ末端ドメインを該Ｎ末端ドメインの第２のコピーで置換し、（ｂ）該Ｎ末端ドメイン、または該Ｃ末端ドメイン、または該Ｎ末端ドメインと該Ｃ末端ドメインとの両方を、第２の制限エンドヌクレアーゼまたはメチラーゼからのＤＮＡ結合ドメインで置換し、あるいは（ｃ）該Ｎ末端ドメイン、該Ｃ末端ドメインまたは両方のドメインを突然変異させて結合特異性を改変することを含む。これらの任意の修飾において、あるいはこれらの修飾の非存在下、追加的な修飾を加えることが可能である。すなわち、特異性サブユニットのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間のスペーサーアミノ酸配列の長さを変化させることが可能である。前記のいずれにおいても、特異性サブユニットおよび触媒サブユニットは別々の異なる遺伝子によりコードされうる。

本発明の１つの実施形態においては、第２の制限エンドヌクレアーゼまたはメチラーゼからのＤＮＡ結合ドメインは、もう１つのＩＩＧ型制限エンドヌクレアーゼであるＩ型制限エンドヌクレアーゼから、あるいはγ型ｍ^６Ａメチルトランスフェラーゼから誘導されうる。また、Ｎ末端切断ドメインは他のＤＮＡ結合タンパク質上に連結されうると予想される。

発明の詳細な説明
ほとんどの制限酵素においては、認識配列への結合をもたらす該タンパク質の部分（「特異性」：Ｓ）とその切断をもたらす該タンパク質の部分とが相互連結されている。これらの機能のいずれか一方の改変は他方の機能をしばしば損ない、該酵素を不活性にすることが、経験から示されている。特異性の機能と触媒の機能とが概ね分離された新規クラスの酵素を同定した。ＩＩＧ型クラスの制限エンドヌクレアーゼのこれらのメンバーは、制限と修飾との一対の活性が単一ポリペプチド鎖において組合されている一方で別のポリペプチド鎖に特異性が存在する大きな酵素である。このクラスの制限エンドヌクレアーゼの具体例としては、ＣｓｐＣＩ、ＢｃｇＩおよびＢａｅＩが挙げられる。理論により限定されるものではないが、ＣｓｐＣＩは１つのＲ−Ｍサブユニットと１つのＳサブユニットとの二量体として作用し、一方、ＢｃｇＩは２つのＲ−Ｍサブユニットと１つのＳサブユニットとの三量体として作用すると考えられる。

このクラスの酵素の、分離された機能体制は、タンパク質工学のための特異な機会を提供する。なぜなら、実施例Ｖに詳しく記載されているとおり、選択される新規特異性を得るために、該機能モジュールを、独立して操作することが可能だからである。

エンドヌクレアーゼのこの新規クラスは、Ｒ−Ｍ遺伝子とは異なる特異性サブユニットをコードするＤＮＡにより特徴づけられる。これらの遺伝子は天然においては並んで存在し、シスで発現される。また、これらの遺伝子は、異なるレプリコンに分離され、活性の低下を伴うことなくトランスで発現されうる。これらの遺伝子が、異なるアンプリコン内に別々に位置することは、Ｓ遺伝子およびＲ−Ｍ遺伝子が個別に改変されることを可能にし、該遺伝子を同一ＤＮＡ分子内に再結合させることなく、それらの２つのレプリコンを同一細胞内に導入することにより、該エンドヌクレアーゼまたはその変異体がインビボで容易に再構築されることを可能にする。再構築は個別に、または一緒に行われることが可能であり、これは、一方の改変遺伝子のライブラリーを、もう一方を含有する細胞内に形質転換することにより行われうる。両方の遺伝子は、混合物中で一緒に、択一的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）に同時形質転換されうる。

あるいは、Ｒ−Ｍ遺伝子およびＳ遺伝子は、それらが個別に異なる宿主細胞内で発現されることが可能となるよう、分離されうる。いずれのタンパク質も単独では毒性活性を示さないため、いずれか一方のサブユニットを産生する細胞は生存可能であると理解されるであろう。それらのサブユニットを別々に発現させることは、それらが個別に精製されることを可能にし、それらの２つのサブユニットの調製物を互いに単に混合することにより、該酵素またはその変異体がインビトロで容易に再構築されることを可能にする。精製されたタンパク質の代わりに細胞の抽出物を使用して、ハイスループットスクリーニングおよび／またはマルチプレックス化が達成されうる。

このクラスのエンドヌクレアーゼにＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼモチーフが存在することは、該エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ活性のほかに固有のメチル化活性を有することを示唆している。例えば、ＣｓｐＣＩはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）に依存的である。これらの活性の触媒部位を突然変異させることにより、これらのエンドヌクレアーゼの変異体が単離されうる。これらの突然変異体においては、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡメチル化活性またはそれらの両方が欠損していることが可能である。

典型的には、ＩＩＧ型クラスにおけるエンドヌクレアーゼの特異性サブユニットは、ＤＮＡ分子内のどの標的配列がＲＭサブユニットによる切断を受けるのかを決定する。Ｒ−Ｍサブユニットは、ＤＮＡ切断のための特有のＮ末端ドメイン、およびＤＮＡメチル化のための特有のＣ末端ドメインを有する。Ｓサブユニットは、二成分認識配列の半分に結合する特有のＮ末端ドメイン、および残りの半分に結合する特有のＣ末端ドメインを有する。

認識部位から遠い配列においてＤＮＡを特徴的に切断する他のモジュラー酵素が存在する。しかし、これらの酵素は単量体（ＣｊｅＩおよびＡｌｏＩ）またはホモ二量体（ＨａｅＩＶ）であり、どちらのタイプも、Ｒ−Ｍ−Ｓの組成を有する単一タンパク質である。

モジュラー構造を有することが認められている任意の未知の制限エンドヌクレアーゼに関して、該クラスのエンドヌクレアーゼの認識配列を、公知配列の標的ＤＮＡにおける切断部位の位置をマッピングすることにより決定する。これらの領域のＤＮＡ配列を、類似性および共通の特徴に関して比較する。候補認識配列を、種々のＤＮＡのエンドヌクレアーゼ切断により生じた、観察された制限断片と比較する。エンドヌクレアーゼ消化により生じたＤＮＡ断片のおおよそのサイズを、ｈｔｔｐ：／／ｔａｑ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／〜ｖｉｎｃｚｅ／ＲＥＢｐｒｅｄｉｃｔｏｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ．においてアクセスされうるプログラムＲＥＢＰｒｅｄｉｃｔｏｒに入力する。実施例ＩＩＩには、ＣｓｐＣＩに関する潜在的認識部位を予想するためにＲＥＢＰｒｅｄｉｃｔｏｒをどのようにして使用したかが記載されている。

前記のタイプのモジュラーエンドヌクレアーゼは、宿主細胞において組換えの産物として又は天然株を培養することにより得ることが可能である。宿主細胞を、１００ｍｇ／ｍｌ アンピリシンで補足された適当な培地内で培養し、３７℃で好気的にインキュベートする。後期対数増殖期の細胞を遠心分離により集め、直ちに破壊するか又は−７０℃で凍結保存する。

細胞溶解された細胞から該エンドヌクレアーゼを単離するためには、通常のタンパク質精製技術を用いることが可能である。細胞ペーストをバッファー溶液に懸濁させ、音波処理、高圧分散または酵素消化により破裂させて、該バッファー溶液によるエンドヌクレアーゼの抽出を可能にさせる。ついで無傷細胞および細胞残渣を遠心分離により除去して、該エンドヌクレアーゼを含有する無細胞抽出物を得る。ついでイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーまたはこれらの方法の組合せにより、該エンドヌクレアーゼを該無細胞抽出物から精製する。

対称ＤＮＡ配列およびハイブリッドＤＮＡ配列を認識する新規酵素を得るために、Ｉ型制限酵素における特異性ドメインの改変が達成されている（Ｂｉｃｋｌｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８ｃｌ３６（１９９４）；Ｂｉｃｋｌｅら，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １５：４７７５−４７８３（１９９６））。実施例ＶＩには、モジュラーＩＩ型制限酵素における特異性ドメインが、該酵素の特異性を改変するためにどのようにして操作されうるかが記載されている。

本発明の実施形態は、以下の実施例により更に詳しく例示される。これらの実施例は、本発明の実施例の理解を助けるために記載されており、本発明を限定するものとは解釈されない。

