RU2655761C1 - Применение суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности - Google Patents
Применение суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности Download PDFInfo
- Publication number
- RU2655761C1 RU2655761C1 RU2017128292A RU2017128292A RU2655761C1 RU 2655761 C1 RU2655761 C1 RU 2655761C1 RU 2017128292 A RU2017128292 A RU 2017128292A RU 2017128292 A RU2017128292 A RU 2017128292A RU 2655761 C1 RU2655761 C1 RU 2655761C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- liver
- mmsc
- cells
- liver failure
- Prior art date
Links
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 title claims abstract description 27
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 title claims abstract description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 7
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 title claims abstract 3
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 32
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 208000000857 Hepatic Insufficiency Diseases 0.000 abstract 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 78
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 15
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 15
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 8
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 6
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 108010033918 Alanine-glyoxylate transaminase Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 5
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 3
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- -1 AcAT Proteins 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 208000008964 Chemical and Drug Induced Liver Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 208000007348 Experimental Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 206010016454 Femur fracture Diseases 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000037037 animal physiology Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001164 bioregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002615 fibrolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000000686 immunotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008756 pathogenetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009719 regenerative response Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/407—Liver; Hepatocytes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, трансплантологии, и может быть использовано для коррекции печеночной недостаточности у субъекта. Для этого применяют суммарную РНК, выделенную из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения печеночной недостаточности и предупредить развитие осложнений, связанных с применением биотехнологических методов коррекции и профилактики печеночной недостаточности стволовыми/прогениторными клетками. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.
Description
Изобретение относится к клинической медицине, а именно к гепатологии, трансплантологии и может быть использовано для лечения печеночной недостаточности.
В экономически развитых странах хронические заболевания печени (хронический гепатит, цирроз печени) входят в число шести основных причин смерти пациентов от 35 до 60 лет, составляя 14-30 случаев на 100 тысяч населения. Ежегодно в мире умирают 40 миллионов человек от цирроза печени. Возрастание медицинской и социальной значимости хронических заболеваний печени требует разработки новых более эффективных технологий лечения и профилактики этих заболеваний на основе достижений современной биологической и медицинской науки.
Известны суммарные РНК, выделенные из лейкоцитов, дрожжей, микробных и растительных клеток, которые используются для неспецифической стимуляции иммунитета и лечения вирусных инфекций, а также воспалительных процессов [SV Total RNA isolation system. Technical Manual. 08.2016. Phomega Corporation].
К настоящему времени в арсенале лечебных средств имеется две разновидности препаратов, в состав которых входит ксеногенная РНК. Действующим веществом в препаратах первой группы (НКАД, Нуклеинат натрия, Ридостин, Полирибонат, Виталанг 2) является одна или двуспиральная высоко или низкомолекулярная РНК, выделенная из дрожжей Sacharomyces cerevisiae.
Препараты дрожжевой РНК обладают неспецифическим иммунотропным действием: регулируют миграцию Т лимфоцитов, активируют гуморальный иммунитет и функциональную активность макрофагов [Кактурский Л.В., Шабанова М.Е., Большакова Г.Б. Изменение состава грануляционной ткани при заживлении экспериментального инфаркта миокарда под влиянием препарата НКАД // Тез. 7 Всесоюзной конф. по регенерации и клеточному делению, М., 1985, с. 17; Земсков В.М., Земсков A.M., Караулов А.В. Низкомолекулярная РНК - естественный модулятор иммунологического гомеостаза // Практический врач, 1995, №1, с. 6-9; Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Выделение и анализ биологической активности высокополимерной РНК из пекарских дрожжей // Бюлл. СО РАМН, 2012, №6, с. 60-68; Ридостин - инструкция к препарату ООО «Вектор Фарм. Россия»].
К препаратам другой группы относят высоко или низкомолекулярные РНК, выделенные из различных органов крупного рогатого скота [Витвицкий В.М., Ушаков И.В., Сидляров Д.П., Апросин Ю.Д. Средство, стимулирующее репарирование повреждений, обладающее ткане-, органо- и стадиеспецифичностью и противовирусной активностью. // Патент РФ №2238756 С1, 2003].
В отличие от дрожжевых препаратов эти РНК оказывают исключительно органоспецифическое стимулирующее действие только на гомологичные органы реципиента, независимо от их видовой принадлежности.
Известен способ коррекции хронической печеночной недостаточности в эксперименте при моделировании токсического цирроза печени (затравка CCl4) у мышей путем внутрибрюшинного введения им цитоплазматической РНК, выделенной из печени здоровых крыс [Чернух A.M., Вышепан Е.Д., Разумова И.Л. и др. Особенности течения экспериментального цирроза печени под влиянием печеночной РНК Бюлл. экспер. биологии и медицины 1970, №10, с. 12-15]. В этом исследовании, выполненном на мышах, авторы использовали экзогенную РНК из печени здоровых крыс, исходя из представлений о видовой неспецифичности РНК.
