CN112076217A - 一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法 - Google Patents

一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，该方法采用免疫激活的外周血单个核细胞（PBMCs）或其条件培养基模拟炎症微环境激活MSCs，再外加合成氧化脂质所必需的底物，即可显著促进间充质干细胞大量合成和分泌氧化脂质。本发明制备的氧化脂质组合物来源于间充质干细胞，具有重要的生物学功能，可以降低炎症反应，可用于炎症性疾病的预防和治疗，加速组织修复和愈合。相对于干细胞疗法，该氧化脂质组合物性质稳定，易于保存运输，同时也可避免发生免疫排斥反应和肿瘤形成风险等问题，简单易行且安全有效，极其适合于临床研究和应用，也为基于间充质干细胞的抗炎症非细胞疗法提供了新思路和新选择。

Description

一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法。
背景技术
间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，具有分化成骨、软骨、脂肪和其他类型细胞的潜能。间充质干细胞来源于中胚层，最早发现于骨髓，还可从脂肪、脐血、羊水、牙体等组织中分离出来。近年来，随着研究的进展，发现间充质干细胞除具有自我复制和多向分化潜能外，还具有免疫调节作用。基于间充质干细胞的免疫炎症调节作用，有关间充质干细胞在治疗移植物抗宿主反应、自身免疫性疾病的临床研究越来越多。
间充质干细胞对适应性免疫和固有免疫都有较强的免疫抑制作用。间充质干细胞对适应性免疫的抑制作用主要表现在对T淋巴细胞和B淋巴细胞的免疫抑制作用，对固有免疫的抑制作用主要表现在对单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞的免疫抑制作用。但是，随着对间充质干细胞临床研究的不断深入，研究者发现移植入体内的间充质干细胞分化成组织细胞的几率很低且移植到体内后存在存活率低及长期临床应用可能存在致瘤隐患，并且MSCs活细胞产品保存和运输困难等不足使得其临床应用受到限制，因此，寻找一种操作简单、安全有效的基于MSCs的非细胞疗法显得十分重要。
进一步的研究发现，MSCs并非本身就具备免疫抑制特性，而是需要在炎症微环境受到刺激活化后才能够发挥抗炎和免疫抑制作用，其抗炎作用的发挥主要是通过其旁分泌作用实现的。目前，关于间充质干细胞分泌的活性物质的应用，主要集中在MSCs总提取物、上清液等。如发明专利CN201710346752.7采用人间充质干细胞外泌体提取物治疗褥疮，能够深入皮肤基底层促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，促进损伤皮肤组织的结构重建与再生修复，促进创面愈合，减少损伤组织的细菌感染及炎症反应。发明专利CN202010386308.X采用包括间充质干细胞培养上清液的组合物可促进皮肤伤口愈合的组合物，可以降低炎症反应，加速皮肤伤口愈合，避免瘢痕增生现象。
氧化脂质是指多不饱和脂肪酸（花生四烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、DHA、EPA、DGLA等）发生自动氧化或者是在特定酶（COX、LOX、CYP450）的作用下生成的一系列氧化代谢产物，在机体炎症反应、免疫防御、内分泌调节以及氧化应激等方面发挥着重要作用。已有研究表明，氧化脂质是MSCs在炎症过程中合成的重要调控介质之一，在炎症的发起和消退过程中发挥关键作用。以往的研究结果提示，前列腺素E2（PGE2）是MSCs在炎症状态下合成的最主要的氧化脂质，但是新近的研究结果显示，PGE2（或者说AA通路下）有着复杂的代谢通路和众多的活性代谢产物（氧化脂质），其中数种已被证实具有抗炎和免疫调节活性，尤其以15-LOX代谢产物研究最多，但是目前对间充质干细胞来源的抗炎性氧化脂质的功能和应用尚缺乏深入研究。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，解决现有MSCs活细胞疗法存在性质不稳定，不易保存运输、有发生免疫排斥反应和肿瘤形成风险等问题，并且为MSCs的非细胞疗法提供了新选择。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，包括如下步骤：
