CN1654637A

CN1654637A - 一种干扰性rna逆转录病毒及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN1654637A
Application number: CN 200510008449
Authority: CN
Inventors: 田文志
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-02-21
Filing date: 2005-02-21
Publication date: 2005-08-17

Abstract

本发明公开了一种干扰性RNA逆转录病毒，它是一种通过将白血病或爱滋病的致病基因的干扰性RNA装入所构建的逆转录病毒载体而制成的干扰性RNA逆转录病毒。它通过利用所述病毒去感染靶基因提供者的骨髓细胞或干细胞，再将受感染的细胞回输到靶基因提供者体内，因重建后的白细胞缺乏致病基因而达到治愈白血病或爱滋病。本发明应用现代生物高科技，结合骨髓移植手术，将相关的致病基因予以灭活，从而达到治愈疾病的目的。本发明技术含量高，产品的特异性强。另外，由于用于骨髓移植的细胞来自于病人本身，这样就避免了移植排斥的后遗症。

Description

一种干扰性RNA逆转录病毒及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种干扰性RNA逆转录病毒及其制备方法和用途。

背景技术

白血病及爱滋病均系血细胞系统的疾病。前者系基因异常所导致的幼稚白细胞持续不断地增殖。病人因缺乏正常数量的成熟白细胞而失去正常的抵抗力，同时因大量的幼稚细胞遍布全身，使得病人反复感染，缺血，最后死于器官衰竭。而爱滋病系由爱滋病毒(HIV)感染人体免疫细胞所致。人体免疫细胞具有HIV的受体(如CD4，CCR5，CXCR4)。经与这些受体结合，HIV得以侵入免疫细胞并在细胞内大量繁殖，最终将细胞破坏掉。病人因此而患有严重的免疫缺陷，最终死于重症感染或器官衰竭。到目前为止，由于种种原因还没有一种治疗方法能彻底治愈白血病及爱滋病，这种状况给病人及其家属带来了极大的灾难，给国家带来了巨大的损失。

发明内容

本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种干扰性RNA逆转录病毒及其制备方法和用途，将该病毒用于治疗白血病及爱滋病。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

本发明干扰性RNA逆转录病毒，它是一种通过将白血病或爱滋病的致病基因的干扰性RNA装入所构建的逆转录病毒载体而制成的干扰性RNA逆转录病毒。逆转录病毒载体含有启动干扰性RNA表达的U6启动子.干扰性RNA必须装在U6启动子的下游。

本发明还提供了一种制备所述的干扰性RNA逆转录病毒方法，它包括下列步骤：

1)、构建表达干扰性RNA的逆转录病毒载体；

2)、检测干扰性RNA对靶基因的干扰活性；

3)、逆转录病毒的制备。

本发明制备方法中所述靶基因为白血病或爱滋病的致病基因。

本发明制备方法中所述检测干扰性RNA对靶基因的干扰活性的方法包括用瞬时转染法或用流式细胞仪或Western杂交法。

本发明同时提供一种所述干扰性RNA逆转录病毒的用途，它是通过利用所述病毒去感染靶基因提供者的骨髓细胞或干细胞，再将受感染的细胞回输到靶基因提供者体内，因重建后的白细胞缺乏致病基因而达到治愈白血病或爱滋病。

以一种新基因OCILRP2做为靶基因，通过构建表达干扰性RNA的逆转录病毒载体，并用由此而制成的逆转录病毒去感染小鼠的骨髓细胞，再将感染的骨髓细胞移植到经放射线照射的受体小鼠。一到两个月后，检测供体骨髓细胞在小鼠各免疫器官的重建水平。同时，检测靶基因OCILRP2的表达及由此表达的变化所引起的免疫细胞的功能改变。实验表明，通过结合基因干扰及骨髓移植技术，可在体内干扰靶基因OCILRP2的表达。OCILRP2表达的缺失，导致T淋巴细胞功能的改变，从而影响其发挥正常的免疫功能。据此把针对白血病(如CML)或爱滋病的相关基因的干扰性RNA装入所构建的逆转录病毒载体，利用该病毒去感染患者的骨髓细胞或干细胞，再将受感染的细胞回输到患者体内。重建后患者的白细胞因缺乏致病基因而达到治愈的效果。

本发明应用现代生物高科技，结合骨髓移植手术，将相关的致病基因予以灭活，从而达到治愈疾病的目的。本发明技术含量高，产品的特异性强。另外，由于用于骨髓移植的细胞来自于病人本身，这样就避免了移植排斥的后遗症。

