JPH1057082A - 大腸菌中で制限エンドヌクレアーゼＳａｐＩをクローニング及び産生する方法 - Google Patents
大腸菌中で制限エンドヌクレアーゼＳａｐＩをクローニング及び産生する方法Info
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- JPH1057082A JPH1057082A JP9173894A JP17389497A JPH1057082A JP H1057082 A JPH1057082 A JP H1057082A JP 9173894 A JP9173894 A JP 9173894A JP 17389497 A JP17389497 A JP 17389497A JP H1057082 A JPH1057082 A JP H1057082A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、及び、
組換えＤＮＡからのＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼの
産生、並びに、大腸菌のような適当な宿主中での放線菌
類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ遺伝子のクローニング方
法を提供する。 【解決手段】 単離ＤＮＡがＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙ
ｓｐｏｒａ種から得られることを特徴とするＳａｐＩ制
限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。
及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、及び、
組換えＤＮＡからのＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼの
産生、並びに、大腸菌のような適当な宿主中での放線菌
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法を提供する。 【解決手段】 単離ＤＮＡがＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙ
ｓｐｏｒａ種から得られることを特徴とするＳａｐＩ制
限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＳａｐＩ制限エン
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換え
ＤＮＡ、並びに、組換えＤＮＡからのＳａｐＩ制限エン
ドヌクレアーゼの産生に関する。
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換え
ＤＮＡ、並びに、組換えＤＮＡからのＳａｐＩ制限エン
ドヌクレアーゼの産生に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】クラス
IIの制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に存在す
る一群の酵素である。これらの酵素を細菌の他の成分か
ら分離して精製することができれば、実験室で制限エン
ドヌクレアーゼを使用し、ＤＮＡ分子を分子クローニン
グ及び遺伝子キャラクタリゼーションのための正確なフ
ラグメントに開裂させることが可能である。
IIの制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に存在す
る一群の酵素である。これらの酵素を細菌の他の成分か
ら分離して精製することができれば、実験室で制限エン
ドヌクレアーゼを使用し、ＤＮＡ分子を分子クローニン
グ及び遺伝子キャラクタリゼーションのための正確なフ
ラグメントに開裂させることが可能である。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に
沿ってヌクレオチドの特定配列（「認識配列」）を認識
しこの配列に結合することによって作用する。制限エン
ドヌクレアーゼは一旦結合すると、次いで認識配列の内
部またはその片側で分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼは異なる認識配列に親和性を有している。
今日まで試験された数百種類の細菌について、ユニーク
な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼは２００種類
以上同定されている。
沿ってヌクレオチドの特定配列（「認識配列」）を認識
しこの配列に結合することによって作用する。制限エン
ドヌクレアーゼは一旦結合すると、次いで認識配列の内
部またはその片側で分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼは異なる認識配列に親和性を有している。
今日まで試験された数百種類の細菌について、ユニーク
な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼは２００種類
以上同定されている。
【０００４】概して、細菌は、個々の種毎には少数の制
限エンドヌクレアーゼしか有していない。典型的には起
原となる細菌に因んでエンドヌクレアーゼが命名されて
いる。従って、例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄ
ｉｏｐｈｉｌｕｓ種は異なる３種類の制限エンドヌクレ
アーゼを合成し、これらはＤｒａＩ、ＤｒａII及びＤｒ
ａIII と命名されている。これらの酵素は夫々、配列
５′ＴＴＴＡＡＡ３′、５′ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ３′及
び５′ＣＡＣＮＮＮＧＴＧ３′を認識し開裂する。他方
で、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１
３は、配列５′ＧＡＡＴＴＣ３′を認識する１種類の酵
素ＥｃｏＲＩだけを合成する。
限エンドヌクレアーゼしか有していない。典型的には起
原となる細菌に因んでエンドヌクレアーゼが命名されて
いる。従って、例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄ
ｉｏｐｈｉｌｕｓ種は異なる３種類の制限エンドヌクレ
アーゼを合成し、これらはＤｒａＩ、ＤｒａII及びＤｒ
ａIII と命名されている。これらの酵素は夫々、配列
５′ＴＴＴＡＡＡ３′、５′ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ３′及
び５′ＣＡＣＮＮＮＧＴＧ３′を認識し開裂する。他方
で、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１
３は、配列５′ＧＡＡＴＴＣ３′を認識する１種類の酵
素ＥｃｏＲＩだけを合成する。
【０００５】制限エンドヌクレアーゼは本来は細菌細胞
の自己防御機能を果たすと考えられている。制限エンド
ヌクレアーゼの存在によって細菌は、ウイルス及びプラ
スミドのような細菌を破壊したりまたは細菌に寄生した
りする外来ＤＮＡ分子の感染に対して耐性になる。制限
エンドヌクレアーゼは、認識配列が発生する度毎に侵入
性外来ＤＮＡ分子を開裂することによって耐性を与え
る。開裂が生じると、感染遺伝子の多くはその能力を失
い、感染遺伝子のＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによっ
て更に分解され易くなる。
の自己防御機能を果たすと考えられている。制限エンド
ヌクレアーゼの存在によって細菌は、ウイルス及びプラ
スミドのような細菌を破壊したりまたは細菌に寄生した
りする外来ＤＮＡ分子の感染に対して耐性になる。制限
エンドヌクレアーゼは、認識配列が発生する度毎に侵入
性外来ＤＮＡ分子を開裂することによって耐性を与え
る。開裂が生じると、感染遺伝子の多くはその能力を失
い、感染遺伝子のＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによっ
て更に分解され易くなる。
【０００６】細菌の防御系の第二成分は、修飾メチラー
ゼである。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼに相補
的であり、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護して外来の感
染性ＤＮＡから識別できるようにする手段を提供する。
修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと
同じ認識配列を認識し該認識配列に結合するが、ＤＮＡ
を開裂するのでなく、メチル基を付加することによって
配列内部のヌクレオチドのいずれかを化学的に修飾す
る。メチル化後の認識配列は制限エンドヌクレアーゼに
よってもはや開裂されない。細菌細胞のＤＮＡはその修
飾メチラーゼの活性によって常に十分に修飾されてい
る。従って、該ＤＮＡは、内在性制限エンドヌクレアー
ゼの存在に対しては完全に不感受性である。制限エンド
ヌクレアーゼによる認識及び開裂に感受性なのは、修飾
されていないため外来であることが確認された外来ＤＮ
Ａだけである。
ゼである。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼに相補
的であり、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護して外来の感
染性ＤＮＡから識別できるようにする手段を提供する。
修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと
同じ認識配列を認識し該認識配列に結合するが、ＤＮＡ
を開裂するのでなく、メチル基を付加することによって
配列内部のヌクレオチドのいずれかを化学的に修飾す
る。メチル化後の認識配列は制限エンドヌクレアーゼに
よってもはや開裂されない。細菌細胞のＤＮＡはその修
飾メチラーゼの活性によって常に十分に修飾されてい
る。従って、該ＤＮＡは、内在性制限エンドヌクレアー
ゼの存在に対しては完全に不感受性である。制限エンド
ヌクレアーゼによる認識及び開裂に感受性なのは、修飾
されていないため外来であることが確認された外来ＤＮ
Ａだけである。
【０００７】遺伝子工学技術の出現に伴って、遺伝子を
クローニングし、これらの遺伝子がコードしているタン
パク質及び酵素を従来の精製技術で得られるよりも大量
に産生することがいまや可能になっている。制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子の単離クローンを得るためには、複
合「ライブラリー」内部のクローン、即ち、「ショット
ガン」手順によって１０-3から１０-4という低い頻度で
発生するクローンの集団を同定する簡便で信頼できる方
法を開発することが必要である。所望の希少なクローン
を生存させながら大多数の不要なクローンを破壊するよ
うにその方法が選択的であるのが好ましい。
クローニングし、これらの遺伝子がコードしているタン
パク質及び酵素を従来の精製技術で得られるよりも大量
に産生することがいまや可能になっている。制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子の単離クローンを得るためには、複
合「ライブラリー」内部のクローン、即ち、「ショット
ガン」手順によって１０-3から１０-4という低い頻度で
発生するクローンの集団を同定する簡便で信頼できる方
法を開発することが必要である。所望の希少なクローン
を生存させながら大多数の不要なクローンを破壊するよ
うにその方法が選択的であるのが好ましい。
【０００８】クラスIIの制限−修飾系がクローニングさ
れる頻度は増加しつつある。クローニングされた最初の
系は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選
択する手段としてバクテリオファージ感染を使用した
（ＥｃｏＲII：Ｋｏｓｙｋｈら，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．１７８：７１７−７１９（１９８０）；Ｈ
ｈａII：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ ３：９７−１１２（１
９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１５０３−１５０７（１
９８１））。細菌中に制限−修飾系が存在すると、細菌
はバクテリオファージ感染に対して耐性になる。従って
原則的には、クローニングされた制限−修飾遺伝子を含
む細胞はファージに接触したライブラリーから生存細胞
として選択的に単離され得る。しかしながらこの方法は
余り有用でないことが判明した。即ち、クローニングさ
れた制限−修飾遺伝子は選択的生存を与えるための十分
なファージ耐性を必ずしも示さないことが判明したから
である。
れる頻度は増加しつつある。クローニングされた最初の
系は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選
択する手段としてバクテリオファージ感染を使用した
（ＥｃｏＲII：Ｋｏｓｙｋｈら，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．１７８：７１７−７１９（１９８０）；Ｈ
ｈａII：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ ３：９７−１１２（１
９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１５０３−１５０７（１
９８１））。細菌中に制限−修飾系が存在すると、細菌
はバクテリオファージ感染に対して耐性になる。従って
原則的には、クローニングされた制限−修飾遺伝子を含
む細胞はファージに接触したライブラリーから生存細胞
として選択的に単離され得る。しかしながらこの方法は
余り有用でないことが判明した。即ち、クローニングさ
れた制限−修飾遺伝子は選択的生存を与えるための十分
なファージ耐性を必ずしも示さないことが判明したから
