TW202246511A - 靶向ny-eso-1之增強免疫細胞療法 - Google Patents

靶向ny-eso-1之增強免疫細胞療法 Download PDF

Info

Publication number
TW202246511A
TW202246511A TW111107142A TW111107142A TW202246511A TW 202246511 A TW202246511 A TW 202246511A TW 111107142 A TW111107142 A TW 111107142A TW 111107142 A TW111107142 A TW 111107142A TW 202246511 A TW202246511 A TW 202246511A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
eso
tcr
cell
jun
Prior art date
Application number
TW111107142A
Other languages
English (en)
Inventor
哈利 格魯特 健森
布萊斯 Ｄ 颯特
瑞秋 Ｃ 琳
比讓 Ａ 波爾達吉普爾
肇 平良木
舒巴 波特魯裡
瑞秋 Ａ 富庫達
梅根 Ｌ 摩爾特
斯賓塞 帕克
沛雅 黃
英 王
妮可 克里斯特
奧利薇 約 曼德斯
Original Assignee
美商萊爾免疫藥物股份有限公司
英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商萊爾免疫藥物股份有限公司, 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司 filed Critical 美商萊爾免疫藥物股份有限公司
Publication of TW202246511A publication Critical patent/TW202246511A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464488—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明提供用於治療之工程化人類細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)。亦提供用於製造該等工程化細胞之表現構築體。

Description

靶向NY-ESO-1之增強免疫細胞療法
近年來，過繼性T細胞療法作為癌症治療之潛在場所得到了深入研究。在許多研究中，治療性T細胞經工程化以表現對腫瘤抗原具有特異性之抗原受體。然而，T細胞療法面臨之一個挑戰為由於一種稱為T細胞耗竭的現象，T細胞在活體內缺乏持久性。(參見例如Fraietta等人, Nat Med. (2018) 24(5):563-71；Long等人, Nat Med. (2015) 21(6):581-90；及Eyquem等人, Nature(2017) 543(7643):113-7)。T細胞耗竭的特徵在於代謝功能之明顯變化、轉錄程式改寫、效應功能喪失(例如，細胞介素分泌及細胞毒性之減少)、多種表面抑制性受體之表現增加及細胞凋亡。T細胞耗竭歸因於持續的抗原暴露，導致連續的TCR信號傳導，或經由T細胞上之工程化抗原受體的強直性非抗原依賴性信號傳導(參見例如，Long，同上)。已經尋求預防或逆轉T細胞耗竭作為增強T細胞有效性之手段，例如，在患有癌症或慢性感染之患者中以及在T細胞療法中。參見例如WO 2019/118902，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
因此，仍然需要改良之T細胞療法，其中工程化T細胞具有較高的以及持續的腫瘤殺死效力。
本發明提供了用於增強靶向癌症中NY-ESO-1-表現之免疫細胞療法的組合物及方法。在一個態樣中，本發明提供一種表現構築體，該表現構築體包含一或多個用於表現以下之表現卡匣：a)T細胞受體(TCR)，其特異性結合至與HLA-A分子複合之來自人類NY-ESO-1蛋白質的肽；及b)人類c-Jun多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種減少工程化免疫細胞之功能異常(例如耗竭)的方法。在一相關態樣中，本發明提供一種抑制或減少工程化免疫細胞之耗竭(例如，如藉由下文進一步描述之T細胞耗竭標記物之表現減少所指示)的方法，及一種增加工程化免疫細胞之功能或活性(例如，如藉由增加之抗原誘導之細胞激素產生、細胞毒性及增殖所指示)的方法。此等方法包含向該工程化免疫細胞中引入增加c-Jun在該細胞中之表現的外源核酸分子，其中該工程化免疫細胞包含一或多個表現構築體，該一或多個表現構築體包含一或多個用於表現以下之表現卡匣：a)T細胞受體(TCR)，其特異性結合至與I類MHC分子複合之來自NY-ESO-1蛋白質的肽；及b)人類c-Jun多肽。在一些實施例中，免疫細胞為T細胞，例如人類T細胞。