前記および後記において引用されている参考文献ならびに米国仮特許出願第６０／５５５，７９５号を参照により本明細書に組み入れることとする。

実施例
実施例Ｉ：ＣｓｐＣＩの単離
（ｉ）シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）または（ｉｉ）形質転換宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ＃１５５４を培養し、該細胞からエンドヌクレアーゼＣｓｐＣＩを回収することにより、ＣｓｐＣＩを得た。シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）のサンプルは、ブダペスト条約の条項および条件に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に２００４年３月４日に寄託されており、特許受託番号ＰＴＡ−５８４６が付与されている。ＣｓｐＣＩを発現する組換え株のサンプルである大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＮＥＢ＃１５５４）も、ブダペスト条約の条項および条件に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に２００４年３月２４日に寄託されており、特許受託番号ＰＴＡ−５８８７が付与されている。

シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＮＥＢ＃１５５４）を好気的に３７℃でインキュベートした。後期対数増殖期の細胞を遠心分離により集め、直ちに破壊するか又は−７０℃で凍結保存する。

ＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼを通常のタンパク質精製技術によりシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＮＥＢ＃１５５４）から単離した。細胞ペーストをバッファー溶液に懸濁させ、音波処理、高圧分散または酵素消化により破裂させて、該バッファー溶液によるエンドヌクレアーゼの抽出を可能にさせる。ついで無傷細胞および細胞残渣を遠心分離により除去して、ＣｓｐＣＩを含有する無細胞抽出物を得る。ついでイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーまたはこれらの方法の組合せによりＣｓｐＣＩを該無細胞抽出物から精製して、該エンドヌクレアーゼを得た。

実施例ＩＩ：天然または組換えＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼの製造
２７７グラムの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ＃１５５４ ＣｓｐＣＩ細胞ペレットまたはシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を、３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１リットルのバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４），１．０ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５％ グリセロール）に懸濁させ、ガウリン（Ｇａｕｌｉｎ）ホモジナイザーに〜１２，０００ｐｓｉｇで通過させた。ライセートを〜１３，０００×Ｇで４０分間遠心分離し、上清を集めた。

上清溶液を、バッファーＡ＋３００ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡化された４００ｍｌ ＤＥＡＥ ファーストフロー（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，かつてはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）にアプライし、ＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼ活性を含有する溶出液をバッファーＡで１：１希釈した。

希釈された酵素を、バッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１．０ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５％ グリセロール）中で平衡化された３７５ｍｌ ヘパリン・ハイパーＤ（Ｈｅｐａｒｉｎ Ｈｙｐｅｒ−Ｄ）カラム（Ｂｉｏｓｅｐｒａ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ ＭＡ）にアプライした。バッファーＢの洗浄液２．５Ｌをアプライし、ついでバッファーＢ中の０．１５Ｍから１Ｍまでの勾配の２ＬのＮａＣｌをアプライし、画分を集めた。２０μＭ（Ａｄｏｍｅｔ）で補足された５０マイクロリットルのＮＥＢｕｆｆｅｒ２バッファー中の１マイクログラムのファージラムダＤＮＡ（ＮＥＢ）と共に３７℃で１５分間インキュベートすることにより、画分をＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。０．３Ｍから０．３５ＭのＮａＣｌでＣｓｐＰＩ活性が溶出した。

ＣｓｐＣＩ活性を含有するヘパリン・ハイパーＤ（Ｈｅｐａｒｉｎ Ｈｙｐｅｒ−Ｄ）カラム画分をプールし、バッファーＢ中で平衡化された２００ｍｌ セラミック（Ｃｅｒａｍｉｃ）ｈｔｐカラム（Ｂｉｏｓｅｐｒａ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ ＭＡ）上に直接的にローディングした。バッファーＢの洗浄液１Ｌをアプライし、ついでバッファーＢ中の０Ｍから０．６Ｍまでの勾配のＫＨＰＯ_４（ｐＨ７．５）１Ｌをアプライし、画分を集めた。２０μＭのＡｄｏＭｅｔで補足された５０マイクロリットルのＮＥＢｕｆｆｅｒ２バッファー中の１マイクログラムのファージラムダＤＮＡと共に３７℃で１５分間インキュベートすることにより、画分をＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。０．４Ｍから０．５ＭまでのＫＨＰＯ_４でＣｓｐＣＩ活性が溶出した。

ＣｓｐＣＩ活性を含有するセラミック（Ｃｅｒａｍｉｃ）ＨＴＰカラム画分をプールし、バッファーＣ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１００ｍＭ ＮａＣｌ，１．０ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５％ グリセロール）中に透析した。

このプールを、バッファーＣ中で平衡化された５０ｍｌ ソース（Ｓｏｕｒｃｅ）Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；かつてはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）中に流し、バッファーＣ中で平衡化されたヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）ＴＳＫ上に直接的に流した。バッファーＣの洗浄液２５０ｍＬをアプライし、ついでバッファーＣ中の０．１Ｍから０．８Ｍまでの勾配のＮａＣｌの４００ｍｌをアプライし、画分を集めた。２０μＭのＡｄｏＭｅｔで補足された５０マイクロリットルのＮＥＢｕｆｆｅｒ２バッファー中の１マイクログラムのファージラムダＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と共に３７℃で１５分間インキュベートすることにより、画分をＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。０．３Ｍから０．３５ＭまでのＮａＣｌでＣｓｐＣＩ活性が溶出した。

該プールを保存バッファー（Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１００ｍＭ ＮａＣｌ，１．０ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５０％ グリセロール）中に透析した。この方法により１００万単位のＣｓｐＣＩを得た。このようにして得られたＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、混入ヌクレアーゼを含有しない。この調製物のサンプルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、それが約７０ｋＤａおよび３５ｋＤａの２つの主要タンパク質を２：１のおおよその質量比で含むことを示した。

活性測定
ＣｓｐＣＩ活性：１〜１０マイクロリットルのサンプルを、２０μＭのＡｄｏＭｅｔで補足された１マイクログラムのファージラムダファージＤＮＡを含有する１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）よりなる５０マイクロリットルの基質溶液に加えた。該反応液を３７℃で６０分間インキュベートした。２０マイクロリットルの停止溶液（５０％ グリセロール，５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および０．０２％ ブロモフェノールブルー）を加えることにより、該反応を停止させた。該反応混合物を１％ アガロースゲルにアプライし、電気泳動させた。得られたバンドをＤＮＡサイズ標準物との比較により同定した。

単位の定義：１単位のＣｓｐＣＩは、２０μＭのＡｄｏＭｅｔで補足された１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）５０マイクロリットルの反応容量中の１マイクログラムのファージラムダＤＮＡを３７℃で１時間以内に完全に切断するのに要するＣｓｐＣＩの量と定義される。

ＣｓｐＣＩの特性：
ＡｄｏＭｅｔ：２０ｍＭ ＡｄＭｅｔでのＣｓｐＣＩ反応の補足は該酵素の活性を著しく増強した。ＡｄｏＭｅｔを使用しなかった反応においては、該酵素は、ＡｄｏＭｅｔで補足された反応においてそれが示した切断活性の５％未満の活性しか示さず、このことは、ＡｄｏＭｅｔがこの酵素に必要な補因子であることを示している。

種々の反応バッファーにおける活性：ＣｓｐＣＩは、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２＋ＡｄｏＭｅｔにおいて、他の標準的なＮＥＢｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と比較して、最も活性であることが判明した。

以下のＮＥＢｕｆｆｅｒ中、３７℃で１時間の消化は、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）＋２０ｍＭ ＡｄｏＭｅｔに対する以下のおおよその切断活性比率（％）を示した。

ＮＥＢｕｆｆｅｒ１＋２０ｍＭ ＡｄｏＭｅｔ：１０％
ＮＥＢｕｆｆｅｒ２＋２０ｍＭ ＡｄｏＭｅｔ：１００％
ＮＥＢｕｆｆｅｒ３＋２０ｍＭ ＡｄｏＭｅｔ：１０％
ＮＥＢｕｆｆｅｒ４＋２０ｍＭ ＡｄｏＭｅｔ：７５％
ＮＥＢｕｆｆｅｒ２−（ＡｄｏＭｅｔ無し）：＜５％
１６時間の反応における活性：１６時間の消化において１マイクログラムのファージラムダＤＮＡを切断するためには０．５単位のＣｓｐＣＩが要求され、一方、１時間の消化において１マイクログラムのファージラムダＤＮＡを切断するためには１単位が要求される。

温度：１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２＋２０μＭ ＡｄｏＭｅｔ中の１時間のインキュベーションにより３７℃でＣｓｐＣＩの単位力価を測定した。３７℃で反応を行う前の７０℃で２０分間のＣｓｐＣＩのインキュベーションは該酵素を不活性化しない。７０℃で２０分間の熱処理の後、ＣｓｐＣＩはほぼ完全な活性を保有する。

