CN103003442A - 一种通过微小rna表达水平评估人同种异体移植物状况的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法，及其他方面。这种方法包括测定患者的生物样本中非编码标记小RNA的表达量。这种方法进一步包括比较患者的非编码标记小RNA的表达量与非编码标记小RNA的参考表达量。在另外一个方面，本发明涉及一种用于对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的试剂盒。

Description

一种通过微小RNA表达水平评估人同种异体移植物状况的方法
本申请要求一项申请号为61/160,188，申请日为2009年3月13日的美国临时专利申请的优先权益，此临时申请的内容在此全文参考并入。 
本申请所述的发明在美国国立卫生研究院的资助下完成，基金号为AI51652和AI72790。美国政府享有本发明的某些权益。 
发明背景 
在过去短短的五十年中，器官移植已经由一项风险较高的实验性治疗发展成为一种安余的和能够挽救生命的治疗方法。然而，移植接受者需要使用非特异性的、有毒性的多种免疫抑制药物进行长期治疗，而且会因为移植器官存在免疫摊斥反应而一直生活在可能失去其网种异体移植物的阴影之下。 
在人体问进行器官移植时产生的急性排斥反应是导致同种异体移植失败的重要风险因素。但是急性排斥反应的结果却很难预测。 
目前，预测急性排斥反应能否对抗排斥治疗产生应答的最佳方法是通过芯针进行组织活检，取得同种异体移植物的组织，以观察其组织学特点。但是，进行组织活检的侵入性搡作会导致诸如出血、动静脉瘘、甚至移植物损失等并发症。因此，需要一种非侵入性测定方法，以确定移植器官出现急性排斥反应的患者是否存在丧失移植器官的风险。 
发明概述 
本发明满足了上述需求，在一个方面，其提供了一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法。本方法包括测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量。本方法进一步包括比较患者非编码标记小RNA的表达量与非编码标记小RNA的参考表达量。 
在一实施方式中，非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs：1-9，或其变体，其中与所述非编码标记小RNA的参考表达量相比，所述非编码标记小RNA表达量升高至少1倍时，即提示移植器官产生排斥反应的风险增加。 
在另一个实施方式中，非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs：10-49，或其变体，其中与所述非编码标记小RNA的参考表达量相比，所述非编码标记小RNA表达量升高小于1倍时，即提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。 
在另一个实施方式中，这种方法进一步包括(c)测定生物样本中非编码标记小RNA的表达量与非编码标记小RNA的参考表达量之间的差异；(d)测定患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；(e)测定患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量与内源性非编码参比小RNA的参考表达量之间的差异；(f)比较步骤(c)中的差异与步骤(e)中的差异；其中步骤(c)中的差异大于步骤(d)中的差异时，进一步提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。 
在另一个实施方式中，对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法包括：(a)测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs：1-9或其组合；(b)测定患者生物样本中内源性表达的菲编码参比小RNA的表达量；(c)比较步骤(a)的测定结果与步骤(b)的测定结果，以确定第一个比率；(d)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中所述非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs：1-9或其组合；(e)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量，且比较步骤(d)的测定结果与步骤(e)的测定结果，以确定第二个比率；其中计算得到第一个比率比第二个比率至少高1倍时，即提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。 
在另一个实施方式中，对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法包括：(a)测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs：10-49或其组合；(b)测定患者生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；(c)比较步骤(a)的测定结果与步骤(b)的测定结果，以确定第一个比率；(d)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中所述非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs：10-49或其组合；(e)测 定带有非排斥器官的人体的生物样本中内源性表达的非编码参考小RNA的表达量，且比较步骤(d)的测定结果与步骤(e)的测定结果，以确定第二个比率；其中计算得到第一个比率比第二个比率高至少小于1倍时，即提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。 
在另一个方面，本发明涉及一种用于对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的试剂盒。这种试剂盒包括至少一种与选自SEQ ID NO：1-49s或其变体的非编码标记小RNA互补的核酸分子，以及一种用于测定生物样本中非编码标记小RNA表达量的方式。 
附图说明
图1.对miRNA表达谱差异进行的无监督聚类分析和主成分分析能够区分人肾脏同种异体移植物的急性排斥反应组织活检样本与正常同种异体移植物组织活检样本。(A)采用含有365个人成熟miRNA的引物对和TaqMan探针的微流控芯片，测定7份人肾脏同种异体移植物组织活检样本[3份样本显示出急性排斥反应(AR)的组织学特征，4份样本显示出正常同种异体移植物的组织活检结果(N)]中微小RNA(miRNA)的表达类型。在所有样品中，共有174±7个miRNA的表达水平具有显著性(即，CT＜35)。性别、年龄、种族、移植类型以及从移植到组织活检的时间如下：AR1(男性，黑人，52岁，活体捐赠，161天)，AR2(男性，白人，32岁，活体捐赠，119天)，AR3(女性，白人，48岁，尸体捐赠，31天)，N1(女性，黑人，40岁，活体捐赠，203天)，N2(男性，印第安人，50岁，活体捐赠，191天)，N3(男性，黑人，31岁，活体捐赠，196天)和N4(男性，亚裔，51岁，尸体捐赠，88天)。根据表达类型的相似性，用无监督聚类分析对组织活检样本进行分组。组织活检样本表达类型的相关程度以图片顶部的树状图表示。分枝长度表示各样品(上部)或miRNA(左侧)之间的相似程度。两个主要的簇(上部)将AR组织活检样本与正常同种异体移植物组织活检样本精确分离。各列代表肾脏同种异体移植物组织活检样本的表达谱，各行代表miRNA。各格的颜色反映了与在组织活检样本的整体集合中相应miRNA的平均表达水平相比，相应样品中相应miRNA的表达水平。红色强度增加表示给定样品中特定miRNA的表达量较高，绿色强度增加表示该miRNA的表达量较低。标尺(右下角)表示，给定样品中miRNA的丰度与所有样品中的平均 水平之比。(B)根据在所有样本中具有显著性表达的174个小RNA(即，CT＜35)，对7个肾脏同种异体移植物组织活检样本进行主成分分析。PCA是一种用于减少多变量系统维度的双线性分解方法，其用于概述多变量数据中的簇。其将若干相关变量转化为被称为主成分(PC)的少数非相关变量。第一个PC用于解释数据中尽可能多的变异性，各后续成分用于解释尽可能多的剩余变异性。PCA显示了明显的聚类性，并且证实可以将AR样本从正常同种异体移植物组织活检样本中分离。通过PC1将样本精确分组，其解释了miRNA表达总体变异性的45.91％，而PC2解释了变异性的21.48％，且不能根据其诊断将样本分类。 
图2.miRNA在急性排斥反应组织活检样本与正常同种异体移植物组织活检样本中的差异性表达，P值＜0.05。采用含有365个人成熟miRNA的引物对和TaqMan探针的徽流控芯片，测定7份人肾脏同种异体移植物组织活检样本[3份样本显示出急性排斥反应(AR)的组织学特征，4份样本显示出正常同种异体移植物组织活检的结果(N)]中微小RNA(miRNA)的表达类型。各列代表肾脏同种异体移植物组织活检样本的表达谱，各行代表miRNA。利用ABqPCR软件，鉴别在AR组织活检样本和正常同种异体移植物组织活检样本中差异性表达的miRNA。首先执行CT过滤程序。当各组中50％以上样品的CT值＞35时，则认为该实验为未检出。两组均为未检出的实验不包括在分析中。对于其余各实验，通过t检验确定差异表达的miRNA。miRNA聚类树位于图的左侧。分枝长度表示各miRNA之间的相似程度。红色强度较高则表示表达水平较高。 
图3.在人肾脏同种异体移植物的AR组织活检样本和正常同种异体移植物组织活检样本中验证微小RNA的表达差异。用含有9个急性排斥反应组织活检样本和17个正常肾同种异体移植物组织活检样本的独立验证集，测定了移植物内miR-142-5p、-155、-223、-10b、-30a-3p和let-7c的表达水平。表达水平的定量采用经改良的TaqMan miRNA实验，该方法可以绝对定量miRNA。使用稳定表达的RNU44小核仁RNA对miRNA的拷贝数进行归一化处理，并以miRNA的拷贝数对RNU44拷贝数的平均比率(±SE)表示。RNU44的拷贝数在9个急性排斥反应组织活检样本(8.87×106±1.48×106个拷贝/μg RNA)和17个正常同种异体移植物组织活检样本(8.72×106±8.42×105个拷贝/μg RNA，P＝0.92)之间不存在差异。采用t检验计算P值。 
