CN102901826A - 人类潜在新细胞因子tmem98及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供人类潜在新细胞因子TMEM98的应用。人TMEM98基因编码一种非经典分泌蛋白，其同时具有细胞膜定位形式和细胞外分泌形式，其在多种炎性因子刺激后表达上调，表明其与炎症的发生、发展密切相关。体内及体外功能研究发现人TMEM98蛋白能促进小鼠Th1细胞在体内及体外的分化、促进IFN-γ的分泌，抑制CD46和CD59的表达并且对小鼠黑色素瘤有抑制作用。因此，人TMEM98蛋白可能作为炎症治疗的新靶点和抗肿瘤药物，并且可通过其功能发挥抑制和/或治疗多种炎症、感染、纤维化作用、过敏性疾病和自身免疫疾病的作用。

Description

人类潜在新细胞因子TMEM98及其用途

技术领域

本发明涉及疾病的诊断及治疗领域，特别涉及人类潜在细胞因子TMEM98在免疫相关疾病(例如炎症)以及肿瘤中的诊断和治疗中的应用。

背景技术

人体免疫系统历经30亿年的进化，形成复杂而精细的调控系统，在机体具有至关重要的作用。它对外能够防御病原微生物的入侵，对内则能清除衰老、病变和死亡的细胞，维持内环境的稳定。免疫系统通过固有免疫应答和适应性免疫应答完成上述功能。固有免疫应答是机体抵御病原体入侵的第一道防线，主要包括单核-巨噬细胞、树突状细胞(Dendritic cell，DC)等，在机体早期抗感染过程中发挥重要作用，并能够启动适应性免疫应答，影响其应答类型。适应性免疫应答是指抗原特异性T细胞和B细胞分别通过TCR和BCR识别抗原、活化、增殖、分化为效应细胞，发挥生物学效应的过程，包括T细胞介导的细胞免疫应答和B细胞介导的体液免疫应答。

细胞因子是由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长分化、调节免疫功能和生理反应并参与病理反应的小分子蛋白质，通过与受体结合发挥作用。细胞因子主要包括白细胞介素(Interleukin，IL)、集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor，CSF)、干扰素(Interferon，IFN)、肿瘤坏死因子(Tumor-Necrosis Factor，TNF)等，是免疫细胞之间的交流语言，对固有免疫应答和适应性免疫应答均发挥重要的调控作用。

CD4⁺T细胞主要包括Th1、Th2、Th17以及Treg等，其中Th1和Th2是最早发现的两类细胞，Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、LTα等，通过细胞免疫应答在抗病毒、抗胞内病原体感染、抗肿瘤、迟发型超敏反应中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等，通过辅助B细胞产生抗体参与体液免疫应答。Th17主要分泌IL-17A、IL-21、IL-17F、IL-22等，在抗胞外细菌和真菌感染中具有重要作用，并参与炎性肠病等自身免疫病的发生、发展。iTreg主要分泌TGF-β、IL-35、IL-10，在免疫耐受、淋巴细胞稳态、调节免疫应答方面发挥重要功能。

多种细胞因子参与了Th1、Th2细胞的分化调节。如IL-12、IL-4分别是决定Th1、Th2分化所必需的细胞因子。其次，细胞因子对已分化的CD4⁺T细胞也具有调控作用，如IL-12与IL-18能够以TCR非依赖的方式协同促进Th1细胞产生IFN-γ。此外，细胞因子还是Th细胞发挥作用的主要方式，Th1、Th2细胞产生的特征性细胞因子分别是IFN-γ、IL-4。深入研究Th1、Th2细胞的分化、生理和病理功能以及调控机制及两者之间的平衡具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

细胞因子在肿瘤发生过程中亦发挥重要功能。目前已有多种细胞因子药物应用于临床肿瘤治疗。IFN-α和IL-2是FDA批准的用于肿瘤治疗的细胞因子。IL-2是第一个被证明具有肿瘤治疗作用的细胞因子，其主要用于治疗肾细胞癌和黑色素瘤，已经成功上市。IL-2通过促进细胞毒性的NK细胞和CD8+T细胞的增殖、活化而发挥抗肿瘤作用，IL-2不仅在肾细胞癌和黑色素瘤等免疫敏感的肿瘤中具有治疗作用，在其它类型肿瘤中也发挥抗肿瘤作用。此外，还有多种细胞因子的抗肿瘤研究处于临床研究的不同阶段，有望用于临床肿瘤治疗中。其中IL-12和IL-21是抗肿瘤研究中比较热门的两个细胞因子。因此，发现新细胞因子并研究其功能和机制不仅有利于进一步全面了解肿瘤的发生机制，也将为其治疗提供新的选择。

目前利用基因工程技术生产的重组细胞因子、可溶性受体以及抗细胞因子或细胞因子受体抗体等在治疗肿瘤、造血障碍、感染等已收到良好疗效。重组细胞因子作为药物具有很多优越之处，如：细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和免疫功能，很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物制剂，已成为某些疑难病症不可缺少的治疗手段。目前已批准生产的细胞因子药物包括干扰素α、β、γ，EPO，GM-CSF，G-CSF，IL-2等。另外，据不完全统计，目前国际上至少已有26个基因组药物进入临床研究，包括新的重组细胞因子、重组可溶性受体等。同时，细胞因子或者细胞表面受体检测也是判断机体免疫功能和免疫细胞分化的指标，在许多疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等方面具有重要价值。

2006年5月18日，Nature杂志公布了人类1号染色体的精细图谱，标志着人类基因组计划的完成，生物医学研究进入功能基因组时代。从2008年开始，我们与国家人类北方基因研究中心合作，利用免疫基因组学策略，通过生物信息学遴选、功能筛选和系统性功能研究发现了人类新基因TMEM98，其编码一种非经典分泌蛋白，并具有细胞膜定位形式；我们利用多肽免疫，制备了抗TMEM98的多克隆抗体，该抗体可以用于免疫沉淀、免疫荧光、Western blot和ELISA分析；TMEM98在活化的CD4⁺T细胞中表达上调，在IL-1β刺激的A549、LPS刺激的PBMC中表达上调，在单核细胞分化为DC后表达明显上调；功能研究发现其编码的分泌蛋白能促进小鼠Th1细胞在体内及体外的分化，能够抑制前列腺癌细胞系DU145中CD46、CD59的表达，并且体内功能研究发现人TMEM98原核蛋白对小鼠黑色素瘤有抑制作用。因此，TMEM98真核及原核表达蛋白、抗体在炎症、感染性疾病(尤其是抗胞内细菌感染及抗病毒感染)、肿瘤的辅助诊断及治疗方面具有临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于阐明人类TMEM98基因在炎症细胞中的表达特点、分泌蛋白的N端切割位点及人TMEM98蛋白对炎症、Th1细胞分化、IFN-γ水平、补体系统以及对小鼠黑色素瘤的影响。本发明还提供人TMEM98蛋白的检测方法，及该蛋白在炎症、感染性疾病(尤其是抗胞内细菌感染及抗病毒感染)、肿瘤的辅助诊断及治疗方面的应用。