両側性切断：ＣｓｐＣＩはその認識配列の両側でＤＮＡを切断する。その結果、ＣｓｐＣＩ切断は、規則的な制限断片を与えることに加えて、各認識部位からの断片である３５±１ｂｐの小さな内部「小断片」を与える。これらの小断片はゲル電気泳動により可視化され（図２）、認識配列と、各側における切断部位までのフランキングＤＮＡとを含む。小断片を生成する２つの切断事象は別々に進行するらしい。すなわち、切断は、両側で同時に生じるのではなく、まず、認識配列の一方の側で生じ、ついで、もう一方の側で生じる。その結果、ＤＮＡの部分消化サンプルをゲル電気泳動により調べると、該ＤＮＡ断片は、小断片がその末端から切断されているかどうかに応じて二重線または三重線として現れる（図３）。

実施例ＩＩＩ：ＣｓｐＣＩ切断部位の測定
認識配列に対するＣｓｐＣＩ誘導性切断の位置を、２つの方法、すなわち、プライマー合成およびランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）自動化配列決定により決定した。

Ａ：プライマー合成法
プライマー伸長産物を切断し、ついでそれを、同じプライマーおよび鋳型から得られた標準ジデオキシ配列決定反応物のセットと共に電気泳動に付すことにより、認識配列に対するＣｓｐＣＩ切断の位置を決定した。３００９位における認識配列位置の近傍のプライマーと共に鋳型としてＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡを使用した。このプライマー／鋳型の組合せに関する読取り可能な配列は３０６９位から始まり、ＣｓｐＣＩ部位まで続く。

配列決定反応
切断部位の決定のための修飾を伴うＳｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２．０ ＤＮＡ配列決定キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，かつてはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、配列決定反応を行った。２．５マイクロリットルのｄＨ２Ｏ、３マイクロリットルの５×配列決定バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、８マイクロリットルのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（１．６マイクログラム）および１．５マイクロリットルのプライマー（濃度３．２ｍＭ）を一緒にすることにより、鋳型およびプライマーを０．５ｍｌ エッペンドルフチューブ内で集合させた。該プライマー−鋳型溶液を６５℃で２分間インキュベートし、ついで実験台上の６５℃の水のビーカー内で２０分かけて３７℃に冷却させて該プライマーをアニールさせた。標識混合物（１：２０希釈物）およびＴ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅポリメラーゼを該製造業者の指示に従い希釈した。該アニール化プライマーおよび鋳型チューブを氷上に配置した。このチューブに、１．５マイクロリットルの１００ｍＭ ＤＴＴ、３マイクロリットルの希釈ｄＧＴＰ標識混合物、１マイクロリットルの［α−^３３Ｐ］ｄＡＴＰ（２０００Ｃｉ／ｍＭ，１０ｍＣｉ／ｍｌ）および３マイクロリットルの希釈Ｔ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅポリメラーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，かつてはＡｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加えた。該反応を混合し、室温で４分間インキュベートした。

ついで３．５マイクロリットルのこの反応物を、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ配列決定終結反応のための２．５マイクロリットルの終結混合物を含有する４本のチューブのそれぞれに移した。残りの反応物に、１０マイクロリットルの反応伸長混合物（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ｍｉｘ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，かつてはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加えた。これは、後続の切断のためのＣｓｐＣＩ認識部位を経て伸長するＤＮＡの標識鎖を与えるよう終結を伴うことなくＣｓｐＣＩ部位を経てそれを十分に越えてプライマーが伸長するのを可能にするｄＮＴＰ（ｄｄＮＴＰ非含有）の混合物である。該反応物を３７℃で５分間インキュベートした。該Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ反応物に４マイクロリットルの終結溶液を加え、該サンプルを氷上で保存した。ついでＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，かつてはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を不活性化するために該伸長反応物を７０℃で２０分間インキュベートし、ついで氷上で冷却した。

ついで１０マイクロリットルの該伸長反応物をゾーン０．５ｍｌ エッペンドルフチューブ内に配置し、７マイクロリットルを第２のチューブ内に配置した。第１のチューブに１マイクロリットル（約０．５単位）のＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼを加えた。該反応を混合し、ついで２マイクロリットルを第２のチューブに移した。これらの酵素消化反応物を混合し、ついで３７℃で１時間インキュベートし、ついで該反応物を半分に分割した。一方の半分に、４マイクロリットルの終結溶液を加え、混合した（「マイナス」ポリメラーゼ反応）。もう一方の半分に、８０ｍＭ ｄＮＴＰを含有する０．４マイクロリットルのクレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ＃２１０）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を加え（「プラス」反応）、該反応物を室温で１５分間インキュベートし、ついで４マイクロリットルの終結溶液を加えた。

同じプライマーおよび鋳型の組合せから得られた配列決定反応物のセットの隣で、伸長反応のＣｓｐＣＩ消化物と共に、該配列決定反応産物を６％ ビス−アクリルアミド配列決定ゲル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）上で電気泳動させた。

結果
伸長反応産物の消化（「マイナス」反応）は、ＣｓｐＣＩ認識配列の１２塩基５’側のＣ残基（５’−ＣＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＣＣＣＡＣＡＡＧＡＡＴＴＧ−３’（配列番号１０））と共に泳動するバンドを与え、このことは、この鎖上の認識配列の５’側の第１２塩基と第１１塩基との間での切断を示している。この鎖上のＣｓｐＣＩ認識部位の１２塩基３’側のＡ残基（ＣＣＡＣＡＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴＴＡＡＧＣＣＣＡＡ（配列番号１１））と共に泳動する第２のバンドが生成し、このことは認識部位の３’側の第１２塩基と第１３塩基との間での切断を示している。該認識部位から１塩基離れた位置にもかすかなバンドが存在し、このことは、該分子の僅かな一部が認識配列の３’側の第１３塩基と第１４塩基との間で切断されたことを示している。クレノウＤＮＡポリメラーゼでの該切断伸長反応産物の処理（「プラス」反応）は、前記の第１のバンドより２塩基短いバンドを与え、これは認識配列の１４塩基５’側のＡ残基（５’−ＡＴＣＧＡＧＡＧＡＴＡＡＣＣＣＡＣＡＡＧＡＡＴＴＧ−３’（配列番号１２））と共に泳動し、このことは該ＤＮＡの反対鎖上の認識配列の３’側の第１３塩基と第１４塩基との間の切断（５’−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ（Ｎ_１３）（配列番号１３））を示している。「プラス」レーンにおいて、該部位の１２塩基３’側の、元のバンドに対応する幾つかの追加的なバンド、ならびに認識配列により近い反対ＤＮＡ鎖上の切断から生じた１塩基および２塩基短いバンドも観察された（図４）。

これらの結果は、後記の第２の方法により得られた結果と合わせると、ＣｓｐＣＩがＤＮＡをその認識配列の両側で切断し、配列５’−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−３’（配列番号１４）の５’側のＮ１１／Ｎ１３またはＮ１０／Ｎ１２において及び該配列のＮ１３／Ｎ１１またはＮ１２／Ｎ１０においてそのように切断して、２−塩基３’−伸長を有するＤＮＡ断片、および認識部位を含有する３４、３５または３６塩基の切断断片を与えうることを示している。

Ｂ：ランオフ配列決定法
第２のアプローチにおいては、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用するＣｓｐＣＩ部分切断鋳型ＤＮＡの自動配列決定を用いて、切断部位を経て伸長するシークエンシングトレースを得た。ＣｓｐＣＩ認識配列を含有するオリゴヌクレオチドをｐＵＣ１９のｎｔ２６１７のＡａｔＩＩ部位内に両方の配向で挿入することにより構築された２つのプラスミド（ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１およびｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４）を鋳型として使用した（後記の実施例ＩＩＩ第２節に記載されている）。

ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１およびｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４のＣｓｐＣＩ切断
認識部位の両側の切断部位を決定するために、ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１およびｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４の部分消化物に対して配列決定反応を行った。

該消化は以下のとおりに行った。

ａ．
２５マイクログラムのｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１およびｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４、
１００マイクロリットルのＮＥＢｕｆｆｅｒ２、
１マイクロリットルの３２ｍＭ ＡｄｏＭｅｔ、
１０００マイクロリットルまでのｄＨ２Ｏ
を一緒にする。

ｂ．該混合物を、１本の反応チューブ内に２００マイクロリットル、後続の８本のチューブに１００マイクロリットル分配する。

ｃ．第１チューブに１６０単位のＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼを加え、混合し、１００マイクロリットルを取り出し、それを第２チューブに加え、混合し、１００マイクロリットルを取り出し、それを第３チューブに加えるなどを、第９チューブに達するまで繰返す。

