CN108478782B

CN108478782B - 辐抗肽在促肝细胞再生中的应用

Info

Publication number: CN108478782B
Application number: CN201810465462.9A
Authority: CN
Inventors: 葛常辉; 杨刚刚; 杨晓明; 于淼; 张全义; 张文; 詹轶群; 王磊
Original assignee: Henan Xinxiang Hua Xing Pharmaceutical Factory; Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Henan Xinxiang Hua Xing Pharmaceutical Factory; Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2038-05-16
Also published as: CN108478782A

Abstract

本发明公开了辐抗肽蛋白CBLB502的新用途。本发明提供了辐抗肽蛋白CBLB502在制备用于促进肝细胞增殖的产品中的应用。本发明的辐抗肽蛋白CBLB502可促进肝细胞增殖和肝脏再生，具有潜在的临床应用价值。

Description

辐抗肽在促肝细胞再生中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及辐抗肽蛋白在促进肝细胞增殖和肝再生中的新用途。

背景技术

肝脏疾病是严重威胁人类生命健康的重要疾病之一，而肝脏移植是治疗终末期肝病唯一有效的方法。虽然肝脏本身具有极强的再生和功能代偿能力，但如何有效促进和调控肝细胞再生以代偿受损的肝功仍是临床亟需解决的问题。目前国内外的大多数学者认为，肝再生虽然是以肝实质细胞的增殖为主，但任何形式的肝再生过程都与炎症反应和免疫活化密切相关，因此对肝脏固有免疫功能的合理调控对促进肝脏再生修复将具有重要意义。

肠道微生物及其代谢产物通过肠-肝轴与肝脏在解剖结构和功能上密切关联，肠道微生态的失衡是导致慢性肝病向终末期发展的重要诱因，而Toll样受体(TLRs)介导免疫应答反应对维持胃肠道稳态和肝脏健康至关重要。除了TLR3以外，目前发现的所有TLRs以及IL-1β、IL-18等细胞因子都要通过髓样分化因子88(MyD88)介导下游NF-κB信号通路的活化。

TLR5作为目前已知的唯一一个配体为蛋白质(细菌鞭毛蛋白)的模式识别受体，其在组织损伤修复中的作用日渐受到关注。研究表明，细菌鞭毛蛋白对电离辐射、基因毒性药物、病原体感染、缺血-再灌注、移植物抗宿主病等导致组织损伤均具有明显的防护效果。Burdelya等人发现，肝脏是CBLB502蛋白(一种重组的沙门氏菌鞭毛蛋白)发挥辐射防护活性的主要靶器官，CBLB502蛋白能够从骨髓中募集大量免疫细胞(如T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、中性粒细胞)入肝，显著活化肝脏特别是肝实质细胞NF-κB信号通路，诱导肝脏产生某些未知的促增殖因子参与辐射损伤后的造血重建。

肝脏拥有两个独立的再生机制，即急性肝损伤(如肝切除、药物性肝损伤)时完全依靠肝实质细胞的再生和慢性肝损伤条件下依赖肝前体细胞(如肝卵圆细胞)的肝再生，但不论哪种形式下的肝再生都与骨髓细胞的动员和分化密切相关。近年来，骨髓细胞在肝再生中的重要作用逐渐受到重视。一方面，由骨髓细胞分化而来kupffer细胞以及肝窦内皮细胞的激活在肝再生启动和修复过程中扮演了重要角色；另外，骨髓细胞可以通过转分化为肝细胞或者与肝细胞发生融合生成新的肝细胞。最近研究表明肝切除后骨髓来源的造血干/祖细胞向肝内迁移并与肝实质细胞融合后快速增殖的新机制，提示骨髓细胞的动员、募集和分化在肝再生过程中的重要作用。由此不难想象，如果能在肝损伤前适当调整肝内免疫微环境(将骨髓干/祖细胞提前募集到肝内)，使肝脏处于一种特殊的“感受态”，就可以为后续的肝实质细胞增殖做好准备，从而达到促进肝脏再生修复的效果，而TLR5信号通路的活化则刚好能满足这一需求。除此之外，与其他TLRs的激动剂不同，细菌鞭毛蛋白在调控肝脏免疫方面有其独特的优势：首先，TLR5在肝内的表达水平相对较低且仅限于胆管上皮细胞，因而不会像LPS一样直接诱导kupffer细胞活化并分泌大量的TNF-α和IL-1β触发肝毒性；另外，鞭毛蛋白诱导肝内多种抗凋亡、抗感染因子表达，有利于肝脏损伤修复过程中外源性病原体的清除；第三，鞭毛蛋白诱导的肝内免疫活化反应本身并不会导致肝损伤，甚至在外源性促凋亡因子(如Fas抗体)刺激下也能保护肝实质细胞免于损伤；最后，CBLB502蛋白是经过人工改构的重组鞭毛蛋白，在保留天然生物学活性的同时其免疫原性大为降低(约为前者的1/50)，使其临床应用的安全性显著提高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种辐抗肽蛋白在制备用于促进动物肝细胞增殖的产品中的应用。