图4.人同种异体移植物组织活检样本中的miRNA与mRNA呈正相关。采用TaqMan miRNA实验来定量miRNA在移植物内的水平，采用实时定量PCR实验来定量mRNA在移植物内的水平，显示了miRNA和mRNA在移植物内的水平之间的关系，还显示了皮尔森相关性系数(R2)和P值。CD3mRNA的水平与在急性排斥反应组织活检样本中过表达的miRNA的水平被发现有明显的正相关：(A)miR-142-5p(R2＝0.72，P＜0.0001)；(B)miR-155(R2＝0.69，P＜0.0001)；或(C)miR-223(R2＝0.66，P＜0.0001)。还观察到肾小管特异性NKCC-2mRNA与在急性排斥反应组织活检样本中低表达的miRNA呈现出相关性：(E)miR-30a-3p(R2＝0.53，P＜0.0001)；(F)mif-10b(R2＝0.36，P＜0.0001)；或(G)let-7c(R2＝0.13，P＝0.04)。显示了所有33个肾同种异体移植物组织活检样本的测定结果(红色，12个急性排斥反应组织的活检样本；绿色，21个正常同种异体移植物组织活检样本)。阈值循环(CT)是指在miRNA/mRNA测定中荧光信号越过固定阈值时的循环分数。 
(D)mRNA(18S rRNA，24.8±1.3vs.24.7±1.1，P＝0.86，t检验)和(H)miRNA(RNU44小核仁RNA，27.1±0.7vs.27.1±0.5，P＝0.97，t检验)的内源性对照的平均(±SD)CT值在急性排斥反应样本中与在正常肾同种异体移植物样本中相似。 
图5.静息或活化的正常人外周血单核细胞中miRNA的水平。外周血单核细胞(PBMC)取自健康人，将其在不含(空心柱)或含有(实心柱)2μg/mL PHA的条件下培养24h(A，F和G)(n＝7名受试者)、48h(D)(n＝4名受试者)，或24、48和72小时(B，C，E，H和I)(n＝2名受试者)，分离RNA进行miRNA定量(A-E)或mRNA定量(F-I)。采用RNU44小核仁RNA的拷贝数对miRNA的拷贝数进行归一化处理，采用18S rRNA的拷贝数对mRNA的拷贝数进行归一化处理，结果显示为miRNA拷贝数对RNU44拷贝数的比值的平均值(±SE)或mRNA拷贝数对18S rRNA拷贝数的比值的平均值(±SE)。采用配对t检验计算P值。 
图6.静息或活化的正常人肾上皮细胞中miRNA的水平。将原代正常人肾上皮细胞(HREC)与静息PBMC的无细胞上清液(空心柱)或加入2μg/mL PHA的活化PBMC的无细胞上清液(实心柱)共同培养24h(A，B)或24和48h(C)。从HREC中分离总RNA，采用改良的TaqMan miRNA实验对急性排斥反应组织活检样本中过表达(A)或低表达(B或C)的miRNA亚群进行定量。采用RNU44小核仁RNA的拷贝数对miRNA的拷贝数进行归一化处理，结果显示为miRNA拷贝数对 RNU44拷贝数比值的平均值(±SE)。结果来自两次连续实验，采用来自两个人肾脏的两份独立的HREC原代培养物。采用配对t检验计算P值。 
图7.静息或活化的正常人肾上皮细胞中趋化因子mRNA的水平。将原代正常人肾上皮细胞(HREC)与静息PBMC的无细胞上清液(空心柱)或加入2μg/mLPHA的活化PBMC的无细胞上清液(实心柱)共同培养24h。从HREC中分离总RNA，采用实时PCR定量趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)和平扰素诱导蛋白10(IP-10)的mRNA绝对水平。采用18S rRNA的拷贝数对mRNA的拷贝数进行归一化处理，结果显示为mRNA拷贝数对18S rRNA拷贝数比值的平均值(±SE)表示。结果来自两次连续实验，采用来自两个人肾脏的两份独立的HREC原代培养物。采用配对t检验计算P值。 
图8.人肾脏同种异体移植物组织活检样本中移植物内的mRNA的水平。箱线图显示，在人肾脏同种异体移植物的12个急性排斥反应组织活检样本和21个正常同种异体移植物样本中，IFN-γ(A)和白介素-4(B)的mRNA拷贝数与18S rRNA拷贝数比值的第10、第25、第50(中位数)、第75和第90百分位数值。与正常同种异体移植物组织活检样本相比，急性排斥反应组织活检样本中IFN-γ的水平升高，但白介素-4的水平未升高。采用实时定量PCR实验来定量mRNA的绝对水平。采用t检验计算P值。 
图9.尿细胞中miRNA 155的水平用于诊断急性排斥反应。从肾同种异体移植接受者的尿细胞中分离包含miRNA的总RNA，采用定量实时PCR实验来测定RNU44(管家基因)和miRNA 155的水平。与来自移植物功能稳定和组织活检结果正常患者的尿液相比(n＝13个样本)，在组织活检样本分类为急性排斥反应患者的尿液中(n＝3个样本)，尿细胞中miRNA 155的水平显著升高，而RNU 44未出现升高。 
对发明内容的详细说明 
本发明涉及采用微小RNA对器官排斥反应进行非侵入性测定的方法和组合物。发明人发现，器官衰竭(例如，急性排斥反应)会引起某些标记微小RNA(miRNA)过表达或低表达，等等。 
在一个方面，本发明涉及一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法。 
带有移植器官的患者指带有移植的器官并且该器官的排斥反应风险将要被评估的任何人。 
如本申请所述，移植器官指任何器官。示例性的器官包括肾脏、心脏、肝脏、肺、肠、胰腺、胰岛等。 
器官排斥反应指因反向免疫应答导致的移植器官的任何衰竭。例如，器官排斥反应包括急性和/或慢性排斥。器官的急性排斥反应事件可能由抗体介导或细胞介导的免疫应答引起。细胞介导的免疫应答反应中涉及的细胞包括，例如，活化的细胞毒性T细胞。如果患者未使用免疫抑制剂，则急性排斥反应事件通常发生在器官移植后的14天以内，更通常的发生在10天以内，特别通常的发生在5天以内。 
但是，大部分，如果不是全部，接受移植的患者均使用了免疫抑制剂。这样，急性排斥反应事件通常发生在器官移植后约1年以内，更特别是发生在器官移植后约9个月以内，尤其特别是发生在约6个月以内，以及最特别是发生在约3个月以内。然而，急性排斥反应可以发生在移植器官的生存期的任何时间。而且，一名患者的移植器官可能会发生不止一次的急性排斥反应事件。 
非编码标记小RNA表达量的测定 
这种方法包括测定患者的生物样本中非编码标记小RNA的表达量。 
如本发明所述，非编码小RNA指不编码蛋白质的核糖核酸序列。例如，非编码小RNA可能在细胞中发挥调节功能，利用与互补mRNA序列的序列特异性碱基配对从而调节基因表达。 
非编码小RNA的长度小于约40个核苷酸，优选地小于约30个核苷酸，例如，长度约为29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个核苷酸。非编码小RNA的长度大于约10个核苷酸，例如，长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。任意最大值均能与任意最小值进行组合，以定义一个范围。 
非编码小RNA的例子包括，转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)和/或信号识别颗粒RNA复合物(SRP)。优选地，非编码小RNA为miRNA。 
本发明所述的非编码标记小RNA是指用于评估器官排斥反应风险的非编码小RNA。非编码标记小RNA的具体例子包括下述核酸分子和/或与下文所列举的序列至少约有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸分子： 
miR-142-5p CAUAAAGUAGAAAGCACUAC(SEQ ID NO：1) 
miR-142-3p UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA(SEQ ID NO：2) 
miR-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG(SEQ ID NO：3) 
miR-146a UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU(SEQ ID NO：4) 
miR-146b UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU(SEQ ID NO：5) 
miR-342 UCUCACACAGAAAUCGCACCCGUC(SEQ ID NO：6) 
miR-650 AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC(SEQ ID NO：7) 
miR-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO：8) 
miR-425-5p AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA(SEQ ID NO：9) 
miR-30c UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC(SEQ ID NO：10) 
miR-30a-3p CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC(SEQ ID NO：11) 
miR-10a UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG(SEQ ID NO：12) 
miR-30e-3p CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC(SEQ ID NO：13) 
miR-30b UGUAAACAUCCUACACUCAGCU(SEQ ID NO：14) 
miR-10b UACCCUGUAGAACCGAAUUUGU(SEQ ID NO：15) 
miR-32 UAUUGCACAUUACUAAGUUGC(SEQ ID NO：16) 
miR-9 UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA(SEQ ID NO：17) 
miR-193b AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCUUU(SEQ ID NO：18) 
miR-143 UGAGAUGAAGCACUGUAGCUCA(SEQ ID NO：19) 
miR-489 AGUGACAUCACAUAUACGGCAGC(SEQ ID NO：20) 
miR-27b UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC(SEQ ID NO：21) 
miR-126 CAUUAUUACUUUUGGUACGCG(SEQ ID NO：22) 
miR-193a AACUGGCCUACAAAGUCCCAG(SEQ ID NO：23) 
miR-378 CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU(SEQ ID NO：24) 
miR-429 UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU(SEQ ID NO：25) 