ｄ．全９個の反応物を３７℃で６０分間インキュベートし、ついで氷上に配置する。

ｅ．各反応のサンプルをアガロースゲル上で分析し、完全切断および部分切断プラスミドを選択する。

ｆ．Ｚｙｍｏ ＤＮＡクリーン・アンド・コンセントレーター（Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）−５遠心カラムを製造業者の推奨（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）に従い使用して、配列決定のために該切断プラスミドを精製する。

配列決定反応
ＣｓｐＣＩで切断されたｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１および−４プラスミド鋳型、ならびに一方の側でＣｓｐＣＩ部位から約２５０ｎｔ離れた位置で合成を開始するプライマー（フォワードプライマー）と、もう一方の側のＣｓｐＣＩ部位から１６０ｎｔ離れた位置で合成を開始するプライマー（リバースプライマー）とのペアを使用して、ＡＢＩ３７７ ＤＮＡシークエンサーで該反応を行った。これらの２つのプライマーの配列は以下のとおりである。

５’−ＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧ−３’（配列番号１５）
フォワードプライマー；これはｐＵＣ１９のｎｔ２３４６−２３６６に対応し、該ベクターのマイナス鎖に対処するものである。

５’−ＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＧＧＣ−３’（配列番号１６）
リバースプライマー；これはｐＵＣ１９のｎｔ９６−１１８の相補体に対応し、該ベクターのプラス鎖に対処するものである。

配列決定反応が鋳型鎖の５’末端に遭遇した場合には、それは、しばしば、最終的な非鋳型化Ａを合成鎖に付加する。鋳型ＤＮＡが、不完全に切断されたＤＮＡサンプルの場合のように無傷鎖と末端切断鎖との混合物を含む場合には、切断の位置は、正常ピーク上に重ね合わされた異常なＡピークにより、および後続ピークの高さにおける全体的な減少により、シークエンシングトレースにおいて現れる。例えば、異常な位置に通常存在する塩基がＡ−Ｇ以外のものである場合には、混合シグナル（この実施例ではＧ＋Ａ）が見られる。しかし、また、この位置に通常存在する塩基がＡである場合には、恐らく通常より高い単一のＡピークが見られ、これは明白な同定を混乱させる。

結果
認識配列の５’側の切断の位置に関しては明白な結果が得られたが、３’側の切断に関してはデータはより乏しいものであった。しかし、全体としては、それらは、２−塩基３’−突出部を有する断片を与えるエンドヌクレアーゼ切断と一致した。代表的な反応からのシークエンストレースを図５に示す。

フォワードプライマーとの部分切断ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４の反応は、認識配列の前にはＧ１３ｎｔ上に重ね合わされる強力な異常Ａを、そしてその後には予想より強力なＡピーク１１ｎｔを示した。

５’．．．ＡＡＧＴＧｃｃａｃｃｔｇａｃｇｔｇｃａａｃｃｔａｇｇｔｇｇｃａｃｇｔｃｔａａｇａａａｃ．．．（配列番号１７）。

（注釈．下線部：ＣｓｐＣＩ認識部位；ボールド：異常Ａが重ね合わされる正常塩基；大文字：正常な高さのピーク；小文字：減少した高さのピーク）。

これらの結果は、相補鎖の切断（｜で示されている）が生じることを示唆している：
５’−ＧＴＴＴ｜ＣＴＴＡＧＡＣＧＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＧＴＴＧＣＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣ｜ＡＣＴＴ．．．（配列番号１８）。

リバースプライマーとの部分切断ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４の反応は認識配列の前にＴ１２ｎｔ上の強力なＡ異常を示し、該配列の後の２つのＧ１１および１２ｎｔ下の２つの異常Ａの示唆を示した：
５’．．．ＴＧＧＴＴｔｃｔｔａｇａｃｇｔｇｃｃａｃｃｔａｇｇｔｔｇｃａｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｃａｃｔ．．．（配列番号１９）。

Ｇ−１１異常を一時的に無視すると、これらの結果は、相補鎖の切断が生じることを示唆している：
５’．．．ＴＧＣ｜ＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＧＣＡＡＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡ｜ＡＣＣＡ．．．（配列番号２０）。

これらの結果を合わせると、ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４内の部位におけるＣｓｐＣＩ切断は以下のとおりであるらしい：
５’．．．ＡＧＴＧＣ｜ＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＧＣＡＡＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡ｜ＡＣＣ．．．（配列番号２１）。

３’．．．ＴＣＡ｜ＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣ｜ＴＴＴＧＧ．．．（配列番号２２）。

すなわち、１１／１３ ＣＡＡ Ｎ_５ ＧＴＧＧ １２／１０（配列番号１４）。

部分切断ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１をフォワードプライマーで調べた場合、同じＧ−１３およびＡ−１１ Ａ異常が見られ、それをリバースプライマーで調べた場合、同じＴ１２ Ａ異常が見られた。したがって、ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１内の部位における切断は以下のとおりであるらしい：
５’．．．ＡＧＴＧＣ｜ＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧＣＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡ｜ＡＣＣ．．．（配列番号２３）。

３’．．．ＴＣＡ｜ＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣ｜ＴＴＴＧＧ．．．（配列番号２４）。

すなわち、１０／１２ ＣＡＡ Ｎ_５ ＧＴＧＧ １３／１１（配列番号１４）。

切断距離におけるこの数的逆転は、ＤＮＡ切断の位置が認識配列の配向に無関係であり、フランキング配列の性質に左右されることを示している。認識部位の左側（反時計回り）の配列は両方のプラスミドにおいて同じであり、右側（時計回り）の配列でも同様である。後者は幾らかＡ：Ｔに富んでおり、左側のＧ：Ｃに富むＤＮＡより物理的に伸長していると考えられるであろう。したがって、該エンドヌクレアーゼは、それをその結合部位から評価すると、該ＤＮＡが伸長している場合にはいずれかの側の１２／１０を切断し、該ＤＮＡがコンパクトな場合には１３／１１を切断する。

前記において一時的に無視したＧ−１１異常に戻ると、ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４／リバースプライマー反応におけるその存在は、それが存在しなければコンパクトな状態となる左側のＤＮＡが、おそらく、消化中のスーパーコイル解除を伴うねじれ緩和により、より伸長して、この位置における１０／１２切断が生じうることを示唆している。これは、ある程度は、ＣｓｐＣＩが、
１０／１２ ＣＡＡ Ｎ_５ ＧＴＧＧ １２／１０ （配列番号１４）を、および伸長により、
１１／１３ ＣＡＡ Ｎ_５ ＧＴＧＧ １３／１１ （配列番号１４）を切断しうることを証明している。

実施例ＩＶ：ＣｓｐＣＩ制限−修飾遺伝子のクローニング
１．ゲノムＤＮＡの調製
以下の工程により、２．５ｇのシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４からゲノムＤＮＡを調製した。

ａ．リゾチーム（最終２ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（最終１％）および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の添加による細胞壁の消化。

ｂ．２４ｍｌの細胞溶解混合物（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０，６２．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ）の添加による細胞溶解。

ｃ．ＤＮＡのフェノール−ＣＨＣｌ_３抽出（等容量で２回）によるタンパク質の除去。

ｄ．４リットルのＴＥバッファー中での透析、４回のバッファー交換。

ｅ．ＲＮＡを除去するためのＲＮアーゼＡ処理。

ｆ．０．４Ｍ ＮａＣｌおよび０．５５容量の１００％ イソプロパノール中でのゲノムＤＮＡ沈殿、巻取り、乾燥およびＴＥバッファーへの再懸濁。

２．プラスミドベクターｐＵＣ２ＣｓｐＣの調製
２つのＣｓｐＣＩ認識部位（１つはｎｔ２６１７におけるユニークＡａｔＩＩ部位、もう１つはｎｔ１５６３におけるＤｒａＩ部位）を挿入することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングベクターｐＵＣ１９からプラスミドクローニングベクターｐＵＣ２ＣｓｐＣを構築した。

ａ．相補的オリゴヌクレオチドの２つのペアを合成した。各ペアのアニーリングはＣｓｐＣＩ認識部位を与え、また、連結産物がもはやＡａｔＩＩ部位もＤｒａＩ部位も含有しないＡａｔＩＩまたはＤｒａＩ ＤＮＡ断片に連結されうる二本鎖末端を与える。

アニールした二本鎖形態のオリゴヌクレオチド配列を以下に示す。

ｂ．ＡａｔＩＩ部位リンカーの場合、１マイクログラムのｐＵＣ１９を、小さな容量中、ＡａｔＩＩで消化した。

ｃ．アニールしたオリゴヌクレオチドリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびリガーゼバッファーと共に該反応に加え、該反応を室温で２時間インキュベートした。

