CN105985928A - 一种增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，通过不同蛋白因子组合体外预处理间充质干细胞，找到最佳因子配比从而快速增强间充质干细胞的免疫调节能力。经过本发明所述的短时间预处理方法，间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调节能力得到明显增强，从而有助于强化其对于自身免疫性疾病和免疫紊乱相关疾病的临床治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体地说，涉及增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理培养方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)是来源于发育早期中胚层的一类重要的成体干细胞，具有多种组织修复能力，已广泛用于临床治疗研究。MSCs最初是由骨髓基质中分离获得的非造血多能干细胞，现已证实MSCs也存在于脂肪组织、脐带等多种组织内。研究表明间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)一个重要应用是免疫调节领域。大量研究证实，MSCs在体内可诱导免疫抑制，减少造血干细胞移植治疗过程中的GVHD及排斥反应，以及抗炎调节能力。MSCs的免疫抑制能力在大量的动物试验和临床研究中得到证实。Jarvinen等[Giles JT,Bartlett SJ,Gelber AC,et al.Tumor necrosis factor inhibitor therapy and risk of seriouspostoperative orthopedic infection in Rheumatoid Arthritis.Arthritis Care Res 2006,55:333–337.]发现肺细胞来源的MSCs在体外培养时不表达免疫刺激分子CD80、CD86，将MSCs加入非特异性丝裂原刺激的T细胞中，发现T细胞增殖显著受抑制。Corcione等[Corcione A,Benvenuto F,Ferretti E.Human mesenchymal stem cells modulate B-cellfunctions.Blood 2006,107(1):367-372]将骨髓间充质干细胞与B细胞体外共培养实验发现B细胞的增殖被抑制在细胞周期的G0/G1期，不能诱导凋亡的发生。Sotiropoulou等[Sotiropoulou PA,Perez SA,GritzapisAD.Interactions between human mesenchymal stem cells and naturalkiller cells.Stem Cells 2006,24(1):74-85]研究骨髓间充质干细胞对NK细胞作用的实验中发现在NK/骨髓间充质干细胞比例较低时，骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)改变了NK细胞的表型，抑制了NK细胞的增殖、细胞因子的分泌以及对HLA-I表达靶物的细胞毒性作用。
然而，MSCs在免疫调节领域的应用仍存在一些问题亟需解决。首先，由于来源不同、细胞分离扩增的方法存在差异，MSCs的质量也存在很大差异，因此导致不同实验室的MSCs其调节免疫效果差异较大。另外，由于细胞治疗本身的特点，MSCs在治疗某些自身免疫性疾病方面的效果仍存在不确定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有间充质干细胞免疫调节能力的不确定性，建立一套有效的增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，将达到质量要求的P2代间充质干细胞体外培养3-4天，换成预处理培养液，并向培养液中添加重组炎性细胞因子，预处理48-72小时后，获得处理后的间充质干细胞。
所述重组炎性细胞因子为胞因子为素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ中的两种或三种组合，向预处理培养液中添加量为：
白细胞介素-2： 500-2000IU/ml
肿瘤坏死因子-α： 10-20ng/ml
干扰素-γ： 10-20ng/ml。
所述预处理培养液为DMEM/F12，并按体积比加入2％胎牛血清，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中静止培养。
优选，P2代间充质干细胞体外培养3-4天，向预处理培养液添加下述重组炎性细胞因子，预处理48小时，获得处理后的间充质干细胞；
白细胞介素-2： 1000IU/ml
肿瘤坏死因子-α： 20ng/ml
干扰素-γ： 15ng/ml。
本发明的有益效果是：通过本发明的方法，经IL-2、TNF-α或IFN-γ等多种因子组合预处理的MSCs，可显著抑制经植物血凝素-P(PHA-P)激活的外周血淋巴细胞。多种因子组合的预处理可显著增强MSCs的免疫抑制能力。通过检测间充质干细胞培养上清液发现经过预处理的间充质干细胞分泌PGE-2的能力显著增强。
附图说明
图1是体外培养的间充质干细胞形态、分化能力分析。A为BM-MSCs细胞形态，B为BM-MSCs成脂及成骨诱导分化结果。
图2是BrdU吸收法检测间充质干细胞体外抑制淋巴细胞反应。
图3是经IL-2、TNF-α或IFN-γ等蛋白因子处理的MSCs免疫调节能力分析。
图4是ELISA分析经预处理的MSCs表达TGF-β1、HGF、HLA-G5及PGE-2水平。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，将达到质量要求的P2代间充质干细胞体外培养3-4天，换成预处理培养液，并向预处理培养液中添加重组炎性细胞因子，预处理48-72小时后，获得处理后的间充质干细胞。
所述重组炎性细胞因子为白细胞介素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ中的两种或三种组合，向预处理培养液中添加量为：
白细胞介素-2： 500-2000IU/ml
肿瘤坏死因子-α： 10-20ng/ml