miR-181c AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU(SEQ ID NO：26) 
miR-196b UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGG(SEQ ID NO：27) 
miR-199a CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC(SEQ ID NO：28) 
miR-660 UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG(SEQ ID NO：29) 
miR-203 GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG(SEQ ID NO：30) 
miR-204 UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(SEQ ID NO：31) 
miR-30e-5p UGUAAACAUCCUUGACUGGA(SEQ ID NO：32) 
miR-30a-5p UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG(SEQ ID NO：33) 
miR-30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG(SEQ ID NO：34) 
miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA(SEQ ID NO：35) 
miR-130a CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID NO：36) 
miR-126 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGC(SEQ ID NO：37) 
miR-195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC(SEQ ID NO：38) 
miR-26a UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGC(SEQ ID NO：39) 
miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGUU(SEQ ID NO：40) 
miR-497 CAGCAGCACACUGUGGUUUGU(SEQ ID NO：41) 
miR-152 UCAGUGCAUGACAGAACUUGGG(SEQ ID NO：42) 
miR-141 UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(SEQ ID NO：43) 
miR-296 AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU(SEQ ID NO：44) 
miR-365 UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU(SEQ ID NO：45) 
miR-99a AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG(SEQ ID NO：46) 
miR-100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG(SEQ ID NO：47) 
miR-186 CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCUU(SEQ ID NO：48) 
let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO：49) 
miR-223 UGUCAGUUUGUCAAAUACCCC(SEQ ID NO：50) 
let-7e UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU(SEQ ID NO：51) 
miR-125a UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUG(SEQ ID NO：52) 
miR-200a UAACACUGUCUGGUAACGAUGU(SEQ ID NO：53) 
确定序列同一性的方法为本领域的公知常识。与本申请所列的非编码小RNA的核酸序列具有的核苷酸序列同一性百分比定义为，将候选序列与特定非编码小RNA序列进行序列比对，必要时引入空缺，以达到最大的序列同一性，此时候选序列中与特定非编码小RNA序列中相同的核酸所占的百分比，任何保守性取代都不计入序列同一性。 
可以通过本领域技术人员公知的多种途径进行序列比对，以确定核酸序列同一性的百分比，例如，采用公众能够获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定比对时采用的适宜参数，包括在被比对序列全长范围内为实现最大比对所需的任何算法。 
然而，在本申请中，采用序列比较计算机程序NCBI-BLAST2(Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))确定核酸序列同一性百分比(％)。可以从美国国家生物技术信息中心的网站上下载NCBI-BLAST2序列比较程序，另外还可以从美国国立卫生研究院(Bethesda，Md)获得此程序。NCBI-BLAST2中采用了多个检索参数，所有这些检索参数均设定为默认值，包括，例如，暴露＝是，链＝全部，预期事件＝10，最低复杂性长度＝15/5，多途径e值＝0.01，多途径常数＝25，最终有间隔的序列比对减少＝25。 
本发明所述的方法可以包括测定一种非编码小RNA的表达量，或者上述非编码小RNA的某一组合的表达量。 
非编码小RNA通常来自于患者的生物样本。如本发明所述，生物样本指取自患者的任何样本。生物样本的例子包括血液、尿液、各器官的组织样本和/或移植器官的组织样本。优选尿液样本。 
非编码标记小RNA的参考表达量 
本方法进一步包括将患者生物样本中测得的非编码标记小RNA的表达量与非编码标记小RNA的参考表达量进行比较。 
在一个实施方式中，非编码标记小RNA的参考表达量可以通过测定在带有非排斥器官的人体中该非编码小RNA的表达量来获得。例如，带有非排斥器官的人体包括健康人。优选地，健康人是指，与带有移植器官并且该器官的衰竭风险将要被评估的患者具有相似年龄、性别、种族、移植器官供体来源、Banff组织学分级接近和/或接受相同的初始抗排斥反应治疗的人。 
带有非排斥器官的人体的另外一个例子是，带有功能良好(例如，稳定)的移植器官的人。功能良好(例如，稳定)的移植器官可以被定义为未出现器官衰竭(例如，排斥反应)的移植器官。优选地，功能良好的移植器官是指，未出现移植体机能异常或无形态学证据表明在移植体区域出现移植体损伤的移植器官。例如，功能稳定的肾脏移植体可以被定义为，在收集用于测定非编码小RNA的生物样本前7天和后7天这期间，其血清肌酸酐浓度的变化量不超过约0.2mg每分升。优选地，带有功能良好(例如，稳定)移植器官的人是指，与带有移植器官并且该器官的衰竭风险将要被评估的患者具有相似年龄、性别、种族、移植器官供体来源、Banff组织学分级接近和/或接受相同的初始抗排斥反应治疗的人。 
在另外一个实施方式中，参考量可以通过测定来自患者的另外一份生物样本中所述非编码小RNA的表达量来获得。例如，另外一份生物样本可以在所述患者进行器官移植前取得和/或取自所述患者的另外一个非排斥器官。 
在又一个实施方式中，非编码小RNA的参考表达量是指本领域公认的非编码小RNA的表达量。 
与测得的非编码标记小RNA表达量进行比较 
本方法包括将测得的非编码小RNA的表达量与该非编码小RNA的参考表达量进行比较。非编码标记小RNA可以是，例如，选自SEQ ID NOs：1-53或其变体的非编码小RNA。优选地，非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs 1：49，或其变体。 
在一个更为优选的实施方式中，非编码标记小RNA是选自SEQ ID NOs：1-9或其变体的序列。例如，非编码标记小RNA包括选自miR-142-5p；miR-142-3p；miR-155；miR-223；miR-146a；miR-146b；miR-342；miR-650；miR-21和/或miR-425-5p的非编码小RNA，或其组合，其中与非编码标记小RNA的参考表达量相比，非编码标记小RNA的表达量升高至少1倍时，即提示移植器官产生排斥反应的风险增加。在一个最优选实施方式中，非编码标记小RNA为miR-142-5p；miR-142-3p和/或miR-155。 
表达量升高至少1倍可以是指，与非编码标记小RNA的参考表达量的升高量相比，表达量升高至少为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或以上。优选地，升高量为倍数值。用于定量表达量升高的示例方法是本领域的公知常识，参见下文中的一般方法章节。 
在不同患者和不同类型的器官移植中，器官排斥反应的风险增加情况不同。一般情况下，与不存在器官排斥反应风险的人相比，增加的风险为至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％。 
相反的，在一个实施方式中，选自SEQ ID NOs：1-9的序列或其变体的非编码标记小RNA的表达量比该非编码标记小RNA的参考表达量升高约小于1倍时，即提示移植器官产生排斥反应的风险降低。在不同患者和不同类型的器官移植中，器官排斥反应的风险降低情况不同。一般情况下，与不存在器官排斥反应风险的人相比，降低的风险为至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％。 
在另外一个优选的实施方式中，非标记编码标记小RNA选自SEQ ID NOs：10-49中的序列或其变体。例如，非编码标记小RNA包括选自miR-30c；miR-30a-3p；miR-10a；miR-30e-3p；miR-30b；miR-10b；miR-32；miR-9；miR-193b；miR-143；miR-489；miR-27b；miR-126；miR-378；miR-429；miR-181c；miR-196b；miR-199a；miR-660；miR-203；miR-204；miR-30e-5p；miR-30a-5p；miR-30d；miR-125b；miR-130a；miR-126；miR-195；miR-26a；miR-26b；miR-497；miR-152；miR-141；miR-296；miR-365；miR-99a；miR-100；miR-186；和/或let-7a的非编码小RNA，其中与非编码标记小RNA的参考表达量相比，所述非编码标记小RNA的表达量升高小于1倍时，即提示移植器官产生排斥反应的风险增加。 