である。
【０００９】別のクローニング方法では、最初にプラス
ミド耐性（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）であると特性
決定された系を大腸菌クローニングプラスミドに導入す
る。（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７６（１
９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ ａｎｄＢｒ
ｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８０：４０２−４０６（１９８３）；Ｔｈｅｒｉ
ａｕｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ １９：３５５−
３５９（１９８２）；ＰｖｕII：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ
ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−５０９
（１９８５））。
ミド耐性（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）であると特性
決定された系を大腸菌クローニングプラスミドに導入す
る。（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７６（１
９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ ａｎｄＢｒ
ｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８０：４０２−４０６（１９８３）；Ｔｈｅｒｉ
ａｕｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ １９：３５５−
３５９（１９８２）；ＰｖｕII：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ
ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−５０９
（１９８５））。
【００１０】系をクローニングする場合の使用頻度が増
えている第三の方法は、活性メチラーゼ遺伝子の選択を
用いるクローニング方法である（１９９３年４月６日許
諾の米国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：
Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１３：６４
０３−６４２１（１９８５））。制限遺伝子と修飾遺伝
子とはしばしば密接に結合しているので、双方の遺伝子
がしばしば同時にクローニングされる。この選択は完全
な制限系を必ずしも産生せず、メチラーゼ遺伝子だけを
産生したりする（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ
ら，Ｇｅｎｅ １０：２１９−２２５（１９８０）；Ｂ
ｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ ２０：１
９７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ ａ
ｎｄ Ｂａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ ２１：１１１−１１
９（１９８３）；及びＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４１（１
９８３））。
えている第三の方法は、活性メチラーゼ遺伝子の選択を
用いるクローニング方法である（１９９３年４月６日許
諾の米国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：
Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１３：６４
０３−６４２１（１９８５））。制限遺伝子と修飾遺伝
子とはしばしば密接に結合しているので、双方の遺伝子
がしばしば同時にクローニングされる。この選択は完全
な制限系を必ずしも産生せず、メチラーゼ遺伝子だけを
産生したりする（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ
ら，Ｇｅｎｅ １０：２１９−２２５（１９８０）；Ｂ
ｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ ２０：１
９７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ ａ
ｎｄ Ｂａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ ２１：１１１−１１
９（１９８３）；及びＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４１（１
９８３））。
【００１１】もっと最近になって、ｄｉｎＤ：：ｌａｃ
Ｚ融合を含む指標大腸菌株に基づいて大腸菌中の制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングする方法
（“ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄ”）が発表され
た（Ｆｏｍｅｎｋｏｖら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２２：２３９９−２４０３，１９９４）。この方法
は、制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアー
ゼによってＤＮＡ損傷を生じた大腸菌のＳＯＳ応答を利
用する。複数の熱安定ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔｔｈ１１
１Ｉ，ＢｓｏＢＩ，Ｔｆヌクレアーゼ）がこの方法によ
ってクローニングされた（１９９６年３月１２日許諾の
米国特許第５，４９８，５３５号）。
Ｚ融合を含む指標大腸菌株に基づいて大腸菌中の制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングする方法
（“ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄ”）が発表され
た（Ｆｏｍｅｎｋｏｖら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２２：２３９９−２４０３，１９９４）。この方法
は、制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアー
ゼによってＤＮＡ損傷を生じた大腸菌のＳＯＳ応答を利
用する。複数の熱安定ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔｔｈ１１
１Ｉ，ＢｓｏＢＩ，Ｔｆヌクレアーゼ）がこの方法によ
ってクローニングされた（１９９６年３月１２日許諾の
米国特許第５，４９８，５３５号）。
【００１２】大腸菌中でのこれらの系のクローニングの
別の障害は多様なメチラーゼ遺伝子をクローニングする
過程で発見された。（クローニングに常用されている菌
株を含む）多くの大腸菌株はシトシンメチル化を含むＤ
ＮＡの導入に抵抗する系を有している（Ｒａｌｅｉｇｈ
ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３：９０７０−９０７４（１
９８６））。従って、（１つまたは複数の）どの大腸菌
株をクローニングに使用するかを慎重に考慮することも
必要である。
別の障害は多様なメチラーゼ遺伝子をクローニングする
過程で発見された。（クローニングに常用されている菌
株を含む）多くの大腸菌株はシトシンメチル化を含むＤ
ＮＡの導入に抵抗する系を有している（Ｒａｌｅｉｇｈ
ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３：９０７０−９０７４（１
９８６））。従って、（１つまたは複数の）どの大腸菌
株をクローニングに使用するかを慎重に考慮することも
必要である。
【００１３】精製された制限エンドヌクレアーゼ、より
限定的には修飾メチラーゼは実験室で遺伝子キャラクタ
リゼーションを行うための有効なツールであるから、こ
れらの酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術
によって得ることは商業的な動機からも要望されてい
る。このような菌株が有用である理由は、これらの菌株
が精製作業を容易にし且つ工業的に有用な量を産生する
手段を提供するからである。
限定的には修飾メチラーゼは実験室で遺伝子キャラクタ
リゼーションを行うための有効なツールであるから、こ
れらの酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術
によって得ることは商業的な動機からも要望されてい
る。このような菌株が有用である理由は、これらの菌株
が精製作業を容易にし且つ工業的に有用な量を産生する
手段を提供するからである。
【００１４】上記に指摘したような制限−修飾遺伝子の
クローニングに関連する問題以外にも、大腸菌にこのよ
うな外来制限修飾系をクローニング及び導入する場合、
恐らくは大腸菌中の遺伝子の無効な転写または翻訳が原
因で、天然エンドヌクレアーゼ産生菌株に比較してメチ
ラーゼ及びエンドヌクレアーゼの収率が極めて低い値に
なったりする。特に放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｓの遺伝子を大腸菌にクローニングするときにはこれら
の２種類の微生物のＧＣ含量が違っているのが原因でこ
のような低収率が生じ易い。従って、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｐｏｌｙｓｐｏｒａ種に由来のＳａｐＩ制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子のような放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｔｅｓの遺伝子を大腸菌中で十分に発現させ効率的な遺
伝子発現に基づいて選択させ得るクローニング系の開発
が望まれている。
クローニングに関連する問題以外にも、大腸菌にこのよ
うな外来制限修飾系をクローニング及び導入する場合、
恐らくは大腸菌中の遺伝子の無効な転写または翻訳が原
因で、天然エンドヌクレアーゼ産生菌株に比較してメチ
ラーゼ及びエンドヌクレアーゼの収率が極めて低い値に
なったりする。特に放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｓの遺伝子を大腸菌にクローニングするときにはこれら
の２種類の微生物のＧＣ含量が違っているのが原因でこ
のような低収率が生じ易い。従って、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｐｏｌｙｓｐｏｒａ種に由来のＳａｐＩ制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子のような放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｔｅｓの遺伝子を大腸菌中で十分に発現させ効率的な遺
伝子発現に基づいて選択させ得るクローニング系の開発
が望まれている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、修飾メチラー
ゼ選択方法によって大腸菌中でＳａｐＩ制限−修飾系の
メチラーゼをクローニングする方法に関する。本発明方
法の好ましい段階を図１に示す。放線菌Ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅのＳａｐＩメチラーゼ遺伝子のクローニング
において、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種から
目標のメチラーゼ遺伝子（ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子）
をクローニングするために、ｐＵＣ１９ベクターを用い
る標準メチラーゼ遺伝子選択方法を使用した。１つのＳ
ａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ１）をクローニングした。
ＳａｐＩの認識配列は非対称なので（一方のストランド
は５′ＧＣＴＣＴＴＣ３′、他方のストランドは５′Ｇ
ＡＡＧＡＧＣ３′である）、ＳａｐＩ制限−修飾系は２
つのメチラーゼと１つのエンドヌクレアーゼとを含んで
いるに違いないと推測した。Ｍ１ ＤＮＡの左半部と右
半部をプローブとして用いるサザンブロット法によって
ゲノムＤＮＡ地図を作成した。メチラーゼ選択方法によ
って第二のメチラーゼ遺伝子をクローニングするため
に、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩのゲノムＤＮＡ
ライブラリーを構築した。
ゼ選択方法によって大腸菌中でＳａｐＩ制限−修飾系の
メチラーゼをクローニングする方法に関する。本発明方
法の好ましい段階を図１に示す。放線菌Ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅのＳａｐＩメチラーゼ遺伝子のクローニング
において、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種から
目標のメチラーゼ遺伝子（ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子）
をクローニングするために、ｐＵＣ１９ベクターを用い
る標準メチラーゼ遺伝子選択方法を使用した。１つのＳ
ａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ１）をクローニングした。
ＳａｐＩの認識配列は非対称なので（一方のストランド
は５′ＧＣＴＣＴＴＣ３′、他方のストランドは５′Ｇ