ｄ．反応産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換し、アンピシリンの存在下で増殖させた。

ｅ．Ａｐ^Ｒ形質転換体を単離し、それらのプラスミドを、ＦａｓｔＰｌａｓｍｉｄ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して調製し、制限酵素ＡａｔＩＩおよびＣｓｐＣＩで消化することにより分析した。

ｆ．ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１およびｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４の２つのプラスミド（それぞれは、ＡａｔＩＩ部位を欠くが、２つの可能な反対の配向のいずれかで１つのＣｓｐＣＩ認識部位を含有する）を同定した。ＤｒａＩ部位におけるリンカーの挿入のために、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を該製造業者の推奨に従い使用して、これらのうちの１つｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４を大規模精製した。

ｇ．ＤｒａＩ部位リンカーの場合には、部分消化産物のみが望まれる。したがって、消化、連結およびＤｒａＩ部位リンカー成分をすべて、同時に加えた。

ｈ．２、５、１０、２０、４０および１００分間のインキュベーション時間の後、該反応のサンプルを取り出し、氷上に配置した。

ｉ．反応サンプルを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換し、前記ｄおよびｅと同様にしてプラスミドを調製し分析し、制限酵素ＤｒａＩおよびＣｓｐＣＩで消化した。

ｊ．２つのＣｓｐＣＩ部位を含有する１つのプラスミドｐＵＣ２ＣｓｐＣを同定し、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔを製造業者（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の推奨に従い使用して大規模調製した。

ＣｓｐＣＩ制限−修飾系の遺伝子をクローニングするためのプラスミド選択ベクターとしてプラスミドｐＵＣ２ＣｓｐＣを使用した。プラスミドｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１および−４をＣｓｐＣＩ切断反応の分析のための基質として使用した（前記実施例ＩＩ第ｂ節）。

３．ゲノムＤＮＡ消化およびライブラリー構築
完全消化および部分消化を達成するために、〜１０マイクログラム量のシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４ゲノムＤＮＡを個々に消化するために、制限酵素ＡｐｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩおよびＳａｕ３ＡＩを使用した。該制限酵素の６５℃で１５分間の熱不活性化の後、ＡｐｏＩ消化物を、ＥｃｏＲＩで切断されたＣＩＰ脱リン酸化ｐＵＣ２ＣｓｐＣベクターに連結し、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩおよびＳａｕ３ＡＩ消化物を、ＢａｍＨＩで消化されたＣＩＰ脱リン酸化ｐＣｓｐＩ×２に連結した。ついで、ＣａＣｌ_２法によりコンピテントにされたｅｎｄＡ⁻大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２６８３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を形質転換するために、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで一晩行った連結の産物を使用した。数千個のアンピシリン耐性（Ａｐ^Ｒ）形質転換体を各連結から得た。各連結からのこれらのコロニーをプールし、５００ｍｌのＬＢ＋Ａｐ中で一晩増殖させ、ＣｓＣｌ勾配精製によりそれらからプラスミドＤＮＡを調製して一次プラスミドライブラリーを作製した。

４．メチラーゼ選択によるＣｓｐＣＩ遺伝子のクローニング
該一次プラスミドライブラリーのそれぞれの１マイクログラムを、〜８単位のＣｓｐＣＩでの３７℃で１時間の消化により攻撃した。該消化物をＥＲ２６８３内に再び形質転換し、生存体に関してプレーティングした。ＢｇｌＩＩＩライブラリーからは約５００個の、ＢａｍＨＩライブラリー、Ｓａｕ３ＡＩライブラリーおよびＡｐｏＩライブラリーからはそれぞれ５、２９および２０個のＡｐ^Ｒ生存体が得られた。ＢａｍＨＩ、Ｓａｕ３ＡＩおよびＡｐｏＩ生存体からのプラスミドを、Ｃｏｍｐａｓｓ Ｍｉｎｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ法を用いて個々に調製し、ＣｓｐＣＩ消化に付した。ＡｐｏＩライブラリーからの２０個中３個のクローンがＣｓｐＣＩに対して抵抗性であることが判明したが、ＢａｍＨＩライブラリーおよびＳａｕ３ＡＩライブラリーからのすべてのクローンは感受性であることが判明した。ＢｇｌＩＩライブラリーからの生存体をプールし、それを使用して二次プラスミドライブラリーを調製した。これを再びＣｓｐＣＩで攻撃し、プレーティングした。該生存体のなかで、いくつかの追加的なＣｓｐＣＩ抵抗性クローンが見出された。

５．ｃｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍエンドヌクレアーゼ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子およびｃｓｐＣＩ−Ｓ特異性遺伝子の同定
ＣｓｐＣＩ抵抗性プラスミドクローン中の挿入ＤＮＡのｎｔ配列をジデオキシ自動配列決定により決定した。ＧＰＳ−１系（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用するクローンＡｐｏＩ＃３内へのトランスポゾン挿入は、配列決定のための初期基質を与え、ついでクローンＡｐｏＩ＃３および＃１２ならびにＢｇｌＩＩ＃２および＃１７上でプライマー歩行を用いて該配列を最終決定した。合計で４６１６ｂｐを決定し（図６）、このなかで、１８９９ｂｐ（ｎｔ１６０４−３５０２）および９６０ｂｐ（ｎｔ３４８９−４４４８）の２つの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見出された（図７）。それらの２つのＯＲＦは同一配向を有し、１４ｂｐ重複している（図８）。該ＯＲＦの分析は、大きいほうのＯＲＦ（ｃｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍと称される）が、組合された制限および修飾酵素（Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩ）をコードしており、小さいほうのＯＲＦ（ｃｓｐＣＩ−Ｓと称される）がＤＮＡ配列特異性タンパク質Ｓ−ＣｓｐＣＩをコードしていることを示した（図９）。Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩは６３２ａａの長さ及び７０，７１２ダルトンの分子量（あるいは、Ｎ末端ｆＭｅｔを伴わない場合には、６３１ａａおよび７０，５８０ダルトン）を有すると推定される。Ｓ−ＣｓｐＣＩは３１９ａａの長さ及び３５，２６７ダルトンの分子量（あるいは、ｆＭｅｔを伴わない場合には、３１８ａａおよび３５，１３６ダルトン）を有すると推定される。ＣｓｐＣＩ制限エンドヌクレアーゼ活性のためには両方のタンパク質が必要である。

Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩは、ＤＮＡメチル化触媒部分に結合したＤＮＡ切断触媒部分を含むらしい。Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩのＮ末端半分であるアミノ酸２−３００は、多少なりとも、エンドヌクレアーゼドメインを形成し、主として、ＣｓｐＣＩのＤＮＡ鎖切断活性をもたらすと考えられる。この部分は、多数のＤＮＡエンドヌクレアーゼの触媒部位に見出されるモチーフであるａａ配列モチーフ．．．ＰＥ−Ｘ_１５−ＥＣＫ．．．（ａａ５７−７６）を含み、したがってＣｓｐＣＩのエンドヌクレアーゼ触媒部位である可能性がある。該タンパク質のＣ末端半分であるＲ−Ｍ−ＣｓｐＣＩのアミノ酸３０１−６３２は、メチルトランスフェラーゼドメインを形成し、主として、ＤＮＡ修飾をもたらすと考えられる。この部分は、．．．ＶＬＴＰ．．．（ａａ３２５−３２８）、．．．ＶＬＤＩＣＡＧＴＧＧＦ．．．（配列番号２６）（ａａ３４７−３５７）および．．．ＮＰＰＹ．．．（ａａ４３５−４３８）を含む、ＤＮＡ−アデニンメチルトランスフェラーゼのγクラスに特徴的ないくつかのａａ配列モチーフを含む。これに基づき、ＣｓｐＣＩは、その認識配列内でアデニン残基をメチル化することにより修飾を達成すると推定される。対称性の考慮は、修飾塩基が上側の鎖（左側の副配列）における第２のＡであり、下側の鎖（右側の副配列）における唯一のＡであることを示唆している。したがって、以下のとおりである。

Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩは、ＢｃｇＩ制限酵素の融合Ｒ−ＭサブユニットおよびＧｅｎｂａｎｋ内のいくつかの類似した推定Ｒ−Ｍサブユニットに対して相当な相同性を示す。

