CN102712697B - 用于细胞因子递送的穹窿体复合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种穹窿体复合物的组合物，所述穹窿体复合物包含重组细胞因子融合蛋白，其含有细胞因子和靶向作用于穹窿体的结构域，以及使用穹窿体复合物向细胞或对象递送细胞因子的方法，以及使用所述组合物治疗癌症，如肺癌的方法。

Description

用于细胞因子递送的穹窿体复合物

相关申请的交叉引用

本申请要求申请日为2009年11月2日的美国临时申请No.61/257,358的优先权，其全部内容在此整体参考并入，用于所有目的。

有关联邦政府赞助研究或开发的声明

本发明在美国国立卫生研究院(基金号5R01CA126944)和美国退伍军人事务部的资助下进行。政府享有本发明的某些权益。

参考序列表

本申请连同电子形式的序列表一起提交，该序列表以命名为11111US_sequencelisting.txt的文件提交，该文件于201X年X月XX日创建，XXX，XXX字节大小。该序列表参考并入本申请。

背景技术

发明领域

本发明涉及包含细胞因子，如趋化因子CCL-21的穹窿体复合物的组合物，以及穹窿体复合物将细胞因子递送至细胞的用途。穹窿体复合物包括将感兴趣的细胞因子与主穹窿蛋白相互作用的结构域融合的融合蛋白。本发明还包括组合物的用途，即作为癌症免疫治疗剂，用于活化针对肿瘤的免疫应答以及用于治疗癌症，包括肺癌。

对相关技术的描述

穹窿体是于1986年首次描述的细胞质中普遍存在的核糖核蛋白颗粒，其可见于所有真核细胞中[1]。天然穹窿体为12.9±1MDa的卵圆形，总体尺寸约为宽40nm长70nm[2，3]，其存在于几乎所有真核有机体中，每个细胞中含10⁴至10⁷个颗粒[4]。尽管其在细胞中丰度较高，但穹窿体的功能仍尚不明确，虽然已将其与多种细胞过程相关联，包括先天性免疫应答、癌细胞中的多药耐药、多面信号通路、以及细胞内转运[5]。

穹窿体在体外是高度稳定的结构，且大量研究显示这些颗粒是非免疫原性的[6]。可以使用杆状病毒表达系统设计和表达穹窿体，且可以使用名为INT的蛋白靶向结构域(因穹窿体相互作用而得名)，将异源性蛋白导入这些重组颗粒中。已将若干种异源性蛋白与INT结构域融合(例如，荧光和酶蛋白)，这些融合蛋白在重组穹窿体中表达并保留其天然特性，因而赋予了这些穹窿体新的性质[7，8]。

已将CLL-21鉴定为淋巴趋化因子，其主要且组成性地由高内皮小静脉在淋巴结和派伊尔结(Peyer’s patche)中表达，以及由淋巴管和间质细胞在脾脏和阑尾中表达[9]。CCL-21与趋化因子受体CCR7结合，其是成熟DC、初始和记忆性T细胞的趋化剂[10，11]。该趋化因子以及CCL-19均是正常淋巴组织构成所需的，其是有效的T细胞-DC相互作用最终所必需的。自然杀伤(NK)和自然杀伤T(NKT)抗肿瘤效应器表达CCR7受体，且其可以被CCL-21所趋化吸引。趋化因子将DC、淋巴细胞以及NK和NKT效应器吸引至肿瘤的用途可以作为有效的抗肿瘤策略。基于该理念，此前的研究结果显示，在鼠源性肺癌模型中瘤内给予重组的CCL-21可以降低肿瘤负荷[12]。然而，由重组CCL-21诱导的抗肿瘤应答需要高剂量、高频率的给药，因为瘤内给予的蛋白无法在局部长期保留。尽管这些研究描述了CCL-21作为有效抗肿瘤剂的作用，但是频繁高剂量的瘤内给药可能因其存在潜在的全身毒性而具有临床局限性。基于该方法的局限性，检验了自体树突状细胞在瘤内CCL-21递送中的用途[13.14]。临床前研究中已证实，在鼠源性肺癌模型中瘤内给予CCL-21基因修饰的树突状细胞使肿瘤得到根治。在对CCL-21的抗肿瘤性质进行的这个最初描述后，若干其它研究小组也报道了CCL-21在多种模型系统中具有高效的抗肿瘤性质[15-19]。在所有模型中，CCL-21均显示出对肿瘤的高效抑制作用，其依赖于宿主T细胞免疫。基于广泛的临床前评估，在一项针对晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的I期临床试验中，瘤内注射转导了表达次级淋巴趋化因子基因的腺病毒载体的DC(Ad-CCL-21-DC)并进行了评估。

尽管利用趋化因子基因修饰的DC进行瘤内给药的临床研究显示，其有望作为一种有效的治疗方法，但是表达CCL-21的自体树突状细胞的制备复杂、昂贵且费时。急需一种有效的并且通过类似治疗机制工作的试剂。需要避免制备自体DC、使批次间的变异性降至最低、以及允许具有可比性和进行标准化的组合物和方法。需要以启动抗肿瘤免疫应答为目的的细胞因子递送，例如非基于DC途径的瘤内CCL-21递送。

已在下述专利/申请中大概地描述了穹窿体：U.S.专利号7,482,319，申请日2004年3月10日；U.S.申请号12/252,200，申请日2008年10月15日；国际申请号PCT/US2004/007434，申请日2004年3月10日；U.S.临时申请号60/453,800，申请日2003年3月20日；U.S.专利号6,156,879，申请日1998年6月3日；U.S.专利号6,555,347，申请日2000年6月28日；U.S.专利号6,110,740，1999年3月26日；国际申请号PCT/US1999/06683，申请日1999年3月26日；U.S.临时申请号60/079,634，申请日1998年3月27日；以及国际申请号PCT/US1998/011348，申请日1998年6月3日。针对衣原体感染免疫接种的穹窿体组合物已在U.S.申请号12/467,255，申请日2009年5月15日中描述。这些申请的全部内容整体参考并入，用于所有目的。

发明概述

本申请公开了包括穹窿体复合物的组合物，所述穹窿体复合物具有融合了细胞因子和靶向作用于穹窿体结构域例如mINT的融合蛋白。在一个实施方式中，所述穹窿体复合物包括趋化因子融合蛋白，其具有由SEQ ID NO：1(小鼠CCL21氨基酸序列)组成的趋化因子(C-C基序)配体21(CCL-21)和由SEQ ID NO：9(小鼠mINT氨基酸序列)组成的主穹窿蛋白相互作用结构域(mINT)。在另一个实施方式中，所述穹窿体复合物包括趋化因子融合蛋白，其具有由SEQ ID NO：2(人CCL21氨基酸序列)组成的趋化因子(C-C基序)配体21(CCL-21)和由SEQ ID NO：8(人mINT氨基酸序列)组成的主穹窿蛋白相互作用结构域(mINT)。

相应地，在本发明的一个方面，所述细胞因子是趋化因子。在一个方面，所述细胞因子是半胱氨酸-半胱氨酸(CC)趋化因子。在另一个方面，所述细胞因子是CCL-21趋化因子。所述趋化因子可以包括人或小鼠CCL-21的全部或一部分，例如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2。在某些实施方式中，所述细胞因子融合蛋白包括荧光蛋白，例如mCherry荧光蛋白。

在一个实施方式中，所述靶向作用于穹窿体的结构域是来自穹窿体聚-ADP-核糖聚合酶(VPARP)的穹窿体相互作用结构域。在一个实施方式中，所述靶向作用于穹窿体的结构域是主穹窿蛋白相互作用(mINT)结构域。在另一个实施方式中，所述靶向作用于穹窿体结构域包含或由SEQ ID NO：8(人氨基酸序列)组成。在又一个实施方式中，所述靶向作用于穹窿体结构域包含SEQ ID NO：9(小鼠氨基酸序列)。

在某些实施方式中，所述穹窿体复合物包括MVP。MVP可以是人MVP，例如SEQID NO：16。

本发明的穹窿体复合物可以包括穹窿体聚ADP-核糖聚合酶(VPARP)、和/或端粒酶穹窿体相关蛋白1(TEP1)、和/或未翻译RNA分子(vRNA)。

此外，本发明提供了编码细胞因子融合蛋白的分离核酸，其包括细胞因子编码序列和mINT编码序列。在一个实施方式中，所述mINT编码序列为SEQ ID NO：7(人序列)或SEQ ID NO：6(小鼠序列)。在另一个实施方式中，所述细胞因子编码序列为SEQ ID NO：5(人)，并且所述mINT编码序列由SEQ ID NO：7(人)组成。在一个实施方式中，所述细胞因子编码序列为SEQ ID NO：3(小鼠序列)，并且所述mINT编码序列为SEQ ID NO：6(小鼠序列)。

在某些实施方式中，所述细胞因子融合蛋白为SEQ ID NO：13(人)。在其它实施方式中，所述细胞因子融合蛋白为SEQ ID NO：12(小鼠)。本发明还包括含有本文所述的分离核酸的载体、具有本文所述的分离核酸的细胞、以及具有本文所述的载体的细胞。

本发明还包括一种向细胞递送细胞因子的方法，包括将本发明的穹窿体复合物引入至细胞。在某些实施方式中，所述方法包括将穹窿体复合物引入细胞周围的细胞外环境。本发明包括一种通过将细胞与本发明的穹窿体复合物接触，在细胞内刺激免疫应答的方法。在某些实施方式中，所述细胞是人细胞。在其它实施方式中，所述免疫应答诱导T细胞和树突状细胞的迁移。在另一个实施方式中，与仅给予CCL-21细胞因子相比，将细胞与本发明的穹窿体复合物接触使T细胞向细胞迁移增加至少5％。

此外，本发明提供了一种通过给予对象本发明穹窿体复合物而在对象中刺激免疫应答的方法。在一个实施方式中，所述对象是人。

在另一个实施方式中，本发明包括一种在需要治疗或控制癌症的对象中治疗或控制癌症的方法，包括给予对象治疗有效量的本文所述的穹窿体复合物。在某些实施方式中，给药包括将组合物瘤内注射至对象的肿瘤。在一个实施方式中，所述癌症为肺癌。在另一个实施方式中，给药减小肿瘤体积和/或减慢肿瘤生长。在某些实施方式中，给药增加白介素-2(IL-2)的表达。在一个实施方式中，所述方法包括哺乳动物或人类对象。

本发明包括一种制备本发明穹窿体复合物的方法，包括a)将融合蛋白与由Sf9细胞产生的大鼠MVP混合得到混合物，所述融合蛋白包含由Sf9细胞产生的与mINT融合的细胞因子；b)将混合物孵育足够长的时间以使得融合蛋白包装进入穹窿体复合物内部，从而产生穹窿体复合物。

在另一个实施方式中，本发明还包括一种制备本发明穹窿体复合物的方法，包括a)将融合蛋白与由昆虫幼虫细胞产生的大鼠MVP混合得到混合物，所述融合蛋白包含由昆虫幼虫细胞产生的与mINT融合的细胞因子；b)将混合物孵育足够长的时间以使得融合蛋白包装进入穹窿体复合物内部，从而产生本文所述的穹窿体复合物。

在另一个实施方式中，本发明包括一种制备本发明的组合物的方法，包括a)将融合蛋白与由Sf9细胞或昆虫幼虫细胞产生的人MVP混合得到混合物，所述融合蛋白包含由Sf9细胞或昆虫幼虫细胞产生的与mINT融合的细胞因子；b)将混合物孵育足够长的时间以使得融合蛋白包装进入穹窿体复合物内部，从而产生本文所述的穹窿体复合物。