ＡＡＧＡＧＣ３′である）、ＳａｐＩ制限−修飾系は２
つのメチラーゼと１つのエンドヌクレアーゼとを含んで
いるに違いないと推測した。Ｍ１ ＤＮＡの左半部と右
半部をプローブとして用いるサザンブロット法によって
ゲノムＤＮＡ地図を作成した。メチラーゼ選択方法によ
って第二のメチラーゼ遺伝子をクローニングするため
に、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩのゲノムＤＮＡ
ライブラリーを構築した。
【００１６】第二のＳａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ２）
をクローニングし配列決定した後、２つのＳａｐＩメチ
ラーゼ遺伝子の上流及び下流のＤＮＡフラグメントのク
ローニング及び配列決定を試みた。通常は、特定の制限
−修飾系におけるメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレア
ーゼ遺伝子は互いに極めて近接した位置に存在する。Ｍ
２遺伝子の上流の合計１７３１ｂｐのＤＮＡを配列決定
し、ＧｅｎＢａｎｋの全ての既知遺伝子と比較した。こ
のＤＮＡは、抗生物質合成に関与する１つの遺伝子に相
同性を有する推定遺伝子を含む。ＳａｐＩ制限エンドヌ
クレアーゼはＭ２の上流には存在せず、Ｍ１遺伝子の下
流に存在するらしいという結論が得られた。Ｍ１と下流
のＤＮＡとを含むより大きいゲノムインサートをクロー
ニングするために、ＮｌａIII 部分ゲノムライブラリー
を構築した。下流のＤＮＡをＮｌａIII ライブラリーか
らスクリーニングし配列決定した。このＤＮＡは６５７
ｂｐの長さしかなく、完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を
コードできる十分な大きさではなかった。次に、エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含むと考えられる配列の残部を逆
ＰＣＲを使用して増幅しクローニングした。
をクローニングし配列決定した後、２つのＳａｐＩメチ
ラーゼ遺伝子の上流及び下流のＤＮＡフラグメントのク
ローニング及び配列決定を試みた。通常は、特定の制限
−修飾系におけるメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレア
ーゼ遺伝子は互いに極めて近接した位置に存在する。Ｍ
２遺伝子の上流の合計１７３１ｂｐのＤＮＡを配列決定
し、ＧｅｎＢａｎｋの全ての既知遺伝子と比較した。こ
のＤＮＡは、抗生物質合成に関与する１つの遺伝子に相
同性を有する推定遺伝子を含む。ＳａｐＩ制限エンドヌ
クレアーゼはＭ２の上流には存在せず、Ｍ１遺伝子の下
流に存在するらしいという結論が得られた。Ｍ１と下流
のＤＮＡとを含むより大きいゲノムインサートをクロー
ニングするために、ＮｌａIII 部分ゲノムライブラリー
を構築した。下流のＤＮＡをＮｌａIII ライブラリーか
らスクリーニングし配列決定した。このＤＮＡは６５７
ｂｐの長さしかなく、完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を
コードできる十分な大きさではなかった。次に、エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含むと考えられる配列の残部を逆
ＰＣＲを使用して増幅しクローニングした。
【００１７】別々の逆ＰＣＲ増幅を２回行った後、Ｍ１
の下流のＤＮＡフラグメントをクローニングして配列決
定し、１つの読取り枠を発見した。この読取り枠（ＯＲ
Ｆ）はＧｅｎＢａｎｋの既知の遺伝子に相同性を全く有
していなかった。これをＳａｐＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子であると推測した。ＳａｐＩ制限−修飾系の遺
伝子編成を図２に示す。Ｍ１遺伝子及びＭ２遺伝子をｐ
ＡＣＹＣ１８４またはｐＳＣ１０１に由来のベクターに
クローニングし、染色体ＤＮＡを予め修飾するために大
腸菌中に形質転換させた。
の下流のＤＮＡフラグメントをクローニングして配列決
定し、１つの読取り枠を発見した。この読取り枠（ＯＲ
Ｆ）はＧｅｎＢａｎｋの既知の遺伝子に相同性を全く有
していなかった。これをＳａｐＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子であると推測した。ＳａｐＩ制限−修飾系の遺
伝子編成を図２に示す。Ｍ１遺伝子及びＭ２遺伝子をｐ
ＡＣＹＣ１８４またはｐＳＣ１０１に由来のベクターに
クローニングし、染色体ＤＮＡを予め修飾するために大
腸菌中に形質転換させた。
【００１８】推定ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を
ＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９にクローニングし、
予め修飾した大腸菌宿主を形質転換させた。ｐＵＣ１９
中のインサートを含むプラスミドは、細胞抽出物中で低
いＳａｐＩエンドヌクレアーゼ活性を示したが、大量培
養物中では全部の単離物が活性を喪失しており、クロー
ンが安定でないことを示した。発現クローンを安定化す
るために、Ｍ２の手前に有効なリボソーム結合部位を組
み込んで、ｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。Ｍ１
遺伝子も同じベクターにクローニングした。ＳａｐＩエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を、Ｔ７プロモーターの上流に
転写ターミネーターを有しているＴ７発現ベクター（ｐ
ＥＴ２１誘導体）にクローニングした。転写ターミネー
ターは更に、非誘導条件下の遺伝子発現の基底レベルを
更に低下させた。エンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲに
よって増幅し、Ｔ７発現ベクターに挿入した。最終構築
物はｐＵＣ１９−ＳａｐＩＲよりも安定であった。
ＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９にクローニングし、
予め修飾した大腸菌宿主を形質転換させた。ｐＵＣ１９
中のインサートを含むプラスミドは、細胞抽出物中で低
いＳａｐＩエンドヌクレアーゼ活性を示したが、大量培
養物中では全部の単離物が活性を喪失しており、クロー
ンが安定でないことを示した。発現クローンを安定化す
るために、Ｍ２の手前に有効なリボソーム結合部位を組
み込んで、ｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。Ｍ１
遺伝子も同じベクターにクローニングした。ＳａｐＩエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を、Ｔ７プロモーターの上流に
転写ターミネーターを有しているＴ７発現ベクター（ｐ
ＥＴ２１誘導体）にクローニングした。転写ターミネー
ターは更に、非誘導条件下の遺伝子発現の基底レベルを
更に低下させた。エンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲに
よって増幅し、Ｔ７発現ベクターに挿入した。最終構築
物はｐＵＣ１９−ＳａｐＩＲよりも安定であった。
【００１９】
【発明の実施の形態】ＳａｐＩのメチラーゼ遺伝子及び
エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングし発現させる
本発明の方法は図１に示されており、以下の段階を含
む。
エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングし発現させる
本発明の方法は図１に示されており、以下の段階を含
む。
【００２０】１．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ
種のゲノムＤＮＡを精製した。
種のゲノムＤＮＡを精製した。
【００２１】２．Ｓａｕ３ＡＩもしくはＮｌａIII また
はそのアイソシゾマーのいずれかのような、完全Ｓａｐ
Ｉメチラーゼ遺伝子を含む（１つまたは複数の）ＤＮＡ
フラグメントを生じさせる制限エンドヌクレアーゼによ
ってＤＮＡを部分消化する。２−２０ｋｂの範囲のＤＮ
Ａフラグメントをゲル精製した。
はそのアイソシゾマーのいずれかのような、完全Ｓａｐ
Ｉメチラーゼ遺伝子を含む（１つまたは複数の）ＤＮＡ
フラグメントを生じさせる制限エンドヌクレアーゼによ
ってＤＮＡを部分消化する。２−２０ｋｂの範囲のＤＮ
Ａフラグメントをゲル精製した。
【００２２】３．段階２でＳａｕ３ＡＩ消化したゲノム
ＤＮＡをＢａｍＨＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ク
ローニングベクターに結合させた。ＮｌａIII 消化した
ゲノムＤＮＡをＳｐｈＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１
９クローニングベクターに結合させた。得られた混合物
を用いて適当な宿主、即ち大腸菌ＲＲ１株のようなＨｓ
ｄＲ- 、ＭｃｒＢＣ- 、Ｍｒｒ- 菌株を形質転換させ
た。ＤＮＡ／細胞混合物を形質転換細胞用のアンピシリ
ン選択培地で平板培養した。インキュベーション後、形
質転換コロニーを収集し、収集コロニーを一緒にして一
次細胞ライブラリーを作製した。
ＤＮＡをＢａｍＨＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ク
ローニングベクターに結合させた。ＮｌａIII 消化した
ゲノムＤＮＡをＳｐｈＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１
９クローニングベクターに結合させた。得られた混合物
を用いて適当な宿主、即ち大腸菌ＲＲ１株のようなＨｓ
ｄＲ- 、ＭｃｒＢＣ- 、Ｍｒｒ- 菌株を形質転換させ
た。ＤＮＡ／細胞混合物を形質転換細胞用のアンピシリ
ン選択培地で平板培養した。インキュベーション後、形
質転換コロニーを収集し、収集コロニーを一緒にして一
次細胞ライブラリーを作製した。
【００２３】４．一次細胞ライブラリーから組換えプラ
スミドを完全に（ｉｎ ｔｏｔｏ）精製して一次プラス
ミドライブラリーを作製した。精製したプラスミドライ
ブラリーを次に、ＳａｐＩエンドヌクレアーゼまたは任
意のＳａｐＩアイソシゾマーによってｉｎ ｖｉｔｒｏ
で完全消化した。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ消化は非
修飾のメチラーゼ非含有クローンを選択的に破壊し、Ｓ
ａｐＩメチラーゼを含むクローンの相対頻度が増加し
た。
スミドを完全に（ｉｎ ｔｏｔｏ）精製して一次プラス
ミドライブラリーを作製した。精製したプラスミドライ
ブラリーを次に、ＳａｐＩエンドヌクレアーゼまたは任
意のＳａｐＩアイソシゾマーによってｉｎ ｖｉｔｒｏ
で完全消化した。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ消化は非
修飾のメチラーゼ非含有クローンを選択的に破壊し、Ｓ
ａｐＩメチラーゼを含むクローンの相対頻度が増加し
た。
【００２４】５．ＳａｐＩメチラーゼクローンの同定。
消化したプラスミドライブラリーＤＮＡで大腸菌ＲＲ１
のような宿主を再度形質転換させ、アンピシリンプレー
トに平板培養することによって形質転換コロニーを再度
調製した。コロニーを採取し、それらのプラスミドＤＮ
Ａを調製し、ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子の存在を分析す
るために、精製したプラスミドＤＮＡをＳａｐＩエンド
ヌクレアーゼと共にｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートす
ることによってＳａｐＩ消化に耐性であるか否かを判定
した。
消化したプラスミドライブラリーＤＮＡで大腸菌ＲＲ１
のような宿主を再度形質転換させ、アンピシリンプレー
トに平板培養することによって形質転換コロニーを再度
調製した。コロニーを採取し、それらのプラスミドＤＮ
Ａを調製し、ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子の存在を分析す
るために、精製したプラスミドＤＮＡをＳａｐＩエンド
ヌクレアーゼと共にｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートす
ることによってＳａｐＩ消化に耐性であるか否かを判定
した。
【００２５】６．メチラーゼ遺伝子がクローニングされ
たことを確認した後、制限地図作成及び欠失地図作成に
よってクローンを分析した。完全インサートを配列決定
し、ＳａｐＩ Ｍ１メチラーゼ遺伝子に対応する１つの
読取り枠を発見した（図３、配列番号１参照）。
たことを確認した後、制限地図作成及び欠失地図作成に
よってクローンを分析した。完全インサートを配列決定
し、ＳａｐＩ Ｍ１メチラーゼ遺伝子に対応する１つの
読取り枠を発見した（図３、配列番号１参照）。
【００２６】７．Ｍ１遺伝子の近傍のゲノムＤＮＡ地図
を構築するために、Ｍ１クローンに由来の２つのＤＮＡ
フラグメント（ＣｌａＩ−ＳｍａＩフラグメント及びＣ
ｌａＩ−ＳｐｈＩフラグメント）を、ＡａｔII、Ｅｃｏ
Ｏ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、Ｓｍａ
Ｉ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＸｂａＩ、ＸｍｎＩ、Ａｆｌ
II、ＡｖｒII、ＢｓｇＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｔＢＩ，Ｂ
ｓｕ３６Ｉ、ＤｒａIII、ＥａｇＩ、Ｅｃｏ４７III 、
ＥｃｏＮＩ、ＭｓｃＩ、ＭｕｎＩ、ＮｃｏＩ、Ｎｄｅ
Ｉ、ＮｒｕＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｍｌＩ、ＲｓｒII、Ｓａ
ｃII、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩまたはＳｔｙＩによって消
化されたゲノムＤＮＡを検出するサザンブロットのプロ
