CN114292810B - 含有IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15中至少两种的细胞因子组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含有IFN‑γ，IL1β，IL6，IL10，IL15中至少两种的细胞因子组合物，涉及生物医学技术领域。本发明提供的细胞因子组合物中包含IFN‑γ，IL1β，IL6，IL10，IL15至少两种细胞因子；本发明还提供所述的细胞因子组合物在体外培养抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞的用途。该培养基含有所述的细胞因子组合物及基础培养基。本发明还提供含有所述的细胞因子组合物的培养基培养得到的抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞，具有更好的抗病毒性肺炎活性，可用于治疗病毒性肺炎引起的免疫炎症反应，降低炎症反应对肺部组织的破坏；具体表现在：具有增殖速度更快，免疫调节因子IDO、PGE2、TGF‑β的表达增加、对T细胞的抑制能力更优。

Description

含有IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15中至少两种的细胞因子组 合物

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及含有IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15中至少两种的细胞因子组合物。

背景技术

病毒性呼吸系统疾病是近年来高发的传染性疾病，如：2003年，由SARS病毒引起的非典型肺炎开始在我国广东爆发，发病迅速、传播快、致死率高，伴随高热及呼吸窘迫，对肺部伤害极大，且患者经过治疗后一般有不同程度的后遗症。甲型H1N1流感病毒自世界卫生组织于2009年首次宣布为引起急性呼吸系统传染性疾病的病原体起，因为宿主范围广、发病迅速，发病率较高，曾多次在世界范围内引起暴发和流行。2017年末及2018年开始，我国多地相继出现甲型H1N1病毒性肺炎患者，特别是重症肺炎患者，临床表现为迅速进展的间质性肺炎，严重者短期内可出现急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及多器官功能障碍，病死率较高；特别是自2019年年底开始，新冠病毒肆虐全球，由新冠病毒引起的病毒性肺炎更是引起了世界各国医药界的关注。疾病进程较快，有基础性疾病的患者在感染新冠病毒后，容易发展为重型病毒性肺炎并导致急性呼吸窘迫综合征，体内细胞因子风暴等。

目前针对病毒性肺炎的治疗手段，临床一般采取支持治疗、抗病毒治疗、免疫治疗、糖皮质激素治疗为主，而对重症、危重症患者采取呼吸支持、防治并发症等。可以预见的是，在目前治疗手段中，对于重型、危重型病毒性肺炎患者，特别是正在流行的新冠病毒性肺炎患者来说，临床治疗手段相对常规，应对相关并发症时也往往以支持治疗为主。而当发生由病毒引起的体内细胞因子风暴时，往往治疗手段相对匮乏，仅能以支持治疗为主，依靠患者自身痊愈。在新冠病毒性肺炎研究过程中，有研究者提出使用间充质干细胞进行治疗及预防重型、危重型病程的发生，均取得较好的效果，但是不同患者在使用间充质干细胞进行治疗的效果差异较大，疗效无法稳定体现的问题也依旧存在，而导致这种问题的产生是由于间充质干细胞的天然特性带来的。

间充质干细胞是一类具有自我更新、自我复制、多向分化能力的干细胞，除了在组织器官修复上有一定的临床研究价值外，因为其低免疫原性及较好的免疫抑制功能被广泛的应用在相关免疫性疾病的临床治疗中。间充质干细胞可以通过旁分泌的方式，抑制体内细胞炎症因子激活的免疫细胞，减少炎症反应，降低机体内发生细胞因子风暴的风险。但是，普通间充质干细胞并不是均一的，分离获取的间充质干细胞内天然存在多个功能亚群，其性质和免疫抑制特性并不完全相同。而间充质干细胞发挥特定的免疫抑制功能，往往是在输注到机体内后，受到机体内微环境细胞因子刺激后，开始发挥特定的免疫抑制效果。而有研究者亦证明了在受到特定细胞因子刺激后，普通间充质干细胞可以朝向特定功能亚群分化，细胞亚群会呈现均一化的特点。基于上述特点，开发特定功能亚群的间充质干细胞作为精准医学治疗手段具有一定的可行性。但间充质干细胞在受到不同因子刺激后所能产生生物学变化并不明确，并不能完全契合临床治疗需求，可见，此技术有待进一步的开发，相关因子和/或因子组合物对间充质干细胞的刺激方法及其产物有待明确。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是背景技术中提到的不足，结合病毒性肺炎患者发病进程中机体内环境细胞因子的表达特点，研发利用间充质干细胞作为病毒性肺炎治疗药物。