附图简述

通过下面的描述及相应附图，使本发明的这些和其它特征、方面、和益处更加便于理解，其中：

图1显示了将CCL-21与mCherry-INT构建体融合以构建CCL-21融合蛋白的示意图。

图1B显示了通过限制性酶切掺入pFastBac表达载体和通过凝胶电泳分析得到的CCL-21融合蛋白的表达。

图1C显示了包含经蔗糖梯度纯化的包装CCL-21-mCherry-mINT的MVP重组穹窿体。通过SDS-PAGE分析40和45％组分。

图1D显示了包含经蔗糖梯度纯化和利用考马斯亮蓝染色分析的包装CCL-21-mCherry-mINT的MVP重组穹窿体。

图1E显示了通过负性染色透射电子显微镜检验的纯化穹窿体复合物。

图2A为显示CCL-21穹窿体复合物增加T2细胞迁移的图。

图2B为利用IL-2生成检测的CCL-21穹窿体复合物对T细胞活化作用的图。

图3为显示与空穹窿体相比瘤内注射给予CCL-21穹窿体复合物(200ng)使肿瘤负荷减小的图。

图4A显示了经对照穹窿体处理的细胞中白细胞的浸润情况。

图4B显示了经CCL-21穹窿体复合物处理的细胞中白细胞的浸润情况。

图5A为显示稀释剂对3LL肺癌细胞处理作用的照片。

图5B为显示对照穹窿体对3LL肺癌细胞处理作用的照片。

图5C为显示CCL-21穹窿体复合物对3LL肺癌细胞处理作用的照片。

图6A为显示在天然3LL细胞和经稀释剂、对照穹窿体(VC)或CCL-21穹窿体复合物处理的3LL细胞中采用流式细胞术检测的肿瘤负荷百分率的一系列图。以GFP和Epcam表达肿瘤细胞占总肺部消化产物的总百分率计算肿瘤负荷。

图6B为在经稀释剂、对照穹窿体、或CCL-21穹窿体复合物处理的3LL细胞中肿瘤负荷百分率的柱状图。

图7A为显示注射稀释剂、对照穹窿体、或CCL-21穹窿体复合物后在肿瘤部位的瘤内白细胞分群(CD4、CD8、CD3CXCR3、CD3CCR7、DEC205、MDSC和Tregs)百分率的图。CCL-21穹窿体复合物增强CD4、CD8、CXCR3+CD3+T、CCR7+CD3+T和DEC205+DC的浸润，降低MDSC和Tregs浸润。

图7B为显示在经稀释剂、对照穹窿体、或CCL-21穹窿体复合物处理后，表达IFNγ和IL-10的CD4+细胞百分率的图。来自CCL-21穹窿体复合物处理小鼠的肿瘤T淋巴细胞浸润使胞质内IFN表达增加且IL-10表达减少。

图7C为显示在经稀释剂、对照穹窿体、或CCL-21穹窿体复合物处理后，表达IFNγ和IL-10的CD8+细胞百分率的图。

图7D为显示瘤内注射稀释剂、对照穹窿体、或CCL-21穹窿体复合物后脾脏T细胞的肿瘤溶解百分率的图。

发明详述

对本发明多方面的描述均出于说明目的，其无意于排除或限制发明的公开形式。相关领域的技术人员可以理解，在实施方式的教导下可能存在多种改变和变化。

值得注意的是，本文中使用的语言主要选择了具有易读性并且是出于说明目的的，其并非选择用于描述或限定本发明的主题。相应地，公开的目的是说明性的，并非用于限制本发明的保护范围。

需要注意的是，说明书中使用的单数形式的“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非上下文中另有明确说明。

需将在本文中未直接定义的任意术语理解为具有与其在本发明领域的理解相关的通常含义。本文中讨论的某些术语在描述组合物、设备、方法和诸如本发明的实施方式方面，以及如何制备或使用它们，为从业人员提供了进一步的指导。应理解，同一个问题可以以一种以上的方式表述。因而，替代性语言和同义词可以用于本文所讨论的任意一个或多个术语。无论某术语是否在本文中被阐述或讨论，并不意味着其意义可以被替换。提供了某些同义词或替代方法、材料等等。除非另有明示，否则使用一个或若干同义词或其等同表述并不表示排除使用其它同义词或其等同表述。例子的使用，包括术语的例子，仅用于说明目的，并不是用于限制本发明实施方式的范围和意义。

简言之，如下文中更详细的描述，本文所述的穹窿体复合物的组合物包含细胞因子如CCL-21，及其在将细胞因子递送至细胞中的用途。穹窿体颗粒包括将所关注的细胞因子与主要穹窿体相互作用结构域融合的融合蛋白。本发明还包括组合物的用途，即作为癌症免疫治疗剂用于活化针对肿瘤的免疫应答以及用于治疗癌症，包括肺癌。

CCL-21及其它细胞因子已显示出作为癌症免疫治疗剂的有效性。然而，采用细胞因子如CCL-21治疗癌症的常规途径涉及使用修饰的树突状细胞。其制备和治疗复杂、昂贵且费时。常规方法所面临的困难包括自体DC的制备、批次间存在变异性以及缺乏可比性和标准化。需要更为方便和有效的递送和使用细胞因子试剂治疗的方法。

本发明弥补了常规的基于DC方法的不足。穹窿体复合物提供了用于启动抗肿瘤免疫应答目的的有效的和足量的瘤内细胞因子例如CCL-21递送。

定义

除另有说明外，否则对权利要求和说明书中使用的术语的定义如下文所示。

术语“细胞因子”是指分泌的涉及免疫调节和炎症过程的细胞信号蛋白家族成员之一的蛋白。“趋化因子”是指一个家族的细胞因子，其由形成二硫键的不变半胱氨酸残基定义。趋化因子的一个例子是“CCL-21”，指的是趋化因子(C-C基序)配体21。C-C基序是半胱氨酸-半胱氨酸基序。

如本文所使用的，术语“穹窿体”或“穹窿体颗粒”是指在真核细胞中发现的大型细胞质核糖核蛋白(RNP)颗粒。穹窿体或穹窿体颗粒由MVP、VPARP、和/或TEP1蛋白以及一个或多个未翻译的vRNA分子组成。

如本文所使用的，术语“穹窿体复合物”是指包封了感兴趣的小分子或蛋白的重组穹窿体。本发明的穹窿体复合物包括融合蛋白，例如细胞因子融合蛋白。

如本文所使用的，术语“细胞因子融合蛋白”是指由核苷酸表达的重组蛋白，所述核苷酸编码与靶向作用于穹窿体的结构域在框内融合的细胞因子。

如本文所使用的，术语“靶向作用于穹窿体的结构域”或“穹窿体相互作用结构域”是指一种结构域，其负责使异源性融合蛋白与穹窿体蛋白发生相互作用或结合，或使VPARP与穹窿体蛋白如MVP发生相互作用。如本文所使用的，术语“mINT结构域”是指来自穹窿体聚-ADP-核糖聚合酶(VPARP)的穹窿体相互作用结构域，其负责使VPARP与主穹窿蛋白(MVP)发生相互作用。术语“mINT结构域”是指主穹窿蛋白(MVP)相互作用结构域。

如本文所使用的，术语“MVP”是指主穹窿蛋白。术语“cp-MVP”是指富含半胱氨酸肽的主穹窿蛋白。

术语“VPARP”是指穹窿体聚ADP-核糖聚合酶。

如本文所使用的，术语“TEP-1”是指端粒酶/穹窿体相关蛋白1。

如本文所使用的，术语“vRNA”是指穹窿体中的未翻译RNA分子。

如本文所使用的，术语“荧光蛋白”是指一种蛋白，具有在其多肽序列内形成可见波长发色团的性质。可以对荧光蛋白进行改造，使其与其它蛋白一并表达，其包括但不限于，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(mCherry)、蓝色荧光蛋白(EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal)、青色荧光蛋白(ECFP、Cerulean、CyPet)和黄色荧光蛋白衍生物(YFP、Citrine、Venus、YPet)。

如本文所使用的，术语“载体”指作为媒介将外来遗传物质转移至细胞的DNA或RNA分子。载体的四种主要类型为质粒、噬菌体和其它病毒、粘粒、和人工染色体。载体可以包括一个复制原点、一个多克隆位点、和一个选择性标记物。

如本文所使用的，“细胞”包括真核和原核细胞。

如本文所使用的，术语“有机体”、“组织”和“细胞”包括天然存在的有机体、组织和细胞，经遗传修饰的有机体、组织和细胞，以及病理性的组织和细胞，如体外的肿瘤细胞系和体内的肿瘤。

如本文所使用的，术语“T细胞”或T淋巴细胞是指被称为淋巴细胞的白细胞，其在细胞介导的免疫中起核心作用。

如本文所使用的，术语“细胞外环境”是指细胞的外部环境。

如本文所使用的，术语“体内”是指发生在生物体内的过程。

“对象”在本文中可以是任意动物，包括哺乳动物(例如，实验动物如大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、灵长类，等等)，家畜或经济动物(例如，母牛、马、山羊、驴、绵羊，等等)，宠物(例如，猫、犬、雪貂，等等)，鸟类或人。

本文中使用的术语“哺乳动物”包括人类和非人类，包括但不仅限于人、非人灵长类、犬科、猫科、鼠科、牛科、马科和猪科。

如本文所使用的，术语“人”是指“智人”。

如本文所使用的，术语“足量”是指足以产生目标作用的量，例如在细胞中足以调节蛋白聚集的量。

如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指足以有效改善疾病如癌症症状的量。

“预防有效量”是指有效预防的量。

“免疫应答”是指宿主针对外来免疫原或抗原的应答。“细胞介导的免疫应答”是指涉及生成干扰素-γ(IFN-γ)的辅助T细胞应答，其导致细胞介导的免疫。

如本文所使用的，术语“刺激”是指在细胞或有机体内活化、增加、或触发分子、细胞或酶活性或应答。

如本文所使用的，术语“给药”包括任意适宜的给药途径，本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解，包括直接注射至实体器官、直接注射至细胞块如肿瘤、吸入、腹腔注射、静脉注射、在粘膜表面局部应用、或应用至或分散于环境介质中、以及上述的组合。

如本文所使用的，术语“修饰的”以及该术语的变体如“修饰”是指，对天然存在的MVP、VPARP或TEP1序列的一种或一种以上的改变，其选自：在C-末端加入多肽序列、在N-末端加入多肽序列、在C-末端删除约1至100个氨基酸残基、在N-末端删除约1至100个氨基酸残基、不改变多肽功能的一个或一个以上氨基酸残基取代，如将丙氨酸替换为甘氨酸取代，这是本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解的，以及上述的组合。

如本文所使用的，当术语“同一性”百分率用于两个或多个核酸或多肽序列时，是指当对两个或多个序列或子序列，采用下文所述的序列比较算法之一(例如，本领域技术人员可采用的BLASTP和BLASTN或其它算法)或目测检测进行比较或比对，以实现最大一致性时，相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分率。根据其应用不同，“同一性”百分率可以存在于被比较的序列区域，例如功能性结构域，或者可选地，存在于被比较的两个序列的全长。

对于序列比较而言，一般地将一条序列作为对照序列与待测序列进行比较。当使用序列比较算法时，将待测和对照序列输入计算机，如有必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。随后根据指定的程序参数，采用该序列比较算法计算待测序列相对于对照序列的序列同一性百分率。