ーブとして使用した。サザンブロットは、ＥｃｏＲＩ
（１１ｋｂ）、ＫｐｎＩ（５．８ｋｂ）及びＳｍａＩ
（６．５ｋｂ）のフラグメントがＳａｐＩＭ２遺伝子及
び／またはＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のク
ローニングの有望な候補であることを示した。
を構築するために、Ｍ１クローンに由来の２つのＤＮＡ
フラグメント（ＣｌａＩ−ＳｍａＩフラグメント及びＣ
ｌａＩ−ＳｐｈＩフラグメント）を、ＡａｔII、Ｅｃｏ
Ｏ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、Ｓｍａ
Ｉ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＸｂａＩ、ＸｍｎＩ、Ａｆｌ
II、ＡｖｒII、ＢｓｇＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｔＢＩ，Ｂ
ｓｕ３６Ｉ、ＤｒａIII、ＥａｇＩ、Ｅｃｏ４７III 、
ＥｃｏＮＩ、ＭｓｃＩ、ＭｕｎＩ、ＮｃｏＩ、Ｎｄｅ
Ｉ、ＮｒｕＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｍｌＩ、ＲｓｒII、Ｓａ
ｃII、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩまたはＳｔｙＩによって消
化されたゲノムＤＮＡを検出するサザンブロットのプロ
ーブとして使用した。サザンブロットは、ＥｃｏＲＩ
（１１ｋｂ）、ＫｐｎＩ（５．８ｋｂ）及びＳｍａＩ
（６．５ｋｂ）のフラグメントがＳａｐＩＭ２遺伝子及
び／またはＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のク
ローニングの有望な候補であることを示した。
【００２７】８．ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ
またはＳｍａＩで消化した。約１１ｋｂのＥｃｏＲＩフ
ラグメント、約５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメント及び
約６．５ｋｂのＳｍａＩフラグメントをゲル精製し、Ｅ
ｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＳｍａＩ消化しＣＩＰ処理し
たｐＵＣ１９ベクターに結合させ、結合したＤＮＡでＲ
Ｒ１コンピテント細胞を形質転換させてＥｃｏＲＩ、Ｋ
ｐｎＩ及びＳｍａＩゲノムＤＮＡライブラリーを構築し
た。ライブラリーＤＮＡを一緒に混合し、ＳａｐＩ制限
エンドヌクレアーゼで消化し、ＲＲ１コンピテント細胞
を再度形質転換させ、ＳａｐＩ耐性クローンをスクリー
ニングした。
またはＳｍａＩで消化した。約１１ｋｂのＥｃｏＲＩフ
ラグメント、約５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメント及び
約６．５ｋｂのＳｍａＩフラグメントをゲル精製し、Ｅ
ｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＳｍａＩ消化しＣＩＰ処理し
たｐＵＣ１９ベクターに結合させ、結合したＤＮＡでＲ
Ｒ１コンピテント細胞を形質転換させてＥｃｏＲＩ、Ｋ
ｐｎＩ及びＳｍａＩゲノムＤＮＡライブラリーを構築し
た。ライブラリーＤＮＡを一緒に混合し、ＳａｐＩ制限
エンドヌクレアーゼで消化し、ＲＲ１コンピテント細胞
を再度形質転換させ、ＳａｐＩ耐性クローンをスクリー
ニングした。
【００２８】９．ＳａｐＩ消化に部分耐性を示すクロー
ンとして５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメントインサート
を含む３つのクローンを単離した。制限地図作成及び欠
失地図作成によってこれらのクローンを分析した。サブ
クローンを配列決定した。第二のメチラーゼ（Ｍ２）を
コードする読取り枠を発見した（図４、配列番号２参
照）。
ンとして５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメントインサート
を含む３つのクローンを単離した。制限地図作成及び欠
失地図作成によってこれらのクローンを分析した。サブ
クローンを配列決定した。第二のメチラーゼ（Ｍ２）を
コードする読取り枠を発見した（図４、配列番号２参
照）。
【００２９】１０．５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメント
インサートはＭ２遺伝子全部とＭ１遺伝子の大部分とを
含む。読取り枠の位置の検出を期待してＭ２の上流のＤ
ＮＡを配列決定した。Ｍ２遺伝子の上流の合計１７３１
ｂｐのＤＮＡを配列決定し、この新しい配列をＧｅｎＢ
ａｎｋの全部の既知遺伝子に比較した。抗生物質合成に
関与するａｂａＡ遺伝子に相同性を有する１つの読取り
枠を発見した。ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
はＭ２遺伝子の上流には存在しないという結論が得られ
た。
インサートはＭ２遺伝子全部とＭ１遺伝子の大部分とを
含む。読取り枠の位置の検出を期待してＭ２の上流のＤ
ＮＡを配列決定した。Ｍ２遺伝子の上流の合計１７３１
ｂｐのＤＮＡを配列決定し、この新しい配列をＧｅｎＢ
ａｎｋの全部の既知遺伝子に比較した。抗生物質合成に
関与するａｂａＡ遺伝子に相同性を有する１つの読取り
枠を発見した。ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
はＭ２遺伝子の上流には存在しないという結論が得られ
た。
【００３０】１１．Ｍ１遺伝子の下流のＤＮＡ配列を増
幅するために逆ＰＣＲを行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏ
ｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＡｆｌIII 、Ａｇｅ
Ｉ、ＡｓｅＩ、ＢｇｌII、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、Ｂ
ｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫａｓＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＮｇｏＭＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、Ｐｐｕ１０
ＩまたはＰｓｔＩのような制限酵素または逆ＰＣＲ反応
に適した大きさの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ未満）を生じる
任意の他の制限酵素によって消化した。消化したＤＮＡ
は低いＤＮＡ濃度（１ｍｌあたり２マイクログラム未
満）で自己結合した。結合した環状ＤＮＡを鋳型として
使用し、ＳａｐＩ Ｍ１遺伝子の末端にアニーリングし
た１組のプライマー（実施例１、第５項参照）を用いて
逆ＰＣＲ反応を行った。
幅するために逆ＰＣＲを行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏ
ｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＡｆｌIII 、Ａｇｅ
Ｉ、ＡｓｅＩ、ＢｇｌII、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、Ｂ
ｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫａｓＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＮｇｏＭＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、Ｐｐｕ１０
ＩまたはＰｓｔＩのような制限酵素または逆ＰＣＲ反応
に適した大きさの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ未満）を生じる
任意の他の制限酵素によって消化した。消化したＤＮＡ
は低いＤＮＡ濃度（１ｍｌあたり２マイクログラム未
満）で自己結合した。結合した環状ＤＮＡを鋳型として
使用し、ＳａｐＩ Ｍ１遺伝子の末端にアニーリングし
た１組のプライマー（実施例１、第５項参照）を用いて
逆ＰＣＲ反応を行った。
【００３１】１２．ＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、ＡｓｅＩ、
ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、Ｋａ
ｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰａｅＲ７Ｉ及びＰｐｕ１０Ｉで消化
し自己結合した、逆ＰＣＲで用いたＤＮＡ鋳型中に増幅
産物が検出された。ＣｌａＩ反応からの逆ＰＣＲ産物
（１．４ｋｂ）及びＮｓｉＩ反応からの逆ＰＣＲ産物
（１．６ｋｂ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ
４ ＤＮＡポリメラーゼによって処理し、ＨｉｎｃII開
裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ベクターにクローニング
した。完全インサートを配列決定した。ＳａｐＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子（図５、配列番号３）をコードして
いる１つの読取り枠がＭ１遺伝子に対して対向方向に存
在することが判明した。
ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、Ｋａ
ｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰａｅＲ７Ｉ及びＰｐｕ１０Ｉで消化
し自己結合した、逆ＰＣＲで用いたＤＮＡ鋳型中に増幅
産物が検出された。ＣｌａＩ反応からの逆ＰＣＲ産物
（１．４ｋｂ）及びＮｓｉＩ反応からの逆ＰＣＲ産物
（１．６ｋｂ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ
４ ＤＮＡポリメラーゼによって処理し、ＨｉｎｃII開
裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ベクターにクローニング
した。完全インサートを配列決定した。ＳａｐＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子（図５、配列番号３）をコードして
いる１つの読取り枠がＭ１遺伝子に対して対向方向に存
在することが判明した。
【００３２】１３．大腸菌宿主を予め修飾するためにＳ
ａｐＩのＭ１遺伝子及びＭ２遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４
にクローニングした。２つのプライマーを用いたＰＣＲ
によって完全読取り枠（ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺
伝子）を増幅させた。ＡＴＧ開始コドンの前に有効なリ
ボソーム結合部位と７ｂｐのスペーシングとを作製し
た。エンドヌクレアーゼ遺伝子を先ずｐＵＣ１９のよう
な高コピー数発現ベクターにクローニングした。しかし
ながらクローンは安定でなかった。ＳａｐＩエンドヌク
レアーゼ活性は１０ｍｌ培養物の細胞抽出物から検出で
きるが、５００ｍｌ培養物からは検出できない。クロー
ンを安定化するために、エンドヌクレアーゼ遺伝子を修
飾されたＴ７発現ベクターｐＥＴ２１ｔに挿入し、Ｓａ
ｐＩメチラーゼで修飾した細胞の形質転換に用いた。Ｅ
Ｒ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２，ｐＥＴ
２１ｔ−ＳａｐＩＲ〕（ＮＥＢ＃９９８；Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）は湿潤大腸菌細胞１
ｇあたり約２０，０００単位のＳａｐＩエンドヌクレア
ーゼ活性を産生した。ＮＥＢ＃９９８のサンプルはブダ
ペスト条約の約定及び条件に従って１９９６年７月１１
日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号９８１０２
で寄託されている。
ａｐＩのＭ１遺伝子及びＭ２遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４
にクローニングした。２つのプライマーを用いたＰＣＲ
によって完全読取り枠（ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺
伝子）を増幅させた。ＡＴＧ開始コドンの前に有効なリ
ボソーム結合部位と７ｂｐのスペーシングとを作製し
た。エンドヌクレアーゼ遺伝子を先ずｐＵＣ１９のよう
な高コピー数発現ベクターにクローニングした。しかし
ながらクローンは安定でなかった。ＳａｐＩエンドヌク
レアーゼ活性は１０ｍｌ培養物の細胞抽出物から検出で
きるが、５００ｍｌ培養物からは検出できない。クロー
ンを安定化するために、エンドヌクレアーゼ遺伝子を修
飾されたＴ７発現ベクターｐＥＴ２１ｔに挿入し、Ｓａ
ｐＩメチラーゼで修飾した細胞の形質転換に用いた。Ｅ
Ｒ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２，ｐＥＴ
２１ｔ−ＳａｐＩＲ〕（ＮＥＢ＃９９８；Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）は湿潤大腸菌細胞１
ｇあたり約２０，０００単位のＳａｐＩエンドヌクレア
ーゼ活性を産生した。ＮＥＢ＃９９８のサンプルはブダ
ペスト条約の約定及び条件に従って１９９６年７月１１
日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号９８１０２
で寄託されている。
【００３３】以下の実施例は現在好ましく実施されてい
る本発明の実施態様を説明する。この実施例は単なる代
表例であり本発明を限定するものではないこと、及び、
本発明は特許請求の範囲の記載によって限定されること