1）分离并培养获得间充质干细胞；
2）将步骤1）获得的间充质干细胞贴壁培养24h后，然后加入免疫激活的外周血单个核细胞或其条件培养基共培养1~3天，得到预激活的间充质干细胞；
3）向预激活的间充质干细胞中加入合成氧化脂质所需的底物，继续培养1～3天，收集间充质干细胞，经细胞萃取，即得到氧化脂质组合物。
作为优选的，所述所述间充质干细胞来源于人脂肪、牙髓、骨髓、脐带、胎盘或脐带血；所述外周血单个核细胞来源于人外周血。
作为优选的，所述分离并培养获得间充质干细胞包括：采集样本组织进行洗涤；然后将分离出的组织块置于生理盐水中洗涤，并剪碎、称重、酶解后，转入离心管中离心，弃上清液；再向离心管中加入MSCs培养基，培养一段时间，当原代细胞培养至79~80％融合，消化解离并进行传代培养2-7代，获得间充质干细胞。
作为优选的，所述免疫激活的外周血单个核细胞与间充质干细胞的数量比10:1。
作为优选的，所述外周血单个核细胞是通过加入植物血凝素来免疫激活，所述植物血凝素的终浓度为2～10 µg/mL。
作为优选的，所述底物为花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸中的一种或多种。
作为优选的，所述培养条件是在37℃、５％二氧化碳以及饱和湿度。
本发明的另一个目的在于，提供上述方法得到的氧化脂质在制备预防或治疗自身免疫性疾病、炎症性和组织修复相关疾病的药物中的应用。
作为优选的，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、重症肌无力和多发性溃疡性结肠炎等中的至少一种；所述炎性相关疾病包括脓毒症、退行性关节炎和新生儿支气管肺发育不良性肺炎等中的至少一种。
本发明的另一个目的在于，提供一种用于治疗炎症性疾病的药学组合物，包含所述的预激活的间充质干细胞作为有效成分。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明采用免疫激活的外周血单个核细胞（PBMCs）或其条件培养基模拟炎症微环境激活MSCs，再外加所必需的底物，可显著促进间充质干细胞大量合成和分泌氧化脂质，并通过细胞萃取即可得到抗炎症氧化脂质。该方法取材方便，简单易行且安全有效，极其适合于临床研究和应用。
2、本发明制备的氧化脂质组合物来源于间充质干细胞，具有重要的生物学功能，可以降低炎症反应，加速组织修复和愈合，具有较大的临床应用价值。相对于干细胞，氧化脂质性质稳定，易于保存运输，同时也可避免发生免疫排斥反应和肿瘤形成风险等问题；相对于现有抗炎药物，安全有效，具有良好的应用前景。也为基于间充质干细胞的抗炎症非细胞疗法提供了新思路和新选择。
附图说明
图1为实施例1提取氧化脂质组合物中显著差异表达的氧化脂质代谢物的log2FC值。
图2为本发明制备的氧化脂质组合物对Treg细胞比例的影响；从左到右依次是同型对照组，空白对照组，实验组。
图3为本发明制备的氧化脂质组合物对抗炎性细胞因子IL-10表达量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例中未对实验方法进行特别说明的，均为常规操作，所用试剂为普通市售。
实施例1
一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，采用以下步骤：
1）脂肪间充质干细胞的分离、鉴定获得：提取脂肪间充质干细胞
将健康志愿者抽脂肪组织用PBS缓冲液冲洗，充分剪碎，加入0.1％ I型胶原酶进行消化，然后过滤并离心10min得到的细胞生长培养液；对细胞生长培养液进行重悬沉淀得到细胞悬液，将细胞悬液接种到培养瓶中，置于5％CO2细胞培养箱中进行原代培养；当原代细胞培养至80％融合，用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞，然后接种到培养皿中传代培养；待细胞培养至80％融合后，进行传下一代培养，得到第二代脂肪间充质干细胞，如此消化解离传代培养5~6代，得到人脂肪间充质干细胞(ADSCs)。