本发明提供了一种辐抗肽蛋白在制备用于促进动物肝细胞增殖和肝再生的产品中的应用，其中辐抗肽蛋白包括但不限于CBLB502，还可以包括氨基酸序列与CBLB502相似度不低于90％、具有类似活性的多肽；优选所述辐抗肽蛋白为CBLB502。

在本发明的一个具体实施方案中，所述应用是用于在肝损伤或疾病引起的损伤以后在肝脏中促进肝细胞增殖；

进一步地，所述肝损伤或疾病引起的损伤起因于肝切除、肝硬化、肝恶性肿瘤，暴露于酒精、肝毒性药物、暴露于抗结核剂和化学治疗剂。

在本发明的一个具体实施方案中，所述应用是用于在肝切除以后在肝脏中促进肝细胞增殖。

在本发明的一个具体实施方案中，所述促进肝细胞增殖通过以下1)-5)中至少一种体现：

1)提高动物的肝脏指数；

2)提高肝细胞增殖速度；

3)抑制动物肝脏中谷丙转氨酶ALT和/或谷草转氨酶AST表达量；

4)促进肝细胞生长因子HGF的产生和分泌；

5)促进肝细胞转化生长因子TGF-α的产生和分泌。

本发明提供了辐抗肽蛋白在制备具有如下1)-5)中至少一种功能的产品中的应用：

1)提高动物的肝脏指数；

2)提高肝细胞增殖速度；

3)抑制动物肝脏中谷丙转氨酶ALT和/或谷草转氨酶AST表达量；

4)促进肝细胞生长因子HGF的产生和分泌；

5)促进肝细胞转化生长因子TGF-α的产生和分泌；

其中，所述辐抗肽蛋白为CBLB502。

上述应用中，所述产品为药物。

上述应用中，所述动物为哺乳动物，优选为人或鼠。

本发明的另一目的是提供一种具有如下1)-5)中至少一种功能的产品，

1)提高动物的肝脏指数；

2)提高肝细胞增殖速度；

3)抑制动物肝脏中谷丙转氨酶ALT和/或谷草转氨酶AST表达量；

4)促进肝细胞生长因子HGF的产生和分泌；

5)促进肝细胞转化生长因子TGF-α的产生和分泌。

本发明提供了一种具有如下1)-5)中至少一种功能的产品，

1)提高动物的肝脏指数；

2)提高肝细胞增殖速度；

3)抑制动物肝脏中谷丙转氨酶ALT和/或谷草转氨酶AST表达量；

4)促进肝细胞生长因子HGF的产生和分泌；和

5)促进肝细胞转化生长因子TGF-α的产生和分泌，

其活性成分为辐抗肽蛋白CBLB502。

在本发明的一个具体实施方案中，，所述产品为药物，所述动物为哺乳动物，优选为人。

根据本发明，辐抗肽蛋白指的是CBLB502蛋白，其可以在市场上商购或按照现有技术已知的方法制备，其具体的制备方法可参见申请号201110257680.1的“一种重组细菌鞭毛蛋白衍生多肽的制备和活性鉴定方法”的专利申请。

根据本发明，术语“肝细胞增殖”是指来源于肝脏的原代培养的实质细胞、正常肝细胞系以及肝癌细胞系细胞分裂能力的增强，主要通过检测DNA合成来检测细胞的增殖能力。

根据本发明，术语“肝再生”是指哺乳动物肝脏自发恢复的能力。

本发明相对于现有技术具有如下特点：

本发明的实验证明，本发明的辐抗肽蛋白CBLB502可以促进肝细胞增殖和肝脏再生，具体地，CBLB502蛋白可显著提高肝脏指数，提高肝脏切除后肝细胞的增殖速度，抑制动物肝脏中谷丙转氨酶ALT和/或谷草转氨酶AST的表达量，以及促进肝细胞生长因子HGF和转化生长因子TGF-α的产生和分泌。

附图说明

图1为重组CBLB502蛋白的纯度与生物学活性示意图；其中，A为重组CBLB502蛋白SDS-PAGE银染纯度检测示意图，B为HEK-Blue TLR5NF-κB报告基因检测CBLB502蛋白生物学活性示意图；