また、Ｓ−ＣｓｐＣＩは融合タンパク質であるらしい。この場合、それらの２つの部分は配列および機能において類似しており、その認識配列の２つの特異的成分への結合能をＣｓｐＣＩに付与すると考えられる。Ｓ−ＣｓｐＣＩはＩ型Ｒ−Ｍ系の特異性サブユニットに類似しており、実際、それに対する弱い相同性を示す。Ｓ−ＣｓｐＣＩのＮ末端半分であるアミノ酸２−１６８は、多少なりとも、１つの標的認識ドメイン（ＴＲＤ）を形成すると考えられ、これは、認識配列の左側成分５’−ＣＡＡ−３’への結合をもたらすものであろう。アミノ酸１６９−３１９は、もう一方のＴＲＤを形成すると考えられ、もう一方の５’−ＣＣＡＣ−３’成分に結合すると考えられる。これらの２つのＴＲＤは互いに相当な相同性を示し、したがってＳ−ＣｓｐＣＩは、いくつかの内部反復配列を含有する。これらのなかには、近位反復ＩＮＤＬＦ（ａａ４−８）およびＬＱＤＬＦ（ａａ１７２−１７６）ならびに遠位反復ＰＤＡＹＱＧＶＲＳ（ａａ１４４−１５２）およびＰＤＷＤＦＭＥＫＹ（ａａ３００−３０８）が含まれる。他の特異性タンパク質においても同様の反復が見出され、これらは恐らく、ＳサブユニットとＲ−Ｍサブユニットとの結合を媒介するのであろう。Ｓ−ＣｓｐＣＩはＢｃｇＩの特異性サブユニットおよびＧｅｎｂａｎｋ内のいくつかの類似した推定特異性サブユニットに対して相当な相同性を示す。

６．クローン化ＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼの特徴づけ
前記実施例１に従い精製したＣｓｐＣＩ制限エンドヌクレアーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付したところ、それは約７０ｋＤａおよび３５ｋＤａの２つのタンパク質を含むことが判明した。同じサンプルの高圧液体クロマトグラフィーは、それらの７０ｋＤａおよび３５ｋＤａタンパク質が１：０．４７の質量比（これは１：１．０６のモル比を示唆する）で存在することを示した。このことは、ＣｓｐＣＩが、１つの大きなサブユニット（Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩ）と１つの小さなサブユニット（Ｓ−ＣｓｐＣＩ）とを含むヘテロ二量体として精製され、恐らくそのようなものとして活性であることを示すものである、と本発明者らは理解している。

単離されたその大きなサブユニットのＮ末端配列分析は、それが、考えられうるアミノ酸配列ＡＮＥＲＫＴＥＥＬＶ（配列番号２７）から始まることを示した。ＣｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍ ＯＲＦの初期コドンはほぼ同じ配列：ＭＡＮＥＲＫＴＥＳＬＶ（配列番号２８）を特定している。この結果は、その大きなサブユニットがＣｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍ ＯＲＦによりコードされること、その翻訳がｎｔ１６０４の推定ＡＴＧから始まること、および開始ｆＭｅｔが該成熟タンパク質中には存在しないらしいことを裏付けるものである。単離されたその小さいサブユニットのＮ末端分析は、それが、考えられうるアミノ酸配列ＰＫＩＮＤＬＦＨＬＥ（配列番号２９）から始まることを示した。ＣｓｐＣＩＳ ＯＲＦの初期コドンはほぼ同じ配列：ＭＰＫＩＮＤＬＦＨＬＥ（配列番号３０）を特定している。この結果は、その小さなサブユニットがＣｓｐＣＩ−Ｓ ＯＲＦによりコードされること、その翻訳がｎｔ３４８９の推定ＡＴＧから始まること、およびその開始ｆＭｅｔが該成熟タンパク質中にも存在しないらしいことを裏付けるものである。

７．ＣｓｐＣＩの切断部位の確定
エンドヌクレアーゼＣｓｐＣＩはＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡを２回切断して、約３３００ｂｐおよび２０５０ｂｐの断片を与えることが判明した。ＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡをＣｓｐＣＩおよび既知位置で切断する追加的な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＰｓｔＩ、ＳｓｐＩ、ＮｃｉＩおよびＳｔｕＩ）で同時に消化することにより、該切断部位の位置はｎｔ１５７５およびｎｔ４８７５のおおよその位置にマッピングされた（図１）。ＣｓｐＣＩはｐＢＲ３２２ ＤＮＡもｐＵＣ１９ ＤＮＡも切断しなかった。ファージラムダＤＮＡ（１８ｋｂ、１１ｋｂ、８．３ｋｂ、５．１ｋｂ、４．３ｋｂおよび１．８ｋｂ）のＣｓｐＣＩ消化によるＤＮＡ断片のおおよそのサイズを、ｈｔｔｐ：／／ｔａｑ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／〜ｖｉｎｃｚｅ／ＲＥＢｐｒｅｄｉｃｔｏｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐにおいてアクセスされうるプログラムＲＥＢＰｒｅｄｉｃｔｏｒに入力した。

ＲＥＢＰｒｅｄｉｃｔｏｒは、観察された断片サイズを、任意の与えられた認識パターンでｉｎ ｓｉｌｉｃｏで該ＤＮＡを切断することにより生じた断片サイズと比較することにより潜在的認識配列を予測するためにＧｉｎｇｅｒａｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５：４１０５（１９７８）のアルゴリズムを用いる。計算された１つの予測潜在的パターンは５’−ＣＣＡＣＮＮＮＮＮＴＴＧ−３’［配列番号３１］（または相補鎖上の５’−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−３’［配列番号１４］であり、これは、得られたマッピングデータと一致した位置（すなわち、１５６３位および４８６６位）でＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡにおいて見出される。この配列はｐＢＲ３２２ ＤＮＡにおいてもｐＵＣ１９ ＤＮＡにおいても見出されない。ＰｈｉＸ１７４、Ｔ７およびファージラムダＤＮＡ内の５’−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−３’（配列番号１４）部位における切断から予想される断片のサイズは、ＣｓｐＣＩでのこれらのＤＮＡの実際の切断からの観察された断片サイズと一致した。これらの結果から、ＣｓｐＣＩは配列５’−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−３’（配列番号１４）を認識すると結論づけられる。

ＣｓｐＣＩ認識配列における切断の位置を、適当なＤＮＡ基質のＣｓｐＣＩ切断から得られた末端塩基配列のジデオキシ配列決定分析により、および同じプライマー−鋳型ペアから得られた配列ラダーと標識ＤＮＡのＣｓｐＣＩ切断産物の長さとを比較することにより決定した（Ｓａｎｇｅｒら，ＰＮＡＳ ７４：５４６３−５４６７（１９７７）；Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４０：１４３−１４８（１９８０））。前記方法により、ＣｓｐＣＩは、ＢｃｇＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｊｅＩおよびＨａｅＩＶなどのいくつかの他のエンドヌクレアーゼと同様に、その認識配列の両側を切断することが判明した。本発明者らの観察は、以下のように、切断の位置が、一方の側の１つの塩基対によって様々となりうることを示唆しており：５’−Ｎｌｌ／Ｎｌ３−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−Ｎｌ３／Ｎｌｌ−３’（配列番号３２）または５’−Ｎ１０／Ｎ１２−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−Ｎ１２／Ｎ１０−３’（配列番号３３）または５’−Ｎ１０／Ｎ１２−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−Ｎ１３／Ｎ１１−３’（配列番号３４）または５’−Ｎｌｌ／Ｎ１３−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ−Ｎ１２／Ｎ１０−３’（配列番号３５）。理論により限定されるものではないが、該酵素は認識配列から或る距離の位置で切断し、この範囲内のＤＮＡのコンパクトさの度合が、これが１１／１３塩基対における切断を引き起こすのか１０／１２塩基対における切断を引き起こすのかを決定する、と本発明者らは考えている。

実施例Ｖ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼの発現
プラスミド［ｐＵＣｌ９−ＣｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍ−Ｓ ＡｐｏＩ ＃３］をＥＲ２６８３内に導入し、Ａｐ^Ｒプレート上で３７℃で一晩プレーティングした。いくつかの個々のクローンを５０ｍｌのＬＢ＋Ａｐ^Ｒ内に接種し、３７℃で一晩増殖させた。すべてのクローンは、湿潤大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞１ｇ当たり＞１０^５ｕ／ｇでＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼ活性を発現した。ｐＵＣ１９−ＣｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍ−Ｓ ＡｐｏＩは、宿主細胞を形質転換するための単一のプラスミド上に該エンドヌクレアーゼの全３個のドメイン（切断部分、メチラーゼ部分および特異性部分）を含有するが、該切断部分、メチラーゼ部分および特異性部分を別々のプラスミド上または複数のプラスミド上（この場合、それらのドメインの３個中２個が単一のプラスミド上に存在し第３のドメインが第２のプラスミド上に存在する）に配置することは当業者の技量の範囲内である。