可以通过以下方法对序列进行最优比对以进行比较，例如Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性研究方法，可以使用这些算法的计算机执行形式(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)，或通过目测(通常参见上文所述的Ausubel et al.)。

适于确定序列同一性和序列相似性百分率算法的一个例子为BLAST算法，已在Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中对其进行了描述。公众可在国家生物技术信息中心的网站获得进行BLAST分析的软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

如本文所使用的，术语“包含”以及该术语的变体如“包括”和“含有”并不意味着排除了其它添加物、组分、整数或步骤。

必须注意的是，除非文中明确表示为其它含义，否则在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义。

本发明的组合物

如下文中更详细的描述，本发明包括组合物和穹窿体颗粒的使用方法。所述穹窿体颗粒是具有MVP、融合蛋白、mINT和感兴趣的蛋白例如细胞因子如CCL-21的重组颗粒。所述穹窿体颗粒可以用于将感兴趣的蛋白例如细胞因子递送至细胞或肿瘤或对象。

穹窿体和穹窿体复合物

本发明的组合物包含穹窿体复合物。穹窿体复合物是包封了小分子(药物、传感器、毒素，等等)或感兴趣的蛋白的重组颗粒，例如，肽或蛋白，包括内源性蛋白、异源性蛋白、重组蛋白、或重组融合蛋白。本发明的穹窿体复合物包括细胞因子重组融合蛋白。所述穹窿体复合物来自穹窿体颗粒。

穹窿体例如穹窿体颗粒是在几乎所有的真核组织和细胞，包括树突状细胞(DC)、子宫内膜和肺中广泛存在的、高度保守的核糖核蛋白颗粒，其在哺乳动物、鸟类、两栖动物、粘菌盘基网柄菌、和原生动物布氏锥虫中具有系统发育多样性(Izquierdo et al.，Am.J.Pathol.，148(3)：877-87(1996))。穹窿体具有中空的桶样结构，其带有两个突出的端帽，一个内陷的腰部，和位于穹盖周围规则的小开口。这些开口足以允许小分子和离子进入穹窿体内部。穹窿体的质量为约12.9±1MDa(Kedersha etal.，J.Cell Biol.，112(2)：225-35(1991))且其总体尺寸为约42×42×75nm(Kong et al.，Structure，7(4)：371-9(1999))。内部穹窿腔的体积为约50×103nm3，其足以包绕整个核糖体蛋白。

穹窿体包含三种不同的蛋白，分别命名为MVP、VPARP和TEP1，并包含一种或多种不同的未翻译RNA分子，命名为vRNA。vRNA的数量可以有所不同。例如，大鼠(褐家鼠)每个穹窿体仅有一种形式的vRNA，而人的每个穹窿体具有三种形式的vRNA。丰度最高的蛋白--主穹窿蛋白(MVP)在褐家鼠中为95.8kDa的蛋白，在人类中为99.3kDa的蛋白，其在每个穹窿体中存在96个拷贝，约占穹窿体颗粒总蛋白重量的75％。另外两种蛋白，穹窿体聚-ADP-核糖聚合酶VPARP在人类中为193.3kDa的蛋白，端粒酶/穹窿体相关蛋白1(TEP1)在褐家鼠中为292kDa的蛋白，在人类中为290kDa的蛋白，其在各穹窿体中均存在约2至16个拷贝。

VPARP，mINT结构域和mINT融合蛋白

穹窿体聚ADP-核糖聚合酶(VPARP)包括与聚ADP-核糖聚合酶(PARP)(在对DNA损伤的应答过程中催化ADP-核糖聚合物形成的核蛋白)的催化结构域具有28％同一性的约350个氨基酸的区域。VPARP催化NAD-依赖性聚ADP-核糖基化反应，且纯化的穹窿体具有MVP和VPARP自身靶向的聚ADP-核糖基化活性。VPARP包括一个mINT结构域(主穹窿蛋白(MVP)相互作用结构域)。mINT结构域负责VPARP与主穹窿蛋白(MVP)之间的相互作用。

本发明的穹窿体复合物包括mINT结构域。所述mINT结构域负责感兴趣的蛋白例如细胞因子，与穹窿体蛋白如MVP之间的相互作用。一般而言，所述mINT结构域作为与所感兴趣蛋白例如细胞因子的融合蛋白表达。本发明穹窿体复合物的mINT来自VPARP序列。示例性的VPARP序列和mINT序列见表1。本领域技术人员能够理解，mINT可以是完整的天然存在的序列或部分序列或其片段。在其它实施方式中，mINT与表1所公开的任意VPARP和/或mINT序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在一个实施方式中，所述mINT来自人VPARP，SEQ ID NO：14，GenBank登录号AAD47250，由cDNA，SEQ ID NO：15，GenBank登录号AF158255编码。在某些实施方式中，靶向作用于穹窿体的结构域包含或由与人VPARP蛋白序列(全长人VPARP氨基酸序列为SEQ ID NO：14)的残基1473-1724(SEQ ID NO：69)对应的INT结构域组成。

在其它实施方式中，所述靶向作用于穹窿体的结构域包含或由与人VPARP蛋白序列的残基1563-1724(SEQ ID NO：8)对应的mINT结构域组成。在某些实施方式中，所述靶向作用于穹窿体的结构域包含或由mINT结构域(SEQ ID NO：6)(小鼠mINT)组成。在某些实施方式中，所述靶向作用于穹窿体结构域包含或由SEQ ID NO：7(人mINT)组成。在某些实施方式中，所述靶向作用于穹窿体结构域与SEQ ID NOs：6或7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。

在可选的实施方式中，所述mINT结构域来自TEP1序列。本领域技术人员能够理解，所述mINT可以具有TEP1中天然存在的穹窿体相互作用的结构域的完整序列或部分序列或其片段。

MVP

本发明的穹窿体复合物通常包括MVP。示例性的MVP序列可以见表1。本领域技术人员能够理解，所述MVP可以具有完整的天然存在的序列或部分序列或其片段。在其它实施方式中，所述MVP与表1所公开的任意MVP序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在一个实施方式中，所述MVP是人MVP，SEQ ID NO：16，GenBank登录号CAA56256，由cDNA，SEQ ID NO：17，GenBank登录号X79882编码。在另一个实施方式中，所述MVP是褐家鼠MVP，SEQ ID NO：18，GenBank登录号AAC52161，由cDNA，SEQ ID NO：19，GenBank登录号U09870编码。在其它实施方式中，所述MVP与本文所描述的MVP序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。

在一个实施方式中，提供了一个包含、基本上由、或由修饰的MVP组成的穹窿体复合物，其通过在N-末端加入肽以构建一个或一个以上的重金属结合结构域而修饰。在一个优选的实施方式中，所述重金属结合结构域与选自由镉、铜、金和汞的重金属结合。在一个优选的实施方式中，加入至N-末端的肽是富含半胱氨酸的肽(CP)，如例如SEQ ID NO：20，所述MVP是人MVP，SEQ ID NO：16，且修饰的结果为CP-MVP，SEQ ID NO：21，由cDNA，SEQ ID NO：22编码。在另一个优选的实施方式中，所述富含半胱氨酸的肽是SEQ ID NO：20，所述MVP是褐家鼠MVP，SEQ ID NO：18，且修饰的结果为CP-MVP，SEQ ID NO：23，由cDNA，SEQ ID NO：24编码。这些实施方式特别有益，因为由CP-MVP，SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23组成的穹窿体颗粒，在不存在其它穹窿体蛋白的情况下就能稳定存在。

本文所描述的任意穹窿体复合物均可以包括本文所公开的MVP或修饰的MVP。

TEP1

在某些实施方式中，本发明的穹窿体颗粒包括TEP1蛋白。示例性的TEP1序列可以见表1。本领域技术人员能够理解，TEP1可以具有完整的天然存在的序列或部分序列或其片段。在其它实施方式中，TEP1与表1中公开的任意TEP1序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

TEP1可以是人TEP1，SEQ ID NO：25，GenBank登录号AAC51107，由cDNA，SEQID NO：26，GenBank登录号U86136编码。在另一个实施方式中，所述TEP1是褐家鼠TEP1，SEQ ID NO：27，GenBank登录号AAB51690，由cDNA，SEQ ID NO：28，GenBank登录号U89282编码。本文所描述的任意穹窿体复合物均可以包括TEP1或其修饰。

vRNA

本发明的穹窿体复合物可以包括vRNA。示例性的vRNA序列可以见表1。本领域技术人员能够理解，vRNA可以具有完整的天然存在的序列或部分序列或其片段。在其它实施方式中，vRNA与表1中公开的任意vRNA序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一个实施方式中，所述vRNA可以是人vRNA，SEQ ID NO：29，GenBank登录号AF045143，SEQ ID NO：30，GenBank登录号AF045144，或SEQ ID NO：31，GenBank登录号AF045145，或上述的组合。在另一个实施方式中，所述vRNA是褐家鼠vRNA，SEQ ID NO：32，GenBank登录号Z1171。

本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易想到，即使参考文献或实施例中使用了特定种属的序列，任意MVP、VPARP、TEP1和vRNA的实际序列也可以来自适于本文公开的目的的任意种属。例如，当递送趋化因子或细胞因子至人类器官或组织时，优选地使用包含人MVP、VPARP、TEP1和vRNAF序列的人穹窿体或穹窿体样颗粒。进一步地，本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解，MVP、VPARP、TEP1和vRNA序列的某些种内变异与本发明的目的无关。因此，提及MVP、VPARP、TEP1和vRNA时意味着包括了此类种内变体。

细胞因子

本发明的组合物包括包含细胞因子的穹窿体复合物。一般而言，穹窿体复合物包括细胞因子融合蛋白。

细胞因子是一个涉及免疫调节和炎症过程的分泌的细胞信号蛋白家族，其由神经系统的神经胶质细胞和免疫系统的多种细胞分泌。可以将细胞因子分类为蛋白、肽或糖蛋白，其包含大量的和多样的调节子家族。细胞因子与细胞表面的受体结合触发细胞内信号，其可导致若干基因及其转录因子上调或下调，或产生反馈性抑制。

在某些实施方式中，本发明的细胞因子包括免疫调节剂，如白介素(IL)和干扰素(IFN)。适宜的细胞因子可以包括一种或多种下述类型的蛋白：四α-螺旋束家族(包括IL-2亚家族、IFN亚家族、和IL-10亚家族)；IL-1家族(包括IL-1和IL-8)，以及IL-17家族。细胞因子还可以包括分类为1型细胞因子，其可以增强细胞的免疫应答(例如IFN-γ、TGF-β，等等)或2型细胞因子，其协助抗体应答(例如IL-4、IL-10、IL-13，等等)。

在一个实施方式中，所述细胞因子是趋化因子。趋化因子是最大的细胞因子家族，通过形成二硫键的四个不变半胱氨酸残基对其进行定义。趋化因子通过活化特异性的G蛋白偶联受体而产生功能，导致炎性或非炎性细胞向适宜的组织或组织内部区域迁移。趋化因子可作为趋化剂，引导细胞的迁移并且在产生趋化因子的源头促进细胞的聚集。