图2为小鼠肝切除情况下辐抗肽蛋白CBLB502对肝脏指数的影响；其中，PH为对照组，502PH为注射辐抗肽蛋白CBLB502实验组；

图3为小鼠肝切除前1小时注射辐抗肽蛋白CBLB502对肝细胞增殖速度的影响；其中，PH为对照组，CBLB502PH为注射辐抗肽蛋白CBLB502实验组；

图4为小鼠肝切除前5小时注射辐抗肽蛋白CBLB502对肝细胞增殖速度的影响；其中，PHx为对照组，502-5h PHx为注射辐抗肽蛋白CBLB502实验组；

图5为小鼠肝切除前注射辐抗肽蛋白CBLB502血清中谷丙转氨酶ALT的表达水平变化示意图；其中，PH为对照组，502PH为注射辐抗肽蛋白CBLB502实验组；

图6为小鼠肝切除前注射辐抗肽蛋白CBLB502血清中谷草转氨酶AST的表达水平变化示意图；其中，PH为对照组，502PH为注射辐抗肽蛋白CBLB502实验组；

图7为注射辐抗肽蛋白CBLB502对肝细胞生长因子HGF和转化生长因子TGF-α的影响；

图8为小鼠肝切除情况下，辐抗肽蛋白CBLB502蛋白预处理对肝细胞生长因子HGF和转化生长因子TGF-α的影响；

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1辐抗肽蛋白的制备纯化及活性验证

根据现有技术的工艺方法构建温度敏感性原核重组CBLB502表达载体，制备生产菌株，并进行蛋白原核发酵、表达和纯化。

在该工艺条件下可以生产出纯度不低于99％的CBLB502蛋白(图1A)，利用稳定表达TLR5的HEK-Blue TLR5NF-κB报告基因细胞株，体外验证了CBLB502蛋白的生物学活性(图1B)。

实施例2小鼠肝脏指数检测

本实施例使用的实验动物为野生型C57BL/6小鼠。将小鼠随机分为两组，其中，实验组小鼠在肝切除前1小时，腹腔注射CBLB502，给药浓度为0.2mg/kg体重，对照组不注射。随后对两组小鼠分别进行70％肝切除实验，并连续检测其肝脏指数，检测结果如图2所示。

结果表明，在肝脏切除之前进行CBLB502预处理可以显著提高肝脏指数，促进肝脏恢复速度。

实施例3小鼠肝细胞增殖速度检测

增殖细胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen简称PCNA)与细胞DNA合成关系密切，是反映细胞增殖状态的指标。

分别在肝切除前1小时(图3)和5小时(图4)腹腔注射CBLB502，并分别与对照组进行比较。由图可知，在肝脏切除之前进行CBLB502预处理可以显著提高肝切除后肝细胞的增殖速度。

实施例4小鼠肝脏功能检测

血清中谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST的水平说明肝脏损伤的程度，反应了肝脏功能。

本实施例中，将野生型C57BL/6小鼠随机分为两组，其中，实验组小鼠在肝切除前1小时，腹腔注射CBLB502，给药浓度为0.2mg/kg体重，对照组不注射。1小时后对两组小鼠分别进行70％肝切除实验，并连续检测血清中谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST的水平，检测结果如图5和图6所示。

结果表明，在肝切除前1小时腹腔注射CBLB502，可以显著抑制肝切除后24小时血清中ALT(图5)和AST(图6)的水平，说明CBLB502可能促进肝脏功能恢复。

实施例5小鼠细胞因子检测

肝细胞生长因子HGF和转化生长因子TGF-α等细胞因子可以促进肝细胞再生。由图7可知，腹腔注射CBLB502可以促进HGF和TGF-α的产生和分泌。

本实施例中，将野生型C57BL/6小鼠随机分为两组，其中，实验组小鼠在肝切除前1小时，腹腔注射CBLB502，给药浓度为0.2mg/kg体重，对照组注射等量PBS。1小时后对两组小鼠分别进行70％肝切除实验，并连续检测肝细胞生长因子HGF和转化生长因子TGF-α水平，检测结果如图8所示。

结果表明，在部分肝切除的情况下，CBLB502蛋白预处理的小鼠在肝再生早期血清中HGF和TGF-α水平亦要明显高于对照组，从而说明CBLB502蛋白可能通过诱导促增殖相关细胞因子、生长因子水平促进肝再生。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.辐抗肽蛋白在制备用于促进动物肝细胞增殖和肝再生的药物中的应用，用于在肝切除以后在肝脏中促进肝细胞增殖；其中所述辐抗肽蛋白为CBLB502;

其中，所述促进肝细胞增殖通过以下1）-4）体现：

1）提高动物的肝脏指数；

2）提高肝细胞增殖速度；

3）促进肝细胞生长因子HGF的产生和分泌；

4）促进转化生长因子TGF-α的产生和分泌。