CN106636070A - 一种外泌体miRNA精确获取的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种外泌体miRNA精确获取的方法，包括以下步骤：1)从待分离样品中分离获得外泌体；2)从外泌体中提取RNA，获得外泌体总RNA；3)在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA；4)以带特异性接头的总RNA为模板进行反转录合成cDNA，获得反转录产物；5)TBE‑PAGE电泳回收反转录产物中150～170bp的cDNA片段，即得到miRNA。本发明提供的方法不仅避免了扩增时分子间存在的偏好性，而且有效实现单个模板的精确计数，可以精确检测低于10个拷贝以下的miRNA分子。

Description

一种外泌体miRNA精确获取的方法
技术领域
本发明涉及RNA检测领域，尤其涉及一种外泌体miRNA精确获取的方法。
背景技术
外泌体于1983年首次在绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。外泌体为直径在40-100nm的盘状囊泡，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
当外泌体被发现后，一度被认为是细胞排泄废物的一种方式，随着对外泌体研究的不断深入，包括对其生物来源、分布、物质构成及运输和细胞间信号传导的研究，发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能根据来源细胞类型的不同，可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明来源肿瘤细胞的外泌体参与肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息交换，从而导致大量新生血管生成，促进肿瘤的生长与侵袭。
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中的一类内源性、具有调控功能的非编码RNA。miRNA长约20～25个核苷酸，成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的。miRNAs组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
目前，针对外泌体miRNA的研究主要是基于外泌体miRNA的总浓度、定量PCR(Q-PCR)以及microRNA芯片技术，更多关注获取到的miRNA的表达和定量，但是在现有技术中，外泌体miRNA获取方法虽然很多，但是精确度和纯度不够，存在很多杂质，从而影响后期检测的灵敏度和准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种外泌体miRNA精确获取的方法，以解决现有技术中获取的miRNA精确度和纯度不够，影响后期检测灵敏度和准确性的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种外泌体miRNA精确获取的方法，包括以下步骤：
1)从待分离样品中分离获得外泌体；2)从外泌体中提取总RNA，获得外泌体总RNA；3)在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA；4)以带特异性接头的总RNA为模板进行反转录合成cDNA，获得反转录产物；5)TBE-PAGE电泳回收反转录产物中150～170bp的cDNA片段，即得到miRNA；所述特异性唯一标签接头为miRNA常规接头添加8个随机碱基N和3个固定碱基CGA。
优选的，所述的随机碱基N为A、T/U、C和G中的一种。
优选的，步骤1)中所述待分离样品为外周血或体液。
优选的，所述待分离样品为获取后4～6h内的新鲜样品。
优选的，步骤1)中所述分离获得外泌体的方法为磷脂酰丝氨酸亲和法。
优选的，4)中所述的反转录合成cDNA的温度为41～43℃，时间为50～70min。
优选的，所述反转录完成后，还包括RNA消化步骤，所述的RNA消化步骤为向反转录产物中加入RNaseH混合均匀进行孵育充分消化剩余RNA。
优选的，所述孵育的温度为35～38℃。
优选的，所述孵育的时间为25～35min。
优选的，步骤4)中所述miRNA置于-80℃～-20℃保存。
本发明的有益效果：本发明提供的方法在总RNA上连接特异性唯一标签接头，对每个原始模板进行区分，不仅避免了扩增时分子间存在的偏好性，而且有效实现单个模板的精确计数，可以精确检测低于10个拷贝以下的miRNA分子，从而可以更全面精准的检测所有miRNA的真实表达量以及表达谱。
附图说明
图1为实施例中本发明方法的流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种外泌体miRNA精确获取的方法，包括以下步骤：
1)从待分离样品中分离获得外泌体；2)从外泌体中提取总RNA，获得外泌体总RNA；3)在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA；4)以带特异性接头的总RNA为模板进行反转录合成cDNA，获得反转录产物；5)TBE-PAGE电泳回收反转录产物中150～170bp的cDNA片段，即得到miRNA；所述特异性唯一标签接头为miRNA常规接头添加8个随机碱基N和3个固定碱基CGA。