本发明显示，人类TMEM98在多种炎性因子刺激后表达上调，且其编码的分泌蛋白能促进小鼠Th1细胞在体内及体外的分化，促进IFN-γ的分泌，IFN-γ是促炎细胞因子，表明其能促进炎症的发生与发展，能够作为炎症治疗的新靶点用于炎症相关的实验模型中。人TMEM98编码一种非经典分泌蛋白，同时具有细胞膜定位形式和细胞外分泌形式；体内及体外功能研究发现其在活化的CD4⁺T细胞中表达上调，其编码的分泌蛋白可以抑制补体调节蛋白CD46和CD59的表达；体内功能研究发现人TMEM98原核蛋白还对小鼠黑色素瘤有抑制作用。由于Th1通过细胞免疫应答在抗病毒、抗胞内病原体感染以及抗肿瘤、引发皮肤迟发型超敏反应中发挥重要功能，并参与类风湿性关节炎、糖尿病等自身免疫病的发生、发展，而IFN-γ对于某些过敏性疾病、自身免疫性疾病、细菌真菌感染疾病、病毒性感染疾病、寄生虫感染、纤维化作用和肿瘤具有抑制和治疗效果，抑制CD46和CD59蛋白的表达可以使补体系统发挥抗肿瘤作用，这说明人TMEM98在炎症、感染性疾病(尤其是抗胞内细菌感染及抗病毒感染)、肿瘤、纤维化作用、过敏性疾病和自身免疫疾病的辅助诊断及治疗方面的应用。

除非特别注明，为了便于区别，在本说明书中(而非权利要求书中)用全部字母都大写的TMEM98表示人类TMEM98，仅首字母大写的Tmem98表示小鼠Tmem98。

附图说明

图1所示为TMEM98多克隆抗体的鉴定。其中，图1的A为用Western blot的方法检测TMEM98多克隆抗体对超表达人TMEM98的293T细胞裂解液中蛋白的识别能力。由于人与小鼠第一段、第二段多肽的氨基酸序列一致，图1的B所示为用Western blot的方法检测针对TMEM98第一段、第二段多肽的多克隆抗体对超表达小鼠Tmem98的293T细胞裂解液中蛋白的识别能力。图1的C所示为在超表达TMEM98的293T细胞上清中加入TMEM98针对第一段多肽的多克隆抗体进行免疫共沉淀，之后用Western blot方法分别检测未加抗体组上清及抗体免疫共沉淀之后上清中的人TMEM98蛋白量的情况。图中标注34kDa为蛋白marker，以明确目的蛋白在图中位置。图1的D所示为用纯TMEM98蛋白作为抗原，针对第一段多肽的多克隆抗体作为一抗，HRP标记抗兔IgG作为二抗所做的间接免疫荧光，来鉴定针对第一段、第二段多肽的多克隆抗体的特异性及亲和力。并用此方法以超表达pcDB及人TMEM98的293T细胞上清为包被抗原检测其中人TMEM98蛋白含量。

图2所示为TMEM98表达谱分析的结果。其中，图2的A所示为TMEM98在Clontech公司制备的人正常组织及免疫器官cDNA文库中的表达情况。图2的B所示为TMEM98在各个免疫细胞系中的表达情况分析。图2的C所示为TMEM98在构建的3种细胞炎症模型中(包括LPS刺激的PBMC、IL-1β刺激的A549、LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞)的动态表达情况。图2的D左图所示为用流式分析在抗人CD3/CD28刺激的PBMC中CD4阳性的细胞亚群中TMEM98的蛋白水平表达情况；右图所示为TMEM98在PBMC、单核细胞(monocyte)、未成熟的DC细胞(imDC)、Zymosan刺激成熟的DC细胞(mDC-zymosan)及LPS刺激成熟的DC细胞(mDC-LPS)中的mRNA水平表达情况。

图3所示为TMEM98的亚细胞定位分析。其中，图3的A所示为用Confocal的方法分析TMEM98在293T细胞中的定位情况。分别包括用带GFP标签的TMEM98真核表达质粒，及用抗TMEM98第一段多肽的多克隆抗体所做的间接免疫荧光。用Hochest染细胞核。图3的B所示为用抗TMEM98第一段多肽的多克隆抗体进行间接免疫荧光，用流式的方法检测TMEM98在细胞膜定位情况。IgG为阴性对照，抗c-myc抗体为阳性对照。

图4所示为TMEM98分泌验证、真核蛋白鉴定。其中，图4的A所示为用Western blot的方法检测超表达pcDB和TMEM98的293T细胞上清及细胞裂解液中TMEM98蛋白表达情况，及加入经典分泌蛋白抑制剂BFA后293T细胞上清及细胞裂解液中TMEM98蛋白表达情况，右图所示为选用一经典分泌蛋白作为阳性对照。β-actin作为内参。图4的B所示为表达纯化的用于后续功能试验的TMEM98真核蛋白(见28kDa附近条带)的PAGE图。

图5所示为表达纯化的用于后续功能试验的人TMEM98原核蛋白的PAGE图。图中标注23.1kDa为去除GST标签的人TMEM98原核蛋白实际分子量大小。

图6所示为在DU145细胞(ATCC)中分别加入人TMEM98真核及原核蛋白后用流式检测细胞膜表面CD46及CD59的蛋白水平表达变化情况。其中CD59表达变化情况选用IFN-γ作为阳性对照。图中Counts表示细胞计数。

图7所示为人TMEM98真核表达蛋白在小鼠Th1细胞体外分化中的作用。其中图7的A左图所示为用流式的方法检测加入不同浓度人TMEM98蛋白后Th1细胞IFN-γ表达情况；右图所示为用ELISA方法检测加入不同浓度人TMEM98蛋白后Th1细胞IFN-γ表达情况。图7的B所示为在分化过程中不加入小鼠IL-12情况下加入不同浓度的人TMEM98蛋白后用流式的方法检测IFN-γ的表达变化情况；右图所示为用ELISA的方法检测IFN-γ表达变化情况的结果。

图8所示为人TMEM98原核蛋白在小鼠DTH模型中的作用。其中，图8的A所示为mBSA激发后24、48、72小时小鼠足垫肿胀情况，横坐标轴表示时间点(timepoint)，并选用GST标签蛋白作为阴性对照。图8的B所示为用ELISA的方法检测小鼠血清(左图)以及体外加入mBSA的小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的分泌情况。图8的C所示为分离小鼠脾细胞之后用流式的方法对其中CD8阳性细胞比例进行检测的结果。

图9所示为人TMEM98原核蛋白在小鼠黑色素瘤模型中的作用。处理小鼠后取出肿瘤观察其重量(左图)、体积(右图)的变化情况。其中，右图中的标尺刻度表示肿瘤大小，右图所示分别为PBS处理后及TMEM98处理后小鼠体内的黑色素瘤。

具体实施方式

实施例

材料与方法

1 生物信息学分析

使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜区分析；SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于信号肽分析；GNF SymAtlas(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/)用于表达谱分析；使用DNAstar软件分析蛋白质抗原性、亲疏水性、表面暴露性等。

2 基因的cDNA的克隆

2.1 人TMEM98基因的cDNA克隆

通过生物信息学分析，发现UniGene：Hs.3447，其对应基因为TMEM98，GeneID：26022，有两个转录剪接体(transcript variant1和transcript variant2)，编码蛋白序列相同。为一未知功能人类新基因，利用Human est数据库通过BLASTn方法进行序列校正无误，然后根据RefSeq NM 015544设计人TMEM98基因全长阅读框架的巢式特异引物：