通过流式细胞术对ADSCs表面标志蛋白（CD44、CD73、CD90、CD105，CD34、CD45）的表达情况进行鉴定，同时进行成脂、成骨、软骨三向分化潜能鉴定。
2）构建预激活的间充质干细胞：
采用淋巴细胞分离液Lymphoprep™ (购自Stemcell Technologies公司)从健康志愿者全血中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）。
将人脂肪间充质干细胞接种于transwell小室（孔径0.3Ｍｍ）的下室，贴壁培养24h，然后在上室中以PBMCs和ADSCs的细胞数量为10：1的量加入人外周血单个核细胞，再加入植物血凝素PHA（终浓度为５µg/ml）激活PBMCs，置于37°C、５％二氧化碳以及饱和湿度的培养条件下培养1～3天，得到预激活的间充质干细胞体系。
3）促进间充质干细胞合成氧化脂质：
向预激活的间充质干细胞体系中加入花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，使底物的终浓度为10umol~10mmol，继续培养1～3天，收集间充质干细胞，具体方法为：用胰酶消化或用细胞刮将细胞刮下，样本转移到EP管中，4°C，1000 rpm离心10 min，吸弃上清液，将收集到的细胞用适量-20℃预冷的PBS清洗，用移液器轻轻吹打，避免剧烈振荡造成细胞破碎，4°C，1000 rpm离心10 min收集间充质干细胞。
4）氧化脂质的提取：
（1）将收集的间充质干细胞样本置于EP管中，加入4 ℃冰甲醇1.5 mL沉淀蛋白；
（2）涡旋5 min后低温放置沉淀蛋白2～8h；
（3）每一样本中加入1 uM内标混合液10 uL，涡旋10 min；
（4）在4℃条件下5000 rpm离心10 min；
（5）取上清液，氮气吹干，加入4 mL 10%的甲醇水，涡旋均匀；
（6）活化平衡固相萃取柱（萃取柱为C18柱）；
（7）调节样品的pH值，并迅速将调好pH值的酸性样品添加到固相萃取小柱上；
（8）洗脱目标物，收集洗脱液体；
（9）样品用氮气吹干，然后用100μL甲醇-水（v:v=1:1）复溶，涡旋30s，取上清，即得到氧化脂质组合物。
实施例2
一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，采用以下步骤：
1）脂肪间充质干细胞的分离、鉴定获得：提取脂肪间充质干细胞
从健康志愿者抽脂肪组织，用PBS缓冲液冲洗脂肪组织，充分剪碎，加入0.1％ I型胶原酶进行消化，然后过滤并离心10min得到的细胞生长培养液；对细胞生长培养液进行重悬沉淀得到细胞悬液，将细胞悬液接种到培养瓶中，置于5％CO2细胞培养箱中进行原代培养；当原代细胞培养至80％融合，用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞，然后接种到培养皿中传代培养；待细胞培养至80％融合后，进行传下一代培养，得到第二代脂肪间充质干细胞，如此消化解离传代培养5~6代，得到人脂肪间充质干细胞ADSCs。
通过流式细胞术对ADSCs表面标志蛋白（CD44、CD73、CD90、CD105，CD34、CD45）的表达情况进行鉴定，同时进行成脂、成骨、软骨三向分化潜能鉴定。
2）构建预激活的间充质干细胞：
采用淋巴细胞分离液Lymphoprep™ (购自Stemcell Technologies公司)从健康志愿者全血中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）。将PBMCs用完全DMEM/Ｆ12培养基，于37°C、５％二氧化碳、饱和湿度的培养条件下，加入PHA（终浓度为５µg/ml）培养1～3天。室温条件下2000rpm离心10分钟，收集无细胞上清，并用0.22uＭ滤器或滤膜过滤，获得外周血单个核细胞条件培养基。
将ADSCs接种于培养皿，贴壁培养24h，然后去掉原培养基，加入上述收集的外周血单个核细胞条件培养基，共培养1~3天，得到预激活的间充质干细胞。
3）促进间充质干细胞合成氧化脂质：
向预激活的间充质干细胞体系中加入花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，使底物的终浓度为10umol~10mmol，继续培养1～3天，收集间充质干细胞，具体方法为：用胰酶消化或用细胞刮将细胞刮下，样本转移到EP管中，4°C，1000 rpm离心10 min，吸弃上清液，将收集到的细胞用适量-20℃预冷的PBS清洗，用移液器轻轻吹打，避免剧烈振荡造成细胞破碎，4°C，1000 rpm离心10 min收集间充质干细胞。