株ＮＥＢ＃１５５４、ＥＲ２６８３［ｐＵＣ１９−ＣｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍ−Ｓ ＡｐｏＩ＃３］は、ブダペスト条約の条項および条件に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に２００４年３月４日に寄託されており、特許受託番号ＰＴＡ−５８８７が付与されている。

実施例ＶＩ：ＣｓｐＣＩの変異体の操作
ＣｓｐＣＩは、そのモジュラー体制に起因する種々の操作機会を与える。

ＣｓｐＣＩの特異性サブユニットは、自律配列選択ドメインのペアを含む二重体制を有する。該ドメインは直鎖状アミノ酸配列内の直接反復配列として見出されるが、それらは、二本鎖ＤＮＡの逆平行体制に符合するよう、フォールドタンパク質においては逆配向をとる。Ｓ−ＣｓｐＣＩの一方のドメインはｄｓＤＮＡ内の５’−ＣＡＡに選択的であり、もう一方は５’−ＣＣＡＣに選択的であり、それらの２つのドメインは該サブユニットにおいて約１５オングストローム離れていて、全体として、それはｄｓＤＮＡ内の５’−ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ（配列番号１４）を認識する。理論により限定されるものではないが、この配列への実際の結合はＳ−ＣｓｐＣＩとＲ−Ｍ−ＣｓｐＣＩのメチルトランスフェラーゼドメインとの間の協同（一方は配列特異的であり、もう一方は非特異的である）を伴うと提示される。Ｓ−ＣｓｐＣＩ内に導入された改変は、それらがＩ型Ｒ−Ｍ系において行うことが示されているのと同じ様態で、それが認識する配列を変化させうる。

配列選択ドメイン間の分離および認識配列内の非特異的間隔の長さの改変は、「スペーサー」領域内に変化を導入することにより達成されうる。そのような変化の具体例には、挿入、例えば、長さの増加のための小さな重複（例えば、ＣＡＡ Ｎ_６ ＧＴＧＧ［配列番号３６］への変化）または長さの減少のための欠失（例えば、ＣＡＡ Ｎ_４ ＧＴＧＧ［配列番号３７］への変化）が含まれる。

ＣｓｐＣＩの特異性を改変するためには、以下に例示する種々のアプローチを用いる。

（ａ）該エンドヌクレアーゼの認識配列は、２つの特異性ドメインのうちの１つを縦列重複させることにより改変されうる。このようにして、該特異性ドメインは、非対称な認識部位を認識するものから、対称な認識部位を認識するもの（例えば、ＣＡＡ Ｎ_５ ＴＴＧ［配列番号３８］またはＣＣＡＣ Ｎ_５ ＧＴＧＧ［配列番号３９］）へ変換されうる。これは、単一ポリペプチド鎖内でそれらのドメインを物理的に結合させることなく達成され、この場合、該縦列反復配列の二量体化は自発的に生じうる。

（ｂ）アミノ酸の変化をいずれかのドメイン内に導入して、そのドメインにより選択される配列を改変して、特異性の改変を達成し、ヌクレオチド識別の減少（例えば、ＣＡＡ Ｎ_５ ＧＴＧＲ［配列番号４０］）または喪失（例えば、ＣＡＡ Ｎ_５ ＧＴＧ［配列番号４１］）をもたらすことが可能である。配列選択ドメインに隣接した領域内のＳ−サブユニットにおけるアミノ酸変化は、その認識配列の両側での切断を損なうと予想される。いずれかの配向のＳ−サブユニットへのＲ−Ｍサブユニットの結合能は、その結合を単一の配向へ限定するよう修飾されうる。したがって、ＣｓｐＣＩまたは変異体は、その認識配列の一方の側のみにおいて片側で切断するエンドヌクレアーゼへと変換されうる。

（ｃ）Ｓ−ＣｓｐＣＩの配列選択ドメインと他のＩＩＧ型酵素のものとの間の交換は、ハイブリッド特異性を有するキメラＳサブユニットを与えると予想される。Ｓ−ＣｓｐＣＩのＮ末端（認識配列ＣＡＡ Ｎ_５ ＧＴＧＧ）（配列番号１４）と例えばＳ−ＢｃｇＩのＣ末端（認識配列ＣＧＡ Ｎ_５ ＴＧＣ）（配列番号４２）とを含むタンパク質は、Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩと組合されると、ＣＡＡ Ｎ_５ ＴＧＣ（配列番号４３）を認識するエンドヌクレアーゼとなりうる。例えば、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインは、２つのＣ末端ドメインまたは２つのＮ末端ドメインの組合せを与えるよう互換性があると予想される。このようにして、Ｓ−ＣｓｐＣＩおよびＳ−ＢｃｇＩのＣ末端ドメインは一緒になって、ＧＣＡ Ｎ_５ ＧＴＧＧ（配列番号４４）を認識するであろう。ＨａｅＩＶ、ＡｌｏＩおよびＣｊｅＩのような幾つかのＩＩＧ型酵素においては、特異性ドメインが該組合せＲ−Ｍ−Ｓタンパク質のＣ末端において融合される。これらもＳ−ＣｓｐＣＩ内に交換されうる。

配列特異性モジュールは天然に豊富に存在し、個々のタンパク質として及び複合タンパク質内のドメインとして見出される。エンドヌクレアーゼ触媒部位へのこれらの特異性モジュールのカップリングは、新たな特異性を有するエンドヌクレアーゼを与えるであろう。

Ｓ−ＣｓｐＣＩのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインを置換するために使用されうるクラスＩＩＧ制限酵素からの特異性ドメインの具体例は以下のとおりである。

ＢｃｇＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ＣＧＡＮＮＮＮＮＮＴＧＣ（配列番号４５）。

ＢａｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ＡＣＮＮＮＮＧＴＡＹＣ（配列番号４６）。

ＢｐｌＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）ＧＡＧＮＮＮＮＮＣＴＣ（配列番号４７）
カミロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（Ｖｉｔｏｒ，Ｊ．Ｍ．Ｂ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ｄ．Ｇｅｎｅ １５７：１０９−１１０（１９９５））からのＣｊｅＩ，ＣＣＡＮＮＮＮＮＮＧＴ（配列番号４８）。

ＡｌｏＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）ＧＡＡＣＮＮＮＮＮＮＴＣＣ（配列番号４９）。

ＨａｅＩＶ（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ，Ａ．ら，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２９３：１０５５−１０６５（１９９９））ＧＡＹＮＮＮＮＮＲＴＣ（配列番号５０）。

ＢｓａＸＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣ（配列番号５１）。

前記に加えて、Ｉ型特異性タンパク質は、Ｓ−ＣｓｐＣＩとのドメイン交換のための豊富で潜在的な特異性ドメイン源である。Ｓ−ＣｓｐＩの配列選択ドメインは、Ｉ型Ｒ−Ｍ系の特異性サブユニットのものに対していくらかの相同性を有する。何百もの一般には特徴づけられていないＩ型Ｓ−サブユニットがＧｅｎｂａｎｋ内に見出されうる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ−アデニンメチルトランスフェラーゼの、Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩと同じガンマクラスに属するＩ型修飾サブユニットと天然で相互作用し、ドメイン交換のための特異性ドメインとして使用されうる。

独立型のガンマクラスのＤＮＡ−アデニンメチルトランスフェラーゼのＣ末端断片は配列選択ドメインとして作用して、そうでなければ無差別となるであろう触媒部位へ、メチル化されるべき特定のｎｔ配列を伝達すると考えられる。これらのメチルトランスフェラーゼは、いくらか孤立性であり、ＩＩ型およびＩＩＳ型Ｒ−Ｍ系からのものとは別物であり、天然に豊富に存在する。１００種以上が特徴づけされており、より多くの未だ特徴づけられていない例がＧｅｎｂａｎｋ内に見出されうる。一般に、これらの酵素は連続的なｎｔ配列を認識する。ほとんどは４〜６ｎｔの長さの対称配列を認識し、他のものは７ｎｔまでの非対称配列を認識する。これらの独立型のメチルトランスフェラーゼも、Ｓ−ＣｓｐＣＩとのドメイン交換のための豊富で潜在的な特異性ドメイン源に相当する。相当な長さの認識配列を有するＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼ変異体はこれらの酵素から構築されうるであろう。

