CN112626177A - 一种快速定量检测rna加帽效率的方法 - Google Patents

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余兵兵
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Abstract

本发明公开了一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，由以下步骤组成：S1.体外转录合成未加帽的RNA并除去模板DNA；S2.对RNA进行加帽处理；S3.对经S1、S2步骤得到的RNA进行单磷酸化处理：先利用碱性磷酸酶去磷酸化，RNA纯化后再利用多聚核苷酸激酶在RNA的5’端加上单磷酸；S4.用单磷酸酶除去进行单磷酸化处理后的RNA，并设置不用单磷酸酶处理的对照组；S5.跑胶检测，定量测定用单磷酸酶处理的RNA的条带亮度(记为n)以及对照组的RNA的条带亮度(记为N)，计算RNA的加帽效率为：(n/N)×100％。本发明的有益效果是：(1)可快速定量地检测出RNA的加帽效率，操作简单快速，结果有效准确；(2)该方法对样品需求量少，对RNA类型、长度等无特殊要求，适用范围广。

Description

一种快速定量检测RNA加帽效率的方法
技术领域
本发明属于RNA合成研究领域，具体涉及一种快速定量检测RNA加帽效率的方法。
背景技术
RNA(核糖核酸)是所有生物遗传信息传递中重要的大分子，同时在生物体内也扮演着多种多样的调控角色，近年来RNA研究已成为生物学研究中最热门的领域之一。例如，RNA作为药物，相比基因治疗这种改变DNA产生永久不可逆效果的方法，副作用小得多，因此RNA治疗已逐渐成为最热门的药物研究方向，有望成为应对多种疾病的有效方法，具有良好的发展前景。
有效的mRNA治疗需要将mRNA有效递送至患者体内以及在体内有效合成相应的蛋白质。为了优化mRNA递送和体内合成蛋白质，通常要在RNA的5'端加上帽子结构，以防止mRNA降解并促进蛋白质的翻译。因此，加帽效率的有效检测对于确定RNA治疗中RNA的质量是十分必要的。然而，常用的帽检测方法是利用放射性同位素标记，该方法只能定性检测，无法定量测定，这不足以评估RNA的质量和相关的体内使用安全性和效力。中国专利CN105209633A公开了一种信使RNA加帽效率的定量评估，主要是利用抗m7G特异性抗体与帽结构结合，再利用第二抗体与m7G抗体结合，经过ELISA测定出相应信号(如荧光信号)，从而定量RNA加帽效率。中国专利CN105051213A也公开了一种信使RNA加帽效率的定量评估，首先利用核酸酶进行选择性降解，再通过色谱分离加帽片段和未加帽片段，测定加帽片段和未加帽片段的相对量，进而定量RNA加帽效率。这两种方法虽然相比于同位素的方法具有可定量测定RNA加帽效率的优势，但操作上仍较为复杂。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种操作简便，可更快速、定量检测RNA加帽效率的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，由以下步骤组成：
S1.体外转录合成未加帽的RNA，并除去模板DNA；
S2.对步骤S1得到的所述的RNA进行加帽处理；
S3.对加帽处理后的RNA进行单磷酸化处理：先利用碱性磷酸酶进行去磷酸化，RNA纯化后再利用多聚核苷酸激酶在RNA的5’端加上单磷酸；
S4.用单磷酸酶处理步骤S3中所述的进行单磷酸化处理后的RNA，并设置不用单磷酸酶处理的对照组；
S5.跑胶检测，定量测定上述用单磷酸酶处理的RNA的条带亮度(记为n)以及所述对照组的RNA的条带亮度(记为N)，计算出RNA的加帽效率为：(n/N)×100％。