Было констатировано, что введение мышам органоспецифичной цитоплазматической РНК из печени крыс достоверно уменьшило гибель животных и число очагов некроза в ткани печени, а также достоверно увеличило не только митотическую активность гепатоцитов, но и количество междольковых соединительнотканных волокон. Отсутствие полного восстановительного (регенерационного) эффекта от применения тканеспецифичной (печеночной) РНК для лечения фиброзирующего типа печеночной недостаточности предопределило тот факт, что в клинике препараты РНК, полученные из ткани печени, стали для повышения лечебного эффекта сочетать с органоспецифическими препаратами РНК, выделенными из других органов - желудка, селезенки, надпочечников, поджелудочной железы и др. Однако ввиду малой клинической эффективности этот метод, основанный на применении комплекса органных РНК, в настоящее время не находит широкого применения.
Основной недостаток применения органоспецифических РНК от здоровых доноров, прежде всего печеночных РНК, состоит в том, что в тканях органов здоровых животных из-за стабильного равновесного состояния и отсутствия необходимости выработки в них факторов, индуцирующих процессы быстрого роста и развития, имеет место низкий уровень пролиферативной (митотической) активности клеток и поэтому выделенная из них РНК имеет низкий регенерационный потенциал. Кроме того РНК, выделенная из печени, обладает только органоспецифической активностью и не способна участвовать в компенсаторной поддержке других систем организма (почки, легкие), активно участвующих в процессе восстановительной регенерации печени.
Костный мозг, будучи центральным органом иммуногенеза и системы крови в организме, обладает универсальными регуляторными свойствами и его клетки относятся к быстро реагирующим и быстро развивающимся клеткам, содержат постоянно самообновляющийся пул стволовых/прогениторных клеток, постоянно продуцируют цитокины и факторы роста, оказывая регуляторное воздействие на клетки различных паренхиматозных органов и поэтому именно их предпочитают использовать для индукции процессов регенерации.
Известен способ лечения печеночной недостаточности путем применения универсальных регуляторов восстановительных процессов в органах - мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) от здорового донора, который является наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения [Люндуп А.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Применение аллогенных мезенхимальных клеток костного мозга в лечении хронических заболеваний печени, Сборник материалов Всероссийской конференции «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине», Тула, 2009, с. 6-8], который выбран в качестве прототипа.
Известный способ основан на выделении из костного мозга донора - ММСК КМ, культивировании их для увеличения клеточной массы в течение 3-4 недель и внутривенном введении реципиенту с поврежденной печенью. ММСК КМ после введения реципиенту корригируют клинические и морфологические проявления печеночной недостаточности путем индукции митотической активности клеток печени, а также путем активации дефиброзирующих процессов в печени (фибролитический эффект) [Люндуп А.В. «Применение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для коррекции фиброзирующего повреждения печени» (экспериментальное исследование), автореферат диссертации канд. мед. наук, Москва, 2011, 26 с.]. Эффективность применения ММСК КМ, для коррекции и лечения печеночной недостаточности обусловлена тем, что эти клетки обладают высоким регенерационным потенциалом, так как являются стволовыми/прогениторными (малодифференцированными) активно пролиферирующими клетками и в процессе своей жизнедеятельности выделяют комплекс высокоактивных регуляторных рост стимулирующих и паракринных факторов.
Эти факторы, корригируют взаимодействия в системе мезенхимальных клеток организма, в том числе системе мезенхимальных клеток поврежденной печени (купферовских клеток, звездчатых клеток, фибробластов, лейкоцитов), восстанавливают их нарушенное взаимодействие между собой и с паренхиматозными клетками печени (гепатоцитами), обеспечивая, таким образом, регуляцию процессов восстановительной регенерации печени.
Однако внедрение в клиническую практику клеточных технологий для лечения заболеваний печени продолжает оставаться на стадии пилотных исследований. Даже применение аутологичных стволовых/прогениторных клеток не получает единодушной поддержки и не находит широкого клинического применения из-за опасности малигнизации и генетических мутаций стволовых/прогениторных клеток после трансплантации в организме реципиента, а также из-за быстрой гибели этих клеток при получении их от аллогенного или ксеногенного донора.