在一些實施例中，c-Jun為野生型人類c-Jun，其視情況包含SEQ ID NO: 13或16，或與其至少90% (例如至少95、96、97、98或99%)一致之胺基酸序列。在其他實施例中，c-Jun為突變人類c-Jun，其視情況在其轉錄活化域或δ域中包含不活化突變。在特定實施例中，該c-Jun相較於野生型c-Jun包含(i) S63A及S73A突變或(ii)殘基2與102之間或殘基30與50之間的缺失。
在一些實施例中，NY-ESO-1肽來源於人類NY-ESO-1蛋白質且為人類NY-ESO-1 157-165(SEQ ID NO: 19)，且HLA-A分子為HLA-A*02。
在一些實施例中，TCR包含α鏈及β鏈，其中α鏈包含SEQ ID NO: 5中之CDR1-3且β鏈包含SEQ ID NO: 6中之CDR1-3。在其他實施例中，TCR α CDR1-3分別包含SEQ ID NO: 7-9，且TCR β CDR1-3分別包含SEQ ID NO: 10-12。在其他實施例中，該TCR α鏈包含含有SEQ ID NO: 5或與其至少90%(例如至少95、96、97、98或99%)一致之胺基酸序列的可變域，且該TCR β鏈包含含有SEQ ID NO: 6或與其至少90%(例如至少95、96、97、98或99%)一致之胺基酸序列的可變域。在其他實施例中，TCR α及β鏈分別包含SEQ ID NO: 3及4，或分別包含SEQ ID NO: 17及18，或與其至少90%(例如至少95、96、97、98或99%)一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中之表現構築體為病毒載體，例如慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、牛痘載體、單純疱疹病毒載體及艾司坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒載體。
在一些實施例中，本文中之表現構築體包含用於表現c-Jun、TCR α鏈及TCR β鏈之三順反子表現卡匣。在一些實施例中，該三順反子表現卡匣用於表現：a)特異性結合至與HLA-A*02複合之人類NY-ESO-1 157-165肽的αβ T細胞受體(TCR)；及b)人類c-Jun多肽。在一些實施例中，該表現卡匣包含SEQ ID NO: 13之編碼序列及SEQ ID NO: 3及4之編碼序列，視情況其中該等編碼序列在框內藉由選自2A編碼序列及弗林蛋白酶裂解一致序列之序列分開。在一些實施例中，SEQ ID NO: 13之編碼序列包含SEQ ID NO: 21，SEQ ID NO: 3之編碼序列包含SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO: 4之編碼序列包含SEQ ID NO: 2，及/或表現構築體包含SEQ ID NO: 14，或與其至少80%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，表現卡匣包含組成型或誘導型啟動子，視情況EF-1α啟動子，視情況其中該表現構築體為慢病毒載體。
在另一態樣中，本發明亦提供一種包含本文所揭示之三順反子表現構築體之重組病毒，視情況其中該表現構築體為慢病毒載體。
在另一態樣中，本發明提供一種工程化免疫細胞之方法，其包含：(a)提供起始細胞群體，(b)將本文揭示之表現構築體或重組病毒引入起始細胞群體中，(c)視情況選擇表現TCR及c-Jun之細胞，及(d)自步驟(b)或(c)之細胞得到工程化免疫細胞，視情況其中該等免疫細胞為人類細胞。在一些實施例中，該起始細胞群體包含免疫細胞，視情況自體或同種異體T細胞。在其他實施例中，該起始細胞群體包含多能或多潛能細胞，且步驟(d)包含將步驟(b)或(c)之該等細胞分化成免疫細胞，視情況T細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種人類細胞群體，其包含本文所揭示之表現構築體或本文所揭示之重組病毒，視情況其中該等人類細胞為免疫細胞。本發明亦提供一種藉由本文所揭示之方法獲得之免疫細胞群體，視情況其中該等免疫細胞為人類細胞。在一些實施例中，細胞為T細胞，視情況CD8 +T細胞。在一些實施例中，該等細胞相較於不過度表現c-Jun之相應細胞：a)表現較低含量之耗竭標記物(例如CD39、PD-1、TIGIT、TIM-3或LAG-3)，及/或b)表現較高含量之IL-2及/或IFN-γ。在一些實施例中，在持續抗原刺激14天之後，不超過約5%-15%之T細胞為TIGIT陽性。在一些實施例中，在持續抗原刺激14天之後，不超過約2%-5%之T細胞為PD-1陽性。在一些實施例中，在持續抗原刺激14天之後，不超過約20%-45%之T細胞為CD39陽性。在一些實施例中，與不過度表現c-Jun之對照工程化T細胞群體相比，在以1: 1、1: 5、1: 10或1: 20之效應(例如T)細胞與目標細胞比率持續抗原刺激的第0天及/或第14天，T細胞分泌至少多約2倍的IL-2、INF-γ及/或TNF-α。在一些實施例中，與不過度表現c-Jun之對照工程化T細胞群體相比，該等T細胞對抗原起反應增殖至少多約2倍。