は理解されよう。
る本発明の実施態様を説明する。この実施例は単なる代
表例であり本発明を限定するものではないこと、及び、
本発明は特許請求の範囲の記載によって限定されること
は理解されよう。
【００３４】前出及び後出の引用文献は参照によって本
発明に含まれるものとする。
発明に含まれるものとする。
【００３５】実施例１ ＳａｐＩ制限−修飾系のクローニング １．ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ１）のクローニング １０μｇのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲ
ノムＤＮＡを４、２、１、０．５、０．２５単位のＳａ
ｕ３ＡＩによって３７℃で３０分間部分開裂した。部分
消化したＤＮＡをゲル電気泳動によって分析した。１単
位及び０．５単位のＳａｕ３ＡＩ消化によって限定部分
消化が生じることが知見された。２００μｇのＤＮＡに
ついて部分消化を繰り返した（試験管あたり１０μｇの
ＤＮＡを用いて２０の消化を実施した）。アガロースゲ
ルからＤＮＡを切り出し、凍結−解凍し、遠心すること
によって、２−２０ｋｂの範囲のゲノムＤＮＡフラグメ
ントをゲル精製した。ＤＮＡ含有上清を９５％エタノー
ルで沈降させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄
し、乾燥し、ＴＥバッファに再懸濁させた。Ｓａｕ３Ａ
Ｉで部分消化したＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ
種のゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐ
ＵＣ１９ ＤＮＡに１６℃で一夜結合させた。結合した
ＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を形質転換させ、アン
ピシリンプレートで平板培養した。形質転換に由来する
細胞が合計で約５×１０4 個得られた。これらの細胞を
一緒にプールし、１リットルのＬＢブイヨンにＡｐを加
えた培地に接種し、３７℃で一夜培養した。一次細胞ラ
イブラリーからプラスミドＤＮＡを調製した。１０、
５、２、１μｇのプラスミドＤＮＡをＳａｐＩ制限エン
ドヌクレアーゼによって３７℃で４時間開裂した。Ｓａ
ｐＩ消化したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を再度形
質転換させた。生存する形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを再度単離し、プラスミドＤＮＡがＳａｐＩ消化に耐
性であるか否かを確認するためにＳａｐＩ制限酵素によ
って消化した。７２プラスミドがＳａｐＩ消化耐性につ
いてチェックされた。約１．５ｋｂのゲノムＤＮＡイン
サートを含む１つの耐性クローン（＃３２）が見出され
た。欠失クローン及びカスタムプライマーによるプライ
マーウォーキングを用いて完全インサートを配列決定し
た。インサートはＳａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ１）を
含んでいることが判明した。予測されたアミノ酸（ａ
ａ）配列は、保存されたＮ4 シトシンメチラーゼモチー
フＶＸＤＰＸＧＧＸＧＴ（配列番号４）及びＳＰＰＦを
含む。ＤＮＡコーディング配列と予測されたａａ配列と
を図３に示す。
ノムＤＮＡを４、２、１、０．５、０．２５単位のＳａ
ｕ３ＡＩによって３７℃で３０分間部分開裂した。部分
消化したＤＮＡをゲル電気泳動によって分析した。１単
位及び０．５単位のＳａｕ３ＡＩ消化によって限定部分
消化が生じることが知見された。２００μｇのＤＮＡに
ついて部分消化を繰り返した（試験管あたり１０μｇの
ＤＮＡを用いて２０の消化を実施した）。アガロースゲ
ルからＤＮＡを切り出し、凍結−解凍し、遠心すること
によって、２−２０ｋｂの範囲のゲノムＤＮＡフラグメ
ントをゲル精製した。ＤＮＡ含有上清を９５％エタノー
ルで沈降させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄
し、乾燥し、ＴＥバッファに再懸濁させた。Ｓａｕ３Ａ
Ｉで部分消化したＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ
種のゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐ
ＵＣ１９ ＤＮＡに１６℃で一夜結合させた。結合した
ＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を形質転換させ、アン
ピシリンプレートで平板培養した。形質転換に由来する
細胞が合計で約５×１０4 個得られた。これらの細胞を
一緒にプールし、１リットルのＬＢブイヨンにＡｐを加
えた培地に接種し、３７℃で一夜培養した。一次細胞ラ
イブラリーからプラスミドＤＮＡを調製した。１０、
５、２、１μｇのプラスミドＤＮＡをＳａｐＩ制限エン
ドヌクレアーゼによって３７℃で４時間開裂した。Ｓａ
ｐＩ消化したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を再度形
質転換させた。生存する形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを再度単離し、プラスミドＤＮＡがＳａｐＩ消化に耐
性であるか否かを確認するためにＳａｐＩ制限酵素によ
って消化した。７２プラスミドがＳａｐＩ消化耐性につ
いてチェックされた。約１．５ｋｂのゲノムＤＮＡイン
サートを含む１つの耐性クローン（＃３２）が見出され
た。欠失クローン及びカスタムプライマーによるプライ
マーウォーキングを用いて完全インサートを配列決定し
た。インサートはＳａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ１）を
含んでいることが判明した。予測されたアミノ酸（ａ
ａ）配列は、保存されたＮ4 シトシンメチラーゼモチー
フＶＸＤＰＸＧＧＸＧＴ（配列番号４）及びＳＰＰＦを
含む。ＤＮＡコーディング配列と予測されたａａ配列と
を図３に示す。
【００３６】２．ＳａｐＩ Ｍ１遺伝子の周囲のゲノム
ＤＮＡの制限地図作成 Ｍ１クローンに由来のＭ１メチラーゼのＣ末端をコード
する１つのＣｌａＩ−ＳｍａＩ ＤＮＡフラグメント
を、ＡａｔII、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、Ｘｂａ
Ｉ、ＸｍｎＩ、ＡｆｌII、ＡｖｒII、ＢｓｇＩ、Ｂｓｐ
ＥＩ、ＢｓｔＢＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａIII 、Ｅａｇ
Ｉ、Ｅｃｏ４７III 、ＥｃｏＮＩ、ＭｓｃＩ、Ｍｕｎ
Ｉ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｒｕＩ、ＰｆｌＭＩ、Ｐｍ
ｌＩ、ＲｓｒII、ＳａｃII、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩまた
はＳｔｙＩによって消化されたゲノムＤＮＡを検出する
サザンブロットのプローブとして使用した。エンドヌク
レアーゼ消化したゲノムＤＮＡを０．８％アガロースゲ
ルで電気泳動処理した。ＤＮＡを変性し、ブロッティン
グによってニトロセルロース膜に移した。膜のＤＮＡと
ビオチニル化したＣｌａＩ−ＳｍａＩフラグメントプロ
ーブとを６５℃で一夜ハイブリダイズさせた。ハイブリ
ダイズしたＤＮＡをＮＥＢｌｏｔ（登録商標）ホトトー
プ（ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ）検出システムによって検出し
た（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎ
ｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。
同じゲノムＤＮＡの膜をストリッピングし、ＳａｐＩメ
チラーゼＭ１のＮ末端をコードするＣｌａＩ−ＳｐｈＩ
ＤＮＡプローブによって再度プロービングした。サザ
ンブロットは、ＥｃｏＲＩ（１１ｋｂ）、ＫｐｎＩ
（５．８ｋｂ）及びＳｍａＩ（６．５ｋｂ）のフラグメ
ントが、ＳａｐＩ Ｍ２遺伝子及び／またはＳａｐＩ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする周囲のＤＮＡ
のクローニングの有望な候補であることを示した。
ＤＮＡの制限地図作成 Ｍ１クローンに由来のＭ１メチラーゼのＣ末端をコード
する１つのＣｌａＩ−ＳｍａＩ ＤＮＡフラグメント
を、ＡａｔII、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、Ｘｂａ
Ｉ、ＸｍｎＩ、ＡｆｌII、ＡｖｒII、ＢｓｇＩ、Ｂｓｐ
ＥＩ、ＢｓｔＢＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａIII 、Ｅａｇ
Ｉ、Ｅｃｏ４７III 、ＥｃｏＮＩ、ＭｓｃＩ、Ｍｕｎ
Ｉ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｒｕＩ、ＰｆｌＭＩ、Ｐｍ
ｌＩ、ＲｓｒII、ＳａｃII、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩまた
はＳｔｙＩによって消化されたゲノムＤＮＡを検出する
サザンブロットのプローブとして使用した。エンドヌク
レアーゼ消化したゲノムＤＮＡを０．８％アガロースゲ
ルで電気泳動処理した。ＤＮＡを変性し、ブロッティン
グによってニトロセルロース膜に移した。膜のＤＮＡと
ビオチニル化したＣｌａＩ−ＳｍａＩフラグメントプロ
ーブとを６５℃で一夜ハイブリダイズさせた。ハイブリ
ダイズしたＤＮＡをＮＥＢｌｏｔ（登録商標）ホトトー
プ（ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ）検出システムによって検出し
た（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎ
ｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。
同じゲノムＤＮＡの膜をストリッピングし、ＳａｐＩメ
チラーゼＭ１のＮ末端をコードするＣｌａＩ−ＳｐｈＩ
ＤＮＡプローブによって再度プロービングした。サザ
ンブロットは、ＥｃｏＲＩ（１１ｋｂ）、ＫｐｎＩ
（５．８ｋｂ）及びＳｍａＩ（６．５ｋｂ）のフラグメ
ントが、ＳａｐＩ Ｍ２遺伝子及び／またはＳａｐＩ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする周囲のＤＮＡ
のクローニングの有望な候補であることを示した。
【００３７】３．ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子Ｍ２のクロ
ーニング Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡ
をＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＳｍａＩによって開裂し
た。消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲルで電気泳
動処理した。約１１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント、約
５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメント及び約６．５ｋｂの
ＳｍａＩフラグメントをゲル精製し、ＥｃｏＲＩ、Ｋｐ
ｎＩまたはＳｍａＩ消化しＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ベ
クターに結合した。結合したＤＮＡでＲＲ１コンピテン
ト細胞を形質転換させた。約６，０００のコロニーを一
緒にプールし、５００ｍｌのＬＢブイヨンにＡｐを加え
た培地に接種し、一夜培養した。混合した一次細胞ライ
ブラリーからプラスミドＤＮＡを調製した。１０、５、
２、１μｇのプラスミドＤＮＡをＳａｐＩ制限エンドヌ
クレアーゼによって３７℃で４時間開裂した。ＳａｐＩ
消化したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を再度形質転
換させた。Ｍ１ ＤＮＡプローブを用いて形質転換体の
コロニーハイブリダイゼーションを行った。プラスミド
ＤＮＡを陽性クローンから単離し、プラスミドＤＮＡが
ＳａｐＩ消化に耐性であるか否かを判断するためにＳａ
ｐＩ制限酵素によって消化した。単離物＃５、＃１８及
び＃３２はＳａｐＩ消化に部分的に耐性であり、５．８
ｋｂのＫｐｎＩゲノムインサートを含む。制限地図作
成、欠失地図作成及びＤＮＡ配列決定は、インサートが
第二のメチラーゼ遺伝子Ｍ２とＭ１の大部分とを含むこ
とを示した。Ｍ２のコーディング配列と予測ａａ配列と
を図４に示す。ＳａｐＩ Ｍ２メチラーゼはまた、保存
されたＮ4 シトシンメチラーゼモチーフＶＸＤＰＸＧＧ
ＸＧＴ（配列番号４）及びＳＰＰＹを含む。Ｍ２の上流
の余分なＤＮＡは約３．３ｋｂである。ＳａｐＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子である読取り枠を見出すことを期待
してＭ２に隣接のＤＮＡを配列決定した。合計１７３１
ｂｐのＤＮＡを配列決定し、ＧｅｎＢａｎｋの全部の既
知遺伝子に比較して相同性を検査した。Ｍ２の上流の１
つの読取り枠は、抗生物質合成に関与する１つの遺伝子
に類似性を有することが判明した。Ｍ２遺伝子の上流の
この読取り枠はＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
でないという結論が得られた。
ーニング Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡ
をＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＳｍａＩによって開裂し
た。消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲルで電気泳