В настоящее время из ММСК КМ выделено несколько микро РНК (микро РНК-188, микро РНК-21) для ускорения процессов остеогенной дифференцировки ММСК КМ и заживления костных переломов [Li C.J., Cheng P., Liang M.K., Chen Y.S., Lu Q., Wang J.Y. et al., MicroRNA-188 regulates age-related switch between osteoblast and adipocyte differentiation. J Clin. Invest. 2015 Apr., 125(4): 1509-22. doi: 10.1172/JCI177716. Epub 2015, Mar 9; / Sun Y., Xu L., Huang S., Hou Y., Liu Y. et al., Mir-21 overexpressing mesenchymal stem cells accelerate fracture healing in a rat closed femur fracture model. Biomed Res. Int. 2015; 2015: 412327. doi: 10.1155/2015/412327. Epub 2015, Mar., 23].
Описания исследований по выделению и применению микро РНК из ММСК КМ для лечения печеночной недостаточности в литературе отсутствуют.
Кроме того, следует иметь ввиду, что регулирование процесса восстановительной регенерации в печени не может осуществляться какой либо одной микро РНК (их в настоящее время идентифицировано в организме свыше 1800 типов), т.к. печень представляет собой гистологически сложный орган, состоящий из 5 типов клеток различного происхождения (гепатоциты, купферовские клетки, клетки Ито - звездчатые клетки, эндотелиальные клетки, лейкоциты) и выполняет комплекс важнейших гомеостатических функций (синтетическая, детоксикационная, пищеварительная, выделительная, иммунорегуляторная и др.), взаимодействуя с другими системами организма.
Техническая проблема заключается в повышении качества, надежности и безопасности применения клеточной терапии с использованием стволовых/прогениторных ММСК КМ при лечении (коррекции) печеночной недостаточности.
Технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемого изобретения, заключается в повышении эффективности лечения печеночной недостаточности за счет возможности многократного применения препарата, выделенного из ММСК КМ (аллогенного или ксеногенного) донора, а также в предупреждении осложнений, связанных с применением биотехнологических методов коррекции и профилактики печеночной недостаточности стволовыми/прогениторными клетками - (малигнизация и генетические мутации при имплантации ММСК КМ, быстрая гибель аллогенных и ксеногенных клеток костного мозга) путем использования биологически активного комплекса, содержащего в себе все типы РНК, в том числе все типы регуляторных белок - некодирующихмикро РНК, способного осуществить перенос «регенерационной информации» клеткам поврежденного органа - печени, индуцируя в ней процесс ускоренной и эффективной восстановительной регенерации.
Нами во избежание негативных последствий применения терапии ММСК КМ для повышения качества и безопасности применения биотехнологических методов регенерационной терапии предложено использовать не ММСК КМ, а выделенный из них комплекс биологически активных компонентов, включающий в себя все типы РНК, в том числе все типы регуляторных микро РНК, способных осуществить перенос содержащейся в них «регенерационной информации» клеткам поврежденного органа (печени) и тем самым активизировать (индуцировать) в них восстановительные процессы.
Достоинством предлагаемого изобретения, позволяющим по существу достигнуть более выраженного и надежного лечебного эффекта является:
- отказ от необходимости поиска антиген совместимого донора для получения и использования ММСК КМ, так как суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ здорового донора, обладает иммуно-неспецифичными (видо-неспецифичными) свойствами и может быть получена из ММСК КМ как аутологичного, так и аллогенного и ксеногенного донора;
- возможность проводить (курсовую терапию) путем парентерального многократного применения препарата суммарной РНК до полного выздоровления или ремиссии;
- возможность обеспечить компенсаторную поддержку регенерации печени, стимулируя адаптационную и регенерационную поддержку другим органам (почки, легкие), относящимся к единой системе детоксикации организма;
- возможность обеспечения безопасности проведения регенерационной терапии препаратом суммарной РНК из ММСК КМ, так как введенная РНК, являясь химическим веществом, не может стать объектом малигнизации, генетических мутации, а также утратить свою регуляторную активность.
- возможность проводить эффективную регенерационную терапию различных органов и систем в организме, т.к. суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ, сохраняет универсальность регуляторных свойств этих клеток
Сущность изобретения заключается в следующем.
Нами предложено применение суммарной РНК ММСК КМ млекопитающего, например человека или крупного рогатого скота, для лечения (коррекции) печеночной недостаточности.
Применение суммарной РНК из ММСК КМ млекопитающего (человека) для лечения печеночной недостаточности проводят следующим образом.
Для лечения (коррекции) печеночной недостаточности используют не ММСК КМ донора, а биологически активный комплекс, выделенный из этих клеток. Комплекс содержит суммарную (общую) РНК, в состав которой входят все типы регуляторных РНК (прежде всего микро РНК), обеспечивающие перенос «регенерационной информации», содержащейся в ММСК КМ, клеткам поврежденной печени.
Приводим способ получения суммарной РНК ММСК КМ на примере экспериментального животного - крысы, который аналогичен таковому у человека.