外侧正向引物5’-TTGCCACTTCCAGCAGCTTTAGC-3’

外侧反向引物5’-CAGCCGTGGAGAACAACTAACTCTA-3’

内侧正向引物5’-GCGGCCGCCACCATGGAGACTGTGGTGATTGTTGC-3’

内侧反向引物5’-GGTACCGCAATTGCAGACTGCTCCTGCAG-3’

用上述引物，以正常人外周血单个核细胞(PBMC)cDNA文库为模板进行第一次PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

反应条件(touchdown，巢式PCR)：

94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，65℃～60℃逐步退火，10循环，72℃延伸1分钟；最后60℃退火25循环，最后在72℃下延伸10分钟。

一扩产物用双蒸水稀释50倍作为模板进行第二次PCR扩增反应，条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

反应条件(touchdown，巢式PCR)：

94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，65℃～60℃逐步退火，10循环，72℃延伸1分钟；最后60℃退火25循环，最后在72℃下延伸10分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pGEM-T EASY载体(Promega，A1360)在16℃下连接8小时，连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序。

2.2 小鼠Tmem98基因的cDNA克隆

根据小鼠同源基因Tmem98(UniGene：Mm.27682，GeneID：26022)的RefSeq序列NM_015544设计编码区(ORF)巢式PCR引物，如下：

外侧正向引物5’-TGCAATTGAGCTTCCACCTG-3’

外侧反向引物5’-GGCCGACAGAGCTCTAGAGAAC-3’

内侧正向引物5’-CCGGAATTCCACCATGGAGACTGTGGTGATCGTC-3’

内侧反向引物5’-CGGGGTACCTTAAATGGCCGACTGTTCCTGC-3’

内侧反向引物(myc-his)5’-CGGGGTACCGA AATGGCCGACTGTTCCTGCAG-3’

用上述引物，以正常小鼠组织器官cDNA文库为模板进行第一次PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

反应条件(touchdown，巢式PCR)：

94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，63℃～58℃逐步退火，10循环，72℃延伸1分钟；最后58℃退火25循环，最后在72℃下延伸10分钟。

一扩产物用双蒸水稀释50倍作为模板进行第二次PCR扩增反应，条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

反应条件(touchdown，巢式PCR)：

94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，63℃～58℃逐步退火，10循环，72℃延伸1分钟；最后58℃退火25循环，最后在72℃下延伸10分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pGEM-T EASY载体(Promega，A1360)在16℃下连接8小时，连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序。

3 RNA提取、RT-PCR和Real-time PCR

收集未刺激及炎性因子IL-1β(购自R&D公司)刺激3h、6h、24h的A549(ATCC)细胞，未刺激及炎性因子LPS(Sigma)刺激6h的PBMC(peripheral blood mononuclearcell，外周血单个核细胞)(北京市红十字血液中心提供)，未刺激及炎性因子LPS刺激2h、4h、6h的小鼠腹腔巨噬细胞(腹腔注射3％硫代乙醇酸钠每只C57小鼠2ml，48小时后断颈处死固定，向腹腔内注射5mlPBS，轻柔腹腔后打开腹腔回收PBS，2000rpm，4℃离心获取腹腔巨噬细胞)。使用TRIzol提取总RNA，用Reversetranscript^TM kit(Fermentas)逆转录合成单链cDNA文库。

4 表达谱分析

为了分析TMEM98在正常组织器官、免疫细胞系中的mRNA表达水平及其在体外炎症模型细胞中mRNA水平的变化情况，我们使用Clontech公司制备的人正常组织cDNA文库以及制备的不同的免疫细胞系cDNA文库和炎性因子刺激的A549、PBMC和小鼠腹腔巨噬细胞cDNA文库，用2中巢式PCR扩增条件对人TMEM98进行扩增；使用小鼠5’引物(5’-TGCAATTGAGCTTCCACCTG-3’)与3’引物(5’-GGCCGACAGAGCTCTAGAGAAC-3’)对小鼠Tmem98进行扩增，扩增条件为94℃(5分钟)→94℃(30秒)，58℃(30秒)，72℃(30秒)，扩增30个循环→72℃(7分钟)；使用5’引物(5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’)与3’引物(5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’)扩增GAPDH作为内参，扩增条件为94℃(5分钟)→94℃(40秒)，58℃(40秒)，72℃(40秒)，扩增20个循环→72℃(7分钟)。

5 真核细胞表达质粒的构建

5.1 真核细胞表达质粒pcDNA3.1B-TMEM98-myc-his的构建

为对人TMEM98进行功能研究，首先构建了含有人TMEM98 cDNA的真核表达质粒：pcDNA3.1B-TMEM98-myc-his(pcDB-TMEM98-myc-his)。使用Not I和Kpn I酶切pGEM-T-TMEM98(来源见实施例2.1)重组质粒，回收目的基因片断，并连接到经过Not I和Kpn I处理的真核表达载体pcDNA3.1-myc/his(-)B(Invitrogen，V85520)，用测序方法对重组子进行鉴定证实正确后，即得到pcDB-TMEM98-myc-his(带有c-myc和his标签)重组质粒。

5.2 真核细胞表达质粒pEGFP-N1-TMEM98的构建

用Not I和Kpn I分别酶切真核细胞表达质粒pcDB-TMEM98-myc-his与真核表达载体pEGFP-N1(购自Clontech公司)，将酶切后的人TMEM98片段与载体在16℃下连接8小时，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含卡那霉素的LB平板培养基上生长，挑选生长的菌落，提取质粒，PCR鉴定，挑选阳性克隆，通过测序(使用ABIPRISM 3700DNA分析仪，同上)，选出正确插入序列的克隆，命名为pEGFP-N1-TMEM98(其C端带有GFP标签)。

5.3 真核细胞融合表达质粒pYD11-TMEM98-hFc的构建

使用EcoRI，BamHI酶切TMEM98片段和pYD11载体(购自加拿大国家研究院生物技术研究所)，将片段与载体用胶回收试剂盒纯化后，在16℃下连接8小时，转化大肠杆菌XL-1 Blue，转化物在含卡那霉素的LB平板培养基上生长，挑选生长的菌落，提取质粒，PCR鉴定，挑选阳性克隆，通过测序(同上)，pYD11-TMEM98-hFc为C端带有hFc标签的人TMEM98真核细胞表达质粒。

5.4 真核表达质粒pcDB-Tmem98-myc-his的构建

为了检测小鼠Tmem98的体内功能，首先分别构建含有小鼠Tmem98 cDNA的真核表达质粒：pcDNA3.1B-Tmem98-myc-his(pcDB-Tmem98-myc-his)及pcDNA3.1B-Tmem98(不与Myc/His标签融合)。用EcoRI(TaKaRa)和Kpn I(TaKaRa)直接从重组质粒pGEM-T-Tmem98(fusion)(来源见实施例2.2)和pGEM-T-Tmem98(stop)(来源见实施例2.2)载体酶切目的片断，进一步连接到经EcoRI和KpnI酶切处理的pcDNA3.1/mycHis(-)B(Invitrogen，V85520)载体，对重组子进行测序验证，得到pcDB-Tmem98-myc-his(带有c-myc和his标签)和pcDB-Tmem98重组质粒。