本發明亦提供包含本文中之表現構築體、病毒或工程化細胞及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在一個態樣中，本發明提供一種殺死目標細胞之方法，其包含使該等目標細胞與本文中之工程化免疫細胞(例如T細胞，諸如CD8 +T細胞)或醫藥組合物在允許該等免疫細胞殺死該等目標細胞之條件下接觸，其中該等目標細胞為表現NY-ESO-1之癌細胞，視情況其中，相較於不包含導致c-Jun過度表現之外源核酸分子的相應免疫細胞，該等免疫細胞在與該等目標細胞接觸時表現較低含量之耗竭標記物(例如CD39、PD-1、TIGIT、TIM-3或LAG-3)。
在另一態樣中，本發明提供一種治療有需要之人類患者的方法，其包含向該患者投與本文所揭示之人類細胞或醫藥組合物。患者可能患有例如表現NY-ESO-1之癌症(例如轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌、骨髓瘤、食道癌、滑膜肉瘤、黏液/圓細胞脂肪肉瘤、胃癌、乳癌、肝細胞癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌或膀胱癌)。
本發明亦提供本文中之表現構築體、病毒或工程化細胞的用途，其用於製造用以治療有需要之患者之藥劑。進一步提供用於在如本文所述之治療方法中治療有需要之患者的表現構築體、病毒、細胞或醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供對與HLA-A*02複合之NY-ESO-1 157-165肽具有特異性之αβ T細胞受體(TCR)，其中TCR之α鏈包含分別包含SEQ ID NO: 7-9之CDR1-3，且TCR之β鏈包含分別包含SEQ ID NO: 10-12之CDR1-3。在一些實施例中，TCR之α及β鏈分別包含SEQ ID NO: 5及6；分別包含SEQ ID NO: 3及4；或分別包含SEQ ID NO: 17及18。
本發明之其他特徵、目標及優勢在以下實施方式中顯而易見。然而，應理解，實施方式雖然指示本發明之實施例及態樣，但仍僅藉助於說明而非限制之方式給出。對於熟習此項技術者而言，在本發明之範疇內的各種改變及修飾將自實施方式變得顯而易見。
相關申請之交叉引用
本申請案主張2021年2月25日提交之美國臨時申請案63/153,939及2021年8月25日提交之63/236,789的優先權，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供工程化人類細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)，其包含用於共表現重組T細胞受體(TCR)及c-Jun蛋白之表現構築體。該重組TCR結合與HLA-A分子複合之NY-ESO-1肽。NY-ESO-1蛋白質由一系列腫瘤表現(Chen等人, PNAS(1997) 94:1914-8)。源自此蛋白質之肽係藉由腫瘤細胞表面上之腫瘤細胞的I類HLA分子呈現。因此，NY-ESO-1肽/HLA複合物提供治療性T細胞可靶向之癌症標記物。
c-Jun在此等治療性(例如，T)細胞中之過度表現係藉由例如減輕、減少或預防T細胞功能異常(例如，T細胞耗竭)來幫助維持細胞的活性狀態。諸如T細胞之本發明工程化免疫細胞針對攜帶NY-ESO-1之腫瘤細胞表現出持續有效的細胞毒性。與不過度表現c-Jun(例如經由外源引入之c-Jun基因序列)之T細胞相比，本發明工程化T細胞顯示較少的T細胞耗竭跡象。工程化細胞可能具有以下一或多種特徵：(i)它們不具有隨時間增加之耗竭標記物PD-1、TIGIT及/或CD39的表現，(ii)它們具有降低之細胞凋亡速率，(iii)它們保持活性生物學狀態，包括分泌細胞介素，包括IL-2及INF-γ，(iv)它們具有增強之細胞毒性；(v)它們顯示出對具有低表面抗原之腫瘤目標的識別增加；(vi)它們對抗原起反應之增殖增強；(vii)在重複抗原刺激後保持存活及功能性。 I. 免疫細胞來源
本發明之工程化免疫細胞的來源可以為待治療之患者(即自體細胞)或來自並非待治療患者之供體(例如同種異體細胞)。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化T細胞。本文中之工程化T細胞可為CD4 +CD8 -(亦即CD4單陽性) T細胞、CD4 -CD8 +(亦即CD8單陽性) T細胞或CD4 +CD8 +(雙陽性) T細胞。功能上，T細胞可為細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺手T細胞、抑制T細胞或其混合物。待工程化之T細胞可為自體或同種異體。