Получение биологически активного комплекса суммарной РНК ММСК КМ начинают с получения мононуклеарной фракции клеток из аспирата костного мозга. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала болынеберцовых и бедренных костей крысы получали клетки костного мозга путем аспирации их шприцем с иглой 18G, содержащим среду для забора (0,5 мл фосфатно-буферного раствора с 50 ЕД/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина).
Суспензию клеток КМ центрифугировали при 1500 об/мин (350g) 5 мин, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов (114 мМ NH4Cl, 7,5 мМ КНСОз, 100 мкМ EDTA) в течение 3 мин и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% телячью эмбриональную сыворотку («HyClonegold», USA), инсулин 0,4 мкМ и 0,25 мг/л гентамицина.
Выделенные клетки, представляли собой фракцию, преимущественно мононуклеарных клеток костного мозга (первичная культура), которые затем высевали в количестве 2,0-2,5 млн. кл/мл в культуральные флаконы.
Затем культуральные флаконы помещали в СО2-инкубатор с 5% концентрацией СО2 и 95% содержанием атмосферного воздуха с повышенной влажностью. Через 2 сут после выделения первичной культуры не прикрепившуюся клеточную взвесь удаляли, а оставшиеся клетки с фибробластоподобной морфологией продолжали культивировать. Замену культуральной среды на свежую, осуществляли каждые 3-4 сут. После образования субконфлюэнтного монослоя клетки однократно отмывали раствором Версена, затем снимали раствором Версена с 0,25% трипсина, ресуспендировали в ростовой среде и разливали в новую культуральную посуду. Для работы использовали клетки после 2-го пассажа, в концентрации 2,5-3,0×106 клеток /мл.
Клеточный материал, представляющий собой прикрепившиеся к пластику распластанные фибробластоподобные клетки - ММСК КМ считался пригодным как для применения при лечении печеночной недостаточности по способу прототипу, так и для получения суммарной РНК при лечении печеночной недостаточности по предлагаемому способу, так как выделенная фракция ММСК КМ сохраняла популяционную активность и не содержала погибшие клетки. Гомогенность культуры ММСК КМ была подтверждена иммуногистохимическим исследованием путем выявления в них коллагена I типа с помощью кроличьих моноклональных антител («Имтэк»).
Далее приступали к выделению суммарной РНК из полученной культуры ММСК КМ (суммарный выход ММСК обычно составлял 8-10×106 клеток) по методике ExtractRNA, разработанной фирмой «Евроген» (Россия). Культуру ММСК КМ после 2-го пассажа снимали раствором Версена с 0,25% трипсина, дважды отмывали средой ДМЕМ без добавок, каждый раз центрифугируя при комнатной температуре при скорости 1500 об/мин в течение 5 мин и удаляли надосадочную жидкость.
Далее к выделенной культуре ММСК (в камере Горяева предварительно подсчитывали количество клеток) добавляли реагент ExtractRNA из расчета 1 мл реагента на 1×106 клеток, инкубировали 15 мин (периодически пипетируя) и центрифугировали при 13400 об/мин 10 мин для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант переносили в новую пробирку и приступали к разделению фаз. Для этого добавляли 0,2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента ExtractRNA, инкубировали смесь в течение 5 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая образец; затем образец центрифугировали при 13400 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре.
В ходе центрифугирования происходило разделение смеси на три фазы: нижнюю - органическую фенол хлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу. РНК находится в верхней водной фазе, которую аккуратно собирали и переносили в чистую пробирку.
Затем приступали к непосредственному выделению РНК. Для этого в водную фазу добавляли 0,5 мл 100% изопропанола на каждый 1 мл использованного реагента (ExtractRNA). Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем аккуратно отбирали супернатант, оставляя осадок РНК на дне пробирки. Далее аккуратно, по стенке пробирки, добавляли 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола, использованного ранее. Полученный образец центрифугировали на максимальной скорости (13400 об/мин) в течение 5 мин. Удаляли этанол пипеткой и осадок выделенной РНК растворяли в 1 мл дистиллированной воды и определяли концентрацию РНК в 100 мкл образца на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Из каждых 8-10 млн исходно использованных ММСК в 1 мл определялось 750-950 мкг РНК. Далее из этого концентрированного раствора РНК готовили рабочие растворы РНК требуемой концентрации для введения в организм с целью коррекции печеночной недостаточности.
Суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ представляет собой биотехнологический продукт высокой степени очистки, который вводят в эффективном количестве парентерально (внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно или интрапортально в паренхиму печени).