本发明的目的在于提供一种细胞因子组合物，该组合物中包含IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15至少两种细胞因子。

本发明的另一目的在于提供包含IFN-γ、IL1β、IL6、IL10、IL15至少两种细胞因子组合物的培养基，以进行间充质干细胞的培养。

本发明的再一目的在于提供由上述培养基培养得到的间充质干细胞用于制备治疗病毒性肺炎药物、细胞制剂。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种细胞因子组合物，该组合物中包含IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15至少两种细胞因子。

其进一步的技术方案为，该细胞因子组合物中包含IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15至少三种细胞因子。

其进一步的技术方案为，该细胞因子组合物中包含IL6、IL10及IL15，或者，该细胞因子组合物中包含IFN-γ、IL1β及IL15。

本发明提供所述的细胞因子组合物在体外培养抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞的用途。

具体地，利用包含IFN-γ、IL1β、IL6、IL10、IL15至少两种细胞因子的上述细胞因子组合物预处理的间充质干细胞的生产方法，包括包含IFN-γ、IL1β、IL6、IL10、IL15至少两种细胞因子的细胞因子组合物培养间充质干细胞的步骤。

具体地，所述的人间充质干细胞，其来源包含骨髓、脂肪、胎盘、脐带、牙髓等不同人体组织来源的间充质干细胞，优选地，使用人脐带间充质干细胞。

第二方面，本发明提供一种用于培养抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞的培养基，包括第一方面所述的细胞因子组合物及基础培养基。

具体地，所述基础培养基为通常使用于培养哺乳动物细胞的任一培养基，如：可使用达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基和F12的混合物(DMEM/F12)、RPMI 1640等等。

具体地，所述的细胞因子组合物在培养基中的浓度分别为：所述IFN-γ浓度为1ng/ml至150ng/ml；IL1β浓度为1ng/ml至100ng/ml；IL6浓度为10ng/ml至80ng/ml；IL10浓度为20ng/ml至100ng/ml；IL15浓度为10ng/ml至150ng/ml。

其进一步的技术方案为，对于包含IL6、IL10及IL15的细胞因子组合物，在培养基中的优选浓度为20ng/ml IL6、25ng/ml IL10、20ng/ml IL15；对于包含IFN-γ、IL1β及IL15的细胞因子组合物，在培养基中的优选浓度为20ng/ml IFN-γ、10ng/ml IL1β、20ng/mlIL15。

第三方面，本发明还提供一种抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞的培养方法，在其中至少一个步骤中将人间充质干细胞与第二方面所述的培养基相接触。

具体地，所述人间充质干细胞与所述培养基的接触培养时间为8-24小时，优选10-18小时。

更具体地，使用包含IL6、IL10及IL15的细胞因子组合物进行培养时，优选接触培养时间为14小时；使用包含IFN-γ、IL1β及IL15的细胞因子组合物进行培养时，优选接触培养时间为12小时。

本发明还提供由所述的培养方法得到的抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞在制备治疗病毒性肺炎药物、细胞制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

本发明提供的细胞因子组合物是根据病毒性肺炎患者发病进程中机体内环境细胞因子的表达特点筛选出来的，可刺激人间充质干细胞在针对病毒性肺炎上具有更好的抗炎症活性。

经本发明培养方法获得的人间充质干细胞在单细胞测序数据上的细胞生物学特性与常规培养方法获得的人间充质干细胞存在明显区别。

相比常规培养方法获得的人间充质干细胞，经本发明培养方法获得的人间充质干细胞可以有更好的抗病毒性肺炎活性，以用于治疗病毒性肺炎引起的免疫炎症反应，降低炎症反应对肺部组织的破坏，缓解疾病进展速度；具体表现在：具有增殖速度更快，免疫调节因子IDO、PGE2、TGF-β的表达增加、对T细胞的抑制能力更优。