该方法的原理为：对RNA进行加帽时，由于RNA加帽效率的差异，体系中会存在部分未成功加帽的RNA。而未加帽的RNA中既存在单磷酸RNA也存在多磷酸RNA，因此对该体系进行单磷酸化处理，即先利用碱性磷酸酶进行去磷酸化，去除RNA的磷酸基团，RNA纯化后再利用多聚核苷酸激酶在RNA的5’端加上单磷酸，其中未加帽的RNA均被处理为5’单磷酸RNA，而加帽的RNA由于稳定性增强而不受影响，即不会被去磷酸化和加上单磷酸。然后用单磷酸酶对其进行处理，其中未加帽的RNA由于被处理为5’单磷酸RNA，因此会被单磷酸酶识别并降解，而加帽的RNA由于其5’端不存在单磷酸，因此不会被降解，同时设置不用单磷酸酶处理的对照组。最后进行跑胶检测，其中用单磷酸酶处理后的RNA为加帽RNA，对照组中的RNA为总的RNA量(包括加帽和未加帽的RNA)，分别测量两者的条带亮度值，其比值就是RNA的加帽效率。
优选地，步骤S1-S3后均需进行RNA纯化。
优选地，步骤S1具体包括：以纯化后的线性化DNA作为转录模板，通过RNA聚合酶与模板上的特异性启动子结合并起始RNA的体外转录，得到未加帽的RNA，然后用DNA酶消化除去模板DNA。
优选地，步骤S2中所述加帽处理的方法为：利用加帽酶对RNA进行体外加帽。
优选地，所述加帽酶为牛痘病毒加帽酶，牛痘病毒加帽体系可利用牛痘病毒加帽酶及其它组份，将7-甲基鸟苷帽结构(Cap 0)加到RNA的5'末端。
优选地，步骤S2中所述加帽处理的方法为：在步骤S1所述的体外转录体系中，同时加入抗-反向帽类似物-ARCA进行共转录，即在转录的同时对RNA进行加帽，待转录完成后得到的RNA就是加帽的RNA。
优选地，所述碱性磷酸酶为小牛肠碱性磷酸酶，所述多聚核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶。
优选地，步骤S4中所述单磷酸酶为XRN-1。
优选地，步骤S5中利用ImageJ软件定量测定所述条带亮度。
所述快速定量检测RNA加帽效率的方法在RNA生产期间及RNA作为治疗产品的质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)可快速定量地检测出RNA的加帽效率，操作简单快速，结果有效准确。
(2)本发明的检测方法对样品需求量少，对RNA类型、长度等无特殊要求，适用范围广，可用于所有RNA加帽效率的检测，尤其是用于RNA生产期间及RNA作为最终治疗产品的质量控制。
附图说明
图1为本发明实施例1中sox7 RNA加帽效率的检测结果；图1-A为未加帽和加帽的sox7 RNA经过CIP、PNK和XRN-1处理后的电泳图；图1-B为对图1-A中条带亮度值测定后计算出的加帽效率的统计图；
图2为本发明实施例2中cas9 RNA加帽效率的检测结果；图2-A为未加帽和加帽的cas9 RNA经过CIP、PNK和XRN-1处理后的电泳图；图2-B为对图2-A中条带亮度值测定后计算出的加帽效率的统计图；
图中：XRN-1为单磷酸酶；CIP为小牛肠碱性磷酸酶；PNK为T4多聚核苷酸激酶；+为用XRN-1处理；-为不用XRN-1处理；CK为对照组，即未进行加帽处理的RNA，VCE为经过牛痘病毒加帽酶进行加帽的RNA；共为用共转录方法进行加帽的RNA；
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中采用牛痘病毒加帽酶和共转录的方法，分别对sox7RNA进行加帽，然后用NEB生产的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，#M0290)对RNA进行去磷酸化，进行RNA纯化后再利用NEB生产的T4多聚核苷酸激酶(PNK，#M0201)在RNA的5’端加上单磷酸得到单磷酸RNA，然后用NEB生产的单磷酸酶(XRN-1，#M0338)消化单磷酸化的RNA，最后跑胶检测并定量测定条带亮度，从而区分出加帽和未加帽的RNA，达到快速定量检测RNA加帽效率的目的，具体步骤如下：
S1.体外转录合成未加帽的RNA：以纯化后的线性化DNA作为转录模板，通过KP34RNA聚合酶与模板上的特异性启动子结合并起始RNA的体外转录，得到20μL未加帽的sox7RNA。转录反应在37℃下进行，转录时间为1.5h，反应体系如表1所示。
表1体外转录反应体系
Figure BDA0002225999870000031
Figure BDA0002225999870000041