在某些实施方式中，本发明的趋化因子包括自平衡趋化因子，其组成性地产生和分泌。自平衡趋化因子直接将淋巴细胞运输至淋巴组织，其与免疫监视有关并具有利用淋巴系统中的抗原定位T细胞或B细胞的功能。在其它实施方式中，本发明的趋化因子包括促进树突状细胞募集和定位至炎症和感染部位的炎性趋化因子。若干趋化因子与单核细胞和不成熟的树突状细胞迁移有关，这些细胞表达趋化因子受体如CCR1、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR2。在这些树突状细胞上，趋化因子受体的表达受到调节。当暴露于成熟信号时，树突状细胞经历趋化因子受体转变，出现炎性趋化因子受体下调，随后诱导CCR7。这使得不成熟的树突状细胞脱离组织，并定位于发生抗原提呈的淋巴器官(由CCR7激动剂所致)。

在某些实施方式中，所述细胞因子包含CC或β-趋化因子，其前两个半胱氨酸彼此相邻。在其它实施方式中，所述趋化因子包含CXC或α趋化因子，其在前两个半胱氨酸之间具有间隔的氨基酸。在其它实施方式中，所述趋化因子包含CX3C或γ-趋化因子，该类别中仅有一个蛋白，定义为在前两个半胱氨酸之间具有三个间隔的残基。四半胱氨酸模式的两个例外之一为C或δ-趋化因子，其中的多肽仅具有四个半胱氨酸中的两个。

在某些实施方式中，所述细胞因子包含CC趋化因子。所述CC趋化因子的特点为在氨基末端附近具有两个相邻的半胱氨酸，也将其称为β-趋化因子或17q趋化因子。在哺乳动物中，CC亚家族至少包括27个不同的亚家族成员。其包括，但不限于下述CC趋化因子：CCL-1、CCL-2、CCL-3、CCL-4、CCL-5、CCL-7、CCL-8、CCL-9/CCL-10、CCL-11、CCL-12、CCL-13、CCL-14、CCL-15、CCL-16、CCL-17、CCL-18、CCL-19、CCL-20、CCL-21、CCL-22、CCL-23、CCL-24、CCL-25、CCL-26、CCL-27和CCL-28。该亚家族的趋化因子通常含有四个半胱氨酸(C4-CC趋化因子)，但少数CC趋化因子有六个半胱氨酸(C6-CC趋化因子)。C6-CC趋化因子包括CCL1、CCL15、CCL21、CCL23和CCL28。CC趋化因子抑制造血作用，并且诱导单核细胞以及其它类型的细胞如自然杀伤(NK)细胞和树突状细胞的迁移。CC趋化因子在体外趋化胸腺细胞和活化的T细胞，但对B细胞、巨噬细胞、或中性粒细胞没有趋化作用。CC趋化因子还具有介导淋巴细胞归巢至次级淋巴器官的作用。

在其它实施方式中，所述细胞因子包含CXC趋化因子。CXC趋化因子具有被一个氨基酸“X”所分隔的两个N-末端半胱氨酸。在哺乳动物中有17种不同的CXC趋化因子，可以将其分为两类，一类在CXC基序的第一个半胱氨酸前紧接有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(或缩写为ELR)特异性氨基酸序列(或基序)(ELR-阳性)，一类不含ELR基序(ELR-阴性)。缺乏ELR基序的其它CXC趋化因子例如CXCL13，其倾向于趋化淋巴细胞。到目前为止，共发现了7个与CXC趋化因子受体结合的CXC趋化因子，将其命名为CXCR1-7。

在另一个实施方式中，所述细胞因子包含C趋化因子(也称为γ趋化因子)，其仅具有两个半胱氨酸(一个N-末端半胱氨酸和一个下游半胱氨酸)。该组共包括了两个趋化因子(XCL1(淋巴细胞趋化因子-α)和XCL2(淋巴细胞趋化因子-β))。这些趋化因子将T细胞前体吸引至胸腺。

在又一个实施方式中，所述细胞因子包含CX3C趋化因子(或d-趋化因子)。所述CX3C趋化因子在两个半胱氨酸之间具有三个氨基酸。到目前为止，仅发现了一个CX3C趋化因子，将其称为Fractalkine(或CX3CL1)。

在某些实施方式中，所述细胞因子包含CCL-21蛋白。CCL-21表示趋化因子(C-C基序)配体21，其为CC趋化因子家族成员之一。CCL-21由Scya21基因编码，也称为次级淋巴组织趋化因子(SLC)、6Ckine、Exodus-2、Ckβ9、和TCA-4。所述CCL-21与细胞表面趋化因子受体CCR7受体结合。在染色体9的p-臂上发现了人CCL-21基因，其Genebank登录号为NP002980。

示例性的细胞因子序列可以见表1。本领域技术人员能够理解，细胞因子可以是天然存在的完整序列或部分序列或其片段。在另一个实施方式中，所述细胞因子与表1中公开的任意细胞因子序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在某些实施方式中，所述细胞因子包含或由SEQ ID NO：1(小鼠CCL-21蛋白序列)组成。在其它实施方式中，所述细胞因子包含或由SEQ ID NO：2(人CCL-21蛋白序列)组成。在其它实施方式中，所述细胞因子与SEQ ID NOs：1或2具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在另一个实施方式中，本发明的细胞因子由包含SEQ ID NO：3(小鼠CCL-21DNA序列终止密码子减去3个氨基酸)或SEQ ID NO：4(全长小鼠CCL-21DNA序列)的核酸编码。在又一个实施方式中，本发明的细胞因子由包含SEQ ID NO：5(人CCL-21DNA序列)的核酸编码。在某些实施方式中，本发明的细胞因子包含天然的完整DNA序列、部分DNA序列或其片段。在某些实施方式中，本发明的细胞因子由包含与SEQ ID NOs：3、4或5具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸编码。

在又一个实施方式中，所述细胞因子包含下表1中任意细胞因子或趋化因子序列中的一个。用于本发明的组合物和方法的来自人的适宜细胞因子包括，但不限于，白介素-2(IL-2)(DNA序列为SEQ ID NO：33，蛋白序列为SEQ ID NO：34)、白介素-7(IL-7)(DNA序列为SEQ ID NO：35，蛋白序列为SEQ ID NO：36)、白介素15(IL-15)(DNA序列为SEQ ID NO：37，蛋白序列为SEQ ID NO：38)、白介素12B(IL-12B)(DNA序列为SEQ ID NO：39，蛋白序列为SEQ ID NO：40)、白介素12A(IL-12A)(DNA序列为SEQ ID NO：41，蛋白序列为SEQ ID NO：42)、集落刺激因子2(DNA序列为SEQ ID NO：43，蛋白序列为SEQ ID NO：44)、趋化因子(C-X-C基序)配体9(CXCL9)(DNA序列为SEQ ID NO：45，蛋白序列为SEQ ID NO：46)、趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10)(DNA序列为SEQ ID NO：47，蛋白序列为SEQID NO：48)、干扰素α-d(IFN-α)(DNA序列为SEQ ID NO：49，蛋白序列为SEQ IDNO：50)、干扰素-γIEF SSP5111(DNA序列为SEQ ID NO：51，蛋白序列为SEQ IDNO：52)、趋化因子(C-C基序)配体19(CCL-19)(DNA序列为SEQ ID NO：53，蛋白序列为SEQ ID NO：54)、趋化因子(C-C基序)配体21(CCL-21)(DNA序列为SEQ ID NO：55，蛋白序列为SEQ ID NO：56)、肿瘤坏死因子(TNF)(DNA序列为SEQ ID NO：57，蛋白序列为SEQ ID NO：58)、和白介素27(IL-27)(DNA序列为SEQ ID NO：59，蛋白序列为SEQ ID NO：60)。

本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解，即使参考文献或实施例中使用了特定种属的序列，任意细胞因子的实际序列也可以来自适于本文公开的目的的任意种属。例如，当递送趋化因子或细胞因子至人类器官或组织时，优选地使用人细胞因子。进一步地，本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解，细胞因子序列的某些种内变异与本发明的目的无关。因此，提及细胞因子时意味着包括了此类种内变体。

融合蛋白

一般而言，本发明的穹窿体复合物包括融合蛋白，例如细胞因子融合蛋白。所述细胞因子融合蛋白是由核苷酸表达的重组蛋白，所述核苷酸编码与靶向作用于穹窿体的结构域，例如mINT，在框内融合的细胞因子。在某些实施方式中，所述细胞因子融合蛋白包含与趋化因子蛋白序列融合的mINT结构域。在其它实施方式中，所述细胞因子融合蛋白包含与CCL-21蛋白融合的mINT结构域。在另一个实施方式中，所述细胞因子与MVP蛋白的N-末端融合。在一个实施方式中，所述细胞因子与MVP蛋白的C-末端融合。

示例性的细胞因子融合序列可以见表1。本领域技术人员能够理解，细胞因子融合序列可以具有天然存在的完整序列或部分序列或其片段。在其它实施方式中，所述细胞因子融合序列与表1中的任意细胞因子融合序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在某些实施方式中，所述细胞因子融合蛋白由核酸序列SEQ ID NO：10(小鼠CCL21-mINT融合DNA序列)编码。在其它实施方式中，所述细胞因子融合蛋白由核酸序列SEQ ID NO：11(人CCL21-mINT融合DNA序列)编码。在某些实施方式中，细胞因子融合蛋白包含或由SEQ ID NO：12(小鼠CCL21-mINT融合蛋白序列)组成。在某些实施方式中，所述细胞因子融合蛋白包含或由SEQ ID NO：13(人CCL21-mINT融合蛋白序列)组成。

在一个实施方式中，所述细胞因子融合蛋白包括天然存在的完整细胞因子蛋白序列、部分细胞因子蛋白序列、或其片段。在其它实施方式中，所述细胞因子融合蛋白与SEQ ID NOs：12或13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。在另一个实施方式中，所述细胞因子融合重组DNA序列包括天然存在的完整细胞因子DNA序列、部分细胞因子DNA序列、或其片段。

本文所述的任意细胞因子均可以表达为带有本文所公开的任意mINT结构域的融合蛋白。

荧光蛋白

在某些实施方式中，本发明的穹窿体复合物包括荧光蛋白。在某些实施方式中，所述细胞因子融合蛋白包含荧光蛋白。可以对荧光蛋白进行设计使其与其它蛋白一并表达，其包括但不限于，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(mCherry)、蓝色荧光蛋白(EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal)、青色荧光蛋白(ECFP、Cerulean、CyPet)和黄色荧光蛋白衍生物(YFP、Citrine、Venus、YPet)。在一个实施方式中，所述细胞因子融合蛋白包含mCherry荧光蛋白或mCherry荧光蛋白的一部分。

分离的核酸和载体

本发明还包括分离的核酸，其编码包含细胞因子编码序列和穹窿体结构域编码序列的细胞因子融合蛋白。在一个实施方式中，所述分离的核酸编码包含CCL-21编码序列和mINT编码序列的趋化因子融合蛋白。在另一个实施方式中，所述趋化因子编码序列包含或由SEQ ID NO：5(人)组成，并且所述mINT编码序列由SEQ ID NO：7(人)组成。在另一个实施方式中，所述趋化因子编码序列包含或由SEQ ID NO：3(小鼠)组成，并且所述mINT编码序列由SEQ ID NO：6(小鼠)组成。在一个实施方式中，所述分离的核酸是cDNA质粒构建体，其编码全长细胞因子蛋白和包含或由SEQ ID NO：6或7(人和小鼠mINT)组成的mINT结构域。表1中列出了编码某些示例性趋化因子或细胞因子融合蛋白的核酸序列。