在病毒性急性肺炎模型的治疗实验中，经本发明培养方法获得的人间充质干细胞对疾病模型肺部保护程度要优于常规方法获得的人间充质干细胞对疾病模型肺部保护程度。

附图说明

图1A为预处理前后人脐带间充质干细胞在对病毒性肺炎小鼠的生存曲线对比；

图1B为不同细胞因子组合物预处理前后人脐带间充质干细胞生长曲线对比；

图2为预处理前后人脐带间充质干细胞表达的细胞因子的影响(A为IDO使用qPCR检测表达量变化结果的柱状图；B为VEGF通过ELISA检测各组表达水平变化)；

图3为不同细胞因子浓度对人脐带间充质干细胞表达的细胞因子的影响(A为IDO使用qPCR检测表达量变化结果的柱状图；B为VEGF通过ELISA检测各组表达水平变化；C为TGF-β通过ELISA检测各组表达水平变化)；

图4为不同细胞因子组合物预处理后人脐带间充质干细胞的体外免疫抑制功能的影响(A为各组检测CD3⁺T细胞标记CFSE后增殖抑制情况对比，可以发现因子组合1和因子组合2的抑制效果最佳；B为根据流式检测结果绘制的抑制百分比柱状图，可以发现因子组合1和因子组合2的增殖百分比最小)；

图5为急性肺炎模型下不同细胞因子组合物预处理后对人脐带间充质干细胞的疗效对比；

图6为在不同处理时间下因子组合1对人脐带间充质干细胞的体外免疫抑制功能的影响(A为各组检测CD3⁺T细胞标记CFSE后增殖抑制情况对比，可以发现预处理14小时组的抑制效果最佳；B为根据流式检测结果绘制的抑制百分比柱状图，可以发现预处理14小时组的增殖百分比最小)；

图7为在不同处理时间下因子组合2对人脐带间充质干细胞的体外免疫抑制功能的影响(A为各组检测CD3⁺T细胞标记CFSE后增殖抑制情况对比，可以发现预处理12小时组的抑制效果最佳；B为根据流式检测结果绘制的抑制百分比柱状图，可以发现预处理12小时组的增殖百分比最小)；

图8为因子组合1及因子组合2预处理后人脐带间充质干细胞的单细胞测序结果(A为普通MSC组与因子组合1预处理组的细胞聚类分析对比图，可以发现因子组合1预处理组在0、8、9群上与普通MSC组存在明显差别；B为普通MSC组与因子组合1预处理组的细胞聚类分析对比图，可以发现因子组合2预处理组在3、7群及各群的丰度上与普通MSC组存在明显差别)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一实施方式，本发明提供了含有细胞因子组合物培养得到的间充质干细胞，其针对病毒性肺炎具有良好的抗炎活性。经实验验证，相比于普通现有的间充质干细胞，经过含有IFN-γ、IL1β、IL6、IL10、IL15中的至少2种细胞因子的细胞因子组合物处理后的间充质干细胞，在针对病毒性肺炎上有明显改善的抗炎活性【图1A】。而在特定的细胞因子组合物刺激后的间充质干细胞可以获得相比普通间充质干细胞可以有更好的增殖活性【图1B】。

根据本发明的一实施方式中，来源人脐带的间充质干细胞相比其他来源(骨髓、脂肪、胎盘、牙髓等)分离的间充质干细胞，上述脐带间充质干细胞具有以下特征，即增殖速度更快【图1B】、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)的表达增加，【图2】

在本说明书中，所述“抗炎症活性”是指经过含有IFN-γ、IL1β、IL6、IL10、IL15中的至少2种细胞因子的细胞因子组合物处理的后间充质干细胞对T细胞和B细胞的免疫抑制功能。