Для экспериментального животного - (крысы) рабочий раствор РНК содержал 75-95 мкг РНК/мл (к 0,5 мл концентрированного раствора РНК добавляли 9,5 мл дистиллированной воды). Введение РНК осуществляют в дозе 15-45 мкг на 100 г веса животного (или 150-450 мкг/кг веса животного) трехкратно с интервалами в 1-3 сут между первым и вторым введениями и 2-5 сут между последующими введениями внутрибрюшинно или в паренхиму печени. Т.е. крысе массой 400 г вводят 0,2-0,6 мл рабочего раствора РНК в сутки трехкратно по выше указанной схеме
Использование эффективного количества суммарной РНК, выделенной из ММСК КМ, для человека будет зависеть от массы тела пациента, степени тяжести печеночной недостаточности, особенностей ответной реакции организма на вводимый биологически активный комплекс. Для человека суточная доза суммарной РНК будет находиться в диапазоне 1,0-3,0 мг РНК в сутки (или 1000-3000 мкг РНК в сутки или 16-48 мкг/кг), т.е. эффективная доза РНК для человека будет приблизительно в 10 раз меньше на единицу массы тела, чем у крысы, т.к. известно, что интенсивность метаболизма в организме крысы, которая характеризуется отношением поверхности тела к его массе, приблизительно в 10 раз выше, чем у человека (Л. Проссер, Ф. Браун «Сравнительная физиология животных», 1967, Изд. Мир, 768 с.; В.И. Шумаков, Е.Ш. Штенгольд, Н.А. Онищенко «Консервация органов», Москва, Медицина, 1975, 250 с.).
Для усиления биорегуляторного воздействия и закрепления лечебного эффекта суммарную РНК, выделенную из ММСК КМ, целесообразно вводить в указанной дозе, по меньшей мере, трехкратно с интервалом в 1-3 суток между первым и вторым введениями и 2-5 суток между последующими введениями, количество которых может достигать 10 и более, что необходимо для обеспечения эффективной индукции (активации) перепрограммирования процессов регенерации печени в организме больного с патологического (фиброзирующего) типа на восстановительный. Приготовление рабочего раствора РНК и получение эффективного количества суммарной РНК для человека требует выделения не 8-10 млн ММСК из костного мозга (как для крысы), а 80-100 млн. ММСК из костного мозга здорового человека или животного (особи крупного рогатого скота), из которых, по выше описанной методике выделения суммарной РНК, удается получить в 1 мл водного раствора 8-10 мг (или 8000-10000 мкг/мл) суммарной РНК из ММСК. Рабочий раствор РНК для человека (10 мл) содержал 800-1000 мкг РНК/мл и его готовили, добавляя к 0,5 мл полученного (концентрированного) раствора РНК 9,5 мл дистиллированной воды. Для доставки в организм человека необходимой (терапевтической) дозы РНК достаточно ввести 1,2-3,6 мл рабочего раствора РНК, т.е. 1-3 мг РНК.
Для доказательства возможности применения предлагаемого биологически активного комплекса по заявленному назначению и достижения при этом указанного технического результата приводим следующие данные.
Сравнительное изучение эффективности коррекции печеночной недостаточности по известному способу (внутривенное введение ММСК КМ) и по предлагаемому способу (внутрибрюшинное введение или введение в паренхиму печени суммарной РНК, выделенной из ММСК КМ) выполняли на модели хронической печеночной недостаточности (ХПН).
Для этого создавали модель хронического фиброзирующего повреждения печени у крыс путем длительной (в течение 42 дней) затравки четыреххлористым углеродом (CCL4) по описанной ниже методике. Длительным введением раствора CCL4 достигалось развитие хронического токсического гепатита и стимуляция заместительного регенерационного ответа печени (развитие склероза и фиброза печени). Метод поддается высокой степени стандартизации и является «классической» моделью для изучения регенерации печени при хроническом токсическом повреждении.
Моделирование хронического токсического фиброзирующего повреждения печени проводили на белых крысах самцах породы Вистар (вес к началу затравки 250-300 г, n=85), содержащихся в виварии на смешанном рационе питания со свободным доступом к воде.
Затравку крыс CCL4 проводили под кратковременным эфирным наркозом в интервале между 9-ю и 12-ю часами дня, что исключало суточные колебания митотической активности клеток печени. Подкожные инъекции 60% раствора CCL4 на персиковом масле проводили 2 раза в неделю (понедельник, четверг) в течение 6 недель (42 сут) в дозе 0,3 мл раствора на 100 г веса животного. Первая инъекция проводилась в дозе 0,5 мл 60% раствора CCL4 на 100 г веса животного. Суммарная курсовая доза чистого CCL4 составляла 3,5 мл на 100 г веса животного.