初生免疫細胞，包括初級T細胞可獲自多個來源，包括末梢血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、肋膜積液、脾臟組織及/或腫瘤組織。白細胞，包括PBMC，可以藉由眾所周知的技術自其他血細胞中分離出來，例如FICOLL™分離及白細胞去除術。白細胞去除術產物通常含有淋巴球(包括T及B細胞)、單核球、粒細胞及其他有核白血球。進一步自其他白細胞中分離T細胞，例如藉由經由PERCOLL™梯度進行離心或藉由逆流離心淘析。T細胞之特定亞群，諸如CD3 +、CD25 +、CD28 +、CD4 +、CD8 +、CD45RA +、GITR +及CD45RO +T細胞，可以藉由陽性或陰性選擇技術(例如，使用基於螢光或基於磁性之細胞分選)來分離。例如，T細胞可藉由與多種市售抗體結合珠粒中的任一種一起培育一段時間來分離，諸如Dynabeads®、CELLection TM、DETACHaBEAD TM(Thermo Fisher)或MACS®細胞分離產品(Miltenyi Biotec)，該時間足以陽性選擇所需T細胞或陰性選擇以移除不需要之細胞。
在一些情況下，自體T細胞係直接在癌症療法後自癌症患者獲得。已經觀察到，在某些癌症治療後，特別是彼等損害免疫系統之癌症治療後，在治療後不久收集之T細胞的品質可能具有提高之離體擴增及/或離體工程化後移植的能力。
無論在基因修飾之前抑或基因修飾之後，T細胞通常可使用如例如美國專利5,858,358、5,883,223、6,352,694、6,534,055、6,797,514、6,867,041、6,692,964、6,887,466、6,905,680、6,905,681、6,905,874、7,067,318、7,144,575、7,172,869、7,175,843、7,232,566、7,572,631；及10,786,533中所述之方法進行活化及擴增。一般而言，T細胞可藉由與表面接觸而活體外或離體擴增，該表面附接有刺激CD3/TCR複合物相關信號之試劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子之配位體。特定言之，T細胞群體可以如下刺激：諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段或固定於表面上之抗CD3抗體接觸，或藉由與結合鈣離子載體之蛋白激酶C活化因子(例如苔蘚蟲素)接觸。為了共刺激T細胞表面上之輔助分子，可使用結合輔助分子之配位體。舉例而言，可使T細胞群體與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。為了刺激CD4 +T細胞或CD8 +T細胞之增殖，可使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。
細胞培養條件可以包括以下中的一或多種：特定培養基、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑，例如營養素、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，諸如細胞介素、趨化因子、抗原、結合搭配物、融合蛋白、重組可溶性受體及任何其他旨在激活細胞之試劑。在一些實施例中，培養條件包括添加IL-2、IL-7及/或IL-15。
在一些實施例中，待工程化之細胞可為在工程化之後分化成成熟T細胞之多能或多潛能細胞。此等非T細胞可為同種異體的，且可為例如人類胚胎幹細胞、人類誘導多能幹細胞或造血幹細胞或先驅細胞。為了易於描述，多能及多潛能細胞在本文中共同稱為「先驅細胞」。
在某些實施例中，在使用同種異體細胞之情況下，其經工程化以減少移植物抗宿主排斥反應(例如藉由剔除內源性 B2M及/或 TRAC基因)。 II. 免疫或先驅細胞之工程化
如本文所用，術語「細胞工程化」或「細胞修飾」(包括其衍生物)係指細胞，例如本文揭示之免疫細胞之靶向修飾。在一些態樣中，細胞工程化包含病毒基因工程化、非病毒基因工程化、引入受體以允許腫瘤特異性靶向(例如與HLA-A複合之NY-ESO-1肽)、引入一或多種改善T細胞功能之內源基因、引入一或多種改善免疫細胞之合成基因，例如T細胞功能(例如編碼c-Jun多肽之多核苷酸，使得相較於尚未修飾之相應細胞，免疫細胞顯示出增加之c-Jun表現)，或其任何組合。如本發明中的其他地方進一步描述的，在一些態樣中，可以用轉錄活化因子(例如，基於CRISPR/Cas系統之轉錄活化因子)對細胞進行工程化或修飾，其中該轉錄活化因子能夠誘導及/或增加所關注蛋白質(例如，c-Jun)的內源性表現。
在一些態樣中，本文所描述之細胞已經轉錄活化因子修飾，該轉錄活化因子能夠誘導及/或增加所關注蛋白質(例如，c-Jun)在細胞中之內源性表現。如本文所用，術語「轉錄活化因子」係指增加基因或基因組之轉錄(例如藉由結合至核酸序列之強化子或啟動子近端元件，藉此誘導其轉錄)的蛋白質。可與本發明一起使用之此類轉錄活化因子的非限制性實例包括：基於轉錄活化因子樣效應子(TALE)之轉錄活化因子、基於鋅指蛋白(ZFP)之轉錄活化因子、基於成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)/CRISPR相關蛋白(Cas)系統之轉錄活化因子或其組合。參見例如Kabadi等人, Methods(2014) 69(2):188-97，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，本文所述之細胞已經用基於CRISPR/Cas系統之轉錄活化因子，諸如CRISPR活化(CRISPRa)修飾。