转录完成后，利用DNaseI去除模板DNA，按照10μL转录体系加入1μL DNaseI的比例，20μL就加入2μL DNaseI，混匀后37℃水浴30分钟，每隔15min轻轻上下颠倒混匀一次，随后进行RNA纯化。本发明使用NEB生产的RNA纯化试剂盒(#T2030)进行RNA纯化，具体步骤见NEB的RNA纯化试剂盒说明书。
S2.对步骤S1中得到的RNA进行加帽处理：采用牛痘病毒加帽酶(VCE)和共转录两种方式得到两种加帽的RNA。
a.利用牛痘病毒加帽酶(VCE)进行体外加帽：在步骤S1中得到的纯化后的RNA基础上，先将RNA与DEPC水混合，至总体积为15μL，65℃加热5min，再置于冰上5min，后续使用NEB生产的牛痘病毒加帽酶系统(M2080)进行加帽，反应体系如表2所示。
表2牛痘病毒加帽酶体外加帽反应体系
Figure BDA0002225999870000042
加帽反应在37℃条件下进行，反应时间为30min。待反应结束后，使用NEB生产的RNA纯化试剂盒(#T2030)进行RNA纯化。
b.共转录加帽：即在步骤S1的反应体系中加入3.2μL的25mmol/L m7GTP(抗-反向帽类似物-ARCA)，最终体系仍为20μL，转录反应仍是在37℃条件下转录1.5h。
S3.利用CIP和PNK对RNA进行单磷酸化处理：
(1)先利用CIP对RNA进行去磷酸化，反应体系如表3所示。
表3 CIP去磷酸化反应体系
Figure BDA0002225999870000051
反应在37℃下进行，反应时间为1h。待反应结束后，使用NEB生产的RNA纯化试剂盒(#T2030)进行RNA纯化。
(2)将(1)中得到的RNA用PNK进行处理，反应体系如表4所示。
表4 PNK单磷酸化反应体系
Figure BDA0002225999870000052
反应在37℃下进行，反应时间为1h。待反应结束后，使用NEB生产的RNA纯化试剂盒(#T2030)进行RNA纯化。
S4.用单磷酸酶XRN-1处理步骤S3中得到的RNA，反应体系如表5所示。
表5 XRN-1处理反应体系
Figure BDA0002225999870000053
同时设置对照组，对照组中不加入XRN-1，仍补充DEPC水至10μL。反应在37℃下进行，反应时间为1h。
S5.跑胶检测：向步骤S4中得到的RNA加入3X Seq dye上样缓冲液，进行跑胶检测，并且通过ImageJ软件定量测定上述用XRN-1处理的RNA的条带亮度(记为n)以及未用XRN-1处理的对照组的RNA的条带亮度(记为N)，计算出RNA的加帽效率为：(n/N)×100％，结果如附图1所示。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：(1)本实施例中使用的是cas9 RNA进行反应。(2)将实施例1的步骤S1和S2中，转录和共转录的反应体系中的KP34 RNA聚合酶更换为VSW3 RNA聚合酶，且转录反应在16℃下进行，转录时间为16h。
最终跑胶结果和RNA加帽效率的结果图如附图2所示。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于：在S3步骤中进行单磷酸化处理的方法为：用NEB生产的三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase，#M0398)对RNA进行单磷酸化，反应体系如表6所示。
表6 Apyrase单磷酸化反应体系
Figure BDA0002225999870000061
单磷酸化反应在30℃条件下进行，反应时间为2h，待反应结束后，使用NEB生产的RNA纯化试剂盒(#T2030)进行RNA纯化。最终测定得到的RNA加帽效率如表7所示。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于：S3和S4步骤中采用常规的方法进行RNA加帽效率的检测：即向经过加帽处理后的RNA中加入一种帽特异性的结合物质GST-eiF4E，使其与加帽的RNA形成复合物，然后采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法定量测定RNA的加帽效率，最终测定得到RNA加帽效率如表7所示，并以该方法测得的RNA加帽效率为标准值。
测量结果