Через трое суток после завершения моделирования ХПН (на 46 сутки от начала моделирования ХПН) всех животных разделили на 3 группы: 1 группа - контроль (ХПН без применения терапии, n=35); 2 группа - ХПН и внутривенное введение ММСК КМ в хвостовую вену в дозе 2,5×106 кл/мл на крысу двукратно с интервалом в 7 сут, т.е. на 4 и 11 сут после завершения моделирования ХПН (группа сравнения, n=20). 3 группа - ХПН и введение суммарной РНК из ММСК (основная группа, n=30). 3 группа состояла из двух подгрупп: 3.1 (n=15), в которой проводилось внутрибрюшинное введение РНК в дозе 15 мкг на 100 г веса животного (крысы), и 3.2 (n=15), в которой проводилось введение РНК в паренхиму печени в дозе 45 мкг на 100 г веса животного (крысы). Инъекции осуществляли трехкратно с интервалом в 1-3 сут между первым и вторым введением и 2-5 сут для последующих введений после завершения моделирования ХПН.
Результаты оценивали в трех группах опытов на 1, 30, 90, 180 и 270 сутки после проведения терапии с помощью биохимических, гистологических и морфометрических методов.
Биохимическими методами исследовали кровь на содержание аланин - аминотрансферазы (АлАТ), аспарагин - аминотрансферазы (АсАТ) и щелочную фосфатазу (ЩФ). Для этого у крысы под эфирным наркозом надсекали кончик хвоста, пипеткой забирали 28-32 мкл крови, капали на специальные тест-полоски Reflotron™, которые сразу же устанавливали в биохимический анализатор Reflotron™ («Roche», Швейцария) (Принцип измерения - рефлексионная фотометрия, точность измерения - ±0.5%, воспроизводимость - <=0.2%, линейность: ±0.05%).
Для гистологического исследования печени животных забивали под эфирным наркозом декапитацией, извлекали фрагмент средней доли печени, разрезали его на кусочки размерами 3×4×5 мм и помещали в раствор Буэна (через 24 часа раствор Буэна меняли на 70% этанол) для фиксации. После завершения фиксации кусочки промывали в проточной воде в течение 2-3 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм наклеивали влажным способом на стекла с поли-L-лизиновым покрытием («Thermo», США). Затем препараты высушивали в течение 48 ч в термостате при 37°С, депарафинировали, регидратировали и окрашивали срезы гематоксилин-эозином и по Маллори (на соединительную ткань).
Морфометрический анализ срезов фрагмента средней доли печени был произведен с помощью морфометрической программы ImageScopeM (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия). Исследуемые изображения получены с использованием микроскопа Leica DM1000 и камеры Leica LTDCH9435 DFC 295 (Leica Camera AG, Германия).
Данным методом определяли:
1. Наличие цирроза (подсчет количества ложных долек).
2. Долю соединительной ткани (в процентном соотношении к общей площади среза печени), кровеносных сосудов и желчных протоков в %.
3. Выраженность жировой дистрофии (оценивали 10 полей зрения среза каждого образца).
4. Количество двуядерных гепатоцитов (на 10 полей зрения среза при увеличении ×400).
5. Количество гепатоцитов с внутриядерными липидными включениями.
Приводим результаты сравнительного исследования эффективности применения ММСК КМ и РНК из ММСК КМ для восстановительной регенерации поврежденной печени. Так как результаты исследования морфофункциональных показателей в подгруппах 3.1 и 3.2 достоверно не различались (в подгруппе 3.2 отмечалась лишь тенденция к повышению темпа регенерационного процесса), они были объединены в общую группу 3
На фиг. 1 представлена динамика АлАТ у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
На фиг. 2. представлена динамика АсАТ у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
На фиг. 3 представлена динамика ЩФ у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
На фиг. 4 представлена динамика формирования ложных долек у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
Результаты гистологического и морфометрического исследования представлены в таблицах 1 и 2 соответственно.
Обозначения:
* - p<0,05 по сравнению с нормой;
* - p<0,05 по сравнению с 30 сутками в контрольной группе.
Обозначения:
** - p<0,05 по сравнению с 30 сутками в контрольной группе;
# - p<0,05 по сравнению с аналогичным сроком в контрольной группе.
Исследование динамики восстановительных процессов в печени в трех группах опытов показали, что сразу после затравки CCL4 во всех трех группах имело место достоверное повышение ферментов цитолитического повреждения - печени - АлАТ, АсАТ и ЩФ - (фиг. 1, 2, 3). Однако в отличие от 1 контрольной группы во 2 и 3 группах уже на седьмые сутки после окончания затравки происходило достоверное снижение в крови ферментов цитолиза, как после первого внутривенного введения ММСК КМ (2 группа), так и после двукратного внутрибрюшинного введения или введения в паренхиму печени суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
К 14 суткам (уже после второго введения ММСК КМ) во 2 группе и после третьего введения суммарной РНК из ММСК КМ в 3 группе, а также к 21 суткам во 2 группе и в 3 группе происходило дальнейшее достоверное снижение уровня цитолитических ферментов печени по сравнению с 1 контрольной группой к этим срокам.