编码本发明的细胞因子融合蛋白的核酸分子可以由载体如重组病毒载体表达。本发明的重组病毒载体包含编码本发明细胞因子融合蛋白的序列和用于表达细胞因子融合序列的任意适宜的启动子。适宜的启动子包括，例如U6或H1RNA pol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。其它适宜启动子的选择是本领域的常规技术手段。本发明的重组病毒载体还可以包含用于在特定组织或特定细胞内环境中表达细胞因子融合重组基因的诱导性或组成性启动子。在一个实施方式中，在pFastBac质粒和杆状病毒试验方案(Invitrogen，Gaithersburg，MD，目录号13459-016或10608-016)中使用重组杆状病毒和启动子。

适宜的表达载体通常包括DNA质粒或病毒载体。可以使用与真核细胞具有相容性，优选与脊椎动物细胞具有相容性的表达载体，生产用于表达本文所描述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域公知的且可以通过多种商品化渠道获得。通常，提供的此类载体包含用于目标核酸片段插入的适宜限制性位点。表达载体的递送可以是系统性的，如通过静脉或肌内给药、通过对从患者植出的靶细胞给药然后再导入患者体内、或通过允许导入目标靶细胞的任意其它方法。

可以将表达编码细胞因子融合蛋白的核酸序列的质粒以与阳离子脂质载体(例如Oligofectamine)或非基于阳离子脂质的载体(例如Transit-TKOTM)形成复合物的形式转染进入靶细胞。可以采用多种已知方法监测载体是否成功导入宿主细胞。例如，可以使用报告基因标记瞬时转染，如荧光标记物，如绿色荧光蛋白(GFP)。可以采用使转染细胞对特定环境因素(例如，抗生素和药物)具有抗性的标记物如潮霉素B抗性，保证离体细胞的稳定转染。

可用于本文所描述的方法和组合物的病毒载体系统包括，但不限于，(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于过滤性病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒，等等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯性疱疹病毒载体；(e)SV 40病毒；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体如正痘病毒，例如牛痘病毒载体或禽痘，例如金丝雀痘病毒或鸡痘；以及(j)依赖于辅助病毒的腺病毒或裸腺病毒。复制缺陷病毒也可能是有利的。将不同的载体并入或不并入细胞的基因组。如有需要，构建体可以包括用于转染的病毒序列。可选地，可以将构建体加入具有附加型复制能力的载体，例如EPV和EBV载体。用于编码细胞因子融合蛋白的核酸重组表达的构建体通常需要调控元件，例如启动子、增强子等等，以确保细胞因子融合核酸在靶细胞中表达。载体和构建体需要考虑的其它方面将在下文中进一步说明。

用于递送细胞因子融合核酸的载体中可以包括供细胞因子融合核酸在目标靶细胞或组织中表达的足量调控元件(启动子、增强子，等等)。可以选择调控元件以提供组成性或调节性/诱导性表达。本领域技术人员能够根据转基因的预期用途选择适宜的调控/启动子序列。

在一个特定实施方式中，可以使用含有重组基因的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller et al.，Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体中含有使病毒基因组正确包装并整合进入宿主细胞DNA的必要组件。编码细胞因子融合蛋白的核酸序列被克隆至一个或多个载体，其便于将核酸递送至患者。有关逆转录病毒载体更为详细的介绍可以参见，例如Boesen et al.，Biotherapy 6：291-302(1994)，其中描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因递送至造血干细胞以使得干细胞对化疗具有更高的耐受性。其它说明逆转录病毒载体在基因治疗中用途的参考文献为：Clowes et al.，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；以及Grossmanand Wilson，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)。预计使用的逆转录病毒包括，例如U.S.专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276中描述的基于HIV的载体，其参考并入本文。

还预计，可以将编码细胞因子融合蛋白的分离的核酸用腺病毒递送至细胞。在递送基因至呼吸道上皮细胞时，或用于基于腺病毒的递送系统如递送至肝脏、中枢神经系统、内皮细胞、和肌肉时，腺病毒是极具吸引力的载体。腺病毒的优势为能够感染非分裂细胞。Kozarsky and Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)中有一篇关于基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout et al.，Human GeneTherapy 5：3-10(1994)中显示了使用腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸道上皮细胞。腺病毒在基因治疗中用途的其它例子可以见Rosenfeld et al.，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT公开号WO94/12649；以及Wang，et al.，Gene Therapy 2：775-783(1995)。在本发明中表达核酸分子的适宜AV载体的性质，构建重组AV载体的方法，以及将载体递送至靶细胞的方法已在Xia H et al.(2002)，Nat.Biotech.20：1006-1010中描述。

还预计使用腺相关病毒(AAV)载体(Walsh et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；U.S.专利号5,436,146))。在本发明中，表达dsRNA的适宜AAV载体的性质、构建重组AV载体的方法、以及将载体递送至靶细胞中的方法已在SamulskiR et al.(1987)，J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J et al.(1996)，J.Virol，70：520-532；Samulski R et al.(1989)，J.Virol.63：3822-3826；U.S.专利号5,252,479；U.S.专利号5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；和国际专利申请号WO 93/24641中描述，其公开的全部内容整体参考并入本文。

另一种优选的病毒载体是痘病毒，如牛痘病毒，例如减毒牛痘如修饰的病毒Ankara(MVA)或NYVAC，禽痘如鸡痘或金丝雀痘。

载体的药物制剂可以包括可接受稀释剂中的载体，或可以包括包埋有基因递送载体的缓释基质。可选地，当整个基因递送载体完全由重组细胞生产时，例如逆转录病毒载体，所述药物制剂可以包括一种或多种生产基因递送系统的细胞。

本发明中可以使用的其它表达载体的例子包括pFASTBAC表达载体和E.colipET28a表达载体。

一般地，表达重组细胞因子融合蛋白基因的重组载体被递送至并持续存在于靶细胞中。可以通过转染试剂如Lipofectamine将载体或质粒转染至靶细胞。用于表达编码本发明细胞因子融合蛋白的核酸的细胞的例子包括Sf9细胞或昆虫幼虫细胞。可以在昆虫细胞中生产仅基于MVP蛋白表达的重组穹窿体。Stephen，A.G.et al.(2001).J.Biol.Chem.276：23217：23220；Poderycki，M.J.，et al.(2006).Biochemistry(Mosc).45：12184-12193。

本发明的药物组合物

在一个实施方式中，本发明提供了一种使用包含本发明的穹窿体复合物的药物组合物的方法。除一种或多种穹窿体复合物以外，这些组合物中还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其它材料。此类材料应是无毒的，并且不干扰活性成分的效力。载体或其它材料的确切性质依赖于给药途径，例如口服、静脉、皮肤或皮下、鼻内、肌内、腹腔途径。

在某些实施方式中，瘤内注射的药物组合物包含等张的或其它适宜的载体液体或溶液。

用于静脉、皮肤或皮下注射，或在患病部位注射时，活性成分将被制成胃肠外可接受的水溶液形式，其是无热源且具有适宜pH、等张且稳定。本领域相关的技术人员可以使用例如等张溶液，如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格氏注射液，很好地制备适宜的溶液。还可以根据需要加入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。

在其它实施方式中，供口服给药的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包括固体载体如明胶或辅助剂。液体药物组合物通常包括液体载体如水、石油，动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐溶液、右旋糖或其它糖类溶液或糖醇如乙烯乙二醇、丙烯乙二醇或聚乙烯乙二醇。

在某些实施方式中，药物组合物给药可以是局部，肺部，例如通过吸入或吹入粉末或烟雾，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或胃肠外给药。胃肠外给药包括静脉、动脉、皮下、腹腔或肌内注射或输注；或颅内，例如实质内、鞘内或脑室内给药。胃肠外给药的制剂可以包括无菌水溶液，其中还可以包含缓冲剂、稀释剂和其它适宜的添加剂。供静脉使用时，应控制溶质的总浓度以制备等张制剂。

使用方法

本文所描述的穹窿体复合物可以用于递送感兴趣的蛋白，例如细胞因子，至细胞、组织、细胞外环境、肿瘤、生物体或对象。在一个实施方式中，所述穹窿体复合物包含本文所描述的细胞因子，例如CCL-21，且所述穹窿体复合物被引入细胞、组织、或肿瘤。在某些实施方式中，将穹窿体复合物引入细胞周围的细胞外环境。在其它实施方式中，将所述穹窿体复合物引入生物体或对象。本发明穹窿体复合物的递送包括给予穹窿体复合物至特定组织、特定细胞、环境介质、或至生物体。在某些实施方式中，可以通过细胞、组织、或生物体内的传感器检测穹窿体复合物的递送。例如，可以使用标准技术，如荧光测定法或分光光度法进行检测。本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解，该方法可用于，例如，检测细胞内的pH，其中传感器是pH依赖性荧光传感器。

本发明的方法包括通过将细胞与本文所描述的任意穹窿体复合物接触，刺激对细胞的免疫应答。本发明的细胞包括，但不限于，任意真核细胞、哺乳动物细胞、或人细胞，包括肿瘤细胞。在某些实施方式中，将细胞与穹窿体复合物接触而诱导T细胞和/或树突状细胞迁移至细胞。

本发明的方法包括将穹窿体复合物递送至对象。可以通过多种不同方法将穹窿体复合物递送至有需要的对象。可以通过给予对象穹窿体复合物实现直接体内递送。可选地，通过给予编码和指导穹窿体复合物或穹窿体复合物组分表达的一个或多个载体实现间接递送。在一个实施方式中，将穹窿体复合物给予哺乳动物，如小鼠或大鼠。在另一个实施方式中，将穹窿体复合物给予人。

在一个实施方式中，本发明的递送方法包括将穹窿体复合物系统性注射至肿瘤，以增强透过和滞留(EPR)效应。参见Maeda et al.，J.of Controlled Release 2000，65：271-284；Griesh，K.，J.of Drug Targeting 2007，15(7-8)：457-464；Allen et al.，Science2004，303：1818-1822。实体肿瘤具有广泛的血管生成作用，因此具有过多的脉管系统，有缺陷的血管结构，以及受损的淋巴引流/回收系统，并且多种渗透性介质的产生大大增加。由于实体肿瘤的该生物学性质，使得静脉给予大分子抗癌药和试剂包括穹窿体复合物后，会因为实体肿瘤中缺乏有效的淋巴引流而蓄积和保留在肿瘤中。本发明包括系统性或靶向递送本文所描述的穹窿体复合物至实体肿瘤的方法，如肺癌。

本发明的其它方法包括在对象中刺激免疫应答。所述方法包括给予穹窿体复合物至对象。给药可以包括在对象中瘤内注射穹窿体复合物，其已在本文中详细描述。

治疗方法

本发明涉及一种通过给予对象(例如，患者)本发明的穹窿体复合物治疗或控制疾病如癌症的方法。在某些实施方式中，本发明的穹窿体复合物可以用于治疗或控制肺癌。在另一个实施方式中，本发明的方法包括在需要此类治疗或控制的对象中治疗或控制癌症的方法，包括给予对象治疗有效量的本文所描述的穹窿体复合物。在一个实施方式中，所述方法包括通过鉴别已诊断为肺癌或具有发展成肺癌风险的人和给予治疗或预防有效量的CCL-21穹窿体复合物至人，以对人进行治疗。在另一个实施方式中，该方法包括通过瘤内注射给予人治疗或预防有效量的CCL-21穹窿体复合物。