干扰素-γ： 10-20ng/ml。
所述预处理培养液为DMEM/F12，并按体积比加入2％胎牛血清，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中静止培养。
优选，P2代间充质干细胞体外培养3-4天，向培养液添加下述重组炎性细胞因子，预处理48小时，获得处理后的间充质干细胞；
白细胞介素-2： 1000IU/ml
肿瘤坏死因子-α： 20ng/ml
干扰素-γ： 15ng/ml。
实施例1间充质干细胞形态、分化能力及免疫表型
第2代骨髓来源间充质干细胞体外正常传代培养至P2代，基础细胞培养液为DMEM/F12，培养基中加入10％胎牛血清(体积比)。培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中静止培养。待细胞克隆长至80％融合时，0.05％胰酶消化传代至新培养瓶中。对细胞进行细胞形态、分化能力、免疫表型等分析，确定细胞是否达到质量要求。
结果发现间充质干细胞呈长梭形细胞贴壁，并可形成细胞克隆，如图1A所示。经免疫表型分析发现，间充质干细胞高表达黏附分子，如整合素(CD29)；受体分子，如玻璃质酸(CD44)，表面酶(CD73)；血管黏附分子(CD106)和I类主要组织相容性抗原(HLA-ABC)，而不表达内皮标志(CD31)；造血标志(CD34，CD45)和II类主要组织相容性抗原(数据未显示)。对细胞进行成脂及成骨诱导分化，结果发现MSCs显示了良好的成脂、成骨分化能力(图1B)。以上结果显示体外传代培养的MSCs达到了质量要求。
实施例2BrdU吸收法检测间充质干细胞体外抑制淋巴细胞反应
将3个不同批次的间充质干细胞按照0、1×104、2×104、4×104及8×104/孔密度接种于24孔板，相同细胞各做3个平行孔，待细胞贴壁后向每孔中加入8×104个外周血淋巴细胞(PBLC)，同时给予PHA刺激，共培养48小时。BrdU法检测经上述各组MSCs共培养后PBMC的增殖作用，增殖量以OD值(A450nm-A690nm)表示。
如图2所示，外周血淋巴细胞经PHA-P刺激后可显著增殖(未加MSC组)，然而与MSC共培养后，淋巴细胞增殖明显被抑制。且淋巴细胞增殖抑制率与MSCs浓度呈正比，即MSC：PBLC(细胞浓度比)为1：1时，MSC免疫调节能力最强，而MSC：PBLC浓度比降低时，其免疫调节能力随之降低。
实施例3蛋白因子预处理MSCs免疫调节能力检测
体外培养3个不同批次的MSCs，基础培养液培养至对数期后，吸弃培养液并换成预处理培养液(含2％胎牛血清DMEM/F12培养液)，选择1000IU/mlIL-2、20ng/ml TNF-α、15ng/ml IFN-γ三种细胞因子，分别单一加入或者三种因子两两组合加入或者三种因子同时加入预处理培养液中，并对MSC预处理48小时后，将上述各组预处理或未处理BM-MSCs按1×104/孔密度接种于24孔板，相同细胞各做3个平行孔，待细胞贴壁后向每孔中加入8×104个外周血淋巴细胞(MSC：PBLC为1：8)，同时给予PHA刺激，共培养48小时。BrdU法检测经上述各组MSC共培养后PBMC的增殖作用，增殖量以OD值(A450nm-A690nm)表示。
如图3所示，经PHA-P刺激后外周血淋巴细胞与经IL-2、TNF-α或IFN-γ单一预处理的MSC共培养后，淋巴细胞增殖抑制率没有明显提高。而MSCs经三种因子两两组合及三种因子同时加入培养液的预处理，与未处理MSCs相比，其抑制淋巴细胞增殖的能力明显增强，且三种因子同时预处理的MSCs免疫调节能力最强，其对外周血淋巴细胞的抑制能力为46.3％。
实施例4ELISA检测预处理后MSCs抗炎因子表达
将实施例3中三种因子同时加入预处理培养液中处理MSCs48h，收集细胞上清液，通过ELISA法检测细胞上清中TGF-β1、HGF、HLA-G5及PGE-2等因子变化。结果如图4所示，经因子处理后的MSCs，其表达TGF-β1、HLA-G5及HGF的水平没有显著变化，而其表达PGE-2的能力增强，且三种因子组合预处理的MSCs其分泌PGE-2的水平显著高于其他组。
以上结果说明，IL-2、TNF-α或IFN-γ三种因子组合后可显著提高MSCs的免疫调节能力，且MSCs免疫调节的提高可能与其分泌的PGE2的水平有关。
我们在研究中发现，经多种因子组合预处理的MSCs免疫调节能力明显的高于单一因子或不经预处理的MSCs，并且预处理后的MSCs其分泌PGE2的能力显著增强。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Claims (4)
1.一种增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，其特征在于，将达到质量要求的P2代间充质干细胞体外正常培养3-4天，换成预处理培养液，并添加重组炎性细胞因子，预处理48-72小时后，获得处理后的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，其特征在于，所述重组炎性细胞因子为白细胞介素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ中的两种或三种组合，向预处理培养液中添加量为：
白细胞介素-2： 500-2000IU/ml
肿瘤坏死因子-α： 10-20ng/ml
干扰素-γ： 10-20ng/ml。
3.根据权利要求1或2所述的增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，其特征在于，所述预处理培养液为DMEM/F12，并按体积比加入2％胎牛血清，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中静止培养。
4.根据权利要求3所述的增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，其特征在于，将P2代间充质干细胞体外培养3-4天，换成预处理培养液，并添加下述重组炎性细胞因子，预处理48小时，获得处理后的间充质干细胞；
白细胞介素-2： 1000IU/ml
肿瘤坏死因子-α： 20ng/ml
干扰素-γ： 15ng/ml。
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