表达量升高小于1倍可以是指，与非编码标记小RNA参考表达量的升高量相比，表达量升高至多为约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1倍或以下。优选地，升高量为倍数值。用于定量表达量升高的示例方法是本领域的公知常识，参见下文中的一般方法章节。 
相反的，在一个实施方式中，选自SEQ ID NOs：10-49中的序列或其变体的非编码标记小RNA表达量比该非编码标记小RNA的参考表达量升高至少约1倍或以上时，即提示移植器官产生排斥反应的风险降低。在不同患者和不同类型的器官移植中，器官排斥反应的风险降低情况不同。一般情况下，与不存在器官排斥反应风险的人相比，降低的风险为至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％。 
采用内源性表达的非编码参比小RNA进一步提示器官排斥反应的风险增加 
测定和比较内源性表达的非编码参比小RNA的量 
在又一个实施方式中，评估器官排斥反应风险的方法进一步包括测定患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量。除此之外，这种方法包括测定生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的参考量。 
如上文所述，参考量可以通过测定在带有非排斥器官的人体中，或者在来自该患者的另外一份生物样本中，该内源性表达的非编码参比小RNA的表达量来获得。在另外一个实施方式中，参考量是指，该内源性表达的非编码参比小RNA在本领域公认的表达量。 
内源性表达的非编码参比小RNA是指一种内源性表达的非编码小RNA(例如，在患者、细胞和/或组织中表达)，且其在生物样本中的表达相对恒定和丰富。 
选择和验证内源性表达的非编码参比小RNA的方法是本领域的公知常识。参见，例如，美图应用生物系统公司的TaqMan 
Figure BPA00001463276400131
微小RNA的测定实验。优选地，内源性表达的非编码参比小RNA是稳定的，其大小与待测非编码小RNA接近(例如，SEQ ID NOs：1-53)，且适用于测定表达的方式。 
内源性表达的非编码参比小RNA的例子包括，RNU24、RNU66、RNU19、RNU38B、RNU49、Z30、RNU6B、RNU48、RNU43和/或RNU44。优选地，内源性表达的非编码参比小RNA为内源性的小核仁RNA RNU44。 
测定标记RNA与参比RNA的表达差异 
在一个优选实施方式中，本方法进一步包括测定生物样本中非编码标记小RNA表达量与非编码标记小RNA参考表达量之间的差异。例如，本方法能够包括测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量与非编码标记小RNA参考表达量之间的差异。 
如上文所述，参考量可以通过测定在带有非排斥器官的人体中，或者在来自该患者的另外一份生物样本中，该内源性表达的非编码参比小RNA的表达量来获得。在另外一个实施方式中，参考量是指，该内源性表达的非编码参比小RNA在本领域公认的表达量。 
实施方式进一步包括测定生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量与该内源性表达的非编码参比小RNA的参考表达量之间的差异。或者例如，本方法包括测定患者生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量与该内源性非编码参比小RNA参考表达量之间的差异。 
如上文所述，参考量可以通过测定在带有非排斥器官的人体中，或者在来自该患者的另外一份生物样本中，该内源性表达的非编码参比小RNA的表达量来获得。在另外一个实施方式中，参考量是指，该内源性表达的非编码参比小RNA在本领域公认的表达量。 
本实施方式进一步包括，比较(i)患者样本中非编码标记小RNA表达量与参考量之间的差异，和(ii)患者样本中内源性表达的非编码参比小RNA表达量与参考量之间的差异。当(i)中的差异(即，患者样本中非编码标记小RNA表达量与参考量之间)高于(ii)中的差异(即，患者样本中内源性表达的非编码参比小RNA表达量与参考量之间)时，比较结果进一步提示移植器官出现排斥反应的风险升高。 
优选地，当(i)中差异比(ii)中差异高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或以上时，提示移植器官出现排斥反应的风险升高。 
在另外一个优选实施方式中，当(i)中差异比(ii)中差异高小于1倍时，例如，最多约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1倍或以下，提示移植器官出现排斥反应的风险升高。 
相应地，本实施方式对应一个实施例，据此本领域技术人员可以测定和/或确定患者中非编码小RNA表达量的增加与参考量相比是否具有统计学意义。 
归一化 
在一个优选实施方式中，本发明包括对非编码标记小RNA的表达量进行归一化处理。本方法包括依照如上所述的方法测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量。本方法进一步包括测定患者生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量。除此之外，本方法包括比较患者菲编码标记小RNA的测定结果与患者内源性表达的非编码参比小RNA的测定结果，以确定第一个比率。 
本方法进一步包括测定带有非排斥器官的人体的生物样本中非编码标记小RNA的表达量。本方法进一步包括测定带有非排斥器官的人体的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量。除此之外，本方法包括比较带有非排斥器官的人体的非编码标记小RNA的测定结果与带有非排斥器官的人体的非编码参比小RNA的测定结果，以确定第二个比率。 
当计算得到的第一个比率比第二个比率至少高1倍时，计算结果提示带有移植器官的患者中所述移植器官出现排斥反应的风险升高。计算得到的第一个比率比第二 个比率至少高1倍可以是指，高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或以上。 
当计算得到的第一个比率比第二个比率高小于1倍时，计算结果提示带有移植器官的患者中所述移植器官出现排斥反应的风险升高。计算得到的第一个比率比第二个比率高小于1倍可以是指，高至多约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1倍或以下。 
相应地，在本实施方式中，所述非编码标记小RNA的变化倍数或等同参数采用内源性表达的非编码参比小RNA进行归一化处理。 
血清肌酸酐和附加实施方式 
在一个实施方式中，当移植器官为肾脏时，用于评估患者器官排斥反应风险的方法可以进一步包括确定患者体内血清肌酸酐蛋白的含量。血清肌酸酐含量可以用本领域公知的任意方法进行测定，如美国专利公开文本US20080131441中所述的方法，其在此参考并入。 
在本实施方式中，将患者血清肌酸酐的检测结果与健康人或有功能良好(例如，稳定)移植体的人体的血清肌酸酐对照检测结果进行比较，参见U.S.专利公开文本US20080131441，其在此参考并入。例如，在健康人或有功能良好移植体的人体中，血清肌酸酐的正常水平一般约为0.8-1.6毫克/分升。所述人可以是患者或患者以外的人。 
没有必要在每次使用本方法时均测定对照样本中的肌酸酐水平。例如，可以将患者的血清肌酸酐水平与此前获得的一个或多个对照样本的检测结果进行比较，或者与实施本方法的内科医师或临床医师认可的水平进行比较，或由医疗委员会和/或执业医师判定。 
在另外一个实施方式中，这种方法进一步包括告知患者其出现器官排斥反应的风险是否降低或增加。患者出现移植器官排斥反应的风险的信息是有用的。据此就能为患者开具处方和/或给予治疗，以避免排斥反应的发生和/或移植器官的损失。 
在另外一个实施方式中，治疗包括给予患者有效剂量的药物组合物，以预防排斥反应的发生和/或移植器官的损失。此类药物组合物为本领域的公知常识，包括例如激素冲击疗法、抗体等。 
例如，激素冲击疗法可以包括给药高剂量的皮质激素(例如，100mg以上)3至6天。抗体疗法的例子包括给药多克隆抗体Thymoglobin或单克隆抗体OKT37至14天。 
治疗方法的另外一个例子为血浆置换。血浆置换是将血液中的液体部分(即，血浆)与血细胞相分离的过程。通常，采用细胞分离器除去血浆。一般会将细胞回输至接受治疗的人体内，而弃去包含抗体的血浆。 
本发明所述的各种方法和实施方式均可单独使用，或与其他方法的一种或多种或全部联合使用。 
一般方法 
患者或健康人的生物样本可以通过本领域公知的任意方法获得。除上文所述的例子以外，生物样本的例子进一步包括移植组织的组织活检样本、血液、尿液、胆汁、支气管肺泡灌洗液和心包液。适宜的方法包括，例如，通过静脉穿刺获得血液样本、收集尿样以及经皮芯针抽吸组织活检。 
本领域公知的任意方法均可以用于确定非编码小RNA的量。通常，从生物样本中分离总RNA。可以通过本领域公知的任意方法从样本中分离RNA。例如，商品化的试剂盒，如购自Molecular Research Center，Inc.(Cincinnati，OH)的TRI Reagent
Figure BPA00001463276400161
，或Ambion的mirVana miRNA分离试剂盒均可用于分离RNA。可以采用NanoDropND-1000型分光光度计测定RNA的收率和纯度。 
可以采用本领域公知的任意方法对生物样本总mRNA中的非编码小RNA进行定量。例如，涉及逆转录总RNA的动态定量PCR(例如，采用Taqman阵列人微小RNA芯片v1.0适用的Taqman Multiplex RT)以及聚合酶链式反应(PCR)。可以采用Applied BioSystems 7900HT型温度循环仪或其同类产品完成定量PCR，检测过程中使用生产厂商推荐的循环条件。简言之，采用特异性的非编码小RNA引物对总RNA 样本进行逆转录获得cDNA，引物可通过TaqMan微小RNA检测(Applied Biosystems)获得，试剂来自TaqMan微小RNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)。 
一般情况下，可以采用本领域公知的方法对分离得到的非编码小RNA进行扩增。使用例如PCR或RT-PCR的方法的扩增系统为本领域公知。扩增技术的一般性概述，参见，例如，Dieffenbach et al.，PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)。例如，可以采用动态定量PCR确定非编码小RNA的量。优选地，采用TaqMan微小RNA实验(Applied Biosystems)获得的cDNA样本来扩增PCR产物。 