參見例如Nissim等人, Molecular Cell(2014) 54(4):698-710；Perez-Pinera等人, Nat. Methods(2013) 10(10):973-76；Maeder等人, Nat. Methods(2013) 10(10):977-79；Cheng等人, Cell Res. (2013) 23(10):1163-71；Farzadfard等人, ACS Synth. Biol.(2013) 2(10):604-13；其皆以全文引用的方式併入本文中。CRISPRa為一種類型之CRISPR工具，其包含使用缺乏核酸內切酶活性但保持結合至其引導RNA及目標DNA核酸序列之能力的經修飾Cas蛋白。可用於本發明之此類經修飾Cas蛋白之非限制性實例為此項技術中已知的。參見例如Pandelakis等人, Cell Systems(2020) 10(1):1-14，其以全文引用之方式併入本文中。在一些態樣中，經修飾Cas蛋白包含經修飾Cas9蛋白(在此項技術中亦稱為修飾「dCas9」)。在一些態樣中，經修飾Cas蛋白包含經修飾Cas12a蛋白質。在一些態樣中，適用於本發明之經修飾Cas蛋白結合至引導多核苷酸(例如小引導RNA)(「經修飾Cas引導複合物」)，其中該引導多核苷酸包含與編碼所關注蛋白質(例如c-Jun)之核酸序列之區域互補的識別序列。在某些態樣中，引導多核苷酸包含與編碼所關注蛋白質之內源性核酸序列的啟動子區互補的識別序列。在一些態樣中，一或多種轉錄活化因子附接至經修飾Cas引導複合物(例如經修飾Cas蛋白之N端及/或C端)，使得當經修飾Cas引導複合物引入細胞中時，一或多種轉錄活化因子可結合至內源性基因之調節元件(例如啟動子區)，藉此誘導及/或增加編碼蛋白質(例如c-Jun)的表現。可使用之常見一般活化因子之說明性實例包括RNAP、VP16、VP64及p65之ω次單元(參見例如Kabadi及Gersbach, Methods(2014)69(2)：188-97)。
在一些態樣中，一或多種轉錄抑制因子(例如Kruppel相關框域(KRAB))可附接至經修飾Cas引導複合物(例如經修飾Cas蛋白之N端及/或C端)，使得當引入細胞中時，該一或多種轉錄抑制因子可抑制或減少基因之轉錄，例如可干擾c-Jun表現之彼等基因(例如Bach2)。參見例如US20200030379A1及Yang等人, J Transl Med.(2021) 19: 459，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在一些態樣中，適用於本發明之經修飾Cas蛋白可附接至一或多種轉錄活化因子與一或多種轉錄抑制因子兩者。
不受任一理論束縛，在一些態樣中，使用此類經修飾Cas蛋白可允許所關注基因之條件性轉錄及表現。舉例而言，在一些態樣中，細胞(例如T細胞)經修飾以包含重組抗原受體(例如抗NY-ESO-1/HLA-A TCR)，其連接至蛋白酶(例如菸草蝕刻病毒(TEV))及靶向c-Jun啟動子區之單引導RNA(sgRNA)。在一些態樣中，細胞經修飾以進一步包含用於活化T細胞之連接子(LAT)，該連接子與經修飾Cas蛋白複合，該經修飾Cas蛋白經由連接子(例如，TEV可裂解連接子)附接至轉錄活化因子(例如dCas9-VP64-p65-Rta轉錄活化因子(VPR))。在抗原受體活化後，經修飾之Cas蛋白經釋放用於核定位且條件性地且可逆地誘導c-Jun之表現。參見例如Yang等人, J Immunother Cancer(2021) 9(Suppl2):A164，其以全文引用的方式併入本文中。
如熟習此項技術者將顯而易見，在一些態樣中，已使用多種方法之組合來修飾本文所描述之細胞。舉例而言，在一些態樣中，細胞已經修飾以包含(i)編碼一或多種蛋白質(例如，抗NY-ESO-1 TCR及截短EGFR(EGFRt))之外源性核苷酸序列及(ii)增加內源性蛋白質(例如，c-Jun)之表現的外源性轉錄活化因子(例如，CRISPRa)。在一些態樣中，細胞已經修飾以包含(i)編碼第一蛋白(例如抗NY-ESO-1 TCR)之外源性核苷酸序列及(ii)編碼第二蛋白(例如c-Jun蛋白)之外源性核苷酸序列。在一些態樣中，經修飾細胞可進一步包含編碼第三蛋白(例如，EGFRt)之外源性核苷酸序列。如本文所述，在一些態樣中，編碼第一、第二及第三蛋白之外源性核苷酸序列可為單一多順反子載體的一部分。
除非另外指明，否則可使用此項技術中已知之任何適合方法將一或多種外源性核苷酸序列及/或轉錄活化因子引入細胞中。用於向細胞遞送一或多種外源性核苷酸序列之適合方法的非限制性實例包括：轉染(亦稱為轉型及轉導)、電穿孔、非病毒遞送、病毒轉導、脂質奈米粒子遞送及其組合。
在一些態樣中，細胞已經用轉錄活化因子(例如基於CRISPR/Cas系統之轉錄活化因子，例如CRISPRa)修飾，使得內源性c-Jun蛋白之表現與尚未用轉錄活化因子修飾之相應細胞相比增加。