К 28 суткам наблюдения значения АлАТ, AcAT и ЩФ во 2 и 3 группах продолжали снижаться, приближаясь к исходному уровню, тогда как в 1 группе показатели оставались достоверно на более высоком уровне по сравнению с исходными значениями. На протяжении всего этого срока наблюдения достоверных различий в уровне печеночных ферментов между 2 и 3 группой выявлено не было.
Продолжая динамическое наблюдение за содержанием ферментов цитолиза в крови в течение 180 суток, было установлено (фиг. 1, 2, 3), что во 2 и 3 группах значения АлАТ, АсАТ и ЩФ снижались до исходных значений уже к 28-30 дню, тогда как в 1 контрольной группе значения этих показателей нормализовались только через 6 месяцев (к 180 суткам наблюдения).
При гистологической оценке динамики репаративных процессов в печени у животных этих 3-х групп было установлено, что восстановление морфологических показателей печени во всех исследуемых группах происходит в более замедленном темпе, чем восстановление биохимических показателей (ферменты) (таблицы 1, 2).
Так из таблицы 1 следует, что количество гепатоцитов с признаками жировой дистрофии и с дегенерирующими ядрами, а также количество двуядерных гепатоцитов и гепатоцитов с внутриядерными липидными включениями в 1 контрольной группе не нормализуется ни к 180, ни к 270 дню наблюдения.
Во 2 группе (с двукратным введением ММСК КМ) и в 3 группе (с 3-кратным введением суммарной РНК из ММСК КМ) восстановление морфологических показателей происходит более активно: к 180 суткам не все исследуемые показатели возвратились к исходным значениям, но уже на 270 сутки все исследуемые показатели в этих группах не отличались от значений в интактной печени (норма).
В таблице 2 представлены результаты морфометрического определения удельной площади соединительной ткани, пощади кровеносных сосудов и желчных протоков в срезах ткани печени в трех группах опытов при динамическом наблюдении в течение 270 сут. Из таблицы видно, что в 1 контрольной группе на 270 сутки исследуемые показатели были достоверно выше не только по сравнению с интактными животными, но и по сравнению с 30 сутками у животных этой же группы, свидетельствуя об усилении процессов склерозирования ткани печени. Во 2 и 3 группах имеет место постепенная нормализация исследуемых показателей и к 270 суткам они в плотную приближаются к значениям у интактных животных, причем часть из этих показателей имеет достоверно более низкие значения, чем аналогичные показатели в 1 - контрольной группе к 270 суткам наблюдения.
Достоверных различий в динамике исследуемых показателей во 2 и 3 группах обнаружено не было, хотя в 3 группе имела место тенденция к более выраженному снижению площади соединительной ткани и площади кровеносных сосудов, что может быть связано с 3-кратным введением суммарной РНК из ММСК КМ в течение первого месяца после моделирования печеночной недостаточности. Подсчет ложных долек в течение 180 сут (в баллах) также подтвердил (фиг. 4), что во 2 и 3 группах имеет место процесс дефиброзирования ткани печени, тогда как в 1-группе он практически отсутствует. Достоверные различия в содержании ложных долек в печени животных 2 и 3 групп не выявлены.
Таким образом, с помощью биохимических, морфологических и морфометрических исследований ткани печени в динамике после моделирования ХПН нами установлено, что двукратное внутривенное введение ММСК КМ (2 группа) и 3-кратное внутрибрюшинное введение или введение в паренхиму печени суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа) на всех исследуемых сроках обеспечивают постепенную коррекцию нарушенных показателей печени и индуцируют в ней восстановительные процессы по сравнению с 1 контрольной группой.
Также констатировали, что достоверные различия в динамике восстановления биохимических и морфологических показателей печени во 2 и 3 группах отсутствовали. Этот факт свидетельствует о том, что двукратное внутривенное введением ММСК КМ (суммарная доза 5,0×106 кл. на животное) и 3-кратное внутрибрюшинное введение или введение в паренхиму печени суммарной РНК из ММСК КМ (суммарная доза 45 мкг на 100 г животного в подгруппе 3.1 и суммарная доза 135 мкг на 100 г животного в подгруппе 3.2) идентичны по своему биологическому регенераторному воздействию на печень.
Учитывая сходство патогенетических механизмов развития печеночной недостаточности в клинике и при создании ее адекватной модели в эксперименте (как показано выше), представленные результаты эксперимента могут быть правомерно экстраполированы на человека.