本发明的穹窿体复合物可以用于治疗任意实体癌症，例如肺癌、乳腺癌、头颈部癌症、前列腺癌，等等。小鼠遗传学方面的进展产生了可供多种人类疾病研究，如肺癌治疗，的多个小鼠模型。此类模型用于穹窿体复合物的体内检测，以及确定治疗有效量。对适宜的小鼠模型，例如荷瘤小鼠，瘤内注射给予其CCL-21穹窿体复合物。

来自细胞培养试验和动物研究的数据可以用于确定人用剂量范围。对于本发明所述方法中使用的任意化合物而言，可以通过细胞培养试验估算最初的治疗有效剂量。可以在动物模型中确定一个剂量以达到穹窿体复合物的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更加准确地确定在人体内使用的剂量。对给予穹窿体复合物的小鼠肿瘤细胞样品的分析也能够指示治疗有效剂量。

为向对象给予依据本发明的药物组合物，优选给药“治疗有效量”或“预防有效量”(视情况而定，虽然可以将预防认为是治疗)，其足以对个体显示出益处。实际给药量以及给药速率和时间将依赖于所治疗疾病的性质和蛋白聚集的严重程度。全科医生和其它内科医生可以确定治疗处方，例如确定剂量等，通常会考虑所治疗的疾病、每位患者的身体状况、递送部位、给药方法和医师们已知的其它因素。上文中提到的技术和方法的例子可以参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(ed)，1980。组合物可以单独给予或与其它治疗联用，可以同时给予或顺序给予，视治疗状况而定。

在某些实施方式中，穹窿体复合物的给药剂量在约0.1至10,000毫克每千克体重或环境介质之间。在另一个实施方式中，穹窿体复合物的给药剂量在约1至1,000毫克每千克体重或环境介质之间。在另一个实施方式中，穹窿体复合物的给药剂量在约10至1,000毫克每千克体重或环境介质之间。对于静脉注射和腹腔注射而言，给药剂量优选终体积在约0.01至1ml之间。对于吸入给药而言，给药剂量优选终体积在约0.01至1ml之间。本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解，可以根据需要采用相同的参数重复给药一次或多次，以达到本文所公开的目的。

例如，药物组合物可以在对象中针对各肿瘤一次性给药，或者穹窿体复合物可以以适宜的间隔分两次、三次、或更多次给药或注射。那样的话，可以将穹窿体复合物分次注射，以达到所需的总剂量。

本发明的穹窿体复合物可以与其它已知有效的癌症，包括肺癌，治疗剂联合给药。主治医生可以根据采用本领域公知的或本文所描述的效能标准检测方法观察到的结果调整穹窿体复合物给药或注射的剂量和时限。本领域技术人员也可以理解，某些因素可能影响有效治疗对象所需的剂量和时限，包括但不限于，疾病或病症的严重性、既往治疗、总体健康状况和/或对象的年龄、以及存在的其它疾病。

制备穹窿体复合物的方法

本发明的方法包括制备本文所描述的穹窿体复合物。

在一个实施方式中，所述穹窿体复合物来自或纯化自天然来源，如哺乳动物的肝脏或脾脏组织，其使用本领域技术人员熟知的方法制备，如例如组织匀浆、差速离心、不连续蔗糖梯度分级分离和氯化铯梯度分级分离。在另一个实施方式中，所述穹窿体复合物可以采用重组技术制备。重组穹窿体复合物制备方法的详细情况如下文所述。

在某些实施方式中，选择感兴趣的靶点即感兴趣的蛋白包装于穹窿体复合物中。感兴趣的靶点可以选自由酶、药物试剂、质粒、多核苷酸、多肽、传感器及上述组合组成的组。在一个优选的实施方式中，感兴趣的靶点为重组蛋白，例如细胞因子融合蛋白，例如CCL-21融合蛋白。

优选地，如果感兴趣的靶点是重组蛋白，则使用编码重组蛋白的多核苷酸序列产生杆粒DNA，其用于产生包含该序列的杆状病毒。随后采用原位组装系统如杆状病毒蛋白表达系统，依照标准技术使用杆状病毒感染用于生产蛋白的昆虫细胞，其是本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解的。优选地，所述杆状病毒蛋白表达系统可以用于生产毫克数量级的穹窿体复合物，可以将该系统放大至生产克数量级的依据本发明的穹窿体复合物。

在另一个实施方式中，将感兴趣的靶点加入所提供的穹窿体中。在一个优选的实施方式中，通过将穹窿体与感兴趣的靶点在适宜的温度下孵育适宜的时间，即可完成整合，其是本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解的。然后纯化含有感兴趣的蛋白的穹窿体，如例如采用蔗糖梯度分级分离，这是本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解的。

在其它实施方式中，将包含感兴趣靶点的穹窿体给予生物体、特定组织、特定细胞、或环境介质。给药可以采用任意适宜的途径进行，其是本领域的普通技术人员结合本文公开的内容容易理解的。

在一个实施方式中，所述方法包括制备本发明的组合物，通过a)将融合蛋白与由Sf9细胞产生的大鼠MVP混合得到混合物，所述融合蛋白包含由Sf9细胞产生的与mINT融合的趋化因子；b)将混合物孵育足够长的时间以使得融合蛋白包装进入穹窿体复合物内部，从而产生组合物。使用编码重组杆状病毒的CCL-21-mCherry-mINT或CP-MVP感染Sf9细胞。可以将含有重组CCL-21-mINT和由Sf-9细胞产生的大鼠MVP的裂解产物混合，以允许形成含有CCL-21融合蛋白的大分子穹窿体复合物。

在另一个实施方式中，组合物的制备，通过a)将融合蛋白与由昆虫幼虫细胞产生的大鼠MVP混合得到混合物，所述融合蛋白包含与由昆虫幼虫细胞产生的与mINT融合的趋化因子；b)将混合物孵育足够长的时间以使得融合蛋白包装进入穹窿体复合物内部。

关于穹窿体复合物制备方法的详细情况将在实施例中进一步描述。

实施例

下文为用于实现本发明特定实施方式的实施例。所述实施例仅为说明性目的，其无意于以任何方式限制本发明的保护范围。虽已尽力确保所使用数字(例如，量、温度，等等)的准确度，但是某些实验误差和偏差仍是允许的。

除另有说明外，本发明的实践中将采用在本领域范围内常规的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。此类技术已在文献中有详细的解释。参见，例如T.E.Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，现行版本)；Sambrook，etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.，Academic Press，Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Carey and SundbergAdvanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press)Vols A and B(1992)。

方法

穹窿体复合物的克隆、表达、和纯化

将编码CCL-21的cDNA与mINT或mCherry-mINT在框内融合[21]。采用下述引物对鼠源性CCL-21进行PCR扩增：CCL21-正向GCGCGGATCCCCATGGCTCAGATGATG(SEQ ID NO：63)和CCL-21反向GCGCAGATCTTCCTCTTGAGGGCTGTGTCTG(SEQ ID NO：64)。为了在pFastBac中形成mCCL-21-mCherry-mINT，在Qiagen柱中纯化CCL21PCR产物，使用BamH1和Bgl I消化，凝胶纯化，以及连接至BamH1磷酸酶处理的mCherry-mINT pFastBac。使用下述引物对人CCL21进行PCR扩增：CCL-21 F-SpeICCCCACTAGTCCAGTTCTCAGTCACTGGCTCTG(SEQ ID NO：65)、CCL-21-NheICCCCGCTAGCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTG(SEQ ID NO：66)、mINTwith NheICCCCGCTAGCTGCACACAACACTGGCAGGA(SEQ ID NO：67)、mINT with XhoIGGGGCTCGAGTTAGCCTTGACTGTAATGGA(SEQ ID NO：68)以形成hCCL-21-mINT。

采用杆状病毒试验方案产生重组杆状病毒(Invitrogen，Gaithersburg，MD)。使用CCL-21-mCherry-mINT或CP-MVP编码的重组杆状病毒，在感染复数(MOI)为0.01的条件下感染Sf9细胞65小时。收集感染细胞团，将其在含1％Triton X-100、1mM二硫苏糖醇、0.5mM PMSF、和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma P8849)的缓冲液A[50mMTris-HCl(pH 7.4)、75mM NaCl、和0.5mM MgCl2]中于冰上裂解。将含有CP-MVP穹窿体的裂解产物与含有mCCL-21-mCherry-mINT、hCCL-21-mINT的裂解产物混合，在冰上孵育30min，以使得INT融合蛋白包装进入穹窿体。依照此前所描述的方法纯化重组穹窿体复合物[7]。将纯化的重组穹窿体复合物重悬至100-200μl无菌磷酸缓冲盐中。采用BCA检测确定蛋白浓度(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，先通过负染电子显微镜和SDS-PAGE，随后通过考马斯亮蓝染色和Western印记分析对样品进行整体分析。

抗体

Western印记分析使用的一抗为兔抗-MVP多克隆抗体(1/1000稀释)或兔抗-VPARP多克隆抗体(1/500稀释，过夜)，二抗为山羊抗-兔HRP-偶联抗体(1∶2000稀释)(Amersham)。抗-CCL-21抗体购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。对CD3进行免疫染色的一抗购自DAKO。针对CD3(145-2C11)、CD4(RM4-5)、CD8a(53-6.7)的荧光素异硫氰酸酯-、藻红蛋白-、别藻蓝蛋白-、PerCP-或PerCP-Cy7-偶联的抗-小鼠mAb和亚类对照抗体购自BD Biosciences(San Diego，CA)。检测带有细胞表面CD4(GK1.5)、CD25(PC61)、细胞核内Foxp3(FJK-16s)IL-10(JES5-16E3)、和IFNγ(XMG1.2)的Tregs的抗-小鼠mAb购自eBioScience(San Diego，CA)。针对DEC205(205yekta)、CCR7(4B12)和EpCam(G8.8)的抗体购自eBioScience。针对小鼠CD11b(M1/70)、Grl(RB6-8C5)的抗体购自BioLegend(SanDiego)。针对CXCR3(220803)的抗-小鼠mAb购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。卵清蛋白和Bradford蛋白定量染料来自Sigma(St.Louis，MO)。组织消化缓冲液溶于RPMI中，由[0.2mg/ml胶原酶A(Boehringer Mannheim/Roche，Indianapolis，IN)、DNase 25U/ml(Sigma)、和0.3U/ml分散酶(Invitrogen，Carlsbad，Ca)]组成。

趋化作用检测

根据生产厂商的说明，使用带有3μm孔径嵌入物的24-孔板(Costar/Coming，Coming，New York，United States)进行双室趋化作用检测。简言之，将2.0×10⁵个T2细胞在无血清培养基中重悬并加入至上室。在各孔的下室中(三复孔)加入200ng/mlCCL-21-mcherry-vault、600ng/ml重组CCL-21(R&D Systems)、含中和抗-CCL-21重组抗体(5μg/ml)的200ng/ml CCL-21-mcherry-穹窿体、含中和抗-CCL-21重组抗体(5μg/ml)的600ng/ml CCL-21。在这些研究中使用的抗-CCL-21抗体(R&D)的中和浓度(5μg/ml)依据ND50(CCL-21的浓度足以诱发最大应答时，细胞因子活性最高抑制的50％)确定。根据生产厂商的说明，在37℃孵育2小时后，来自下室和嵌入物的迁移细胞得以恢复。将迁移的T2细胞在FACS缓冲液中重悬并通过淋巴细胞计数进行评估。