本发明提供的用于间充质干细胞预处理的IFN-γ为通过活化T细胞和/或NK细胞、CD4⁺CD8⁺淋巴细胞产生的细胞因子，上述IFN-γ为刺激剂，参与上述细胞的活化及增殖，提高抗原呈递效率；IL1β为通过参与IL6、TNF-α的调节，参与T细胞的活化过程，对中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞有趋化作用，上述IL1β为刺激剂，参与上述细胞在炎症反应中的活化及增殖；IL6是多种淋巴细胞及非淋巴细胞均会产生的细胞因子，广泛参与了免疫调节作用的相关过程，可以显著增强淋巴细胞的增殖反应，提高NK细胞的杀伤活性的，上述IL6为刺激剂，广泛参与了炎症反应中，淋巴细胞的增殖与生长，同时也是机体内细胞因子风暴的重要细胞因子；IL10为通过刺激B细胞的产生，增加B细胞的活化、抗体分泌及细胞因子的分泌，上述IL10为刺激剂，参与上述细胞在炎症反应的活化及增殖；IL15为通过刺激活化后的T细胞增殖，增强T细胞的功能，且调节活化NK细胞、促进细胞毒性T细胞的活化，诱导B细胞活化分泌抗体，上述IL15为刺激剂，参与上述细胞在炎症反应中的活化及增殖。

本说明书中，术语“预处理”是指如下过程，在培养人脐带来源的间充质干细胞的过程中，将添加有IFN-γ、IL1β、IL6、IL10、IL15中的至少2种细胞因子的细胞因子组合物的细胞培养基与人脐带来源的间充质干细胞接触培养。

在本发明的一实施方式中，上述含有IFN-γ、IL1β、IL6、IL10、IL15中的至少2种细胞因子的细胞因子组合物加入基础培养基中，配制成预处理培养基对间充质干细胞进行预处理。

在本发明的一实施方式中，上述含有IFN-γ、IL1β、IL6、IL10、IL15中的至少3种细胞因子的细胞因子组合物加入基础培养基中，配制成预处理培养基对间充质干细胞进行预处理。

在本发明的一实施方式中，细胞因子组合物的选择方式是基于疾病发展进程所决定的，根据疾病发生时机体内的炎症表达水平确定因子组合的方式后进行间充质干细胞的预处理。

在本发明的一实施方式中，上述IFN-γ以1ng/ml至150ng/ml、IL1β以1ng/ml至100ng/ml、IL6以10ng/ml至80ng/ml、IL10以20ng/ml至100ng/ml、IL15以10ng/ml至150ng/ml的浓度添加于预处理培养基中。

在本发明的另一实施方式中，上述IFN-γ优选浓度为5ng/ml、IL1β优选浓度为10ng/ml、IL6优选浓度为20ng/ml、IL10优选浓度为25ng/ml、IL15优选浓度为20ng/ml。【图3】

在本发明的另一实施方式中，在病毒性肺炎的情况下，优选的细胞因子组合物为因子组合1(IL6、IL10、IL15)；因子组合2(IFN-γ、IL1β、IL15)；因子组合3(IFN-γ、IL10、IL15)；因子组合4(IL6、IL1β、IL15)。

在本说明书中，通过体外免疫抑制实验及病毒性急性肺炎模型治疗实验，得出因子组合1的优选浓度为20ng/ml的IL6、25ng/ml的IL10、20ng/ml的IL15；因子组合2的优选浓度为20ng/ml的IFN-γ、10ng/ml的IL1β、20ng/ml的IL15；因子组合3的优选浓度为5ng/mlIFN-γ、25ng/ml IL10、15ng/ml IL15；因子组合4的优选浓度为25ng/ml IL6、10ng/ml IL1β、20ng/ml IL15。【图4】【图5】

在本发明中，所述“体外免疫抑制实验”为将激活后人外周血单个核细胞(PBMC)与间充质干细胞于体外接触培养72小时，检测PBMC的增殖情况。在本说明书中，判断标准如下：增强T细胞抑制增殖能力s1/s2>1.5(更优的s1/s2>2，最优的s1/s2>2.5)，s1为预处理后的人脐带间充质干细胞对T细胞的抑制百分比，s2为原始的普通人脐带间充质干细胞对T细胞的抑制百分比。