Таким образом, применение суммарной РНК из ММСК КМ для лечения (коррекции) печеночной недостаточности будет способствовать безопасной восстановительной регенерации печени, т.к. препарат суммарной РНК не несет в своей структуре малигнизирующих и мутационных свойств, не обладает иммуноспецифичностью и пригоден для курсового применения.
Claims (3)
1. Применение суммарной РНК из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности.
2. Применение по п. 1, в котором указанным млекопитающим является человек.
3. Применение по п. 1, в котором указанным млекопитающим является крупный рогатый скот.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128292A RU2655761C1 (ru) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Применение суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128292A RU2655761C1 (ru) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Применение суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2655761C1 true RU2655761C1 (ru) | 2018-05-29 |
Family
ID=62559994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017128292A RU2655761C1 (ru) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Применение суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2655761C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739996C1 (ru) * | 2020-06-16 | 2020-12-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Способ коррекции хронической печёночной недостаточности |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2425645C1 (ru) * | 2010-03-18 | 2011-08-10 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности |
| US20160074437A1 (en) * | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Batu Biologics, Inc. | Immunological treatment of liver failure |
| RU2586952C1 (ru) * | 2015-07-20 | 2016-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лечения печеночной недостаточности |
-
2017
- 2017-08-08 RU RU2017128292A patent/RU2655761C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2425645C1 (ru) * | 2010-03-18 | 2011-08-10 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности |
| US20160074437A1 (en) * | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Batu Biologics, Inc. | Immunological treatment of liver failure |
| RU2586952C1 (ru) * | 2015-07-20 | 2016-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лечения печеночной недостаточности |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIU Y et al., Precise regulation of mir-210 is critical for the cellular homeostasis maintenance and transplantation efficacy enhancement of mesenchymal stem cells in acute liver failure therapy, Cell Transplant. 2017 May 9; 26(5):805-820 - . * |
| LIU Y et al., Precise regulation of mir-210 is critical for the cellular homeostasis maintenance and transplantation efficacy enhancement of mesenchymal stem cells in acute liver failure therapy, Cell Transplant. 2017 May 9; 26(5):805-820 - реферат. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739996C1 (ru) * | 2020-06-16 | 2020-12-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Способ коррекции хронической печёночной недостаточности |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20170182100A1 (en) | Conditioned medium of liver progenitor cells | |
| CN105535022A (zh) | 外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途和药物组合物 | |
| CN106916783B (zh) | 肌肉干细胞体外培养方法及其应用 | |
| EP3013943B1 (en) | Cell populations having immunoregulatory activity, methods for the preparation and uses thereof | |
| RU2650209C1 (ru) | Способ коррекции печеночной недостаточности в эксперименте | |
| NZ727950A (en) | Mesenchymal stromal cells for treating sepsis | |
| JP2020505442A (ja) | 脱毛防止又は発毛促進用注射用組成物 | |
| WO2020103651A1 (zh) | 间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用 | |
| CN113307845B (zh) | 促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽及其用途 | |
| EP0953633A1 (en) | Cell culturing method and medium for producing proliferated, normal, differentiated human liver cells | |
| Freedman et al. | Eggs of Schistosoma mansoni stimulate endothelial cell proliferation in vitro | |
| RU2655761C1 (ru) | Применение суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности | |
| KR860000898B1 (ko) | 인체 융모막성선 자극호르몬(Human Chorionic Gonadotropin)의 제조방법 | |
| Haynes et al. | Mechanisms of corticosteroid action on lymphocyte subpopulations: V. Effects of in Vivo hydrocortisone on the circulatory kinetics and function of naturally occurring and mitogen-induced suppressor cells in man | |
| Kogan et al. | Uncovering the molecular identity of cardiosphere-derived cells (CDCs) by single-cell RNA sequencing | |
| He et al. | Full-thickness tissue engineered skin constructed with autogenic bone marrow mesenchymal stem cells | |
| CN116077448B (zh) | 人间充质干细胞注射液及其应用 | |
| RU2655528C1 (ru) | Способ лечения печеночной недостаточности | |
| Li et al. | An improved two-step method for extraction and purification of primary cardiomyocytes from neonatal mice | |
| US20170095593A1 (en) | Adipose-derived stem cell product | |
| CN116650530A (zh) | Cd146+间充质干细胞亚群的aclf制药用途 | |
| UA91135C2 (ru) | Пептид, имеющий иммуногеропротекторное действие, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения | |
| CN115820548A (zh) | 一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用 | |
| Saxén et al. | Host factors in cell culture: further studies on the growth-controlling action of fresh human serum | |
| CN110731970A (zh) | 一种治疗过敏性鼻炎的细胞制剂 |