抗原加工和提呈检测

将细胞(DC2.4(5×104c/孔))以三复孔接种至含OVA蛋白(350μg/ml)，MHC I类限制性CD8T细胞系B3Z(105c/孔)的96-孔板中，在存在对照穹窿体(200ng/ml)，或CCL-21穹窿体复合物(200ng/ml)，或rCCL-21(200ng/ml)的条件下孵育24小时。为确定CCL-21对APC活性的影响，使用抗-CCL-21Ab(5μg/ml)(R&D)中和CCL-21。通过ELISA(eBioScience)定量检测上清液中活化CD8T细胞分泌的IL-2。

细胞培养

鼠源性Lewis肺癌细胞系(3LL，H2b)来自美国模式培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。将细胞在含加入10％FBS(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)、青霉素(100U/ml)、链霉素(0.1mg/ml)、和2mM谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)的RPMI 1640培养基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)的25-cm²组织培养瓶中常规单层培养，同时保持37℃并使湿润的空气中含5％CO₂。该细胞系无支原体，在第十代前使用细胞。

肿瘤发生模型

将无病原C57BL/6小鼠和UBC-GFP/BL6(6-8周龄；Jackson Laboratory)饲养于西洛杉矶退伍军人事务部动物研究动物饲养所。在肿瘤发生实验中，将1.5×10⁵3LL个肿瘤细胞皮下注射至C57BL/6小鼠的右肩胛处。单次瘤内注射给予荷瘤9日的小鼠以200μl生理盐水为稀释剂的mCCL-21-mCherry-CP-MVP穹窿体(200ng)，CP-MVP穹窿体(200ng)。通过使用测径器测量各肿瘤的两等分直径，监测肿瘤体积。使用公式V＝0.4ab²计算肿瘤体积，其中“a”为最大直径，“b”为最小直径。为确定肿瘤中淋巴细胞的浸润程度，按照上文所述的方式处置荷瘤9天的UBC-GFP/BL6小鼠，给药7天后，分离未坏死的肿瘤并在OCT中冷冻。将冰冻组织切成5-μm厚的切片，固定在载玻片上，使用4′，6-二脒基-2-苯吲哚(DAPI)固定剂复染。在配有电荷偶联照相系统的1X71奥林巴斯荧光显微镜下观察切片。使用Image Pro软件获得x10和x40物镜下的图像。

原位模型

按照此前在Andersson，A.et al.J Immunol 2009，182(11)：6951-6958中描述的方法将肿瘤植入肺部[24]。简言之，在氯胺酮/甲苯噻嗪的麻醉下，利用带有30号针头的结核菌素注射器经胸廓途径将溶于25μl NS稀释剂的5×10³3LL-GFP细胞注入C57BL/6小鼠的左肺。肿瘤接种一周后，通过胸廓注射给予小鼠稀释剂、对照穹窿体或CCL-21穹窿体复合物。肿瘤植入四周后，收集肺脏以评估肿瘤负荷和白细胞浸润的情况。在肺部肿瘤消化物的单细胞悬液中，通过门控表达GFP和EpCam的3LL肿瘤细胞，定量肿瘤负荷情况。

免疫染色

进行免疫组织化学染色以确定和表征浸润细胞。特别地，依照标准试验方案，将5μm厚的石蜡切片在二甲苯中脱蜡并在浓度逐渐降低的乙醇中水化[25]。在柠檬酸缓冲液中热修复抗原(煮沸3min)，随后使用溶于TBS中的3％过氧化氢封闭内源性的过氧化物酶活性10min。在室温条件下(RT)将所有组织封闭(含4％BSA、10％蔗糖、1％正常猪血清的TBS)20min。在封闭溶液中按照下述CD3 1∶200的浓度稀释一抗(DAKO，Cytomation，Carpinteria，CA，USA)。在4℃条件下将切片与抗体孵育过夜。

次日，使用含0.02％吐温的Tris-缓冲盐溶液洗涤切片。随后在室温条件下使用生物素化的山羊抗-小鼠二抗孵育，再加入抗生物素蛋白链菌素-偶联的碱性磷酸酶(VectastainABC-AP试剂盒；Vector Laboratories，Burlingame，California)，并使用Vector Red底物溶液(Vector Laboratories)进行发色团显色。使用苏木素对切片进行复染、经脱水和包埋后用于分析和照相。

流式细胞术

对经上文所述处理的肿瘤单细胞悬液，通过流式细胞术检测下述白细胞标记物CD3、CD4、CD8、CCR7、CD11b、Grl、DEC205、CD25、FOXP3和CXCR3。对T细胞细胞质中的IFNγ和IL-10进行染色。为了对肿瘤组织进行分析，使用10ml注射器在筛网上对肿瘤进行机械破碎，并将其加入组织消化缓冲液在37℃条件下孵育25min。将细胞过滤通过70μm尼龙滤器(BD Biosciences，Bedford，MA)，并使用特异性标记物染色，进行流式细胞术分析。在位于洛杉矶的加利福尼亚大学Jonsson癌症中心流式细胞术中心实验室的FACSCanto(BD Biosciences)/FACSCalibur式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)上采集样品。利用FCS Express 3(De Novo Software，Canada)对总计10,000至25,000个门控事件进行分析。将与无关亚型匹配的抗体共同孵育的细胞和未染色细胞作为对照。根据对照染色的情况设置截止值。

T细胞细胞裂解

对治疗后的T淋巴细胞裂解应答情况进行评估。采用Miltenyi Biotec小球，通过负性选择从脾脏中纯化T细胞，评估其针对自体3LL肿瘤细胞系和同基因对照B16黑色素肿瘤细胞系的细胞裂解活性。在96-孔板中设置4复孔，将T细胞效应器与肿瘤细胞靶(E∶T为20∶1和40∶1)共培养，孵育18小时后在各孔中分别加入20μl阿尔玛蓝。加入阿尔玛蓝三小时后，将培养板置于Wallac 1420荧光酶标仪(Perkin-Elmer Life Science，Turku，Finland)中在激发/发射波长设为530/590nm的条件下读数。

实施例1：将CCL-21包装进入重组穹窿体。

将小鼠趋化因子CCL-21与小鼠mINT融合，以构建包装进入穹窿体复合物中的CCL-21融合蛋白。图1A显示了将CCL-21与mCherry-INT构建体(SEQ ID NO：60)融合，以构建小鼠CCL-21-mCherry-mINT融合蛋白(SEQ ID NO：61)的示意图。将含有重组CCL-21-mINT和由Sf-9细胞产生的大鼠MVP的裂解产物混合，以形成含有可以通过密度梯度超速离心分离的CCL-21融合蛋白的大分子穹窿体复合物。纯化穹窿体复合物含有MVP和CCL-21-mINT(后文中称为CCL-21穹窿体复合物)。图1B显示了通过限制性酶切，将重组CCL-21-mINT加入pFastBac表达载体，并且在电泳凝胶中对CCL-21融合蛋白的表达情况进行分析。通过蔗糖梯度对含有已包装CCL-21-mCherry-mINT的MVP重组穹窿体进行纯化，SDS-PAGE(图1C)分析40％和45％的组分，随后进行考马斯亮蓝染色(图1D)。图1E显示了含有CCL-21-mCherry-mINT的穹窿体的负染TEM成像。

根据对考马斯染色SDS-PAGE凝胶光密度分析的外推结果估计，各穹窿体复合物中有20-30个CCL-21 mINT蛋白分子。其与此前的研究中将其它mINT融合蛋白的多个拷贝包装进入重组穹窿体复合物的结果一致[21]。当估计值为每个穹窿体20-30个CCL-21-mINT蛋白时，其可能处于或接近该尺寸蛋白包装的饱和水平。在蔗糖梯度检测中，CCL-21穹窿体复合物还同含有与荧光素酶融合的INT结构域的穹窿体颗粒表现出非常接近的沉降性质[6，8，21]，提示CCL-21-mINT的加入不影响重组穹窿体复合物的正常结构。图1E显示了通过负染透射电子显微镜检测的纯化穹窿体复合物。

这些结果证实，CCL-21穹窿体复合物的穹窿体具有桶形的形态特征，其与此前确定的含有重组-INT融合蛋白的穹窿体的形态一致[8，26]。

实施例2：CCL-21-穹窿体复合物在体外具有生物学活性并诱导T2细胞的迁 移

为确定当包装进入穹窿体时，CCL-21是否仍保持了其生物学功能，进行了趋化作用检测。通过其受体CCR7介导CCL-21的趋化活性，以诱导T细胞和树突状细胞的迁移。为评估在穹窿体中CCL-21的生物学活性，使用了组成性表达CCR7的T2杂交瘤细胞。将两个不同浓度的CCL-21穹窿体复合物(200ng和600ng)、空穹窿体(600ng)、和重组CCL-21(600ng)置于24-孔Transwell板的下室，将2×10⁵个T2细胞载入上室。

在图2A中，通过流式细胞术确定孵育后迁移至下室的细胞数，以迁移％表示。将2.0×10⁵个T2细胞接种至无血清的上室中。将CCL-21-mCherry-穹窿体复合物(200ng/ml或600ng/ml)、重组CCL-21(600ng/ml)、对照穹窿体(600ng/ml)或中和抗-CCL-21重组抗体(5μg/ml)加入下室的孔中。经过为期两小时的孵育后，通过流式细胞术分析T2细胞的迁移。与对照相比，CCL-21穹窿体复合物能够有效增加T2的迁移，抗-CCL-21中和抗体消除迁移的增加，提示CCL-21穹窿体复合物具有生物学活性并且可以介导T细胞的趋化性迁移。图中的数据为两次独立实验的代表性结果。(柱状图；平均值±SEM，^*p＜0.05，在CCL-21穹窿体复合物与对照穹窿体或抗-CCL-21抗体处理组之间进行比较)

7.5％以上的T2细胞对200ng CCL-21穹窿体复合物产生应答，而相比之下与600ng重组CCL-21共同孵育的T2细胞仅为≤2.5％。将该异常应答考虑为CCL-穹窿体复合物的给定浓度和穹窿体内CCL-21的实际浓度估计值≤20ng。CCL-21穹窿体复合物生物活性增加的可能原因为将蛋白包装进入穹窿体腔的保护环境使得CCL-21的稳定性增加。因为在穹窿体内融合蛋白非共价结合，所以穹窿体向溶液中以梯度形式释放CCL-21，且因形成了陡梯度，使得其迁移细胞数高于重组CCL-21是合理的。中和抗体(针对CCL-21)显示出了对重组CCL-21和CCL-21穹窿体复合物趋化活性的有效阻断，其证明了T2细胞的迁移是CCL-21依赖性的。其最终导致CCL-21穹窿体复合物在功能上具有在体外诱导T2细胞迁移的活性。

这些结果证实，CCL-21细胞因子在包装进入穹窿体复合物后仍能够保持其生物学功能。

实施例3：CCL-21穹窿体复合物增强DC APC的活性

为确定CCL-21穹窿体复合物对树突状细胞(DC)抗原提呈细胞(APC)活性的影响，在体外研究了CCL-21-穹窿体复合物对DC APC活性的影响。比较对照穹窿体、CCL-21-穹窿体复合物增强DC加工和提呈卵清蛋白和活化CD8T细胞分泌IL-2的能力(图2B)。