根据实施例1、对比例1和对比例2的方法分别测定sox7RNA用牛痘病毒加帽酶(VCE)进行加帽后的加帽效率以及用共转录加帽的方法进行加帽后的加帽效率，其中对比例2为现有技术中常规采用的加帽效率测定技术，具有准确率高的优势，但操作较复杂，本申请以对比例2测量得到的加帽效率作为参考标准值，然后分别计算实施例1和对比例1与参考标准值的差值百分比(即参考标准值与测量值的差值除以参考标准值)，最终结果如表7所示。
表7实施例1和对比例1、2测得的RNA加帽效率
Figure BDA0002225999870000062
根据表7的对比例1的数据可知，用三磷酸腺苷双磷酸酶对RNA进行单磷酸化处理，最终测得的RNA加帽效率与参考标准值的差值百分比达到15.06％和14.75％，即与参考标准值存在显著差异，说明利用三磷酸腺苷双磷酸酶对RNA进行单磷酸化处理测得的RNA加帽效率结果不准，而用本申请中对未加帽的RNA先去磷酸化再在其5’端加上单磷酸的处理方法，测得的RNA加帽效率与参考标准值的差值百分比为0.84％和0.63％，该差值百分比较低，在本领域可接受的误差范围内，即采用本申请的方法检测RNA加帽效率时，其测量结果十分准确，同时该检测方法比传统的测量方法即对比例2所述的方法，更加简单、快速。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，由以下步骤组成：
S1.体外转录合成未加帽的RNA，并除去模板DNA；
S2.对步骤S1得到的所述RNA进行加帽处理；
S3.对加帽处理后的RNA进行单磷酸化处理：先利用碱性磷酸酶进行去磷酸化，RNA纯化后再利用多聚核苷酸激酶在RNA的5’端加上单磷酸；
S4.用单磷酸酶处理步骤S3中所述的进行单磷酸化处理后的RNA，并设置不用单磷酸酶处理的对照组；
S5.跑胶检测，定量测定上述用单磷酸酶处理的RNA的条带亮度(记为n)以及所述对照组的RNA的条带亮度(记为N)，计算出RNA的加帽效率为：(n/N)×100％。
2.根据权利要求1所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，步骤S1-S3后均需进行RNA纯化。
3.根据权利要求1所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：以纯化后的线性DNA作为模板，加入RNA聚合酶起始RNA的体外转录，得到未加帽的RNA，然后用DNA酶消化除去模板DNA。
4.根据权利要求1所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，步骤S2中所述加帽处理的方法为：利用加帽酶对RNA进行体外加帽。
5.根据权利要求4所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，所述加帽酶为牛痘病毒加帽酶。
6.根据权利要求1所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，步骤S2中所述加帽处理的方法为：在步骤S1所述的体外转录过程中，同时加入抗-反向帽类似物-ARCA进行共转录。
7.根据权利要求1所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，步骤S3中所述碱性磷酸酶为小牛肠碱性磷酸酶，所述多聚核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶。
8.根据权利要求1所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，步骤S4中所述单磷酸酶为XRN-1。
9.根据权利要求1所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，其特征在于，步骤S5中利用ImageJ软件定量测定所述条带亮度。
10.一种权利要求1所述的一种快速定量检测RNA加帽效率的方法在RNA生产期间及RNA作为治疗产品的质量控制中的应用。
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