6 原核表达质粒的构建

为了进行人TMEM98的功能研究，根据N端测序的结果我们构建了含有人TMEM98 cDNA的原核表达载体：pGEX4T-3-TMEM98。用EcoRI/SalI酶切pGEX4T-3载体(购自GE Healthcare公司)及pcDNA3.1B-TMEM98-myc-his，之后连接得到pGEX4T-3-TMEM98原核表达质粒。pGEX4T-3-TMEM98表达的重组蛋白为GST-TMEM98，即蛋白的N端带有GST标签，而GST标签与人TMEM98目的蛋白之间有一个凝血酶的酶切位点，便于酶切与纯化。

7 质粒提取

实验中所用质粒均使用QIAGEN Maxi(Endo Free)纯化柱制备。小提纯化的质粒转化大肠杆菌XL1 blue后涂至相应抗性的细菌培养皿上，14-16小时后挑单细菌菌落于1ml抗性培养基中，37℃摇床(300转/分钟)培养8小时，扩大培养体系至100mL，继续培养14～16小时；6,000g离心10分钟收获细菌。加入10ml P1(含0.5mg/mL RNase)，充分重悬后加入10ml P2，翻转4-6次，室温孵育5分钟，加入10ml 4℃预冷的P3，翻转4-6次，将裂解液倒入滤筒，室温10分钟，收集滤过液，加入2.5mlER，翻转约10次混合，冰浴30分钟；用10ml QBT预先平衡Qiagen纯化柱，将上述裂解液过柱，用30ml QC洗涤纯化柱，重复1次；加入15ml QN抽提质粒，之后加入10.5ml室温异丙醇到抽提的DNA中并混合，4℃，15000g，离心30分钟，小心弃上清；用5ml 70％室温的去内毒素乙醇洗涤DNA沉淀，15000g，离心30分钟，小心弃上清，空气干燥10分钟后加入400μl的超纯水，待沉淀完全溶解后移入EP管；紫外分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳检测质量，高速离心除菌并分装备用。过程中所用离心管等器皿均经过去内毒素处理。

8 重组真核细胞表达蛋白人TMEM98的表达纯化

在293T细胞中表达与纯化人TMEM98分泌蛋白。将293T细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基铺在10cm培养皿中，在5％CO₂、37℃的培养箱中培养24小时。使用Vigofect阳离子转染法转染目的基因pcDB-TMEM98-myc-his真核表达质粒。转染24小时后用常温的1×PBS洗涤细胞一次，更换新鲜的无血清培养基(但含有低蛋白的培养细胞因子)，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。48小时后收集细胞培养上清，于4℃，800rpm离心10分钟，去除细胞培养上清的细胞，弃沉淀，再于4℃，12000g离心15分钟，去除上清中的小颗粒物质，留取处理后的细胞培养上清。

用Ni²⁺柱料纯化上述处理后的细胞培养上清：先将上清经过0.45μm滤器过滤后，在上清中加入咪唑(5mM)/NaCl(200mM)，将上清装入高压过的液体瓶，采用输液器使上清与柱料结合，以排除纯化过程中内毒素的污染，流速控制在10滴每分钟，然后用平衡缓冲液【咪唑(20mM)/NaCl(200mM)in 1×PBS(PH7.4)】冲洗柱料，以洗去未结合的杂蛋白，至分光回至基线后，用洗脱液【咪唑(500mM)/NaCl(200mM)in 1×PBS(PH7.4)】洗脱结合蛋白，使用超滤管除盐并将蛋白浓缩至500μl，吸出蛋白，于4℃，12000rpm离心20分钟除菌，取上清分装保存于-80℃待用，整个过程均在无菌密闭条件下完成。

取5μl蛋白用BCA方法对其进行蛋白定量，用SDS-PAGE和鲎实验检测蛋白质纯度和LPS的残留情况，通常保证蛋白质纯度≥95％，LPS的残留量＜1EU/ug。

9 重组真核细胞表达蛋白TMEM98-hFc的表达纯化

用Vigofect阳离子转染法转染pYD11-TMEM98-hFc真核表达质粒至293T细胞。转染8小时后常温PBS洗涤细胞，更换新鲜的无血清培养基，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。48小时后收集细胞培养上清于无菌的新离心管中，于4℃，800rpm离心10分钟，去除细胞，4℃，12000g离心15分钟，去除细胞碎片，取处理后的细胞培养上清。

采用Protein G柱进行目的蛋白纯化：先将上清经过0.2μm滤器过滤后，与柱料在4℃孵育过夜。上清与柱料结合后，用20倍体积PBS冲洗柱料，以洗去未结合的杂蛋白。再用1倍体积洗脱液与柱料孵育15分钟后洗脱结合蛋白。收集洗脱液于透析袋中，用预冷的1×PBS(PH7.4)4℃透析两次，每次3小时，然后吸出蛋白，于4℃、12000rpm离心20分钟除菌，取上清分装保存于-80℃待用。

蛋白用BCA方法对其进行蛋白定量，取部分样品加入蛋白上样缓冲液，于100℃水浴煮5分钟，进行SDS-PAGE以及Western blot，鉴定纯化的蛋白纯度。

10 重组原核细胞表达蛋白TMEM98的表达纯化

原核表达质粒pGEX4T-3-TMEM98转化大肠杆菌BL21，转化物LB平板培养基(Amp抗性)上生长，牙签挑单菌落接于1.25ml LB(Amp抗性)中，37℃，300rpm，过夜培养，然后按1％量转接入125ml 2×YP中(含Amp 125ul)，37℃，300rpm，待OD值到0.7～0.8时，加入IPTG(终浓度0.2mM)，22℃，300rpm，诱导表达6小时。

首先取1ml诱导后菌液进行小量鉴定，8000rpm离心10分钟，200ul水溶离心后的菌体，超声裂菌5次(400w，10s超声，10s间隔)，12000rpm，4℃，5分钟离心，取100ul上清，SDS-PAGE电泳。

然后进行大量纯化，收集诱导后的GST-rTMEM98工程菌，用PBS洗涤一次，6500rpm离心20分钟，弃上清取沉淀，用PBS重悬菌体(PBS 15ml/100ml培养基)。超声裂菌90次(400w，10s超声，10s间隔，冰浴)，12000rpm，4℃，20分钟离心，弃沉淀，留上清，上清过0.45um滤膜。取1ml Glutathione-Sepharose4B装柱，用去离子水洗去柱料中的保存液，再用PBS平衡，将滤过的超声上清加到平衡的柱子上，控制流速3ml/分钟左右。上样后，用PBS洗柱至基线，加洗脱液(20Mm还原型谷胱甘肽，50-100M Tris溶于水，pH调至8.0)封闭柱子下面的出液阀，孵育10分钟，将洗脱液置于透析袋中，用预冷的1×PBS(pH7.4)4℃透析三次，每次至少3小时，然后于4℃使用超滤管浓缩蛋白至500μl，吸出蛋白，于4℃，12000rpm离心20分钟除菌，取上清分装保存于-80℃待用。

用DEAE柱对上述三种重组蛋白进行去除内毒素处理：先用PBS平衡DEAE柱，然后将透析过的蛋白过柱，控制流速3ml/分钟左右，采用氯化钠梯度洗脱，留取各个梯度的洗脱液，SDS-PAGE验证最佳洗脱条件，用超滤管将洗脱蛋白进行除盐浓缩处理，然后于4℃，12000rpm离心20分钟除菌，取上清分装保存于-80℃待用。