4）氧化脂质组合物的提取：
（1）将收集的间充质干细胞样本置于EP管中，加入4 ℃冰甲醇1.5 mL沉淀蛋白；
（2）涡旋5 min后低温放置沉淀蛋白2～8h；
（3）每一样本中加入1 uM内标混合液10 uL，涡旋10 min；
（4）在4℃条件下5000 rpm离心10 min；
（5）取上清液，氮气吹干，加入4 mL 10%的甲醇水，涡旋均匀；
（6）活化平衡固相萃取柱（萃取柱为C18柱）；
（7）调节样品的pH值，并迅速将调好pH值的酸性样品添加到固相萃取小柱上；
（8）洗脱目标物，收集洗脱液体；
（9）样品用氮气吹干，然后用100μL甲醇-水（v:v=1:1）复溶，涡旋30s，取上清，即得到氧化脂质。
对比例1
脂肪间充质干细胞未经预激活处理，其它步骤同实施例1。
1、将实施例1和对比例1制备的氧化脂质组分采用UPLC-MS/MS系统（包括超高效液相色谱（UPLC）和串联质谱（MS/MS））进行定性定量分析。
色谱条件主要包括：
1）色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8um 2.1x100mm；
2）流动相：A相为乙腈/水/乙酸 60/40/0.002 (v/v/v)，B相为乙腈/异丙醇 50/50 (v/v)；
3）流速0.4 mL/min；洗脱梯度见表1，柱温40 °C；进样量10μL。
质谱条件主要包括：
电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），多反应监测（MRM）扫描，负离子模式；EPI 扫描范围：m/z：50-640；扫描速度：1000 da/s；Curtain gas：35psi；Ion Source Gas1：40psi； Ion Source Gas 2：40psi；温度：550℃。
表1：色谱分析流动相梯度
Time(min) A(%) B(%)
0.0 99.9 0.1
2.0 70 30
4.0 50 50
5.5 1 99
6.0 1 99
7.0 99.9 0.1
根据质谱分析结果并结合具体样品的分组情况，并将对比例1得到的数据作为空白对照组，比较各分组中代谢物及其定量信息发生的差异倍数变化如表2所示，将各显著差异表达的氧化脂质代谢物的log2FC（差异倍数以2为底取对数）结果展示如图1所示。其中，mws-oxlipid-JJ1 代表PGE2, mws-oxlipid-K6代表PGJ2, mws-oxlipid-J1代表PGE1, mws-oxlipid-K3代表PGF2α, mws-oxlipid-J2代表PGD1, mws-oxlipid-C2代表(±)15-HEPE,mws-oxlipid-L2代表TXB2, mws-oxlipid-E8代表11(S)-HETE, mws-oxlipid-G2代表 (±)7-HDHA)。其中，(±)12-HETE、(±)18-HETE、11(S)-HETE、(±)15-HETE、20-HETE均为花生四烯酸的氧化代谢产物，(±)15-HEPE、(±)12-HEPE、17(18)-EpETE、(±)18-HEPE均为EPA的氧化代谢产物。
表2
氧化脂质ID 氧化脂质 差异变化倍数 log<sub>2</sub>FC 上下调类型
mws-oxlipid-C1 （±）-18-羟基-5Z，8Z，11Z，14Z，16E-二十碳五烯酸 3.0886 1.627 上调
mws-oxlipid-C2 （±）-15-羟基-5Z，8Z，11Z，13E，17Z-二十碳五烯酸 6.7956 2.7646 上调
mws-oxlipid-C3 （±）-12-羟基-5Z，8Z，10E，14Z，17Z-二十碳五烯酸 6.7083 2.7459 上调
mws--oxlipid-E1 20-羟基-5Z，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸 2.7258 1.4467 上调