動処理した。約１１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント、約
５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメント及び約６．５ｋｂの
ＳｍａＩフラグメントをゲル精製し、ＥｃｏＲＩ、Ｋｐ
ｎＩまたはＳｍａＩ消化しＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ベ
クターに結合した。結合したＤＮＡでＲＲ１コンピテン
ト細胞を形質転換させた。約６，０００のコロニーを一
緒にプールし、５００ｍｌのＬＢブイヨンにＡｐを加え
た培地に接種し、一夜培養した。混合した一次細胞ライ
ブラリーからプラスミドＤＮＡを調製した。１０、５、
２、１μｇのプラスミドＤＮＡをＳａｐＩ制限エンドヌ
クレアーゼによって３７℃で４時間開裂した。ＳａｐＩ
消化したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を再度形質転
換させた。Ｍ１ ＤＮＡプローブを用いて形質転換体の
コロニーハイブリダイゼーションを行った。プラスミド
ＤＮＡを陽性クローンから単離し、プラスミドＤＮＡが
ＳａｐＩ消化に耐性であるか否かを判断するためにＳａ
ｐＩ制限酵素によって消化した。単離物＃５、＃１８及
び＃３２はＳａｐＩ消化に部分的に耐性であり、５．８
ｋｂのＫｐｎＩゲノムインサートを含む。制限地図作
成、欠失地図作成及びＤＮＡ配列決定は、インサートが
第二のメチラーゼ遺伝子Ｍ２とＭ１の大部分とを含むこ
とを示した。Ｍ２のコーディング配列と予測ａａ配列と
を図４に示す。ＳａｐＩ Ｍ２メチラーゼはまた、保存
されたＮ4 シトシンメチラーゼモチーフＶＸＤＰＸＧＧ
ＸＧＴ（配列番号４）及びＳＰＰＹを含む。Ｍ２の上流
の余分なＤＮＡは約３．３ｋｂである。ＳａｐＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子である読取り枠を見出すことを期待
してＭ２に隣接のＤＮＡを配列決定した。合計１７３１
ｂｐのＤＮＡを配列決定し、ＧｅｎＢａｎｋの全部の既
知遺伝子に比較して相同性を検査した。Ｍ２の上流の１
つの読取り枠は、抗生物質合成に関与する１つの遺伝子
に類似性を有することが判明した。Ｍ２遺伝子の上流の
この読取り枠はＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
でないという結論が得られた。
【００３８】４．部分ＮｌａIII ライブラリーの構築に
よるＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の一部分の
クローニング ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子がＭ１遺伝子の下流
の位置に存在する可能性が高いので、Ｍ１とＳａｐＩエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子との双方を含むより大きいＤＮ
Ａフラグメントのクローニングを試験した。Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＮｌａII
I 制限エンドヌクレアーゼによって部分消化した。３−
２０ｋｂの範囲のゲノムＤＮＡフラグメントをゲル精製
し、ＳｐｈＩ消化しＣＩＰ処理したｐＵＣ１９に挿入し
た。結合したＤＮＡを用いてＲＲ１コンピテント細胞を
形質転換させた。一次細胞ライブラリーからプラスミド
ＤＮＡを調製した。１０、５、２、１μｇのプラスミド
ＤＮＡをＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼによって３７
℃で４時間開裂した。ＳａｐＩ消化したＤＮＡでＲＲ１
コンピテント細胞を再度形質転換させた。プラスミドＤ
ＮＡを単離し、プラスミドＤＮＡがＳａｐＩ消化に耐性
であるか否かを観察するためにＳａｐＩ制限酵素によっ
て消化した。１５３のプラスミド単離物のスクリーニン
グ後、ｐＵＣ１９−ゲノムインサート＃９、＃１３、＃
１４、＃５９、＃８３、＃８４、＃８８、＃１０９、＃
１１８、＃１２３、＃１２６、＃１３３、＃１４８はＳ
ａｐＩ消化に耐性であることが判明した。制限地図作成
によれば、＃１３、＃１４及び＃５９が同じインサート
を含むことが判明し、Ｍ１メチラーゼ遺伝子の下流のＤ
ＮＡが配列決定された。＃１３のインサートはＭ１イン
サートから更に６５７ｂｐだけ伸びる余分なＤＮＡを含
んでいた。しかしながらこの６５７ｂｐは完全ＳａｐＩ
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードできる大きさで
はない。＃１３は細胞抽出物中で検出可能な制限エンド
ヌクレアーゼ活性を全く示さなかった。
よるＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の一部分の
クローニング ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子がＭ１遺伝子の下流
の位置に存在する可能性が高いので、Ｍ１とＳａｐＩエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子との双方を含むより大きいＤＮ
Ａフラグメントのクローニングを試験した。Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＮｌａII
I 制限エンドヌクレアーゼによって部分消化した。３−
２０ｋｂの範囲のゲノムＤＮＡフラグメントをゲル精製
し、ＳｐｈＩ消化しＣＩＰ処理したｐＵＣ１９に挿入し
た。結合したＤＮＡを用いてＲＲ１コンピテント細胞を
形質転換させた。一次細胞ライブラリーからプラスミド
ＤＮＡを調製した。１０、５、２、１μｇのプラスミド
ＤＮＡをＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼによって３７
℃で４時間開裂した。ＳａｐＩ消化したＤＮＡでＲＲ１
コンピテント細胞を再度形質転換させた。プラスミドＤ
ＮＡを単離し、プラスミドＤＮＡがＳａｐＩ消化に耐性
であるか否かを観察するためにＳａｐＩ制限酵素によっ
て消化した。１５３のプラスミド単離物のスクリーニン
グ後、ｐＵＣ１９−ゲノムインサート＃９、＃１３、＃
１４、＃５９、＃８３、＃８４、＃８８、＃１０９、＃
１１８、＃１２３、＃１２６、＃１３３、＃１４８はＳ
ａｐＩ消化に耐性であることが判明した。制限地図作成
によれば、＃１３、＃１４及び＃５９が同じインサート
を含むことが判明し、Ｍ１メチラーゼ遺伝子の下流のＤ
ＮＡが配列決定された。＃１３のインサートはＭ１イン
サートから更に６５７ｂｐだけ伸びる余分なＤＮＡを含
んでいた。しかしながらこの６５７ｂｐは完全ＳａｐＩ
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードできる大きさで
はない。＃１３は細胞抽出物中で検出可能な制限エンド
ヌクレアーゼ活性を全く示さなかった。
【００３９】５．逆ＰＣＲによるＳａｐＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の残部のクローニング Ｍ１遺伝子の下流に存在するＤＮＡ配列を増幅するため
に逆ＰＣＲを使用した。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐ
ｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、Ａｓ
ｅＩ、ＢｇｌII、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹ
Ｉ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、Ｍｌ
ｕＩ、ＮｇｏＭＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、Ｐｐｕ１０Ｉまたは
ＰｓｔＩから成る制限酵素によって消化した。消化した
ＤＮＡは低いＤＮＡ濃度で自己結合した（結合反応：２
０μｌの消化ＤＮＡ、約１μｇ、５０μｌの１０×結合
バッファ、５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、４２５μｌ
の滅菌蒸留水，１６℃、一夜）。結合した環状ＤＮＡを
フェノール−ＣＨＣｌ3 抽出及びエタノール沈降によっ
て精製し、ＳａｐＩ Ｍ１遺伝子の末端にアニーリング
した１組のプライマーを用いる逆ＰＣＲ反応の鋳型とし
て使用した。逆ＰＣＲに使用したプライマー配列を以下
に示す。
アーゼ遺伝子の残部のクローニング Ｍ１遺伝子の下流に存在するＤＮＡ配列を増幅するため
に逆ＰＣＲを使用した。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐ
ｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、Ａｓ
ｅＩ、ＢｇｌII、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹ
Ｉ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、Ｍｌ
ｕＩ、ＮｇｏＭＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、Ｐｐｕ１０Ｉまたは
ＰｓｔＩから成る制限酵素によって消化した。消化した
ＤＮＡは低いＤＮＡ濃度で自己結合した（結合反応：２
０μｌの消化ＤＮＡ、約１μｇ、５０μｌの１０×結合
バッファ、５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、４２５μｌ
の滅菌蒸留水，１６℃、一夜）。結合した環状ＤＮＡを
フェノール−ＣＨＣｌ3 抽出及びエタノール沈降によっ
て精製し、ＳａｐＩ Ｍ１遺伝子の末端にアニーリング
した１組のプライマーを用いる逆ＰＣＲ反応の鋳型とし
て使用した。逆ＰＣＲに使用したプライマー配列を以下
に示す。
【００４０】順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー：
５′ＴＡＡＧＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧ
３′（配列番号５） 逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー：５′ＡＡＣＡＧ
ＧＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＡＧＴＴＧＴＡ３′（配列番
号６） 逆ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１分間、６０℃で１分
間及び７２℃で２分間であり、これを３０サイクル反復
した。逆ＰＣＲ産物は、ＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、Ａｓｅ
Ｉ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、
ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰａｅＲ７Ｉ及びＰｐｕ１０Ｉで
消化し自己結合したＤＮＡ鋳型中で検出された。Ｃｌａ
Ｉ反応からの逆ＰＣＲ産物（１．４ｋｂ）及びＮｓｉＩ
反応からの逆ＰＣＲ産物（１．６ｋｂ）をＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理
し、ＨｉｎｃII開裂／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターに
クローニングした。欠失クローン及びカスタムプライマ
ーを用いて完全インサートを配列決定した。Ｍ１遺伝子
に対して対向方向で存在する１つの読取り枠が発見され
た。ＤＮＡコーディング配列及び予測ａａ配列を図５に
示す。
５′ＴＡＡＧＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧ
３′（配列番号５） 逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー：５′ＡＡＣＡＧ
ＧＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＡＧＴＴＧＴＡ３′（配列番
号６） 逆ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１分間、６０℃で１分
間及び７２℃で２分間であり、これを３０サイクル反復
した。逆ＰＣＲ産物は、ＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、Ａｓｅ
Ｉ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、
ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰａｅＲ７Ｉ及びＰｐｕ１０Ｉで
消化し自己結合したＤＮＡ鋳型中で検出された。Ｃｌａ
Ｉ反応からの逆ＰＣＲ産物（１．４ｋｂ）及びＮｓｉＩ
反応からの逆ＰＣＲ産物（１．６ｋｂ）をＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理
し、ＨｉｎｃII開裂／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターに
クローニングした。欠失クローン及びカスタムプライマ
ーを用いて完全インサートを配列決定した。Ｍ１遺伝子
に対して対向方向で存在する１つの読取り枠が発見され
た。ＤＮＡコーディング配列及び予測ａａ配列を図５に
示す。
【００４１】６．ｐＵＣ１９中のＳａｐＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の発現 ＳａｐＩ Ｍ１遺伝子をｐＲ９７６（ＴｃR 、ｐＡＣＹ
Ｃ１８４誘導体、図６）にサブクローニングし、Ｍ２遺
伝子をｐＬＧ３３９（ＫｎR ，ｐＳＣ１０１誘導体、Ｓ
ｔｏｋｅｒら，Ｇｅｎｅ １８：３３５−３４１）にク
ローニングした。宿主染色体を予め修飾するために、ｐ