取5μl蛋白用BCA方法对其进行蛋白定量，用SDS-PAGE和鲎实验检测蛋白质纯度和LPS的残留情况，保证蛋白质纯度≥95％，LPS残留量＜1EU/ug。

11 TMEM98多肽设计、合成，TMEM98多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

根据亲水性、抗原指数、位于表面的概率三条原则设计合成三段多肽(杭州中肽生化有限公司)：

30-60(31AA)RYCRPRDLLQRYDSKPIVDLIGAMETQSEPS

134-159(26AA)RISPRVDDVVKSMYPPLDPKLLDARTC

206-225(20AA)ASEPDKGLPGPEGFLQEQSAC

用合成的TMEM98三段多肽免疫动物。选用成年雄性新西兰兔，初次免疫将300ug的抗原用PBS稀释至1ml后与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，于两足部各0.25ml皮下注射，其余后背部皮下多点(6点)注射。之后每3周加强免疫一次，用量同前，全部后背部皮下多点(8点)注射。第三次加强免疫后10天取兔耳缘静脉血样检测效价，至效价达1∶10⁵以上后，将家兔处死心脏取血，获取血清。

用CNBR活化的Sepharose 4B分别耦联TMEM98三段多肽制备亲和层析柱。然后加入抗TMEM98的兔免疫血清4℃旋转混合过夜，留取穿过液备用，再用PBS冲洗柱料。再加入0.1M甘氨酸缓冲液洗脱(pH2.4)，洗脱液接入预加入3M Tris(pH9.0)的收集管中。然后用微量滴度板检测管内抗体浓度。纯化获得的特异性抗体，置于4℃用pH7.4PBS大体积透析，更换三次，每次间隔8小时。然后用聚乙二醇在4℃将蛋白浓缩至1ml。在293T细胞中超表达TMEM98，通过Western blot、FACS、Confocal鉴定抗体的亲和力及特异性。

12 细胞培养和转染

HEK293T细胞为本实验室传代培养，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM(4.5g/L葡萄糖，4mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养。

HEK293T细胞转染方法为阳离子转染法，具体操作步骤如下：

(1)细胞培养：将HEK 293T细胞(3.0×10⁵个)用含10％胎牛血清的DMEM培养基铺在六孔细胞培养板上，在5％CO₂、37℃的培养箱中培养24小时。

(2)制备DNA-Vigofect复合物：用100μl PBS稀释5μg目的质粒，缓慢混合均匀；同样用100μl PBS稀释2μl VigoFect，缓慢混合均匀，在室温下放置5分钟后，与稀释的DNA缓慢混合，室温放置15分钟，以形成DNA-VigoFect复合物。

(3)转染：将DNA-VigoFect复合物缓慢滴入细胞培养板(200μl/孔)，轻微摇匀。5％CO₂，37℃的培养箱中培养。

(4)转染6小时后，弃去培养基，加入新鲜的含10％FBS的DMEM培养基或293T无血清培养基(但含有低蛋白的培养细胞因子)继续培养48小时。

13 TMEM98的亚细胞定位分析

13.1 超表达pEGFP-N1-TMEM98

将HEK293T细胞铺于带细胞爬片的24孔板，培养24小时后分别转染pEGFP-N1-TMEM98和N1-GFP空载体，24小时后3％多聚甲醛冰上固定30分钟，0.1％Triton X-100冰上打孔30分钟，用活细胞核荧光染料Hoechst染核(2ug)5分钟，PBS洗3遍，共聚焦显微镜下观察TMEM98的细胞定位情况。

13.2 间接免疫荧光

将HEK293T细胞铺于带细胞爬片的24孔板，培养24小时后分别转染pcDB-TMEM98-myc-his及pcDB-myc-his空载体，24小时后3％多聚甲醛冰上固定30分钟，0.1％Triton X-100冰上打孔30分钟，加入第一段多克隆抗体冰上孵育30分钟，PBS洗2遍，加入FITC标记的抗兔IgG(购自中杉金桥)孵育30分钟，PBS洗2遍，用活细胞核荧光染料Hoechst染核后(同上)共聚焦显微镜下观察TMEM98的细胞定位情况。

14 细胞培养上清及细胞总蛋白提取和Western blot分析

293T细胞培养上清的收集：细胞转染48小时后，分别收集各实验组细胞培养上清，于4℃，3500rpm离心10分钟，弃沉淀，再于4℃，12000rpm离心15分钟，留取处理后的细胞培养上清。

293T细胞总蛋白的提取：将留取上清后的细胞置于冰上，用冰预冷的1×PBS洗两遍，用冰预冷的1×PBS吹下细胞，将细胞收集到1.5mL离心管中，于4℃，3500rpm离心5分钟。去除上清，在沉淀中加入RIPA细胞裂解液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂Cocktail)，冰上放置30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，上清转入新管，存于-80℃备用。

蛋白定量：细胞提取的蛋白按照BCATM Protein Assay Kit(Pierce，23227)说明书提供的方法进行蛋白定量。

Western blot：每组细胞蛋白取30μg，每组细胞培养上清取40μl，加入蛋白上样缓冲液(北京宝赛生物技术有限公司)，于100℃水浴煮10分钟。12.5％PAGE电泳，100mV电转1.5小时，TBST液平衡，用5％牛奶室温封闭2小时，加入相应的一抗，4℃过夜，用TBST充分洗膜3次，每次10分钟；然后加入相应的IRDye^TM 700/800标记的二抗(1∶10000)，室温避光反应1小时；再用TBST充分洗膜3次，每次10分钟；最后使用Odyssey Infrared Imager检测信号。

15 TMEM98蛋白的分泌验证

用质粒pcDB-TMEM98-myc-his转染293T细胞，转染8小时后用常温的1×PBS洗涤细胞一次，更换新鲜的无血清培养基(但含有低蛋白的培养细胞因子)，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。处理细胞48小时后，收集各实验组细胞及细胞培养上清用于Western blot分析。

16 BFA阻断实验

在293T细胞超表达pcDB-TMEM98-myc-his及pcDB-myc-his空载体质粒(Vigo转染)，24小时后，用常温的1×PBS洗涤细胞一次，换新的无血清培养基，并分别在细胞培养上清中加入10mg/ml Brefeldin-A和异丙醇(用作阴性对照)，24小时后，收集各实验组细胞及细胞培养上清用于Western blot分析。

17 分离小鼠CD4⁺T细胞

取6～8周雌性C57BL/6J小鼠(以下简称C57小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡1分钟，取出小鼠置于无菌皿上，在小鼠腹中部剪开小口，撕开皮肤，眼科剪分离结缔组织，取两侧腹股沟淋巴结；之后进入腹腔取肠系膜淋巴结及两侧腹主动脉旁淋巴结，放入200目筛网上置于盛有1640培养液的培养皿中用研杵轻轻研压淋巴结，获细胞悬液，然后用磁珠阴性分选(