用于测定非编码小RNA表达量的另一种方法包括，使用分子信标以及其他可用于，例如多重PCR，的标记探针。在多重PCR检测中，PCR混合物含有指向非编码小RNA PCR产物的引物和探针。通常，在实验中使用单个荧光染料。通过检测分子信标或探针确定非编码小RNA的量。分子信标的描述请见，例如，Tyagi和Kramer(Nature Biotechnology 14，303-308，1996)以及Andrus和Nichols在U.S.专利申请公开号20040053284中的描述。 
其他方法包括，例如，基于荧光定量的实时检测方法来定量cDNA(通过对非编码小RNA进行逆转录获得)，例如，购自Applied Biosystems，Foster City，Calif.的ABI PRISM 7700或7900型序列检测系统[TaqMan 
Figure BPA00001463276400171
]或由Heid et al.，(Genome Res.1996；6：986-994)和Gibson et al.(Genome Res.1996；6：995-1001)等描述的类似系统。 
然后可以采用内源性表达的非编码参比小RNA的拷贝数对非编码标记小RNA的拷贝数进行归一化处理，非编码标记小RNA的丰度以非编码标记小RNA与内源性表达的非编码参比小RNA的比值表示。 
一般来说，如果非编码小RNA过表达，则生物样本中非编码小RNA的表达量明显增加。例如，将非编码小RNA基因过表达的区分水平(例如，表达量的基线值)定义为在非排斥器官中测得的一组值的平均值±95％置信区间(例如，对照值，即对照水平)。此处使用的一组值包括，例如，最低至少约两个值，更优选地最低至少约10 个值，最优选地最低至少约20个值。此处使用的一组值包括，例如，最高至多约500个值，更优选地最高至多约100个值，最优选地最高至多约50个值。 
如果非编码小RNA的值高于在非排斥器官中测得的一组值的平均值±95％置信区间，则认为非编码小RNA的表达显著增加。类似地，如果非编码小RNA在细胞样本中的表达量低于在非排斥器官中测得的一组值的平均值±95％置信区间，则认为细胞样本中非编码小RNA的水平显著降低。 
如果生物样本中非编码小RNA的水平未高于在非排斥器官中测得的一组值的平均值±95％置信区间，则一般认为非编码小RNA的表达量未显著增加。如果生物样本中非编码小RNA的水平未低于在非排斥器官中测得的一组值的平均值±95％置信区间，则通常认为非编码小RNA的表达量未显著降低。 
可以采用x2检验对上述在非排斥器官中测得的一组值的平均值±95％置信区间进行统计学分析。 
在另外一个实施方式中，如果采用Kruskal-Wallis检验确定，经log转换后的非编码标记小RNA的拷贝数与内源性表达的非编码参比小RNA的拷贝数的平均(±SE)比率高于在非排斥器官中测得的对照比率，则认为生物样本中非编码标记小RNA的表达量显著增加。例如，显著增加的比率通常至少为约±SE 3.0，更加通常在±SE 3.0至5.0之间，以及最为通常在±SE 3.8至4.7之间。 
类似地，如果采用Kruskal-Wallis检验确定，经log转换后的非编码标记小RNA的拷贝数与内源性表达的非编码参比小RNA的拷贝数的平均(±SE)比率低于在非排斥器官中测得的对照比率(即，对照值，对照水平)，则认为生物样本中非编码小RNA的量显著降低。例如，通常非排斥器官对照比率为不超过约2.5，更加通常地为1.0至2.5之间，以及最为通常地为1.3至2.0。 
在本发明的一个实施方式中，一般来说，当与对照量进行比较时，非编码小RNA的量可以增加至少约10％，至少约50％，或至少约100％。当与对照量进行比较时，非编码小RNA的表达量可以降低至少约10％，至少约50％，或至少约100％以下。 
没有必要在每次使用本方法时均测定非编码标记小RNA或内源性表达的非编码参比小RNA的表达量。例如，可以将移植器官生物样本中的非编码标记或参比RNA的量与此前获得的一个或多个对照样本的检测结果进行比较，或者与实施本方法的内科医师或临床医师认可的水平进行比较，或由医疗委员会和/或执业医师判定。 
至于血清肌酸酐，可以采用本领域公知的任意方法测定生物样本中血清肌酸酐的含量。用于确定蛋白水平的适宜方法包括ELISA和标准印记法。简言之，这些实验一般是将某蛋白特异性的抗体与疑似含有这种蛋白的样本共同孵育，再检测是否存在抗体与蛋白的复合物。 
另外，可以使用商品化的试剂盒。用于测定肌酸酐水平的商品化试剂盒的例子为BioAssay Systems(Hayward，Ca)的QuantiChromTM肌酸酐检测试剂盒。 
试剂盒 
在另外一个方面，本发明涉及一种用于对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的试剂盒。试剂盒包括至少一种与选自SEQ ID NO：1-49s或其变体的非编码标记小RNA互补的核酸分子。试剂盒进一步包括一种用于测定生物样本中非编码标记小RNA表达量的方式。试剂盒还可以包括如上文所述的器官排斥反应风险评估方法的书面说明书。 
在一个优选实施方式中，表达量的测定方式包括定量聚合酶链式反应。表达量的其他测定方式包括一般方法章节中所述的方法。 
实施例
实施例1：人肾脏同种异体移植物中微小RNA的表达谱。我们首先采用含有365个人成熟miRNA探针和TaqMan引物的微流控芯片，测定人肾脏同种异体移植物的广谱miRNA表达谱。表1汇总了患者的特性信息，这些患者的肾脏同种异体移植物组织活检样本用于研究miRNA的全局表达类型(训练集)，或研究差异表达的miRNA子集(验证集)。 
在训练集中已分析的365个人成熟miRNA中(4个正常和3个AR组织活检样本)，有174±7miRNA(48％)在各组织活检样本中都表达(AR组织活检样本中有 174±10miRNA，正常同种异体移植物组织活检样本中有174±4miRNA)。miRNA表达类型的无监督聚类分析结果对正常同种异体移植物组织活检样本和AR组织活检样本进行了正确的分类(图1A)。 
通过主成分分析(PCA)，展示出miRNA表达类型之间的关系，这进一步确证了AR组织活检样本能够从正常同种异体移植物组织活检样本中明确分离(图1B)。通过PC1将样本精确分组，其解释了miRNA表达总体变异性的46％，而PC2解释变异性的21％，且不能根据其诊断将样本分类。下表2中列举了对样本总变异性起较大作用的miRNA。 
Figure BPA00001463276400201
实施例2：能将急性排斥反应组织活检样本与正常同种异体移植物组织活检样本区分开的微小RNA。采用监控聚类分析，检测在AR组织活检样本与正常同种异体移植物组织活检样本中差异性表达的miRNA。有17个miRNA差异性表达，P值＜0.01。与正常同种异体移植物组织活检样本相比，在这17个miRNA中有10个在AR组织活检样本中为低表达(let-7c、miR-10a、miR-10b、miR-125a、miR-200a、miR-30a-3p、miR-30b、miR30c、miR30e-3p和miR-32)，7个为过表达(miR-142-5p、miR-142-3p、miR-155、miR-223、miR-146b、miR-146a和miR-342)(图2和表3)。在P值＜0.05水平上，与正常同种异体移植物组织活检样本相比，在AR组织活检样本中，另有33个miRNA低表达，仅有3个miRNA过表达(图2和表3)。 
表3.人肾脏同种异体移植物中微小RNA的差异性表达* 
Figure BPA00001463276400221
Figure BPA00001463276400231
实施例3：验证能预测肾同种异体移植物状况的微小RNA的特征。利用含有26个肾同种异体移植物组织活检样本(9个AR组织活检样本和17个正常同种异体移植物组织活检样本)的独立组，对经全局表达谱鉴定出的在AR组织活检样本和正常同种异体移植物组织活检样本中差异性表达的miRNA子集进行验证。图3证实，与正常同种异体移植物组织活检样本相比，miRNA在AR组织活检样本中存在差异性表达。与在训练集中观察到的结果一致，miR-142-5p(P＜0.0001)、-155(P＜0.0001)和-223(P＜0.0001)在验证集中的AR组织活检样本中过表达，而miR-10b(P＝0.01)、miR-30a-3p(P＝0.04)和let-7C(P＝0.08)低表达。 
实施例4：移植物内的miRNA水平是肾脏同种异体移植物状况的生物标记物。我们研究了移植物内的miRNA水平是否能够预测AR和肾脏同种异体移植物功能。我们采用接受者操纵特性曲线(ROC)分析miRNA的水平，以确定在预测AR和同种异体移植物的功能时，能够达到最高敏感性和专属性组合的截点。我们的分析结果显示，采用miR-142-5p(敏感性100％，专属性95％，P＜0.0001，表1)或miR-155在移植物内的水平(敏感性100％，专属性95％，P＜0.0001，表1)，能够非常精确地预测AR。采用miR-223、-10b、-30a-3p和let-7c在移植物内的水平也能够诊断AR，但其准确度略低(表1)。 
涉及ROC的分析结果显示，也可以采用T细胞CD3mRNA、B细胞CD20mRNA以及编码肾小管蛋白NKCC-2和USAG-1mRNA在移植物内的水平预测AR，但是与miR-142-5p、-155或-223在移植物内的水平相比，上述预测结果的敏感性和专属性较低(表1)。 
我们考察了移植物内miRNA的水平是否能够预测肾脏同种异体移植物的功能。在对同种异体移植物进行组织活检时，已经采用4参数肾脏病饮食改良(MDRD)公式计算了肾小球滤过率(eFGR)从而对肾脏移植物的功能进行了评估。我们的检测结果显示，miR-142-5p(R＝-0.66，P＜0.0001)、-10b(R＝0.62，P＜0.0001)、-155(R＝-0.59，P＝0.0003)、-223(R＝-0.57，P＝0.0006)、-30a-3p(R＝0.57，P＝0.0006)和let-7c(R＝0.37，P＝0.03)在移植物内的水平与eGFR具有显著的相关性。在已评估的移植物内的mRNA水平中，CD3mRNA(R2＝0.36，P＝0.0002)而非CD20(R2＝0.04，P＝0.25)、NKCC-2(R2＝0.01，P＝0.58)或USAG-1(R2＝0.08，P＝0.21)的mRNA与移植物的功能具有相关性。 
实施例5：AR组织活检样本中miRNA在移植物内的表达水平发生改变的作用机制。图4显示，CD3mRNA在移植物内的水平与miR-142-5p(图4A，R2＝0.72，P＜0.0001)、miR-155(图4B，R2＝0.69，P＜0.0001)或miR-223(图4C，R2＝0.66，P＜0.0001)在移植物内的水平呈现出明显的正相关。我们还发现CD20mRNA在移植物内的水平与miR-142-5p(R2＝0.61，P＜0.0001)、miR-155(R2＝0.55，P＜0.0001)或miR-223(R2＝0.56，P＜0.0001)在移植物内的水平呈现出明显的正相关。而与之相反的是，肾小管NKCC-2mRNA或USAG-1mRNA与miR-142-5p、-155或miR-223之间没有相关性(所有P值均＞0.05)。 