图2B显示了CCL-21穹窿体复合物增强DC APC的活性，并阻断CCL-21逆转APC活性的增加。在存在或不存在CCL21穹窿体(200ng/ml)和抗-CCL-21抗体(5μg/ml)或对照抗体(5μg/ml山羊IgG)的条件下，将B3Z细胞(1×105个细胞/200μl/孔)与DC 2.4(5X104个细胞/200ul/孔)和卵清蛋白(350μg/ml)共同培养24小时。对照穹窿体的使用浓度为200ng/ml。利用ELISA通过检测IL-2的生成量分析T细胞的活性。数据为两次独立实验的代表性结果。(柱状图；平均值±SEM，^*p＜0.05，在CCL21穹窿体和对照穹窿体或抗-CCL21抗体处理组之间进行比较)CCL-21的中和作用将DC APC的活性消除至对照水平。

这些结果证实，CCL-21穹窿体复合物在体外增强DC APC的活性。

实施例4：CCL-21穹窿体复合物在体内增强抗肿瘤白细胞浸润的募集并降 低3LL的肿瘤负荷

为确定CCL-21穹窿体复合物的体内抗肿瘤活性，在3LL肿瘤负荷小鼠中检测CCL-21穹窿体复合物对已建立的肿瘤负荷的作用。

如图3所示，与空穹窿体相比，CCL-21穹窿体复合物(200ng)单次瘤内注射导致肿瘤负荷显著降低。皮下注射给予C57BL/6小鼠(n＝5)1.5×1053LL个肿瘤细胞，每日监测一次肿瘤生长情况。肿瘤植入5天后，通过瘤内注射，给予小鼠含有CCL-21-mCherry-mINT(200ng)的穹窿体、仅穹窿体(200ng)或生理盐水(稀释剂)，并在实验期间监测肿瘤的生长情况。根据本文所描述的方法测量肿瘤尺寸，并计算肿瘤体积。使用测径器检测二等分肿瘤直径。与未经处理的荷瘤小鼠相比，瘤内给予含有CCL-21-mCherry-mINT的穹窿体导致肿瘤体积显著减小(p＜.001)。

图4A-4B显示了与对照穹窿体相比，CCL-21-穹窿体复合物处理组(图4B)具有增强的白细胞浸润，免疫染色显示浸润几乎均为表达CD3的T细胞(图4B，右下图)。使用苏木素-伊红(H&E)对石蜡包埋的组织切片进行染色，使用可购买得到的抗体对CD3、CD4、CD8和S-100进行免疫组化检测。图4A和4B中的各图均为分离的原位肿瘤和淋巴结中典型区域放大400x的照片。这样，与对照穹窿体相比，CCL-21穹窿体降低肿瘤负荷并增加肿瘤中表达CD3的T细胞的内流。(数据；平均值±SEM，^*p＜0.05，在CCL-21穹窿体与对照组之间进行比较，n＝8只小鼠/组。)

在附加的实验中，在已建成7天的常位3LL肺癌模型中确定CCL-21-穹窿体复合物的抗肿瘤效能。与对照相比，CCL-21-穹窿体复合物使肿瘤负荷降低7倍。在图5A-5C中，来自稀释剂或对照穹窿体的肺肿瘤H&E染色显示肿瘤增大，而相比之下在CCL-21穹窿体复合物处理组中肿瘤减小。图5A显示了仅使用稀释剂对3LL肺癌细胞的处理作用。图5B显示了使用对照穹窿体的处理作用，图5C显示了使用CCL-21穹窿体的处理作用。

图6A显示了在流式细胞术检测中，天然细胞中，以及经稀释剂、对照穹窿体(CV)、或CCL-21穹窿体复合物处理的3LL细胞中的肿瘤负荷百分率。肿瘤负荷利用表达GFP和Epcam的肿瘤细胞占肺部消化产物总量的总百分率计算。将天然的肺脏作为对照以设置门控。CCL-21穹窿体复合物处理后降低了肿瘤负荷。图6B为显示给予稀释剂、对照穹窿体、或CCL-21穹窿体复合物后3LL细胞的肿瘤负荷百分率。

实施例5：CCL-21-穹窿体复合物诱导浸润肿瘤的T细胞产生IFNγ，但降低 IL-10并且增加系统性T细胞的细胞溶解活性

在体内研究了CCL-21穹窿体复合物诱导肿瘤浸润和IL-10表达的作用。

伴随着肿瘤负荷的降低，对瘤内白细胞分群进行评估的结果显示，CD4、CD8、CD3CXCR3、CD3CCR7和DEC205的频率增加，但MDSC和Tregs的水平降低(图7A-7D)。在图7A中，与仅使用稀释剂或对照穹窿体治疗相比，CCL-21穹窿体复合物增加CD4、CD8、CXCR3+CD3+T、CCR7+CD3+T和DEC205+DC浸润，并降低MDSC和Tregs。图7B和7C显示，与对照相比，给予小鼠CCL-21穹窿体复合物后，T细胞浸润中IFNγ表达增加且IL-10表达降低。图7D显示了CCL-21穹窿体处理增强了纯化的脾脏T细胞在体外针对3LL肿瘤母细胞的溶解活性(E∶T为20∶1和40∶1)。

图6A-7D证明，CCL-21减小肿瘤负荷和免疫抑制，增强T和DC的浸润以及诱导系统性T细胞的抗肿瘤活性。特别地，在3LL常位肺癌模型中，CCL-21穹窿体降低肿瘤负荷和免疫抑制(MDSC和Tregs)，并增强瘤内免疫细胞浸润。图6A-7D中显示的实验为，将5×10³个3LL-GFP肿瘤细胞通过胸廓给药注入左肺。肿瘤注射一周后，通过胸廓给药在左肺中给予小鼠稀释剂(NS)、对照穹窿体(2μg)或CCL-21穹窿体(2μg)。肿瘤植入28天后，收集肺部肿瘤用于进行肿瘤负荷和肿瘤白细胞浸润分析。(数据柱状图，平均值±SEM，^*p＜0.05，在CCL-21穹窿体与对照穹窿体组之间进行比较，n＝8只小鼠/组)。

这些结果证实，CCL-21穹窿体复合物诱导浸润肿瘤的T细胞产生IFNγ但降低IL-10，并且增加系统性T细胞的细胞溶解活性。

实施例6：使用CCL-21穹窿体复合物治疗人类癌症

在人类的癌症治疗中，可以依据治疗的侵入性以及基于需要局部治疗还是全身治疗，通过多种方式给予本发明使用的药物组合物。优选的初始治疗可以采用向患者的肿瘤瘤内注射CCL-21穹窿体复合物的方式。在某些实施方式中，向需要治疗肺癌的患者的肺部肿瘤中瘤内注射CCL-21穹窿体复合物。

在某些实施方式中，可以给予患者不同剂量的含有CCL-21穹窿体复合物的药物组合物。

虽然本发明通过引用优选实施方式和多种替代实施方式的方式对发明进行了特定的展现和描述，但是本领域技术人员都应该能够理解，在不脱离本发明公开的主旨和保护范围的情况下，上述内容还可以进行各种形式和细节上的变化。

用于所有目的的，本说明书中引用的所有参考文献、已授权的专利和专利申请均整体参考并入本文。

表1.序列

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Claims (33)

1.一种包含穹窿体复合物的组合物，所述穹窿体复合物包含趋化因子融合蛋白，所述趋化因子融合蛋白包含由氨基酸序列SEQ IDNO：2组成的趋化因子半胱氨酸-半胱氨酸配体21和由氨基酸序列SEQ ID NO：8组成的主穹窿蛋白相互作用结构域。

2.一种包含穹窿体复合物的组合物，所述穹窿体复合物包含主穹窿蛋白和融合蛋白，所述融合蛋白包含细胞因子和靶向作用于穹窿体的结构域，其中靶向作用于穹窿体的结构域是来自穹窿体聚-ADP-核糖聚合酶的主穹窿蛋白相互作用结构域，其中所述主穹窿蛋白相互作用结构域由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成，其中所述细胞因子是分泌的涉及免疫调节和炎症过程的细胞信号蛋白。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述细胞因子是趋化因子，其中所述趋化因子具有形成二硫键的不变的半胱氨酸残基。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述细胞因子是半胱氨酸-半胱氨酸趋化因子。

5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述细胞因子是半胱氨酸-半胱氨酸配体21趋化因子。

6.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述细胞因子由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。

7.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述细胞因子由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

8.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述融合蛋白由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求2的组合物，其进一步包含穹窿体聚ADP-核糖聚合酶、端粒酶穹窿体相关蛋白1、或非编码RNA分子。

10.根据权利要求2的组合物，其特征在于所述融合蛋白进一步包含荧光蛋白。

11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于所述荧光蛋白是mCherry荧光蛋白。

12.编码细胞因子融合蛋白的分离的核酸，其包含细胞因子编码序列和主穹窿蛋白相互作用结构域编码序列，其中所述主穹窿蛋白相互作用结构域编码序列编码由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的主穹窿蛋白相互作用结构域。

13.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于所述细胞因子编码序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的细胞因子。

14.根据权利要12所述的分离的核酸，其特征在于所述细胞因子编码序列编码由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的细胞因子。

15.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于所述核酸编码由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的细胞因子融合蛋白。

16.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于所述核酸编码由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的细胞因子融合蛋白。

17.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于所述核酸由SEQ ID NO：62的核酸序列组成。

18.包含权利要求12-17中任一项所述分离的核酸的载体。

19.根据权利要求18所述的载体，其特征在于所述载体是杆状病毒表达载体。

20.一种细胞，其特征在于包含权利要求12-17中任一项所述的核酸。

21.权利要求2-12中任一项所述的组合物在生产用于在对象中刺激免疫应答的药物中的用途。

22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于所述对象是人。

23.权利要求2-12中任一项所述的组合物在生产用于在对象中治疗癌症的药物中的用途。

24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于所述药物通过瘤内注射给药。

25.根据权利要求23所述的用途，其特征在于所述癌症是肺癌。

26.根据权利要求23-25中任一项所述的用途，其特征在于所述药物给药减小肿瘤体积。

27.根据权利要求23-25中任一项所述的用途，其特征在于所述药物给药减慢肿瘤生长。

28.根据权利要求23-25中任一项所述的用途，其特征在于所述药物给药增加白介素-2的表达。

29.根据权利要求23-25中任一项所述的用途，其特征在于所述对象是哺乳动物。

30.根据权利要求29所述的用途，其特征在于所述对象是人。

31.一种制备权利要求2-12中任一项所述的组合物的方法，包括a)将融合蛋白与由Sf9细胞产生的大鼠MVP混合得到混合物，所述融合蛋白包含由Sf9细胞产生的与主穹窿蛋白相互作用结构域融合的细胞因子；b)将混合物孵育足够长的时间以使得融合蛋白包装进入穹窿体复合物内部，从而产生权利要求2-12中任一项所述的组合物。

32.一种制备权利要求2-12中任一项所述的组合物的方法，包括a)将融合蛋白与由昆虫幼虫细胞产生的大鼠MVP混合得到混合物，所述融合蛋白包含由昆虫幼虫细胞产生的与主穹窿蛋白相互作用结构域融合的细胞因子；b)将混合物孵育足够长的时间以使得融合蛋白包装进入穹窿体复合物内部，从而产生权利要求2-12中任一项所述的组合物。

33.一种制备权利要求2-12中任一项所述的组合物的方法，包括a)将融合蛋白与由Sf9细胞或昆虫幼虫细胞产生的人MVP混合得到混合物，所述融合蛋白包含由Sf9细胞或昆虫幼虫细胞产生的与主穹窿蛋白相互作用结构域融合的细胞因子；b)将混合物孵育足够长的时间以使得融合蛋白包装进入穹窿体复合物内部，从而产生权利要求2-12中任一项所述的组合物。