Mouse CD4 Cell Negative Isolation Kit)得到小鼠CD4⁺T细胞。

18 小鼠Th1细胞分化

用磁珠分选小鼠CD4⁺T细胞，培养于抗CD3(购自BD公司)(10ug/ml)预包被的培养板中，加入抗CD28(购自BD)(2ug/ml)和IL-2(购自R&D公司)(4ng/ml)，之后在培养体系中加入重组小鼠IL-12(购自R&D)(10ng/ml)、抗小鼠IL-4的抗体(购自BD)(10μg/ml)，在细胞分化的过程中加细胞因子和抗体同时加入TMEM98真核蛋白(0.01ng、0.1ng、1ng、10ng/ml)，四天后换新鲜培养基，在只有IL-2(4ng/ml)、重组小鼠IL-12(10ng/ml)、TMEM98真核蛋白条件下培养两天，之后抗CD3(10ug/ml)、CD28(2ug/ml)抗体刺激过夜，收获细胞培养上清，通过ELISA检测细胞因子IFN-γ的分泌情况，后5小时加入Golgistop抑制细胞因子的分泌，通过FACS检测其细胞内的IFN-γ表达情况，检测TMEM98分泌蛋白对小鼠Th1细胞分化的影响。

19 迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity，DTH)模型建立

选取6～8周龄雌性C57小鼠，第0天每只小鼠腹部皮内两点注射与完全弗氏佐剂充分乳化的2.5mg/mL mBSA进行致敏，此后每天腹腔注射GST-TMEM98重组蛋白(100ng/100ul/只)，连续7天，在第7天选取小鼠一侧足垫皮下注射5mg/mL(30ul)mBSA进行激发，另一侧足垫注射PBS作为对照。激发后观察24小时、48小时、72小时足垫肿胀情况。激发48小时后处死小鼠取血清、足垫及脾，进行以下指标的检测：

足垫肿胀评分；

血清中IFN-γ等细胞因子的含量；

取脾细胞，加入mBSA及重组蛋白，分析抗原特异性T淋巴细胞的增殖，检测培养上清中IFN-γ、IL-17等细胞因子的分泌。

20 免疫荧光染色

20.1 细胞膜分子检测

收获转染后细胞或不同类型的免疫细胞，用PBS/0.1％BSA洗涤两次，直接加入100μl封闭液(PBS/10％正常羊血清)重悬细胞，4℃封闭30分钟；随后加入标记的抗体，4℃避光孵育40分钟；使用与标记抗体相同种属来源的IgG作为阴性对照。最后用PBS/0.1％BSA洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest软件对结果进行分析。

20.2 细胞内分子检测

收获不同类型的免疫细胞，用冷的PBS/0.1％BSA洗涤两次，首先用3％多聚甲醛冰上固定30分钟；然后用0.1％Triton X-100室温孵育30分钟，1500rpm离心5分钟。再加入100μl封闭液(PBS/10％正常羊血清)重悬细胞，室温封闭30分钟。随后加入标记抗体，4℃避光孵育40分钟；使用与标记抗体相同种属来源的IgG作为阴性对照。最后用PBS/0.1％BSA洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest软件对结果进行分析。

其中细胞内细胞因子检测使用BD Cytofix/Cytoperm^TM Fixation/Permeabilization试剂盒(购自BD公司)来处理细胞，之后通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest软件对结果进行分析。

21 ELISA

21.1 细胞培养相应时间后收获上清，于4℃，3500rpm离心10分钟，弃沉淀，再于4℃，12000rpm离心10分钟，去除上清中细胞和碎片。使用IFN-γ、IL-4、IL-17A细胞因子ELISA试剂盒(eBioscience)夹心法检测细胞因子的分泌量。

21.2 间接ELISA

稀释不同浓度蛋白作为抗原包被于ELISA板上，4℃过夜，弃上清，PBST洗2遍，加入封闭液室温封闭30分钟，弃去封闭液，加入TMEM98抗体(1∶10000稀释，浓度为0.1ug/ml)4℃过夜，弃上清，PBST洗3遍，加入HRP标记的抗兔IgG(购自中杉金桥)(1∶5000稀释)室温孵育1小时，弃上清，PBST洗5遍，加入底物TMB避光显色15分钟，2N硫酸终止，OD450读数(同时测OD570去除本底)。

22 小鼠B16肿瘤模型建立

选取8～10周龄雌性C57小鼠，腋下皮下注射B16细胞(本室传代培养)(2×10⁶个细胞/100ul PBS/鼠)，第7天给小鼠脱毛，观察肿瘤生长情况。根据肿瘤生长情况，将小鼠分组，每组至少5只。第8-12天每天注射TMEM98原核蛋白，每组小鼠腹腔注射PBS(200ul/天/鼠)，TMEM98原核蛋白(40ug/天/鼠)。第14天处理小鼠取肿瘤称重。用游标卡尺量取肿瘤长径(a)和短径(b)，肿瘤的体积算法为V＝1/2×ab²。

23 统计学分析

以上数据的标准差代表一次实验中不同复孔间的差异，用学生T检验分析各组之间是否存在显著性差异，p＜0.05认为具有统计学差异。

实验结果

1.人TMEM98基因的cDNA克隆及生物信息学分析

1.1 以正常人外周血单个核细胞(PBMC)cDNA文库为模板扩增获得TMEM98的cDNA，以正常小鼠组织器官cDNA文库为模板扩增获得小鼠Tmem98的cDNA，均与数据库中序列一致。

1.2 生物信息学发现，TMEM98基因定位于17q11.2，其启动子区存在一个典型的CpG岛，说明TMEM98的表达水平可能受甲基化等表观遗传学机制调控。

TMEM98编码一个226个氨基酸的蛋白质，分子量24.6kDa，等电点4.718。各种属之间同源性较高，其中和小鼠的蛋白同源性达到98.7％。TMHMM分析预测其为I型膜分子，但SignalP预测其N端的21个氨基酸是典型的信号肽，与跨膜区(4-26氨基酸)重合，表明TMEM98可能为一新的分泌蛋白。生物信息学预测其有O糖基化修饰位点。

电子表达谱证明TMEM98在各个组织器官中广谱表达。其中，在嗅球、胎肺、甲状腺、前列腺、CD71早期红系、前额叶皮层、下丘脑、慢性髓性白血病细胞系K562中表达较高。NCBI中GEO profile表明TMEM98与GATA3存在相互关系，并且在乳头状甲状腺癌及感染SIV及HIV的Jurkat细胞中高表达(提高2倍作右，表明其可能与病毒感染有关)，在小鼠免疫抵抗的肿瘤细胞系中低表达(约降低2/3，表明其可能与肿瘤免疫逃逸有关)。以上表明TMEM98可能在病毒感染及肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。

2 TMEM98多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

2.1 用合成的TMEM98三段多肽分别免疫家兔，抗体效价达1∶10⁵以上后，将家兔处死心脏取血，获取血清。血清用CNBR分别耦联TMEM98三段多肽纯化获得抗体。在293T细胞中超表达TMEM98，通过Western blot鉴定抗体特异性，结果(见图1的A，Marker：170、130、100、72、55、40、33、24、17、11kDa)表明这三段多肽获得的抗体均能特异性识别外源性表达的TMEM98蛋白，其中抗第一、二段多肽的抗体效果更好。此外，由于人和小鼠TMEM98蛋白同源性较高(98.7％)，而且多肽1和多肽2的人鼠序列一致，因此，在293T细胞中超表达小鼠pcDB-Tmem98-myc-his，选用多肽1和多肽2的混合抗体通过Western blot鉴定其特异性，结果(见图1的B)表明多肽免疫的多克隆抗体也能特异识别小鼠Tmem98蛋白，为后续动物实验的进行提供基础。