mws--oxlipid-E3 （±）18-羟基-5Z，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸 11.8723 3.5695 上调
mws--oxlipid-E6 （±）15-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸 3.9817 1.9934 上调
mws--oxlipid-E7 （±）12-羟基-5Z，8Z，10E，14Z-二十碳四烯酸 13.2722 3.7303 上调
mws--oxlipid-E8 11S-羟基-5Z，8Z，12E，14Z-二十碳四烯酸 11.6127 3.5376 上调
mws-oxlipid-J1 前列腺素E1 42.1691 5.3981 上调
mws-oxlipid-J2 前列腺素D1 26.8883 4.7489 上调
mws-oxlipid-JJ1 前列腺素E2 22.308 4.4795 上调
mws-oxlipid-K1 前列腺素F3α 0.2818 -1.8273 下调
mws-oxlipid-K3 前列腺素F2α 3.8355 1.9394 上调
mws-oxlipid-K6 前列腺素J2 17.7689 4.1513 上调
mws-oxlipid-N10 （±）17,18-环氧-5Z，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸 3.6035 1.8494 上调
mws-oxlipid-N11 （±）16,17-环氧-4Z，7Z，10Z，13Z，19Z-二十二碳五烯酸 3.6304 1.8601 上调
mws-oxlipid-N8 9S-羟基-10E，12Z，15Z-十八碳三烯酸 2.7631 1.4663 上调
从表2和图1可以看出，与空白对照组相比，本发明得到的氧化脂质组分基本上呈现上调，其中，mws-oxlipid-J1的量约是原来的42倍，且上述氧化脂质组分已被证实具有抗炎或者促进炎症消退的作用。具体而言：根据已有文献报道，17(18)-EpETE可通过抑制中性粒细胞迁移、激活PPARγ、减少炎症细胞因子分泌等作用抑制炎症反应（Am J Respir Cell MolBiol. 2010 Nov;43(5):564-75；J. Allergy Clin. Immunol. 142:470.e12； Br. J.Pharmacol. 174:2358）；(±)18-HEPE可通过恢复线粒体功能、抑制单核细胞与内皮细胞粘附、抑制成纤维细胞激活等作用发挥抗炎作用（ J. Exp. Med. 211:1673.；Biochim.Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids 1863:1016；Carcinogenesis. 39:1380.）；(±)15-HEPE、(±)12-HEPE可通过减轻过敏反应、抑制中性粒细胞聚集等作用促进炎症消退（Metabolomics. 2019 Apr 19;15(4):65；Nutrients. 2019 Nov 22;11(12):2868；Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2005a;73:141–162； ProstaglandinsLeukot Essent Fatty Acids. 2005;73:163–177），(±)15-HETE可通过抑菌作用降低牙周炎炎症反应（Front Immunol. 2020 Jun 25;11:1307；J Am Oil Chem Soc. 1988;65:474–474）。因此可以得出，采用本发明的处理方法，可显著促进间充质干细胞大量合成和分泌抗炎性氧化脂质组分。
2、氧化脂质组分的活性试验
从细胞实验的层面，以丝裂原刺激的外周血单个核细胞作为体外炎症细胞模型是具有代表性的，本发明以植物血凝素(PHA)体外激活的正常人外周血单个核细胞(PBMCs)作为应答细胞，验证制备的氧化脂质组合物的抗炎症反应和免疫调节活性。采用淋巴细胞分离液Lymphoprep™ (购自Stemcell Technologies公司)从健康志愿者全血中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）。将PBMCs用完全DMEM/Ｆ12培养基，于37°C、５％二氧化碳、饱和湿度的培养条件下，加入PHA（终浓度为５µg/ml）培养1～3天，得到免疫激活的PBMCs。向免疫激活的PBMCs中加入本发明提取的氧化脂质组合物（106个MSC细胞来源）得到实验组；向免疫激活的PBMCs中加入与氧化脂质组合物等体积的PBS得到对照组；然后将实验组和对照组均置于37°C、５％二氧化碳以及饱和湿度的培养条件下培养3天，收集PBMCs。