我们考察了AR组织活检样本中低表达的miRNA与移植物内的mRNA水平是否具有相关性。我们发现肾小管特异性NKCC-2mRNA与miR-30a-3p(图4E，R2＝0.53，P＜0.0001)、miR-10b(图4F，R2＝0.36，P＜0.0001)或let-7c(图4G，R2＝0.13，P＝0.04)呈正相关。与NKCC-2类似，肾小管相关USAG-1mRNA水平与移植物内miR-30a-3p(R2＝0.44，P＜0.0001)、miR-10b(R2＝0.35，P＝0.0003)或let-7c(R2＝0.19，P＝0.01)的水平呈正相关。而与之相反的是，CD3mRNA或CD20mRNA在移 植物内的水平与miR-30a-3p、miR-10b或let-7c之间没有相关性(所有P值均＞0.05)。 
为确定AR组织活检样本中miRNA表达的改变是否是因为浸润入移植物的免疫细胞与固有肾实质细胞的相对比例，我们对正常人PBMC和正常HREC中差异性表达miRNA的丰度进行了定量。我们还考察了对PBMC或HREC进行刺激后miRNA的表达水平是否会发生改变。我们的研究结果显示，尽管在PBMC和HREC中，RNU44小核仁miRNA的绝对水平相似(2.0×107±1.2×107vs.2.35×107±1.9×106，P＞0.05)，但是与AR组织活检样本中低表达的miRNA(miR-30a-3p、miR-10b或let-7c)相比，在AR组织活检样本中过表达的miRNA(miR-142-5p、miR-155和miR-223)在正常人PBMC中的表达水平均较高。此外，采用丝裂原植物血凝素(PHA)刺激PBMC后，会使得miR-155的丰度增加(P＝0.0002)，而miR-223(P＝0.02)、let-7c(P＝0.02)或miR-142-5p(P＝0.08)的丰度降低(图5)。H-ras和c-myc为let-7c的作用靶点，采用PHA对PBMC进行活化后，导致c-myc(P＝0.01)和H-ras(P＝0.07)mRNA表达量增加(图5)。 
在HREC原代培养物中对miRNA进行定量，结果显示，miR-30a-3p、miR-10b或let-7c在HREC中的表达水平比在PBMC中高，采用经PHA活化的PBMC的无细胞上清液对HREC进行刺激后，miR-30a-3p的丰度降低(P＝0.02)(图6)。与预期结果一致，采用经PHA活化的PBMC的无细胞上清液对HREC进行活化后，HREC中编码促炎性细胞因子MCP-1、RANTES和IP-10的mRNA的表达量增加(图7)。 
实施例6：肾脏同种异体移植物接受者和组织活检样本。我们考察了来自32位人肾脏同种异体移植物接受者的33个肾脏同种异体移植物的组织活检样本的微小RNA表达类型：12个组织活检样本来自移植物功能异常[平均(±SD)肌酸酐：5.6±3.5mg/dL]的11个供体，根据Banff97分类经组织活检确证为AR[平均年龄(±SD)：38.5±8.6岁，7名男性和4名女性，5名为活体捐赠和6名为尸体捐赠]，以及21个组织活检样本来自同种异体移植物功能稳定的21个供体(肌酸酐：1.3±0.3mg/dL)，同种异体移植物的组织活检结果正常(46.4±11.5岁，8名男性和4名女性，15名为活体移植和6名为尸体移植)。在AR组中，移植后至组织活检的平均(±SE)时间为19.1±7.0个月，在移植物功能稳定和组织活检结果正常组中为6.3±0.9 个月(P＝0.51，Mann-Whitney检验)。受试者的其他信息参见表1以及下文中的讨论部分。 
实施例7：微小RNA的表达谱。采用含有365个成熟人miRNA的TaqMan低密度阵列人微小RNA芯片v1.0(Applied Biosystems)对同种异体移植物组织活检样本的全局miRNA谱进行研究。用TaqMan miRNA实验(Applied Biosystems)，并用我们标准曲线实验方案加以改进，对在AR组织活检样本中与正常同种异体移植物组织活检样本相比存在差异性表达的miRNA进行定量。总RNA纯化、miRNA谱、定量以及数据分析的详细情况见下文。 
实施例8：采用动态定量PCR实验测定移植物内的mRNA的水平。采用实时定量PCR实验对mRNA的表达水平进行定量，详细情况见下文。引物和探针序列参见下表4。 
表4.采用实时定量聚合酶链式反应实验对mRNA进行定量时使用的寡核苷酸引物和探针 
Figure BPA00001463276400261
实施例9：细胞培养。采用外周血单核细胞和正常人肾上皮细胞进行体外研究，步骤详见下文。 
实施例10：人肾脏同种异体移植物的组织活检样本的分类。采用经皮芯针抽吸组织活检，将肾脏组织活检样本用福尔马林固定，进行石蜡包埋，再对其进行苏木素和伊红染色、过碘酸-Schiff染色以及Masson三色染色，由病理学家在对分子研究结果处于盲态的情况下依据Banff97分类对染色结果进行分析。免疫抑制剂由基于钙调神经磷酸酶抑制剂的方案组成，急性排斥反应采用的初始治疗药物为甲基泼尼松。本研究由威尔康奈尔医学院的机构审查委员会批准，且各患者均已签署知情同意书。 
实施例11：微小RNA的全局表达谱。将同种异体移植物组织活检样本置于RNAlater(Ambion)中，于-80℃条件下保存，直到进行RNA提取。采用mirVanamiRNA分离试剂盒(Ambion)依照生产厂商的说明提取总RNA。使用NanoDrop ND-1000型分光光度计(Nanodrop Technologies)测定RNA的收率和纯度，使用RNA6000Nano LabChip试剂盒(Agilent Technologies)评估RNA的完整性。我们采用TaqMan低密度阵列人微小RNA芯片v1.0(Applied Biosystems)确定同种异体移植物组织活检样本的miRNA全局谱，该芯片为384孔徽流控芯片，其中含有365个不同的人miRNA的探针和引物，以及2个小核仁RNA，用于对数据进行归一化处理的内源性对照。对三个急性排斥反应(AR)组织活检样本和4个正常肾脏同种异体移植物组织活检样本测定全局的miRNA基因表达类型(7个组织活检样本，训练集)。采用适用于TaqMan阵列人微小RNA芯片v1.0的TaqMan Multiplex RT对总RNA(480ng)进行逆转录。使用水将各RT反应体系稀释62.5倍，各稀释产物分别取55μL，与55μL TaqMan 2X Universal PCR Master Mix(无AmpErase UNG)混合。对各Multiplex混合物，取100微升样品/预混反应试剂，分别加入微流控芯片的样品孔中，随后将该阵列离心，使用Applied Biosystems密封设备进行机械密封。在生产厂商推荐的循环条件下，采用Applied BioSystems 7900HT型温度循环仪进行定量PCR检测。利用内源性对照RNU44小核仁RNA对各miRNA的变化倍数进行归一化处理。以对照样品(正常)作为参比点，采用比较delta CT(阈循环数)法，计算各样品之间的相对表达水平。 
实施例12：TaqMan低密度阵列分析。采用SDS软件2.3版进行数据分析，自动设定基线值和阈值。对数据进行归一化处理后，再对其进行分析，以定义在AR组织活检样本和正常操作组织活检样本之间存在差异性表达的基因。将CT值＞35的实验从分析中剔除。采用RNU44作为内源性对照计算delta CT值。利用无监督聚类分析法 和主成分分析(PCA)确定数据集中的样本类型，而无须预先对样本分类。应用聚类程序和Java Tree View 1.0.12软件进行类平均法聚类分析。应用xlstat软件进行PCA。使用Applied Biosystem’s ABqPCR数据分析工具对数据进行分析(Applied Biosystems，个人通信)。利用Student t检验检测AR样品与正常组织活检样本之间存在差异性表达的miRNA。 
实施例13：微小RNA的定量。利用TaqMan低密度阵列对另外9份AR样品和另外17份正常同种异体移植物组织活检样本(26个组织活检样本，验证集)进行Taq-Man miRNA检测(Applied Biosystems)，以确定与正常同种异体移植物组织活检样本相比，AR组织活检样本中存在差异性表达的miRNA。TaqMan miRNA实验也可以在体外实验中对miRNA定量。采用TaqMan微小RNA逆转录试剂盒对各miRNA进行逆转录(Applied Biosystems)。简言之，对总RNA样本进行逆转录获得cDNA，采用TaqMan微小RNA逆转录实验中的特异性的miRNA引物(Applied Biosystems)，试剂来自TaqMan微小RNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)。各逆转录反应系统由7μL预混反应试剂、3μL miRNA-特异性引物和5μL浓度为1ng/μL的总RNA稀释物组成。在Veriti温度循环仪(Applied Biosystems)中完成逆转录反应，采用以下参数值：16℃30分钟，42℃30分钟，以及85℃5分钟。用TaqMan微小RNA实验(Applied Biosystems)从cDNA样本扩增得到PCR产物。各样品进行PCR检测时均设为双复管，反应体系为20-μL反应体积，采用1μL 20XTaqMan miRNA实验(AppliedBiosystems)，包含miRNA特异性正向PCR引物、特异性反向PCR引物以及miRNA特异性TaqMan MGB探针的混合物，TaqMan Universal PCR MasterMix以及1.5μL cDNA。利用一个合成扩增子得到标准曲线(见下文)并将TaqMan CT值转化为绝对拷贝数。参见N Engl J Med 358：353-361。采用RNU44小核仁RNA的拷贝数对miRNA的拷贝数进行归一化处理，miRNA的丰度以miRNA拷贝数与RNU44拷贝数的比率表示(1μg RNA中的miRNA拷贝数/1μgRNA中的RNU44小核仁RNA拷贝数)。使用ABI Prism 7500实时PCR系统进行TaqMan微小RNA实验。 
实施例14：信使RNA的定量。利用ABI Prism 7500型快速检测系统(Applied Biosystems)测定mRNA的水平。各样品进行PCR检测时均设为双复管，反应体系为20-μL反应体积，使用10μL TaqMan Universal PCR Master Mix、2.5μL预扩增模板 cDNA、0.15μL引物(正义链和反义链引物，各50μM，表4中列出了寡核苷酸引物和探针)、0.05μL探针(100μM)以及7.34μL水。PCR扩增方案为初始在95℃保持20秒后，进行40个循环，包括95℃变性3秒、60℃引物退火以及延伸各30秒。采用我们的标准曲线法(见下文)计算转录水平，利用18D rRNA的拷贝数对mRNA的拷贝数进行归一化处理(1μg RNA中mRNA的拷贝数/1ng RNA中18S rRNA的拷贝数)。 