雖然本文提供的某些揭示內容大體上係關於修飾免疫細胞以包含編碼c-Jun蛋白(野生型c-Jun或其變異體)的外源性核苷酸序列，但對於本領域技術人員而言，其他合適方法亦可用於在細胞中誘導及/或增加c-Jun蛋白表現(野生型或其變異體)。舉例而言，如本文所描述，在一些態樣中，可用轉錄活化因子(例如，CRISPRa)增加內源性c-Jun蛋白表現。除非另外指明，否則使用外源性核苷酸序列之本文所提供之揭示內容同樣適用於本文所提供之在細胞中誘導及/或增加c-Jun蛋白表現的其他方法(例如轉錄活化因子，例如CRISPRa)。
本文中之免疫細胞(例如，T細胞)或先驅細胞可經工程化以表現外源性(亦即，重組) TCR且過度表現c-Jun(例如，人類c-Jun)。重組TCR可特異性地結合至腫瘤細胞上之配位體(例如，與HLA複合之腫瘤抗原肽)。如本文所用，當結合具有小於或等於1 μM之K D及/或具有1x10 -3S -1或更慢之解離率(k off)時，稱受體(例如，TCR)特異性結合至配位體(例如，抗原肽/HLA複合物)，如藉由表面電漿子共振所量測(使用例如Biacore™或Octet™系統)。 A. 重組 TCR
在一些實施例中，由工程化免疫細胞(例如，T細胞)表現之重組TCR為αβ TCR，亦即，包含TCR α鏈及TCR β鏈之異二聚二聚體。在特定實施例中，重組TCR結合由I類MHC分子，諸如HLA-A分子呈現(亦即與該分子複合)之人類NY-ESO-1肽。「重組」意謂TCR並非內源性地由免疫細胞表現，而是由已引入免疫細胞之外源性核苷酸序列(例如，表現構築體)表現。
在某些實施例中，人類NY-ESO-1肽為NY-ESO-1 157-165，具有SLLMWITQC之序列(SEQ ID NO: 19)。NY-ESO-1 157-165肽來源於NY-ESO-1蛋白質，其由一系列腫瘤表現(Chen等人, PNAS(1997) 94:1914-8)。此等癌細胞之I類HLA分子呈現來自此蛋白質之肽，包括NY-ESO-1 157-165肽。因此，與I類HLA分子複合的此肽提供癌症標記物，治療性T細胞可經由其重組TCR靶向該癌症標記物。
在一些實施例中，NY-ESO-1肽與HLA-A*02複合。在其他實施例中，HLA-A分子可為HLAA*02: 01-555中之任一者，諸如HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*02:08、HLA-A*02:09、HLA-A*02:10、HLA-A*02:11、HLA-A*02:12、HLA-A*02:13、HLA-A*02:14、HLA-A*02:15、HLA-A*02:16、HLA-A*02:17、HLA-A*02:18、HLA-A*02:19、HLA-A*02:20、HLA-A*02:21、HLA-A*02:22或HLA-A*02:24。在一些實施例中，重組TCR特異性識別由HLA-A*02: 01呈現(亦即與HLA-A*02: 01複合)之NY-ESO-1 157-165。參見例如WO 2005/113595。
在一些實施例中，特異性靶向NY-ESO-1 157-165/HLA-A*02複合物之本發明TCR包含以下TCR α序列(具有或不具有信號肽(在框中))或與其至少85、90、95、96、97、98或99%一致之胺基酸序列；及/或以下TCR β序列(具有或不具有信號肽(在框中))或與其至少85、90、95、96、97、98或99%一致之胺基酸序列： NY-ESO-1 TCR α鏈胺基酸序列
Figure 02_image001
NY-ESO-1 TCR β鏈胺基酸序列
Figure 02_image003
在上述序列中，可變域(不包括信號肽，在處理之後裂解)為斜體(α及β分別為SEQ ID NO: 5及6)，且CDR加下劃線(α及β分別為SEQ ID NO: 7-9及SEQ ID NO: 10-12)。
可變域及CDR之邊界可基於不同TCR結構分析系統而變化。本發明涵蓋在上述TCR α及β鏈中包含如由任何一種系統所定義之可變域或六個CDR的TCR。
在特定實施例中，本發明重組TCR為α鏈及β鏈的異二聚體，分別包含SEQ ID NO: 3，無信號肽(胺基酸1-19)及SEQ ID NO: 4，無信號肽(胺基酸1-22)。在特定實施例中，本發明重組TCR為α鏈及β鏈的異二聚體，分別由SEQ ID NO: 3，無信號肽(胺基酸1-19)及SEQ ID NO: 4，無信號肽(胺基酸1-22)組成。
在某些實施例中，TCR α序列包含SEQ ID NO: 5中提供之可變域胺基酸序列且TCR β序列包含SEQ ID NO: 6中提供之可變域胺基酸序列。說明性TCR α及β恆定域序列在本文中鑑別出，並且其他有用的恆定域序列可經鑑別供與重組TCR α/β可變域一起使用，例如在IMGT資料庫中(Lefranc等人, Nucleic Acids Res.(2015) 43(資料庫期刊):D413-22. 電子版 2014年11月5日)。
包括信號肽之全長TCR α鏈多肽可由例如SEQ ID NO: 1或其簡併變異體或經密碼子最佳化之型式編碼。包括信號肽之全長TCR β鏈多肽可由例如SEQ ID NO: 2或其簡併變異體或經密碼子最佳化之型式編碼。