2.2 用针对TMEM98第一段多肽的抗体进行间接免疫荧光分析，结果如图3的B所示，与阴性对照和空载体组相比，抗TMEM98抗体能特异识别细胞膜表面的TMEM98，说明该抗体能够用于细胞膜表面蛋白的FACS分析实验。

2.3 此外，我们还用免疫共沉淀的方法检测该抗体的特异性。收集超表达TMEM98真核表达质粒的转染上清，加入抗TMEM98第一段多肽的抗体孵育过夜，之后加入Protein G孵育过夜，PBS洗3遍，加入上样缓冲液煮样品，收集上清进行Western Blot分析。结果如图1的C所示，TMEM98的抗体可以很好的结合上清中的TMEM98蛋白。

上述结果说明TMEM98的抗体具有良好的特异性及亲和力，为后续开发ELISA试剂盒以及进行功能研究提供了基础。如图1的D所示，间接ELISA的结果表明各TMEM98蛋白浓度之间具有良好的梯度性，且与pcDB组相比，该检测方法能特异识别超表达TMEM98的293T上清。目前该抗体已标记生物素用于制备双抗夹心ELISA试剂盒，后续将对该试剂盒的特异性及亲和力做进一步验证。

3 TMEM98在组织和细胞中的表达谱分析

3.1 TMEM98在人正常组织和免疫系统广谱表达

使用购买于clontech公司的人正常组织cDNA文库扩增TMEM98，结果如图2的A所示，TMEM98在多种组织中广泛表达，在免疫系统如：脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓、胎肝以及白细胞中也广谱表达，表明TMEM98可能作为重要的免疫调节因子在免疫系统中发挥重要作用。

3.2 TMEM98在人白血病细胞系中的表达情况

如图2的B所示，TMEM98在九种白血病细胞系中都有表达，仅在THP-1(人单核/巨噬细胞)中未检测到。

3.3 TMEM98在炎性因子刺激后的表达上调

收集未刺激及炎性因子IL-1β刺激3h、6h、24h的A549细胞，未刺激及炎性因子LPS刺激6h的PBMC，未刺激及炎性因子LPS刺激2h、4h、6h的小鼠巨噬细胞，检测潜在新细胞因子编码基因TMEM98在炎性因子刺激后mRNA水平的变化情况，分别选用IL-8、IL-6、IL-1作为阳性对照。结果如图2的C所示，在炎性因子刺激后人TMEM98及小鼠Tmem98表达上调，表明其与炎症的发生发展密切相关，可用于炎症相关的实验模型中，其重组蛋白或抗体具有治疗炎症的功能。

此外，我们还采用FACS的方法检测了抗CD3/CD28抗体刺激后的人PBMC细胞中TMEM98蛋白水平表达变化，结果如图2的D所示，发现其在CD4⁺T细胞中表达上调，在单核细胞分化为DC后表达明显上调，表明其可能与Th细胞的分化或活化等过程相关。

4 TMEM98的亚细胞定位

4.1 生物信息学表明TMEM98存在着跨膜区。为了验证TMEM98是否具有膜定位形式，我们在293T细胞中超表达TMEM98-GFP，通过Confocal观察TMEM98的细胞定位情况。结果如图3的A所示，与对照组GFP全细胞弥散性定位相比，TMEM98-GFP主要定位于细胞膜。

4.2 此外，用针对TMEM98第一段多肽的多克隆抗体进行间接免疫荧光分析其定位。在293T中超表达了TMEM98和空载体pcDB，用兔IgG作为阴性对照，检测细胞膜表面TMEM98，结果如图3的B所示，与阴性对照和空载体组相比，抗TMEM98的抗体能特异识别细胞膜表面的TMEM98，说明其定位于细胞膜上，并且由于myc标签在C端，抗myc抗体能够识别位于细胞膜上的TMEM98蛋白，表明TMEM98为一C端在外的II型膜蛋白。由于目前已知的细胞因子有许多同时具有膜定位及分泌二种形式，这一结果为后续进一步研究其功能机制提供重要线索。

5 TMEM98真核细胞表达质粒的构建、分泌验证、N端测序及真核蛋白表达纯化

5.1 生物信息学表明TMEM98有典型信号肽，可能为分泌蛋白。在293T细胞中超表达TMEM98-Myc-His融合蛋白，发现培养上清中存在分泌形式，证明TMEM98存在分泌形式。之后采用BFA抑制试验对TMEM98是否为经典分泌蛋白进行了验证。结果如图4的A所示(选取一经典分泌蛋白作为阳性对照)，表明TMEM98是通过非经典途径分泌的。

5.2 为了进行TMEM98的功能研究，在293T细胞中超表达TMEM98真核表达质粒，用Ni²⁺柱料纯化细胞培养上清，取5μl蛋白用BCA方法对其进行蛋白定量，取部分样品加入蛋白上样缓冲液，于99℃加热快煮10分钟，进行SDS-PAGE以及western blot，鉴定TMEM98分泌蛋白纯化的纯度。图4的B为TMEM98蛋白纯化后SDS-PAGE图(LPS＜0.1EU/ug)，其纯度在95％以上，达到进行功能实验的要求。

5.3 在293T细胞中超表达pYD11-TMEM98-hFc，Protein G柱进行纯化得到带hFc标签的TMEM98真核蛋白，转PVDF膜，进行N端测序(上海基康生物技术有限公司)，所测氨基酸数目及序列(从N到C)共10个，为METVVIVAIG，表明部分TMEM98是以完整蛋白形式分泌至胞外，且进一步说明其通过非经典途径分泌。

6 TMEM98原核细胞表达质粒的构建以及原核蛋白的纯化

为了研究分泌型TMEM98蛋白的功能，我们构建了含有TMEM98 cDNA的原核表达载体：pGEX-4T-3-TMEM98。其表达的重组蛋白为GST-TMEM98，即蛋白的N端带有GST标签，GST标签与TMEM98目的蛋白之间有一个凝血酶的酶切位点，用凝血酶去除GST标签得到重组TMEM98原核蛋白(图5)。

7 TMEM98对补体调节蛋白分子的影响

补体调节蛋白(CRP)的高表达能抑制补体系统对肿瘤细胞的攻击，使肿瘤逃避机体免疫防御。细胞因子能够通过调节补体调节蛋白从而在肿瘤的免疫治疗中发挥重要功能。如在对肾癌的研究中发现IL-1能下调CD46、CD59的表达，IL-4能持续下调CD46、CD55及转化生长因子，能增加C3在肿瘤细胞上的沉积，在针对抗肿瘤相关抗原使用抗体的同时联合运用细胞因子将成为一种新的有效的免疫治疗方法。前期GEO表达谱分析表明TMEM98可能与肿瘤的发生、发展具有密切关系，因此我们进一步分析了TMEM98分泌蛋白对补体调节蛋白的影响。图6所示，其真核及原核蛋白均能抑制CD46、CD59在蛋白水平的表达，表明TMEM98能够通过下调CRP的表达来阻止免疫逃逸，使得补体系统能够发挥抗肿瘤效应，从而抑制肿瘤的发生发展。也进一步表明TMEM98原核蛋白具有活性。