用eBioscienceTM Human Regulatory T Cell Staining Kit (购自StemcellTechnologies公司) 标记PBMCs，采用流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)比例，结果如图2所示。采用酶联免疫吸附法测定培养上清液中抗炎性细胞因子IL-10的表达量，结果如图3所示。
从图中可以看出，与空白对照组（Control组）相比，本发明制备的MSCs来源的氧化脂质组合物（ADSC-oxylipins组）可明显提高Treg细胞比例和抗炎性细胞因子IL-10的表达水平也上升。而调节性 T 细胞是一类具有免疫抑制功能的T 细胞亚群，对于抑制炎症反应、维持机体免疫稳态、发挥免疫调节及诱导外周免疫耐受具有重要作用，所以本发明制备的MSCs来源的氧化脂质组合物可显著促进调节性T细胞产生和抗炎性细胞因子IL-10的表达，具有明显的抗炎和免疫调节作用。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）分离并培养获得间充质干细胞；
2）将步骤1）获得的间充质干细胞贴壁培养24h后，然后加入免疫激活的外周血单个核细胞或其条件培养基共培养1~3天，得到预激活的间充质干细胞；
3）向预激活的间充质干细胞中加入合成氧化脂质所需的底物，继续培养1～3天，收集细胞，经细胞萃取，即得到氧化脂质组合物。
2.根据权利要求1所述间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人脂肪、牙髓、骨髓、脐带、胎盘或脐带血；所述外周血单个核细胞来源于人外周血。
3.根据权利要求1所述间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，其特征在于，所述分离并培养获得间充质干细胞包括：采集样本组织进行洗涤；然后将分离出的组织块置于生理盐水中洗涤，并剪碎、称重，酶解后转入离心管中离心，弃上清液；再向离心管中加入MSCs培养基，培养一段时间，当原代细胞培养至79~80％融合，消化解离并进行传代培养2-7代，获得间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，其特征在于，所述免疫激活的外周血单个核细胞与间充质干细胞的数量比10:1。
5.根据权利要求1所述间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞是通过加入植物血凝素来免疫激活，所述植物血凝素的终浓度为2～10 µg/mL。
6.根据权利要求1所述间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，其特征在于，所述底物为花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述间充质干细胞来源的抗炎症氧化脂质组合物的制备方法，其特征在于，所述培养条件是在37°C、５％二氧化碳以及饱和湿度。
8.一种如权利要求1~7任一项所述方法得到的氧化脂质组合物在制备预防或治疗自身免疫性疾病、炎症性和组织修复相关疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、重症肌无力和多发性溃疡性结肠炎等中的至少一种；所述炎性相关疾病包括脓毒症、退行性关节炎和新生儿支气管肺发育不良性肺炎等中的至少一种。
10.一种用于治疗炎症性疾病的药学组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的预激活的间充质干细胞作为有效成分。
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