在一些實施例中，TCR α鏈之可變域包含SEQ ID NO: 5，或與其至少90、95、96、97、98或99之胺基酸序列；及/或TCR β鏈之可變域包含SEQ ID NO: 6，或與其至少90、95、96、97、98或99%之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明TCR包含分別包含SEQ ID NO: 7-9之TCR α CDR1-3及分別包含SEQ ID NO: 10-12之TCR β CDR1-3。
本發明重組TCR可藉由募集TCR相關信號傳導分子(包括CD3γε、CD3δε及ζζ(亦稱為CD3ζ或CD3ζζ))來形成TCR-CD3複合物以幫助介導T細胞活化。 B.  c-Jun
I在一些實施例中，c-Jun為人類c-Jun，諸如具有以下序列之野生型人類c-Jun(c-JunWT)(可以寄存編號AAA59197.1在GenBank或以寄存編號P05412.2在UniProtKB可得)：
Figure 02_image005
亦參見Hattori等人, PNAS(1988) 85:9148-52。或者，c-Jun為突變人類c-Jun，只要突變c-Jun不影響突變體拯救功能異常(耗竭之)T細胞之能力即可。在一些實施例中，突變c-Jun包含與野生型c-Jun之C端胺基酸殘基(例如C端50、75、100、150、200或250個或更多殘基)、C端部分(例如四分之一、三分之一或二分之一)或C端域(例如其ε、bZIP及胺基酸C端)至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或99%)的序列一致性。在一些實施例中，野生型c-Jun之N端胺基酸殘基(例如，N端50、75、100或150個或更多)、N端部分(例如，四分之一、三分之一或二分之一)或N端域(例如，其δ、轉錄活化域及胺基酸N端)缺失、突變或以其他方式不活化。
在一些實施例中，c-Jun在其轉錄活化域及/或其δ域中包含不活化突變(例如取代、缺失或插入)。在一些實施例中，c-Jun包含S63A及S73A突變中之一者或兩者(位置在上面加框)。在一些實施例中，與野生型人類c-Jun相比，c-Jun在殘基2與102之間或在殘基30與50之間具有缺失。
歸因於引入外源引入之c-Jun編碼序列，工程化T細胞過度表現，亦即比不具有此序列之T細胞表現較高含量的c-Jun(例如，至少多10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%，或至少多2-、3-、4-、5-或10倍)。在某些實施例中，工程化T細胞比不具有此序列之T細胞表現至少多約2至100倍、多約5至50倍、多約5至40倍、多約5至30倍、多約5至20倍、多約8至20倍或多約10至20倍的c-Jun。
在一些實施例中，本文中之免疫細胞經工程化以經由活化細胞中之內源性c-Jun基因過度表現c-Jun，如上文所描述。 C. 核酸
TCR及c-Jun可經由一或多個核酸分子(例如，DNA或RNA，諸如mRNA)引入T細胞或先驅細胞中。在一些實施例中，核酸分子可置於一或多個DNA或RNA載體上以引入宿主細胞中。
可藉由熟知技術將核酸分子(例如含有其之DNA或RNA載體)引入細胞中，包括(但不限於)電穿孔、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、膠態分散系統(例如，作為大分子複合物、奈米膠囊、微球體及珠粒)及基於脂質之系統(例如，水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體)。或者，可藉由轉導重組病毒將核酸分子引入細胞中，該等重組病毒之基因體包含核酸分子。病毒載體之實例包括(但不限於)來源於慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純疱疹病毒、仙台病毒(Sendai virus)及牛痘病毒之載體。在某些實施例中，重組病毒用異源包膜蛋白假模式化。在一個實施例中，重組病毒為一種慢病毒，其經來源於水泡性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒或另一病毒之包膜醣蛋白假模式化( see e.g., Cronin等人, Curr Gene Ther.(2005) 5(4):387-98；Gutierrez-Guerrero等人, Viruses(2020) 12(9):1016)。
在一些實施例中，TCR多肽鏈及c-Jun之編碼序列可置於單獨表現構築體上。在一些實施例中，αβ TCR及c-Jun之兩個多肽鏈之編碼序列可置於單一表現構築體上。三個編碼序列可以置於構築體上的一或多個表現卡匣中，每個卡匣是其自身的轉錄單元(例如，具有其自身的啟動子及多腺苷酸化位點以及其他轉錄控制元件)。在特定實施例中，三個編碼序列可以置於單一表現卡匣(例如，三順反子表現卡匣)中，其中三個編碼序列在一個共同啟動子下轉錄。在多順反子排列中，編碼序列為同框的且藉由自裂解肽(例如，2A自裂解肽，諸如T2A、P2A、E2A或F2A肽)之編碼序列及/或弗林蛋白酶之一致識別序列彼此分開(參見例如Limstra等人, J Virol.(1999) 73(8):6299-6306 and Thomas, G., Nat Rev Mol Cell Biol.(2002) 3(10):753-66)。或者，編碼序列可藉由核糖體內部進入位點(IRES)彼此分開。因此，多順反子(例如三順反子)表現卡匣轉錄成單一RNA，但最終單一RNA經加工且轉譯成獨立多肽。