在本发明中，所述“病毒性急性肺炎模型治疗实验”为在使用鼠适应性H1N1病毒(PR8)对小鼠进行疾病造模后的第3天，尾静脉注射1×10⁶个预处理前后的人脐带间充质干细胞进行治疗，并于造模后第14天处死小鼠取其肺组织进行病理切片，与对照组一同进行HE染色，判断治疗效果。

在本发明的另一实施方案中，所述“增强对病毒性肺炎的抗炎活性”是指在对病毒性肺炎小鼠模型上，使用本说明书中的预处理后的间充质干细胞进行治疗后，出现明显的治疗效果；【图4】

本说明书中，术语“预处理时间”是指接触培养时间。

在本发明的一实施方式中，添加有细胞因子组合物的细胞培养基与人脐带来源的间充质干细胞接触培养为8到24小时

在本发明的另一实施方式中，所述预处理中，使用含有因子组合1的细胞培养基与人脐带间充质干细胞接触培养，优选的，预处理时间为14小时。【图6】

在本发明的另一实施方式中，所述预处理中，使用含有因子组合2的细胞培养基与人脐带间充质干细胞接触培养，优选的，预处理时间为12小时。【图7】

在本发明的另一实施方案中，预处理前后的人脐带间充质干细胞的差别可以通过使用单细胞测序技术进行检测，使用本说明书中的预处理后的间充质干细胞与普通间充质干细胞在单细胞测序数据上细胞生物学特性上存在明显区别(细胞分群图)。【图8】

本发明中，所用试剂和试验材料均可从市售渠道获取，其中生物材料来源如下：

IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15等细胞因子均购自R&D Systems公司。

实施方案1细胞因子组合物预处理的人脐带间充质干细胞的生产方法

细胞制备方法

人脐带间充质干细胞的分离及培养：

在医学伦理委员会的监督下，从健康供体获取新鲜脐带进行华通氏胶的分离，对华通氏胶进行剪碎，采用贴壁法培养，在无血清培养系统下进行原代细胞的获取和扩增，所述无血清培养系统为：Ultraculture(Lonza)+市售多种生长因子(包含PDGF-BB、PDGF-AB、TGF-β、bFGF等培养哺乳动物细胞常用的生长因子)。

对原代细胞，进行扩增并于P2代进行冻存做为种子细胞。

本说明书中，所述“P2代”指原代细胞在培养瓶和/或细胞工厂中，经过2次融合度达到100％并消化重新种入培养瓶和/或细胞工厂后的代次。

细胞因子组合物预处理人脐带间充质干细胞：

将冻存的种子细胞复苏，按5000-13000cells/cm²接种在培养瓶和/或细胞工厂中，其中在本说明书中，培养瓶最佳接种密度为6500cells/cm²，细胞工厂最佳接种密度为12000cells/cm²。

当细胞融合度达到75％以上时，可以开始使用细胞因子组合物进行预处理，其中在本说明书中，最佳细胞融合度为90％。将旧的细胞培养基更换为含有细胞因子组合物的预处理培养基，与细胞接触培养8到24小时。

在本说明书中，为针对不同疾病进展阶段，优选的组合为因子组合1及因子组合2，其中因子组合1为IL6、IL10、IL15，因子组合2为IFN-γ、IL1β、IL15，因子组合3为IFN-γ、IL10、IL15，因子组合4为IL6、IL1β、IL15；更优选的组合为因子组合1及因子组合2。

在本说明书中，细胞因子组合1的优选浓度为20ng/ml的IL6、25ng/ml的IL10、20ng/ml的IL15，细胞因子组合2的优选浓度为20ng/ml的IFN-γ、10ng/ml的IL1β、20ng/ml的IL15；因子组合3的优选浓度为5ng/ml IFN-γ、25ng/ml IL10、15ng/ml IL15；因子组合4的优选浓度为25ng/ml IL6、10ng/ml IL1β、20ng/ml IL15。