在本发明中，待分离样品优选的为外周血或体液，更优选的为人的外周血或体液；所述外周血或体液的用量优选的为5～20ml，更优选的为10ml；所述待分离样品优选的为获取后4～6h内的新鲜样品；具体的在本发明中，将获得的新鲜待分离样品置于EDTA抗凝管中，上下颠倒6～8次充分混匀后，采用磷脂酰丝氨酸亲和法提取外泌体；本发明对所述的磷脂酰丝氨酸亲和法提取外泌体的具体步骤和参数无特殊要求，采用本领域常规的步骤和参数即可，优选的可采用Wako外泌体提取试剂盒进行，具体步骤按照试剂盒说明书进行。所述磷脂酰丝氨酸亲和法的原理为将磷脂酰丝氨酸与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的磷脂酰丝氨酸，从而获得外泌体，得到的外泌体形态完整，纯度最高，并且具有生物活性。
本发明在获得外泌体后，从外泌体中提取总RNA，本发明对所述外泌体总RNA的提取方法和步骤无特殊限定，采用本领域常规的总RNA提取方法即可，具体的本发明中采用ExoRNeasy提取法、TEI+TER法、超高速离心法+Trizol LS法或ExoQuick+SeraMir法提取RNA。在本发明中，优选的每100ug外泌体能提出0.5～3ug的总RNA。本发明在提取得到总RNA后，将得到的总RNA回溶于LRNase-freewater中，基于Qubit2.0(Invitrogen，QubitRNAHSAssayKits)进行初步定量。所述总RNA与LRNase-freewater的体积比优选的为1∶(1～3)。
本发明在获得外泌体总RNA后，在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA。在本发明中所述的特异性唯一标签接头为miRNA常规接头添加8个随机碱基N和3个固定碱基CGA，具体的序列为：miRNA常规接头序列-NNNNNNNNCGA，所述随机碱基N独立的优选为A、T/U、C和G中的一种；所述特异性唯一标签接头在合成时随机碱基N，由A、T/U、C或G随机合成，因此所述特异性唯一标签接头共有48种，理论上每个原始miRNA片段将被一组特异性唯一标签接头唯一识别，从而可以实现对每个原始miRNA模板进行区分，不仅避免了扩增时分子间存在的偏好性，而且能够有效实现单个模板的精确计数。在本发明中，所述的miRNA常规接头优选的为5′端腺苷化，3′端封闭的寡核糖核苷酸可用于Bartel方法中短片段RNA分子的克隆；RNA连接酶可以识别“活化”的腺苷化寡核糖核苷酸，无需ATP，即可将其5′端与第二条单链RNA的3′端OH共价连接；利用此5′端腺苷化，3′端封闭的寡核糖核苷酸，加入T4RNA连接酶2，截短型、T4RNA连接酶2，截短型K227Q或T4RNA连接酶1(有/无ATP)，只能与核酸混合物中的目的寡核苷酸连接。具体的所述miRNA常规接头苷化的oligo序列：5′-rAppCTGTAGGCACCATCAAT-NH23′。在本发明中，所述的miRNA常规接头优选的采用市售的miRNA常规接头，具体的为北京通用miRNA克隆接头品牌，货号为BTN130681。本发明中所述特异性唯一标签接头为miRNA常规接头添加8个随机碱基N和3个固定碱基CGA，优选的具体的序列为：5′-rAppCTGTAGGCACCATCAATNNNNNNNNCGA-NH23′。
本发明在获得带特异性接头的总RNA后，以带特异性接头的总RNA为模板进行反转录合成cDNA，获得反转录产物。本发明中反转录合成cDNA的温度优选的为41～43℃，更优选的为42℃，反转录时间优选的为50～70min，更优选的为60min。在本发明中所述反转录体系优选的包括：总RNA 1～5μg，DEPC H2O6～10μl，10×PCR buffer 2μL，25mM MgCl22μL，10mMdNTPmix 1μL，0.1M DTT 2μL。本发明在所述反转录完成后，优选的对剩余RNA进行消化，所述的RNA消化步骤为向反转录产物中加入RNaseH混合均匀进行孵育充分消化剩余RNA；所述RNaseH的用量优选的为2～6μL，更优选的为4μL；所述孵育的温度优选的为35～38℃，更优选的为37℃；所述孵育的时间优选的为25～35min，更优选的为30min。
本发明在获得反转录产物后，利用TBE-PAGE电泳回收反转录产物中150～170bp的cDNA片段，即得到miRNA。在本发明中，所述TBE-PAGE胶优选的为质量分数15％的TBE-PAGE胶；所述电泳过程中的电压优选的为100V，所述电泳的时间优选的为10～40min；电泳结束后，切取胶上150～170bp的片段进行回收，本发明对所述胶回收的方法和步骤没有特殊限定，采用本领域常规的胶回收手段即可，具体的在本发明实施例中所述胶回收优选的采用胶回收试剂盒进行，具体的步骤见胶回收试剂盒说明书。
本发明在获得胶回收反转录产物后，优选的将所述miRNA置于-80℃～-20℃进行保存。
下面结合实施例对本发明提供的外泌体miRNA精确获取的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
抽取受检者外周血10ml于EDTA抗凝管中，轻柔上下颠倒7次充分混匀，在采血当天5h内进行以下处理：采用Wako外泌体提取试剂盒从人外周血获取外泌体。
分离得到的全部外泌体后进行外泌体内的totalRNA的提取，具体的采用天根RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒，提取得到总RNA后，将总RNA回溶到14μL的RNase-freewater，然后基于Qubit2.0(Invitrogen，QubitRNAHSAssayKits)进行初步定量。
在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA；特异性唯一标签接头为：
5′-rAppCTGTAGGCACCATCAATATTGCGCACGA-NH23′