Ｒ９７６−Ｍ１及びｐＬＧ３３９−Ｍ２の双方で大腸菌
を形質転換した。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を
ＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９に結合させた。低レ
ベルのＳａｐＩ発現が大腸菌〔ｐＲ９７６−Ｍ１、ｐＬ
Ｇ３３９−Ｍ２、ｐＵＣ１９−ＳａｐＩＲ〕中で得られ
たが、菌株は安定でなかった。ＳａｐＩ活性は１０ｍｌ
の培養物中でのみ検出された。５００ｍｌ培養物中では
ＳａｐＩ活性は喪失していた。
アーゼ遺伝子の発現 ＳａｐＩ Ｍ１遺伝子をｐＲ９７６（ＴｃR 、ｐＡＣＹ
Ｃ１８４誘導体、図６）にサブクローニングし、Ｍ２遺
伝子をｐＬＧ３３９（ＫｎR ，ｐＳＣ１０１誘導体、Ｓ
ｔｏｋｅｒら，Ｇｅｎｅ １８：３３５−３４１）にク
ローニングした。宿主染色体を予め修飾するために、ｐ
Ｒ９７６−Ｍ１及びｐＬＧ３３９−Ｍ２の双方で大腸菌
を形質転換した。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を
ＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９に結合させた。低レ
ベルのＳａｐＩ発現が大腸菌〔ｐＲ９７６−Ｍ１、ｐＬ
Ｇ３３９−Ｍ２、ｐＵＣ１９−ＳａｐＩＲ〕中で得られ
たが、菌株は安定でなかった。ＳａｐＩ活性は１０ｍｌ
の培養物中でのみ検出された。５００ｍｌ培養物中では
ＳａｐＩ活性は喪失していた。
【００４２】７．Ｐ tac プロモーターコントロール下の
低コピー数プラスミドｐＲ９７６中のＳａｐＩエンドヌ
クレアーゼ遺伝子の発現 ｐＵＣ１９のような高コピー数プラスミド中のＳａｐＩ
発現が安定でなかったので、低コピー数プラスミド中の
発現は安定化されるであろうと考えた。宿主ＤＮＡを修
飾するために大腸菌コンピテント細胞をｐＵＣ１９−Ｍ
１及びｐＬＧ３３９−Ｍ２で形質転換させた。ＳａｐＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐ
Ｒ９７６のＰｓｔＩ部位に挿入した。大腸菌株〔ｐＵＣ
１９−Ｍ１、ｐＬＧ３３９−Ｍ２、ｐＲ９７６−Ｓａｐ
ＩＲ〕は、湿潤大腸菌細胞１ｇあたり約１，０００単位
のＳａｐＩを産生し、これは天然型菌株の３倍の産生量
であった。この場合にも、大量細胞培養物中では活性が
減少したので菌株は安定でなかった。この不安定性の原
因はおそらくメチル化が不十分なこと、及び、Ｐtac プ
ロモータからの構成的エンドヌクレアーゼ発現にある。
低コピー数プラスミドｐＲ９７６中のＳａｐＩエンドヌ
クレアーゼ遺伝子の発現 ｐＵＣ１９のような高コピー数プラスミド中のＳａｐＩ
発現が安定でなかったので、低コピー数プラスミド中の
発現は安定化されるであろうと考えた。宿主ＤＮＡを修
飾するために大腸菌コンピテント細胞をｐＵＣ１９−Ｍ
１及びｐＬＧ３３９−Ｍ２で形質転換させた。ＳａｐＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐ
Ｒ９７６のＰｓｔＩ部位に挿入した。大腸菌株〔ｐＵＣ
１９−Ｍ１、ｐＬＧ３３９−Ｍ２、ｐＲ９７６−Ｓａｐ
ＩＲ〕は、湿潤大腸菌細胞１ｇあたり約１，０００単位
のＳａｐＩを産生し、これは天然型菌株の３倍の産生量
であった。この場合にも、大量細胞培養物中では活性が
減少したので菌株は安定でなかった。この不安定性の原
因はおそらくメチル化が不十分なこと、及び、Ｐtac プ
ロモータからの構成的エンドヌクレアーゼ発現にある。
【００４３】８．ｐＵＣ１９及びｐＡＣＹＣ１８４にお
けるＭ１及びＭ２の発現 ＳａｐＩ発現クローンは安定でなかったので、ＳａｐＩ
メチラーゼ遺伝子Ｍ１及びＭ２の過剰発現（ｏｖｅｒｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が問題解決の助けとなると考えら
れた。有効なリボソーム結合部位ＧＧＡＧＧＴ及び６ｂ
ｐのスペーシングＡＡＡＴＡＡをＰＣＲによってＭ２遺
伝子の手前に作製し、遺伝子をｐＵＣ１９−ＳａｐＩＭ
１に挿入した。得られたプラスミドはｐＵＣ１９−Ｓａ
ｐＩＭ１−Ｍ２（ベクター中に１つのＳａｐＩ部位が存
在する）であった。このプラスミドを単離しＳａｐＩで
消化すると、ＤＮＡの約７０％だけがＳａｐＩ消化に耐
性であった。これはｉｎ ｖｉｖｏではＳａｐＩメチラ
ーゼの発現が少なく／ＳａｐＩメチラーゼタンパク質が
不安定であることを示す。
けるＭ１及びＭ２の発現 ＳａｐＩ発現クローンは安定でなかったので、ＳａｐＩ
メチラーゼ遺伝子Ｍ１及びＭ２の過剰発現（ｏｖｅｒｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が問題解決の助けとなると考えら
れた。有効なリボソーム結合部位ＧＧＡＧＧＴ及び６ｂ
ｐのスペーシングＡＡＡＴＡＡをＰＣＲによってＭ２遺
伝子の手前に作製し、遺伝子をｐＵＣ１９−ＳａｐＩＭ
１に挿入した。得られたプラスミドはｐＵＣ１９−Ｓａ
ｐＩＭ１−Ｍ２（ベクター中に１つのＳａｐＩ部位が存
在する）であった。このプラスミドを単離しＳａｐＩで
消化すると、ＤＮＡの約７０％だけがＳａｐＩ消化に耐
性であった。これはｉｎ ｖｉｖｏではＳａｐＩメチラ
ーゼの発現が少なく／ＳａｐＩメチラーゼタンパク質が
不安定であることを示す。
【００４４】ｉｎ ｖｉｖｏのＳａｐＩメチラーゼ修飾
レベルを比較するために、Ｍ１遺伝子及びＭ２遺伝子を
ｐＡＣＹＣ１８４にもクローニングした。得られたプラ
スミドはｐＡＣＹＣ１８４−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２であっ
た。このプラスミドとｐＵＣ１９で大腸菌細胞を同時形
質転換させた。プラスミドＤＮＡ混合物を細胞から単離
し、ＳａｐＩ消化処理した（ｐＵＣ１９中には１つのＳ
ａｐＩ部位が存在するが、ｐＡＣＹＣ１８４−ＳａｐＩ
Ｍ１−Ｍ２中にはＳａｐＩ部位が存在しない）。ｐＵＣ
１９ ＤＮＡの約７０％がＳａｐＩ消化に耐性であるこ
とが判明した。これは、高コピー数プラスミド及び低コ
ピー数プラスミドを用いてメチラーゼを発現させた場合
同様のレベルのＳａｐＩ部位修飾が生じたことを示す。
レベルを比較するために、Ｍ１遺伝子及びＭ２遺伝子を
ｐＡＣＹＣ１８４にもクローニングした。得られたプラ
スミドはｐＡＣＹＣ１８４−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２であっ
た。このプラスミドとｐＵＣ１９で大腸菌細胞を同時形
質転換させた。プラスミドＤＮＡ混合物を細胞から単離
し、ＳａｐＩ消化処理した（ｐＵＣ１９中には１つのＳ
ａｐＩ部位が存在するが、ｐＡＣＹＣ１８４−ＳａｐＩ
Ｍ１−Ｍ２中にはＳａｐＩ部位が存在しない）。ｐＵＣ
１９ ＤＮＡの約７０％がＳａｐＩ消化に耐性であるこ
とが判明した。これは、高コピー数プラスミド及び低コ
ピー数プラスミドを用いてメチラーゼを発現させた場合
同様のレベルのＳａｐＩ部位修飾が生じたことを示す。
【００４５】９．修飾されたＴ７発現ベクター中のＳａ
ｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現 ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅するために２
つのプライマーを作製した。プライマー配列は、 順方向プライマー：５′ＣＧＣＴＣＴＡＧＡ（ＸｂａＩ
部位）ＧＧＡＧＧＴ（リボソーム結合部位）ＴＡＡＡＴ
Ａ（スペーシング）ＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＡ
ＣＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣ３′（配列番号７） 逆方向プライマー：５′ＧＡＧＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨ
Ｉ部位）ＴＣＡＧＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＣＴＴＣ
ＡＴＣＧＡＧ３′（配列番号８） ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をＳａｃｃｈａｒｏ
ｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡから増幅させるた
めに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＶｅｎｔ（登録
商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５０：１の割合）を用い、
９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分３０秒
間のサイクルを２０回反復するＰＣＲ条件で処理した。
ＰＣＲ ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3 抽出及びエタ
ノール沈降によって精製し、ＴＥバッファに再懸濁させ
た。ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限エンドヌクレ
アーゼによって消化し、修飾したＴ７発現ベクターｐＥ
Ｔ２１ｔに結合させた。発現ベクターｐＥＴ２１ｔは、
非誘導条件下の基底発現レベルを更に低下させるために
Ｔ７プロモーターの上流に転写ターミネーターを含んで
いる（ｐＥＴ２１ｔはＨ．Ｋｏｎｇ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって構築され提供され
たものである）。結合したＤＮＡを使用してＳａｐＩメ
チラーゼで修飾した細胞ＥＲ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−Ｓ
ａｐＩＭ１−Ｍ２〕を形質転換させた。ＥＲ２５０４は
ＴｏｎＡ- 及びＤＮａｓＩ- のＢＬ２１（λＤＥ３）誘
導体である。大腸菌細胞ＥＲ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−Ｓ
ａｐＩＭ１−Ｍ２、ｐＥＴ２１ｔ−ＳａｐＩＲ〕をＬＢ
ブイヨン中で後期対数増殖期（約１５０ｋｌｅｔｔ単
位）まで増殖させ、エンドヌクレアーゼ産生を誘発する
ためにＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加した。Ｉ
ＰＴＧ誘発と細胞培養とを３時間継続した。細胞を遠心
によって採取し、音波処理バッファ（１０ｍＭのβ−メ
ルカプトエタノール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５）に再浮遊させた。リゾチームを添加して細胞
を溶解し、音波処理した。落屑細胞を遠心によって除去
し、上清のＳａｐＩ活性をλＤＮＡに対するアッセイに
よって検定した。菌株は湿潤大腸菌細胞１ｇあたり約２
０，０００単位のＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼを産
生していた。１００リットルの発酵槽で培養した細胞も
やはりＳａｐＩエンドヌクレアーゼを産生した。
ｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現 ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅するために２
つのプライマーを作製した。プライマー配列は、 順方向プライマー：５′ＣＧＣＴＣＴＡＧＡ（ＸｂａＩ
部位）ＧＧＡＧＧＴ（リボソーム結合部位）ＴＡＡＡＴ
Ａ（スペーシング）ＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＡ
ＣＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣ３′（配列番号７） 逆方向プライマー：５′ＧＡＧＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨ
Ｉ部位）ＴＣＡＧＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＣＴＴＣ
ＡＴＣＧＡＧ３′（配列番号８） ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をＳａｃｃｈａｒｏ
ｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡから増幅させるた
めに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＶｅｎｔ（登録
商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５０：１の割合）を用い、
９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分３０秒
間のサイクルを２０回反復するＰＣＲ条件で処理した。
ＰＣＲ ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3 抽出及びエタ
ノール沈降によって精製し、ＴＥバッファに再懸濁させ
た。ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限エンドヌクレ
アーゼによって消化し、修飾したＴ７発現ベクターｐＥ
Ｔ２１ｔに結合させた。発現ベクターｐＥＴ２１ｔは、
非誘導条件下の基底発現レベルを更に低下させるために
Ｔ７プロモーターの上流に転写ターミネーターを含んで
いる（ｐＥＴ２１ｔはＨ．Ｋｏｎｇ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって構築され提供され
たものである）。結合したＤＮＡを使用してＳａｐＩメ
チラーゼで修飾した細胞ＥＲ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−Ｓ
ａｐＩＭ１−Ｍ２〕を形質転換させた。ＥＲ２５０４は
ＴｏｎＡ- 及びＤＮａｓＩ- のＢＬ２１（λＤＥ３）誘
導体である。大腸菌細胞ＥＲ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−Ｓ
ａｐＩＭ１−Ｍ２、ｐＥＴ２１ｔ−ＳａｐＩＲ〕をＬＢ