实施例15：mRNA和miRNA的绝对定量方法。采用我们已描述过的标准曲线法计算RNA的水平(mRNA和miRNA)，见Kawai T，et al.(2008)HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.N Engl J Med 358：353-361，在此参考并入。利用PCR获得的73-bp小鼠Bak扩增子作为标准品，建立标准曲线。利用GeneAmp 9600型温度循环仪，使用3μL cDNA和22μL dNTP、10μPCR缓冲液、TaqDNA聚合酶以及Bak特异性寡核苷酸引物对[正义链引物：5’CCCACATCTGGAGCAGAGTCA 3’(192-212)(SEQ ID NO：84)；反义链引物：5’CAGATGCCATTTTTCAGGTCTTG 3’(264-242)(SEQ ID NO：85)，序列号Y13231]通过PCR制备Bak扩增子。使用2％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，利用pUC混合标准分子量8(Crystalgen)作为DNA尺寸标准，确证扩增子的尺寸(73bp)。使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN)从凝胶中分离和纯化Bak扩增子。在A260条件下对已纯化扩增子进行绝对定量，并利用DNA的分子量将其转化为拷贝数。将Bak扩增子稀释至浓度为107个拷贝/μL(储备液)。当建立适用于实时定量PCR检测的标准曲线时，将储备液稀释6个数量级(1,000,000、100,000、10,000、1,000、100以及10个拷贝每1μL)(工作液)。将工作液(2.5μL)加入双复孔，使用Bak特异性引物对和Bak特异性荧光TaqMan探针[5’FAMCAGGTGACAAGTGACGGTGGTCTCCA TAMRA 3’(215-240)(SEQ ID NO：86)]进行扩增。随后，将阈值循环(CT)对Bak扩增子初始量的对数值作图，建立标准曲线。阈值见于PCR的对数期，Bak扩增子的初始拷贝数越高，CT值越低。 
实施例16：正常人外周血单核细胞的分离以及采用植物凝集素的活化处理。7名健康志愿者的全血经标准Ficoll密度梯度离心，获得外周血单核细胞(PBMC)。在含有5％(体积/体积)热灭活FCS、青霉素(100U/mL)、硫酸链霉素(100μg/mL)以及L-谷氨酰胺(4mM)的RPMI 1640(Gibco BRL)中，将PBMC重悬至密度为 106个细胞/mL。在不含或含有终浓度为2μg/mL的植物凝集素(PHA)(Remel)的条件下培养PBMC(106/mL)。将细胞在37℃、5％CO2湿润环境下培养24、48或72小时，随后回收细胞，使用PBS洗涤两次，离心收集细胞团。将mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion)中的600徽升裂解/结合缓冲液直接加入细胞团中。将裂解产物置于-80℃条件下保存或立即采用生产厂商推荐的总RNA分离实验方案提取总RNA。离心收集含有或不含2μg/mL PHA的PBMC无细胞上清液，将其浓缩(Amicon，Millipore)后用于人肾上皮细胞的体外研究。 
实施例17：人肾上皮细胞的培养。正常人肾小管上皮细胞(HREC)取自因肾细胞癌而取出的肾切除标本，利用此前已公开的方法分离细胞，仅对方法稍作改动。将无瘤肾皮质碎片剪碎，并用胶原酶IV(250IU/mL)在37℃条件下消化3小时。将细胞离心，使用PBS洗涤沉淀3次。隧后，在经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养细胞，培养基中含有5μg/mL胰岛素、10μg/mL人转铁蛋白、500ng/mL氢化可的松、10ng/mL EGF、6.5ng/mL三碘甲状腺原氨酸、5ng/mL亚硒酸钠、1％FCS、25IU/mL青霉素、25μg/mL链霉素以及10mM Hepes缓冲液。随后将HREC在37℃条件下，5％CO2和95％空气环境中培养。我们此前已经公开发表了该细胞模型的特征，经确证绝大多数培养物均为肾小管上皮细胞。未使用超过3代以上的HREC进行此项实验。当HREC汇合生长至80％时收集细胞，将其接种于60mm培养皿中，接种密度为3×105个细胞/皿。当细胞汇合生长至50％时，在其中加入不同量的含有或不含2μg/mL PHA的浓缩PBMC无细胞上清液。在37℃、5％CO2-95％空气湿润环境中培养24或48小时后，回收HREC，用PBS洗涤两次。将mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion)中的600微升裂解/结合缓冲液直接加入培养板中裂解细胞。使用无菌细胞刮人工收集裂解产物并将其转移至1.5mL样品管中。将样品在-80℃条件下保存或立即采用生产厂商推荐的总RNA分离试验方案提取总RNA。 
实施例18：统计学分析。我们采用传统的接受者操纵特性(ROC)曲线分析mRNA和miRNA的水平，以确定在区分急性排斥反应的受试者和同种异体移植物功能稳定和组织活检结果正常的受试者时，能够达到最高敏感性和专属性组合的截点。我们计算了曲线下面积(AUC)和AUC的95％置信区间。采用皮尔森回归法分析mRNA与miRNA在移植物内的水平之间的相关性，也采用皮尔森回归法分析了miRNA或mRNA在移植物内的水平与肾脏同种异体移植物功能之间的相关性。除另 有说明外，所有数据均以平均值±SE表示。采用Student t检验或配对t检验来检验统计学显著性。 
实施例19：基于上述内容，我们发现，可以利用移植物内的miRNA谱来区分人同种异体移植物出现AR的患者与同种异体移植物组织活检结果正常的患者，且通过检测移植物内的miRNA可以高度准确地诊断AR。此外，miRNA谱还能够预测肾脏同种异体植物的功能。我们的观察结果支持下述假设，即移植物内miRNA的表达类型可以作为检测人肾脏同种异体移植物状况的生物标记物。 
我们采用2步法来开发可预测AR的miRNA的特征。首先，我们在7个分类为AR或正常的人肾脏同种异体移植物组织活检样本中确定了365个成熟人miRNA在移植物内的表达类型。全局表达谱鉴定出在AR组织活检样本与在正常组织活检样本中存在差异性表达的miRNA(图1和图2)。在第二步中，采用改良的TaqMan miRNA实验，我们确定了另外26个肾脏同种异体移植物组织活检样本中miRNA的绝对拷贝数(图3)。我们的方法揭示，移植物内的miR-142-5p、-155、-223、-10b、-30a-3p和let-7c的水平能够用于诊断AR，其中miR-142-5p、miR-155和miR-223的每一个都能以＞90％敏感性和专属性预测AR(表1)。移植物内CD3、CD20、NKCC-2和USAG-1的水平也能够用于诊断AR，但其敏感性和专属性较低。 
移植物内miR-142-5p、-155、-223、-10b、-30a-3p和let-7c的水平均能够预测肾脏移植物的功能，其中miR-142-5p和miR-10b与移植物的功能具有的相关性最强。在分析的mRNA中，CD3的mRNA，而非CD20、NKCC-2和USAG-1的mRNA，能够预测移植物的功能，但与miR-142-5p或miR-10b相比，CD3mRNA与移植物功能之间的相关性较弱。我们发现，移植物内的miRNA的表达类型能够预测同种异体移植物的状况，结合现有资料已知的miRNA较为稳定，丰度较高并且可以在福尔马林固定的组织中检测的特点，将该理念进一步推进，即miRNA的表达类型具有被开发成一种临床移植生物标记物的价值。 
与正常同种异体移植物组织活检样本相比，在AR组织活检样本中的水平较高的那些miRNA可能在先天性和获得性免疫中具有重要作用。我们的体外研究结果显示，采用多克隆T-细胞丝裂原PHA活化正常人PBMC后，能够增加miR-155的表达。 
与正常同种异体移植物组织活检样本相比，AR样品中miR-146在移植物内的水平较高。miR-146在天然T细胞中的表达水平较低，在Th1细胞而非Th2细胞中表达水平上调，并被认为是属于Th1-特异性miRNA。我们发现，与正常同种异体移植物组织活检样本相比，在AR组织活检样本中，移植物内的1型细胞因子IFN-γmRNA的水平升高，而Th2细胞因子IL-4mRNA水平并未升高，该结果表明在出现排斥的人肾脏同种异体移植物中产生Th1型细胞浸润(图8)。 
在AR组织活检样本中过表达的miRNA中，miR-223的水平最高。我们还发现在正常人PBMC中，miR-223的丰度比miR-142-5p或miR-155高，且PBMC经PHA活化后导致miR-223的表达水平降低。 
与正常同种异体移植物组织活检样本相比，在AR组织活检样本中移植物内的miR-142的水平也较高。我们发现PBMC经活化后，导致PBMC中miR-142的表达水平降低，虽然该差异不具有统计学显著性(P＝0.08)。 
还通过比较出现排斥反应的同种异体移植物与组织活检结果正常的同种异体植物中miRNA的低表达，确定人肾脏同种异体移植物的急性排斥反应。事实上，在AR组织活检样本与正常组织活检样本之间出现差异性表达的53个miRNA中，有43个在AR组织活检样本中为低表达，仅有10个为过表达(图2)。 
let-7家族中有两个成员(let-7a和let-7c)在AR组织活检样本中低表达。我们的研究结果显示，在经PHA活化的PBMC中，let-7c下调(图5D和E)，H-ras和c-myc的mRNA均上调(图5F-I)。但是，在活化24小时后未观察到let-7c的表达量降低，在48小时后较为明显，而在活化24小时后就观察到H-ras和c-myc的最大上调量(图5H和I)。由此可见，在正常人PBMC中，let-7c的下调并不一定是H-ras或c-myc上调的绝对先决条件。 
与正常同种异体移植物组织活检样本相比，在AR组织活检样本中miR-30a-3p和miR-10b均为低表达(图3)。这些miRNA在HREC中的丰度比在PBMC中高，促炎性趋化因子MCP-1、RANTES和IP-10表达量的增加表明HREC被活化，该活化与miR-30a-3p表达量降低有关(图6)。 
实施例20：尿细胞中miRNA 155的水平用于诊断急性排斥反应。从肾同种异体移植接受者的尿细胞中分离包含miRNA的总RNA，采用实时定量PCR测定RNU44(管家基因)和miRNA 155的水平。与移植物功能稳定和组织活检结果正常患者的尿液相比(n＝13个样本)，在组织活检样本分类为急性排斥反应患者的尿液中(n＝3个样本)，尿细胞中miRNA 155的水平显著升高，而RNU 44未出现升高。 
Figure DEST_PATH_GSB00000721778600011
Figure DEST_PATH_GSB00000721778600031
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Claims (39)

1.一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法，这种方法包括：