附图说明

图1构建表达干扰性RNA的质粒。

图2用瞬时转染法检测干扰性RNA对靶基因表达的干扰活性。

图3用流式细胞仪或Western杂交法检测干扰性RNA对靶基因表达的干扰活性。

图4制备逆转录病毒。

图5感染骨髓细胞及骨髓移植。

图6骨髓移植后细胞在体内的重建。

图7干扰性RNA在体内对靶基因表达的干扰活性。

图8干扰靶基因表达可阻断其功能。

图9干扰靶基因表达可阻断其功能。

具体实施方式

1、构建表达干扰性RNA的逆转录病毒载体

将小鼠的U6启动子的DNA序列装入一种逆转录病毒载体，将BCR/ABL(慢性粒细胞白血病)或CCR5(HIV受体)的干扰性RNA装在U6启动子的下游，即构成了用于表达干扰性RNA的逆转录病毒载体，如图1所示。在该载体内，还含有表达绿色蛋白的基因序列。因而可用作检测细胞转染或病毒感染效率的指标。

2、检测干扰性RNA对靶基因的干扰活性

用瞬时转染的方法，将表达OCILRP2的质粒载体与表达干扰性RNA的逆转录病毒载体共转染293F细胞系如图2所示，48小时以后，收集细胞，用流式细胞仪检测带有红色荧光的靶基因的表达如图3上所示。或用Western杂交检测靶基因的表达如图3所示。实验结果表明，两种表达OCILRP2的质粒载体经与表达干扰性RNA的逆转录病毒载体共转染后，均不能表达靶基因OCILRP2。因此，构建的表达干扰性RNA的逆转录病毒载体是成功的。

3、逆转录病毒的制备

如图4所示，将表达干扰性RNA的逆转录病毒载体与表达病毒包膜蛋白及病毒扩增蛋白的病毒包装载体一起共转染病毒包装细胞(293T)，感染后48至72小时，收集细胞培养上清。该上清内即含有所制备的逆转录病毒。经检测病毒滴度后，达到足够高的病毒滴度(5×107/ml)，即可用该病毒感染骨髓细胞。

4、骨髓细胞的感染及骨髓移植

供体小鼠的骨髓干细胞经细胞因子刺激24小时以后，加入逆转录病毒，再培养48小时.然后收集细胞，经洗涤后溶于PBS缓冲液内。最后将细胞经尾静脉注射进受体小鼠体内，如图5所示。一到两个月后，杀死小鼠，从各免疫器官提取免疫细胞，检测免疫细胞表达绿色蛋白的阳性率。如图6所示，一个月以后，绿色蛋白的阳性率最高可达到70％以上。表明供体小鼠的骨髓干细胞可成功地在受体小鼠体内得以重建。

5、干扰性RNA在体内可阻断靶基因的表达

为检测OCILRP2的表达，可用三种不同的方法：RT-PCR、Western杂交、及流式细胞仪，分别检测OCILRP2在RNA水平，蛋白水平，及细胞膜表面的表达。如图7所示，带有干扰性RNA的实验组，OCILRP2的表达水平明现低于对照组。如果去除绿色蛋白阴性细胞，可发现OCILRP2在绿色蛋白阳性细胞的表达已被完全阻断如图7所示。因而实验表明，将基因干扰技术与骨髓移植技术有机结合起来，即可在体内阻断靶基因的表达。

6、干扰靶基因的表达可阻断其功能

为检测基因干扰后的功能变化，将T淋巴细胞分别从两组小鼠的脾脏中提取出来，在体外分别用不同的刺激剂进行刺激，24到48小时后检测T细胞的增殖情况以及IL-2的表达水平。用流式细胞仪分析这两种指标在绿色蛋白阳性细胞中的变化。结果表明，阻断OCILRP2的表达，严重影响了T细胞的增殖如图8及对IL-2的表达如图9。

Claims

1、一种干扰性RNA逆转录病毒，其特征在于它是一种通过将白血病或爱滋病的致病基因的干扰性RNA装入所构建的逆转录病毒载体而制成的干扰性RNA逆转录病毒，逆转录病毒载体含有启动干扰性RNA表达的U6启动子.干扰性RNA必须装在U6启动子的下游。

2、一种制备如权利要求1所述的干扰性RNA逆转录病毒方法，其特征在于它包括下列步骤：

1)、构建表达干扰性RNA的逆转录病毒载体；

2)、检测干扰性RNA对靶基因的干扰活性；

3)、逆转录病毒的制备。

3、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述靶基因为白血病或爱滋病的致病基因。

4、如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于所述检测干扰性RNA对靶基因的干扰活性的方法包括用瞬时转染法或用流式细胞仪或Western杂交法。

5、如权利要求1所述干扰性RNA逆转录病毒的用途，其特征在于它是通过利用所述病毒去感染靶基因提供者的骨髓细胞或干细胞，再将受感染的细胞回输到靶基因提供者体内，因重建后的白细胞缺乏致病基因而达到治愈白血病或爱滋病。