ブイヨン中で後期対数増殖期（約１５０ｋｌｅｔｔ単
位）まで増殖させ、エンドヌクレアーゼ産生を誘発する
ためにＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加した。Ｉ
ＰＴＧ誘発と細胞培養とを３時間継続した。細胞を遠心
によって採取し、音波処理バッファ（１０ｍＭのβ−メ
ルカプトエタノール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５）に再浮遊させた。リゾチームを添加して細胞
を溶解し、音波処理した。落屑細胞を遠心によって除去
し、上清のＳａｐＩ活性をλＤＮＡに対するアッセイに
よって検定した。菌株は湿潤大腸菌細胞１ｇあたり約２
０，０００単位のＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼを産
生していた。１００リットルの発酵槽で培養した細胞も
やはりＳａｐＩエンドヌクレアーゼを産生した。
【００４６】１０．組換えＳａｐＩ制限エンドヌクレア
ーゼの精製 組換えＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼを、ヘパリン−
セファロースカラム、ホスホセルロースカラム及びＱ−
セファロースＨＰＬＣを用いたクロマトグラフィーによ
って精製した。精製した酵素をλ ＤＮＡ及びｐＵＣ１
９を基質としたアッセイによって検定した。
ーゼの精製 組換えＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼを、ヘパリン−
セファロースカラム、ホスホセルロースカラム及びＱ−
セファロースＨＰＬＣを用いたクロマトグラフィーによ
って精製した。精製した酵素をλ ＤＮＡ及びｐＵＣ１
９を基質としたアッセイによって検定した。
【図１】ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニン
グ及び産生を示すスキームである。
グ及び産生を示すスキームである。
【図２】ＳａｐＩ制限−修飾系の遺伝子編成の概略図で
ある。
ある。
【図３】ＳａｐＩＭ１遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号
１）及びこれによってコードされたタンパク質配列であ
る。
１）及びこれによってコードされたタンパク質配列であ
る。
【図４】ＳａｐＩＭ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号
２）及びこの配列にコードされているタンパク質配列で
ある。
２）及びこの配列にコードされているタンパク質配列で
ある。
【図５】ＳａｐＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３）
及びこの配列にコードされているタンパク質配列であ
る。
及びこの配列にコードされているタンパク質配列であ
る。
【図６】ｐＲ９７６の構築を示す。ベクターｐＲ９７６
は、Ｐtac プロモーターとＰtac プロモーターの下流の
多重クローニング部位とを有するｐＡＣＹＣ１８４誘導
体である。このベクターは更に、Ｐtac プロモーターか
らの遺伝子発現を調節するためのＬａｃリプレッサーを
コードしているｌａｃＩ遺伝子を含んでいる（Ａｍａｎ
ｎら，Ｇｅｎｅ ２５：１６７−１７８（１９８
３））。
は、Ｐtac プロモーターとＰtac プロモーターの下流の
多重クローニング部位とを有するｐＡＣＹＣ１８４誘導
体である。このベクターは更に、Ｐtac プロモーターか
らの遺伝子発現を調節するためのＬａｃリプレッサーを
コードしているｌａｃＩ遺伝子を含んでいる（Ａｍａｎ
ｎら，Ｇｅｎｅ ２５：１６７−１７８（１９８
３））。
配列番号：１ 配列の長さ：１１３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：コーディング配列 存在位置：１．．．１１２８ 配列
【化１】
【化２】 配列番号：２ 配列の長さ：１３０２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：コーディング配列 存在位置：１．．．１２９９ 配列
【化３】
【化４】 配列番号：３ 配列の長さ：１２９９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：コーディング配列 存在位置：１．．．１２９６ 配列
【化５】
【化６】
【化７】 配列番号：４ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【化８】 配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：一本鎖ＤＮＡ 配列
【化９】 配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：一本鎖ＤＮＡ 配列
【化１０】 配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：未解明 トポロジー：未解明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【化１１】 配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：未解明 トポロジー：未解明 配列の種類：一本鎖ＤＮＡ 配列
【化１２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:21） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ロバート・イー・モーナス アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01923、ダンバース、キンバリー・ドライ ブ・10
Claims (6)
- 【請求項１】 単離ＤＮＡがＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙ
ｓｐｏｒａ種から得られることを特徴とするＳａｐＩ制
限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡセグメントが挿入されたベクターから成る
組換えＤＮＡベクター。 - 【請求項３】 単離ＤＮＡがＡＴＣＣ Ｎｏ．９８１０
２から得られることを特徴とするＳａｐＩ制限エンドヌ
クレアーゼ及びメチラーゼをコードする単離ＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３に記載の単離ＤＮＡを含むクロ
ーニングベクター。 - 【請求項５】 請求項２または４に記載のクローニング
ベクターによって形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 請求項２または４に記載のベクターによ
って形質転換された宿主細胞をＳａｐＩ制限エンドヌク
レアーゼの発現に好適な条件下で培養することを特徴と
するＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼの産生方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/678,304 US5663067A (en) | 1996-07-11 | 1996-07-11 | Method for cloning and producing the SapI restriction endonuclease in E. coli |
| US678304 | 1996-07-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1057082A true JPH1057082A (ja) | 1998-03-03 |
| JP4172661B2 JP4172661B2 (ja) | 2008-10-29 |
Family
ID=24722261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17389497A Expired - Fee Related JP4172661B2 (ja) | 1996-07-11 | 1997-06-30 | 大腸菌中で制限エンドヌクレアーゼＳａｐＩをクローニング及び産生する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5663067A (ja) |
| EP (1) | EP0818537B1 (ja) |
| JP (1) | JP4172661B2 (ja) |
| DE (1) | DE69731511T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4498496B2 (ja) * | 1998-08-31 | 2010-07-07 | ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド | ＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニングおよび製造並びに組換えＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼの精製のための方法 |
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|---|---|---|---|---|
| US20040038283A1 (en) * | 2001-04-30 | 2004-02-26 | Lynx Therapeutics, Inc. | Method of screening for genetic polymorphism |
| US8293503B2 (en) | 2003-10-03 | 2012-10-23 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
| WO2005087932A2 (en) * | 2003-10-03 | 2005-09-22 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
| EP2540823A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-01-02 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| EP2390319B1 (en) * | 2007-07-12 | 2014-12-24 | New England Biolabs, Inc. | High fidelity restriction endonucleases |
| JP7350659B2 (ja) | 2017-06-06 | 2023-09-26 | ザイマージェン インコーポレイテッド | Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａの改良のためのハイスループット（ＨＴＰ）ゲノム操作プラットフォーム |
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|---|---|---|---|---|
| US5200333A (en) * | 1985-03-01 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Cloning restriction and modification genes |
| US5498535A (en) * | 1994-05-24 | 1996-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for direct cloning of nuclease genes in E. coli |
| US5532153A (en) * | 1995-03-23 | 1996-07-02 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the SacI restriction endonuclease |
-
1996
- 1996-07-11 US US08/678,304 patent/US5663067A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-06-30 JP JP17389497A patent/JP4172661B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-02 EP EP97202015A patent/EP0818537B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-02 DE DE69731511T patent/DE69731511T2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4498496B2 (ja) * | 1998-08-31 | 2010-07-07 | ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド | ＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニングおよび製造並びに組換えＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼの精製のための方法 |
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|---|---|
| US5663067A (en) | 1997-09-02 |
| EP0818537A3 (en) | 1999-08-04 |
| EP0818537A2 (en) | 1998-01-14 |
| DE69731511T2 (de) | 2005-11-24 |
| EP0818537B1 (en) | 2004-11-10 |
| JP4172661B2 (ja) | 2008-10-29 |
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