将带特异性接头的总RNA和其他反转录原料混合，将溶液混匀，置于PCR仪上，42℃孵育1h反转录合成cDNA，获得反转录产物；然后向反转录产物中加入4μLRNaseH混合均匀，37℃孵育30min，以充分消化剩余的RNA；将反转录产物在100V15％TBE-PAGE胶上进行20min电泳分析，切取胶上150～170bp的片段用胶回收试剂盒进行胶回收，得到miRNA。于-80℃保存。
实施例2
人体液10ml于EDTA抗凝管中，上下颠倒6次充分混匀，在采血当天4h内进行以下处理：采用Wako外泌体提取试剂盒获取外泌体。
分离得到的全部外泌体后进行外泌体内的totalRNA的提取，具体的采用总RNA提取试剂盒，提取得到总RNA后，将总RNA回溶到10μL的RNase-freewater，然后基于Qubit2.0(Invitrogen，QubitRNAHSAssayKits)进行初步定量。
在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA；特异性唯一标签接头为：
5′-rAppCTGTAGGCACCATCAATGAACTCGTCGA-NH23′
将带特异性接头的总RNA和其他反转录原料混合，将溶液混匀，置于PCR仪上，43℃孵育55min反转录合成cDNA，获得反转录产物；然后向反转录产物中加入3μLRNaseH混合均匀，37℃孵育35min，以充分消化剩余的RNA；将反转录产物在100V15％TBE-PAGE胶上进行30min电泳分析，切取胶上150～170bp的片段用胶回收试剂盒进行胶回收，得到miRNA。于-80℃保存。
由上述实施例可知，本发明在接特异性的唯一标签接头，对每个原始模板进行区分，不仅避免了扩增时分子间存在的偏好性，而且有效，从而可以更全面精准的检测所有miRNA的真实表达量以及表达谱。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种外泌体miRNA精确获取的方法，包括以下步骤：
1)从待分离样品中分离获得外泌体；
2)从外泌体中提取总RNA，获得外泌体总RNA；
3)在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA；
4)以带特异性接头的总RNA为模板进行反转录合成cDNA，获得反转录产物；
5)TBE-PAGE电泳回收反转录产物中150～170bp的cDNA片段，即得到miRNA；
所述特异性唯一标签接头为miRNA常规接头添加8个随机碱基N和3个固定碱基CGA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的随机碱基N为A、T/U、C和G中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述待分离样品为外周血或体液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待分离样品为获取后4～6h内的新鲜样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述分离获得外泌体的方法为磷脂酰丝氨酸亲和法。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤走4)中所述的反转录合成cDNA的温度为41～43℃，时间为50～70min。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述反转录完成后，还包括RNA消化步骤，所述的RNA消化步骤为向反转录产物中加入RNaseH混合均匀进行孵育充分消化剩余RNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为35～38℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为25～35min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述miRNA置于-80℃～-20℃保存。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653320A (zh) * 2017-11-15 2018-02-02 深圳华大生命科学研究院 Eml4‑alk融合基因无创检测试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105063209A (zh) * 2015-08-10 2015-11-18 北京吉因加科技有限公司 一种外泌体miRNA的定量检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105063209A (zh) * 2015-08-10 2015-11-18 北京吉因加科技有限公司 一种外泌体miRNA的定量检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICHAEL J. LODES ET AL.: "Detection of Cancer with Serum miRNAs on an Oligonucleotide Microarray", 《PLOS ONE》 *
韩柳 等: "胞外囊泡与癌症", 《中国细胞生物学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653320A (zh) * 2017-11-15 2018-02-02 深圳华大生命科学研究院 Eml4‑alk融合基因无创检测试剂盒

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