8 TMEM98对小鼠Th1、Th2细胞分化的影响

由于TMEM98在单核细胞向DC细胞的分化过程及CD4⁺T细胞的活化过程中表达上调，表明其可能参与在Th细胞的分化、活化或在其增殖过程中发挥功能。因此，我们利用小鼠Th1、Th2分化平台对其功能做了进一步研究。

首先获得小鼠淋巴细胞悬液，通过磁珠阴性选择得到CD4⁺T淋巴细胞，然后按小鼠Th1细胞的诱导条件诱导Th1细胞分化，在分化同时分别加入TMEM98真核蛋白(0.01ng、0.1ng、1ng、10ng/ml)，最后通过FACS、ELISA检测细胞内及上清中IFN-γ变化情况。

结果如图7的A所示，表明TMEM98真核蛋白能促进小鼠Th1细胞的分化。

在Th1细胞分化过程中，IL-12起始动作用，许多细胞因子发挥Th1细胞分化促进功能有赖于IL-12，因此，为了进一步研究TMEM98发挥功能是否依赖于IL-12，我们在Th1细胞分化体系中撤除IL-12，之后分别用FACS、ELISA检测TMEM98的功能，如图7的B所示，TMEM98能轻微促进Th1细胞分化，程度弱于IL-12存在的情况下，表明其功能部分依赖于IL-12。

由于Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、LTα等，通过细胞免疫应答在抗病毒、抗胞内病原体感染、抗肿瘤、迟发型超敏反应中发挥重要作用，且Th1细胞分泌的IFN-γ、IL-2等细胞因子具有促炎作用，因此TMEM98重组蛋白及抗体能够通过促进小鼠Th1细胞体外分化从而在抗病毒、抗胞内病原体感染、抗肿瘤以及炎症治疗方面有重要应用价值。

9 TMEM98在小鼠DTH模型中的功能

前期实验表明TMEM98能促进小鼠Th1细胞体外分化，之后我们制备了小鼠DTH模型对其功能做了进一步研究，结果(图8)表明，TMEM98可促进小鼠DTH模型中Th1细胞的分化。

用mBSA诱导小鼠DTH模型，在致敏后激发前每日腹腔注射GST-TMEM98重组蛋白，激发后48h处死小鼠，检测各指标。发现TMEM98能够明显抑制小鼠足垫肿胀程度，肿胀达到高峰的时间也有所延迟(图8的A)。此外，检测小鼠血清中细胞因子发现注射蛋白组小鼠血清中IFN-γ水平与对照组相比明显增加；同时，分离小鼠脾细胞与mBSA共孵育，同时加入GST-TMEM98重组蛋白，检测抗原特异性T淋巴细胞培养上清中的细胞因子，结果发现注射蛋白组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ分泌明显增加(图8的B)。文献报道在mBSA诱导的小鼠DTH模型中Th1细胞起抑制作用，因此推测可能是由于TMEM98促进了小鼠体内Th1细胞分化过程，进而导致小鼠足垫肿胀程度减轻。结合体外作用结果，上述结果表明TMEM98可促进DTH模型小鼠体内Th1细胞的分化。

此外，我们进一步分析了脾细胞中各类细胞比例的变化。如图8的C所示，GST-TMEM98重组蛋白组CD8⁺T细胞的比例增加，由于Th1细胞产生的效应性细胞因子IL-2、IFN-γ可促进CD8⁺T细胞的增殖、成熟，促进其杀伤功能，而CD8⁺T细胞在抗肿瘤方面发挥重要功能，因此，在抗肿瘤方面具有重要应用价值，结合前期生物信息学分析结果以及在DU145中该蛋白对补体调节分子的功能，说明TMEM98在肿瘤治疗方面具有重要的潜在临床应用价值。

10 TMEM98在小鼠B16肿瘤模型中的功能

建立小鼠B16肿瘤模型，在第8-12天每天注射TMEM98原核蛋白，第14天处理小鼠取肿瘤称重。结果发现与PBS组相比，注射蛋白组肿瘤重量明显降低(图9的左图)，体积也比PBS组要小(图9的右图)。

综上所述，TMEM98在多种炎性因子刺激后表达上调，表明其与炎症的发生、发展密切相关，具有治疗及诊断价值；TMEM98编码一种非经典分泌蛋白，并且具有细胞膜定位形式，功能研究发现其在活化的CD4⁺T细胞中表达上调，其编码的分泌蛋白能促进小鼠Th1细胞体外分化，体内功能研究发现TMEM98原核蛋白能够抑制小鼠DTH的发生及发展，血清及抗原特异性脾细胞培养上清IFN-γ分泌增加，脾细胞中CD8⁺T细胞比例增加，由于Th1通过细胞免疫应答在抗病毒、抗胞内病原体感染以及抗肿瘤、引发皮肤迟发型超敏反应方面发挥重要功能，CD8⁺T细胞具有肿瘤杀伤功能，并且GEO profile表明小鼠Tmem98在小鼠免疫抵抗的肿瘤细胞系中低表达(表明其可能与肿瘤免疫逃逸有关)，并且体内功能研究发现人TMEM98原核蛋白对小鼠黑色素瘤有抑制作用，这说明TMEM98在抗病毒感染、抗胞内细菌感染(如结核分枝杆菌等)、肿瘤免疫治疗以及辅助诊断中具有临床应用价值。

Claims (10)

1.一种用于炎症相关实验模型的试剂盒，所述试剂盒含有作为促炎症蛋白的TMEM98蛋白。

2.抗TMEM98蛋白的抗体在制备抗炎症药物中的应用，所述炎症是所述TMEM98蛋白所促进的炎症。

3.TMEM98蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其中，所述肿瘤是指能够通过促进IFN-γ分泌、促进Th1细胞分化和/或抑制CD46和CD59蛋白的表达来抑制和/或治疗的肿瘤。

5.TMEM98蛋白在制备抗感染尤其是抗胞内细菌感染及抗病毒感染、抗纤维化作用、治疗过敏性疾病和/或治疗自身免疫疾病的药物中的应用，其中，所述感染、纤维化作用、过敏性疾病和自身免疫疾病能够通过提高IFN-γ水平和/或通过促进Th1细胞分化来抑制和/或治疗。

6.TMEM98蛋白在制备促进IFN-γ分泌、促进Th1细胞分化和/或抑制CD46和CD59表达的药物中的应用。

7.TMEM98蛋白在制备消除肿胀的药物中的应用，所述肿胀为mBSA诱导的迟发型超敏反应所引起的肿胀。

8.如权利要求1～7中任一项所述的应用，其中，所述TMEM98蛋白为人类TMEM98蛋白。

9.一种用于诊断炎症的试剂盒，所述试剂盒含有：

抗TMEM98蛋白的抗体，所述抗体用于TMEM98蛋白的定量检测；和/或

用于在PCR中合成TMEM98基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物，所述引物用于TMEM98基因表达的定量检测；

其中所述TMEM98蛋白优选为人类TMEM98蛋白或小鼠TMEM98蛋白，所述TMEM98基因优选为人类TMEM98基因或小鼠TMEM98基因。

10.成熟人类TMEM98蛋白N端氨基酸序列METVVIVAIG所对应的DNA序列在下述方面的应用：

构建包含所述N端氨基酸序列的人类TMEM98重组蛋白的原核或真核细胞表达载体；和/或

在原核或真核细胞中表达包含所述N端氨基酸序列的人类TMEM98重组蛋白。

Images