在本说明书中，含有细胞因子组合1的预处理培养基与细胞接触培养时间为8到18小时，优选的在本实施例中，培养时间为14小时。

在本说明书中，含有细胞因子组合2的预处理培养基与细胞接触培养时间为10到24小时，优选的在本实施例中，培养时间为12小时。

经过预处理后获得的间充质干细胞，可以经过消化后，制备为细胞制剂，存储运输至患者处使用。

实施方案2预处理前后人脐带间充质干细胞的生物学特性对比

在本说明书中，发明人为进一步阐明因子组合物对人脐带间充质干细胞的生物学特性影响，进行了体外细胞因子分泌检测及单细胞测序。其中，体外细胞因子分泌检测主要考察在体外培养的条件下，相同培养时间内，普通人脐带间充质干细胞、不同细胞因子浓度预处理的人脐带间充质干细胞和不同细胞因子组合物预处理的人脐带间充质干细胞(组合类型包括：因子组合1、因子组合2、因子组合3、因子组合4)的培养上清中的细胞因子浓度，主要考察不同细胞因子浓度或不同细胞因子组合物对人脐带间充质干细胞表达细胞因子的影响；对普通人脐带间充质干细胞和不同细胞因子组合物预处理的人脐带间充质干细胞(组合类型包括：因子组合1、因子组合2)进行单细胞测序，主要考察人脐带间充质干细胞在接受因子处理前后，细胞在转录组水平的大致变化、基因表达变化和亚群变化等。结果表明，预处理后人脐带间充质干细胞的培养上清中，因子IDO、VEGF、TGF-β的浓度明显上升；且预处理后人脐带间充质干细胞在单细胞测序结果上，与普通人脐带间充质干细胞的群体特点有明显变化，整体上基因表达也发生了明显改变。

在本说明书中，为探究预处理前后人脐带间充质干细胞在生长速率上的变化，进行了代次内的生长曲线测定。其中，通过在96孔内种入1000个普通人脐带间充质干细胞、预处理后的人脐带间充质干细胞(组合类型包括：因子组合1、因子组合2、因子组合3、因子组合4)后，通过MTT法测定每天的细胞OD值，持续测定9天，最后绘制生长曲线。结果表明，因子组合1及因子组合2在预处理人脐带间充质干细胞后，可以获得的优于普通人脐带间充质干细胞的生长速度，同时也优于其他因子组合方式。

实施方案3预处理前后人脐带间充质干细胞的体外免疫抑制试验

间充质干细胞在体外与人外周血单个核细胞共培养，是检测间充质干细胞在体外免疫抑制能力的重要实验检测方法。本发明中，将人外周血单个核细胞标记CFSE且经过CD3、CD28激活后，分别与普通人脐带间充质干细胞、预处理后的人脐带间充质干细胞(组合类型包括：因子组合1、因子组合2、因子组合3、因子组合4)进行共培养，可以看到经过80小时的共培养后，经过因子组合1或因子组合2预处理后的人脐带间充质干细胞的免疫抑制效果明显优于普通人脐带间充质干细胞和其他细胞因子组合物预处理后的人脐带间充质干细胞(因子组合3、因子组合4)的免疫抑制效果。从流式检测结果上看，与因子组合1或因子组合2预处理后的人脐带间充质干细胞共培养的CD3⁺总T细胞的增殖比例明显下降，增殖下降比例明显高于与普通人脐带间充质干细胞和其他因子组合物预处理后的人脐带间充质干细胞(因子组合3、因子组合4)共培养的CD3⁺总T细胞。从抑制百分比统计，与因子组合1或因子组合2预处理后的人脐带间充质干细胞共培养的CD3⁺总T细胞的抑制效果好，抑制比例明显高于与普通人脐带间充质干细胞和其他因子组合物预处理后的人脐带间充质干细胞(因子组合3、因子组合4)共培养的CD3⁺总T细胞的抑制比例。

此外，发明人将因子组合物预处理人脐带间充质干细胞的时间对体外免疫抑制疗效的影响也做了相应的探究。结果表明，因子组合1预处理人脐带间充质干细胞14小时时，因子组合1预处理人脐带间充质干细胞免疫抑制效果可以达到最佳水平；因子组合2预处理人脐带间充质干细胞12小时时，因子组合2预处理人脐带间充质干细胞免疫抑制效果可以达到最佳水平。