Ｉ型Ｓ−タンパク質は天然でＩ型修飾（Ｍ）サブユニットと相互作用して、２Ｍ：１Ｓの組成の三量体を形成する。これらの三量体は、Ｓサブユニットにより選択される配列に特異的に結合し、ついでそれらのメチル化を触媒する。Ｉ型Ｍ−サブユニットはＲ−Ｍ−ＣｓｐＣＩのＣ末端メチルトランスフェラーゼドメインに相同であるが、それらは、エンドヌクレアーゼドメインを形成するこのタンパク質のＮ末端部分を欠く。ＣｓｐＣＩは、Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩからのエンドヌクレアーゼドメインをＩ型Ｍ−サブユニットに移すことにより（「ドメイングラフト」）、Ｉ型修飾酵素にエンドヌクレアーゼ活性を付与するために使用されうる。これは、Ｉ型メチルトランスフェラーゼがＤＮＡを切断しそれを修飾することをもたらすであろう。

Ｒ−Ｍ−ＣｓｐＣＩのエンドヌクレアーゼドメインをＩ型メチルトランスフェラーゼの前に移植（グラフト）するこの実験的アプローチは、元々は修飾されるだけであった配列において切断するために他の単独型メチルトランスフェラーゼに適用されうる。例えば、ガンマクラスＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼであるＲ−Ｍ−ＣｓｐＣＩのＮ末端切断ドメインは、他のガンマクラスＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼに移されうる。

図１は、ファージラムダ、Ｔ７、ＰｈｉＸ１７４、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９ ＤＮＡのＣｓｐＣＩ切断を示すアガロースゲルである。レーンは以下のとおりである。レーン１、１０、１５：ラムダ−ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｈｉＸ１７４−ＨａｅＩＩＩサイズ標準物；レーン２：ラムダＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ；レーン３：Ｔ７ ＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ；レーン４：ＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡ；レーン５：ＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ；レーン６：ＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ＋ＰｓｔＩ；レーン７：ＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ＋ＳｓｐＩ；レーン８：ＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ＋ＮｃｉＩ；レーン９：ＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ＋ＳｔｕＩ；レーン１１：ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ；レーン１２：ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ；レーン１３：ｐＵＣ１９ ＤＮＡ；レーン１４：ｐＵＣ１９ ＤＮＡ＋ＣｓｐＣＩ。 図２は、ＣｓｐＣＩで切断されたｐＵＣ２ＣｓｐＣ ＤＮＡの高濃度アガロースゲルであり、３５±１ｂｐの内部「小断片」（矢印）が示されている。 図３は、部分消化二重線断片を示す高分解能アガロースゲルである。ＤＮＡ：ＢｇｌＩで切断され漸増量のＣｓｐＣＩで再消化されたｐＵＣ２ＣｓｐＣ。一過性ＣｓｐＣＩ−ＢｇｌＩ断片二重線が矢印で示されている。 図４ａおよび４ｂは、プライマー合成によるＣｓｐＣＩ切断部位の決定を示す。同じＭ１３ｍｐ１８鋳型およびプライマーの組合せを使用して、２つの実験を行った。（−）は、ＣｓｐＣＩで切断されたＤＮＡのみである；（＋）は、ＣｓｐＣＩで切断されたＤＮＡのクレノウ処理である。 図５は、ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）自動化配列決定によるＣｓｐＣＩ切断部位の決定を示す。図５ａ：ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４鋳型；フォワードプライマー（配列番号１）。図５ｂ：ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−４鋳型；リバースプライマー（配列番号２）。図５ｃ：ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１鋳型：フォワードプライマー（配列番号３）。図５ｄ：ｐＵＣ１ＣｓｐＣ−１鋳型：リバースプライマー（配列番号４）。鋳型切断を示すＡ−異常（Ａ−ａｎｏｍａｌｉｅｓ）がトレースの下の三角形（△）で示されている。 図６は、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からクローニングされたＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。 図６は、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からクローニングされたＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。 図７ａはＣｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。 図７ｂはＣｓｐＣＩ−Ｓ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。 図８ａはＣｓｐＣＩ制限−修飾系の遺伝子体制を示す。 図８ｂは、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位内に挿入されたＣｓｐＣＩ遺伝子を含有するプラスミドクローンｐＵＣ１９−ＣｓｐＣＩ−Ｒ−Ｍ−Ｓ ＡｐｏＩ ＃３の遺伝子体制を示す。 図９ａはＲ−Ｍ−ＣｓｐＣＩエンドヌクレアーゼ−メチルトランスフェラーゼサブユニットの推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す。 図９ｂはＣｓｐＣＩ特異性サブユニットの推定アミノ酸配列（配列番号９）を示す。

対称ＤＮＡ配列およびハイブリッドＤＮＡ配列を認識する新規酵素を得るために、Ｉ型制限酵素における特異性ドメインの改変が達成されている（ＭａｃＷｉｌｌｉａｍｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８ｃｌ３６（１９９４）；ＭａｃＷｉｌｌｉａｍｓら，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １５：４７７５−４７８３（１９９６））。実施例ＶＩには、モジュラーＩＩ型制限酵素における特異性ドメインが、該酵素の特異性を改変するためにどのようにして操作されうるかが記載されている。

Claims (14)

1. シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）（ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−５８４６）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮＥＢ＃１５５４（ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−５８８７）から入手可能な実質的に純粋なＩＩＧ型制限エンドヌクレアーゼ。
2. 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮＥＢ＃１５５４（ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−５８８７）またはシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）（ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−５８４６）から入手可能な単離されたＤＮＡ。
3. ＤＮＡが、エンドヌクレアーゼおよびメチルトランスフェラーゼ触媒機能を発現する第１ＤＮＡセグメントと、制限エンドヌクレアーゼの配列特異性機能をコードする第２ＤＮＡセグメントとを含み、第１ＤＮＡセグメントおよび第２ＤＮＡセグメントが１以上のＤＮＡ分子を含む、請求項１記載の制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
4. 配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５よりなる群から選ばれる少なくとも１つの配列を認識し、該認識配列の両側で該ＤＮＡを切断しうる、請求項１記載の実質的に純粋な制限エンドヌクレアーゼ。
5. ＣｓｐＣＩ制限エンドヌクレアーゼの制限および修飾ドメインをコードする第１ＤＮＡセグメントと該制限エンドヌクレアーゼの特異性ドメインをコードする第２セグメントとの少なくとも１つを含んでなる組換えＤＮＡベクター。
6. ＣｓｐＣＩ制限エンドヌクレアーゼの制限および修飾ドメインをコードする第１ＤＮＡセグメントならびに該制限エンドヌクレアーゼの特異性ドメインをコードする第２セグメントで形質転換されており、第１ＤＮＡセグメントおよび第２ＤＮＡセグメントが１以上のＤＮＡベクター内に含有されている、宿主細胞。
7. シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種２１４４（ＮＥＢ＃１３９８）のサンプルまたは請求項６記載の宿主細胞を、請求項１記載のエンドヌクレアーゼの産生に好ましい条件下で培養し、それより該エンドヌクレアーゼを精製することを含んでなる、請求項１記載のエンドヌクレアーゼを入手するための方法。
8. （ａ）酵素のセットから制限エンドヌクレアーゼを選択し（ここで、該セット内の各酵素は、特異性サブユニットおよび触媒サブユニットを有するモジュラー構造により特徴づけられ、該特異性サブユニットは更に、二成分認識配列の半分の部位に結合するＮ末端ドメイン、および該二成分認識配列の残りの半分の部位に結合するＣ末端ドメインを含む）、
   （ｂ）該特異性サブユニットを修飾し、
   （ｃ）改変された特異性を有するＩＩ型制限制限エンドヌクレアーゼを得ることを含んでなる、改変された特異性を有するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
9. 工程（ｂ）における特異性サブユニットの修飾が更に、該Ｎ末端ドメインを第２のＣ末端ドメインで置換し、または該Ｃ末端ドメインを第２のＮ末端ドメインで置換することを含む、請求項８記載の製造方法。
10. 該特異性サブユニットの修飾が更に、該Ｎ末端ドメイン、または該Ｃ末端ドメイン、または該Ｎ末端ドメインと該Ｃ末端ドメインとの両方を、第２の制限エンドヌクレアーゼまたはメチルトランスフェラーゼからの結合ドメインで置換することを含む、請求項８記載の製造方法。
11. 該特異性サブユニットの修飾が更に、該Ｎ末端ドメイン、該Ｃ末端ドメインまたは両方のドメインを突然変異させて結合特異性を改変することを含む、請求項８記載の製造方法。
12. 該特異性サブユニットの修飾が更に、特異性モジュールのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間のスペーサーアミノ酸配列の長さを変化させることを含む、請求項８、９、１０または１１記載の製造方法。
13. 第２の制限エンドヌクレアーゼまたはメチルトランスフェラーゼが、Ｉ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＧ型制限エンドヌクレアーゼおよびγ型ｍ^６Ａメチルトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる、請求項１０記載の製造方法。
14. 該特異性サブユニットおよび該触媒サブユニットが、異なる遺伝子によりコードされる、請求項８記載の製造方法。

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