(a)测定所述患者的生物样本中非编码标记小RNA的表达量，所述非编码小RNA选自下组：SEQ ID NOs：1-9及其组合，以及
(b)比较步骤(a)中测得的表达量与所述非编码标记小RNA的参考表达量；其中，与所述非编码标记小RNA的参考表达量相比，所述非编码标记小RNA表达量升高至少1倍时，提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-142-5pCAUAAAGUAGAAAGCACUAC(SEQ ID NO：1)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-142-3pUGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA(SEQ ID NO：2)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-155UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG(SEQ ID NO：3)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-146aUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU(SEQ ID NO：4)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-146bUGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU(SEQ ID NO：5)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-342UCUCACACAGAAAUCGCACCCGUC(SEQ ID NO：6)。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-650AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC(SEQ ID NO：7)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-21UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO：8)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-425-5pAAUGACACGAUCACUCCCGUUGA(SEQ ID NO：9)。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述排斥反应的风险增加约10％至约100％。
12.一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法，这种方法包括：
(a)测定所述患者的生物样本中非编码标记小RNA的表达量，所述非编码小RNA选自下组：SEQ ID NOs：10-49及其组合，以及
(b)比较步骤(a)中测得的表达量与所述非编码标记小RNA的参考表达量；
其中，与所述非编码标记小RNA的参考表达量相比，所述非编码标记小RNA表达量升高小于1倍时，提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-10aUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-10bUACCCUGUAGAACCGAAUUUGU。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-30a-3pCUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-30bUGUAAACAUCCUACACUCAGCU。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-30cUGUAAACAUCCUACACUCUCAGC。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-30e-3pCUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述非编码标记小RNA为miR-32UAUUGCACAUUACUAAGUUGC。
20.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述生物样本为尿样。
21.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述移植器官为肾脏。
22.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述移植器官为心脏。
23.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述移植器官为肝脏。
24.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述移植器官为肺。
25.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述移植器官为胰腺。
26.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述移植器官为胰岛。
27.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述移植器官为肠。
28.根据权利要求1或12所述的方法，其进一步包含告知所述患者其是否具有增加或降低的器官排斥反应的风险。
29.根据权利要求1或12所述的方法，其进一步包括对器官排斥反应风险增加的患者开具治疗处方，以降低其器官排斥反应的风险。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述治疗包括能够降低器官排斥反应风险的有效量的药物组合物。
31.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述参考量通过测定带有非排斥器官的人体中所述非编码标记小RNA的表达量而获得。
32.根据权利要求1或12所述的方法，其中所述参考量通过测定所述患者的另外一份生物样本中所述非编码标记小RNA的表达量而获得。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述另外一份生物样本来自所述患者的另外一个器官。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述器官为非移植器官或非排斥的移植器官。
35.根据权利要求1或12所述的方法，其进一步包括：
(c)测定所述生物样本中所述非编码标记小RNA的表达量与所述非编码标记小RNA的参考表达量之间的差异；
(d)测定所述患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；
(e)测定所述患者的所述生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量与所述内源性非编码参比小RNA的参考表达量之间的差异；
(f)比较步骤(c)中的差异与步骤(e)中的差异，
其中当步骤(c)中的差异大于步骤(d)中的差异时，进一步提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
36.一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法，这种方法包括：
(a)测定所述患者的生物样本中非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自下组：SEQ ID NOs：1-9或其组合；
(b)测定所述患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；
(c)比较步骤(a)的测定结果与步骤(b)的测定结果，以确定第一个比率；
(d)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中所述非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自下组：SEQ ID NOs：1-9或其组合；
(e)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；以及
(f)比较步骤(d)的测定结果与步骤(e)的测定结果，以确定第二个比率；
其中计算得到所述第一个比率比所述第二个比率高至少1倍时，提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
37.一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法，这种方法包括：
(a)测定所述患者的生物样本中非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自下组：SEQ ID NOs：10-49或其组合；
(b)测定所述患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；
(c)比较步骤(a)的测定结果与步骤(b)的测定结果，以确定第一个比率；
(d)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中所述非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自下组：SEQ ID NOs：10-49或其组合；
(e)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；以及
(f)比较步骤(d)的测定结果与步骤(e)的测定结果，以确定第二个比率；
其中计算得到所述第一个比率比所述第二个比率升高至少小于1倍时，提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
38.一种用于对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)至少一种与选自SEQ ID NO：1-49s或其变体的非编码标记小RNA互补的核酸分子，以及
(b)一种用于测定生物样本中非编码标记小RNA表达量的方式。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述方式包括定量聚合酶链式反应。
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