实施方案4不同细胞因子组合物预处理的人脐带间充质干细胞治疗病毒性肺炎小鼠模型

H1N1(PR8)病毒诱导小鼠急性肺损伤是一个经典的模拟人病毒性或自身免疫性急性肺炎的动物模型。在这一模型中，急性免疫应答在介导肺损伤中发挥了主导作用，多种免疫细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞)和炎性因子(IFN-γ、IL-1β、IL6、TNF-α等)都参与了急性肺炎的病变过程，受到病毒感染的小鼠肺部会出现大量的免疫细胞浸润、红细胞析出、肺部出现结构性损伤。

在本发明中，采用了普通人脐带间充质干细胞、预处理后的人脐带间充质干细胞(组合类型包括：因子组合1、因子组合2、因子组合3、因子组合4)的免疫抑制功能特性，应用于治疗病毒性急性肺炎上。结果发现，普通人脐带间充质干细胞在对病毒性急性肺炎有一定的治疗效果，说明普通人脐带间充质干细胞能够接受到体内炎性因子的刺激后发挥相应的免疫抑制作用，但由于普通人脐带间充质干细胞未经过特定细胞因子预处理，并不能在进入体内后立刻发挥作用，因此治疗作用效果有限；然而在急性肺炎疾病模型中，因子组合1和/或因子组合2预处理后的人脐带间充质干细胞表现出了优于普通人脐带间充质干细胞的免疫抑制能力。因此，这一结果与本说明书中在体外实验中得出的结论相符，本发明提供的细胞因子组合物对人脐带间充质干细胞用于治疗病毒性急性肺炎具有增强作用。

此外在本发明中，针对病毒性急性肺炎的进展过程，发明人针对性的在造模后的第3天，使用因子组合1预处理后的人脐带间充质干细胞和因子组合2预处理后的人脐带间充质干细胞对疾病小鼠模型进行干预治疗。结果表明，在造模后，病程较轻的和/或病程发展较慢的情况下，因子组合1或因子组合2预处理后的人脐带间充质干细胞可以有效的减弱小鼠模型肺部的损伤情况、减少肺部炎性细胞浸润。

又在本发明中，针对不同预处理时间的人脐带间充质干细胞的治疗效果进行了比较。结果表明，在造模第3天后，使用不同预处理时间的因子组合1预处理的人脐带间充质干细胞治疗疾病模型，14小时预处理组，治疗效果达到最佳；在造模第5天后，使用不同预处理时间的因子组合2预处理的人脐带间充质干细胞治疗疾病模型，12小时预处理组，治疗效果达到最佳。

综上，通过使用本发明提供的细胞因子组合物预处理后得到的人间充质干细胞可发挥更强的免疫调节功能，更好的用于免疫性疾病的治疗，同时针对疾病的不同状态提供个性化的细胞治疗方案是下一阶段的目标——即精准医学。本发明为精准治疗提供了一套切实可行的临床干细胞治疗方案，可以更好的对病毒性肺炎进行针对性的治疗，有效减少肺部感染和肺损伤。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种含有IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15中至少两种的细胞因子组合物，其特征在于，该组合物中包含IL6、IL10及IL15，或者，该组合物中包含IFN-γ、IL1β及IL15。

2.如权利要求1所述的细胞因子组合物在体外培养抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞的用途。

3.一种用于培养抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞的培养基，其特征在于，包括权利要求1所述的细胞因子组合物及基础培养基。

4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述IFN-γ浓度为1ng/ml至150ng/ml；IL1β浓度为1ng/ml至100ng/ml；IL6浓度为10ng/ml至80ng/ml；IL10浓度为20ng/ml至100ng/ml；IL15浓度为10ng/ml至150ng/ml。

5.一种抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在其中至少一个步骤中将人间充质干细胞与权利要求3或4所述的培养基相接触。

6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述人间充质干细胞与所述培养基的接触培养时间为8-24小时。

7.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述人间充质干细胞来源于人体组织中的脐带、脂肪、骨髓、牙髓中的至少一种。

8.一种由权利要求5-7任一项所述的培养方法得到的抗病毒性肺炎活性增强的人间充质干细胞在制备治疗病毒性肺炎药物或细胞制剂中的应用。

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