在三順反子表現卡匣的特定實施例中，c-Jun之編碼序列與TCR α鏈之編碼序列藉由2A編碼序列分開；TCR α鏈之編碼序列與TCR β鏈之編碼序列藉由弗林蛋白酶裂解一致序列之編碼序列及2A編碼序列分開。參見例如 圖 1及SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，c-Jun編碼序列在三順反子表現卡匣中之TCR編碼序列之前。在一些實施例中，不同於 圖 1中所示之構築體結構，TCR β鏈編碼序列在TCR α鏈編碼序列之前。
表現卡匣(多順反子或單順反子)可包含在哺乳動物(例如人類或人類T)細胞中具有組成型活性之啟動子。此類啟動子包括但不限於即刻早期細胞巨大病毒(CMV)啟動子、猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、艾司坦-巴爾病毒即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子、延伸因子-1α(EF-1α)啟動子、MND啟動子、肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。亦涵蓋來源於前述啟動子之核心或最小啟動子。或者，表現卡匣可包含誘導型啟動子系統。例示性誘導型啟動子系統包括但不限於激素調節之元件、合成配位體調節之元件、電離輻射調節之元件、四環素(Tet)系統(例如「Tet-Off」及「Tet-On」系統)及NFAT系統(參見例如Kallunki等人, Cells(2019) 8(8):796；Uchibori等人, Mol Ther Oncolytics. (2018) 12:16-25)。在一些實施例中，表現卡匣含有延伸因子-1α(EF-1α)啟動子。
在一些實施例中，表現卡匣亦包括Kozak序列、多腺苷酸化位點及促進編碼序列之轉錄及/或轉譯的其他元件。舉例而言，土拔鼠肝炎病毒轉錄後反應元件(WPRE)或其變異體可包括在表現卡匣之3'未轉譯區處。
在表現卡匣中，轉錄/轉譯調節元件，諸如啟動子、任何強化子及其類似物可操作地連接至編碼序列，以便允許編碼序列之有效表現及RNA轉錄物之有效轉譯。
在某些實施例中，本發明提供一種單載體構築體(例如，慢病毒載體)，其包含三順反子表現卡匣，該表現卡匣包含哺乳動物啟動子、c-Jun編碼序列、兩條TCR鏈之編碼序列(α/β)、及多聚腺苷酸化信號序列。編碼序列藉由一或多個核苷酸連接子連接，該等核苷酸連接子選自自裂解肽(例如，P2A、T2A、E2A、F2A或其功能等效物)之編碼序列及弗林蛋白酶裂解一致序列。藉助於實例， 圖 1說明此類表現卡匣，其中啟動子為EF-1α啟動子。
在特定實施例中，表現卡匣編碼包含SEQ ID NO：13或其功能類似物之c-Jun，以及包含分別包含SEQ ID NO：3及4(或其變異體)的兩條多肽鏈之TCR。構築體可為重組慢病毒載體且可另外包含在EF-1α啟動子上游之中央多嘌呤區(cPPT)及SV40多腺苷酸化信號，或用於在哺乳動物細胞中有效轉導及表現之其他序列。
表現卡匣中之編碼序列可經密碼子最佳化，以便於所關注宿主細胞(例如人類細胞)中達最佳表現量。
編碼TCR及c-Jun之核酸分子可整合至工程化細胞之基因體中，或保持游離型。整合可為經由基因編輯發生的靶向整合(例如，由CRISPR、TALEN、鋅指核酸酶及巨核酸酶介導)。
工程化細胞可藉由正向選擇技術富集。例如，可以在例如流式細胞量測術分析中，根據細胞與目標抗原(NY-ESO-1或NY-ESO-1 157-165/HLA-A2)結合之能力來選擇細胞。為確認c-Jun表現，可對工程化免疫(例如T)細胞進行RT-PCR。陽性選擇可導致細胞群體中富集TCR +c-Jun +細胞，其中雙陽性T細胞構成超過30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95%之總細胞群體。可低溫保存工程化細胞直至使用。 D. T 細胞耗竭
c-Jun在T細胞中之過度表現有助於例如藉由減輕或預防T細胞功能異常(例如，T細胞耗竭)來維持細胞的活性狀態。諸如T細胞之本發明工程化免疫細胞針對攜帶NY-ESO-1之腫瘤細胞表現出持續有效的細胞毒性。相較於不過度表現c-Jun之T細胞，本發明工程化T細胞展示較少之T細胞耗竭之跡象及增加之持續效應細胞之跡象。
在某些實施例中，經工程化以表現NY-ESO-1特異性TCR之細胞具有減少的一或多種耗竭標記物之表現，包括但不限於TIGIT、PD-1、TIM-3、LAG-3及CD39。使用整體RNA-Seq總轉錄本分析，可以藉由流式細胞量測術在大量群體中量測耗竭標記物的表現。或者，可使用單細胞RNA-Seq進行個別細胞總轉錄本分析。在某些實施例中，過度表現c-Jun之NY-ESO-1 TCR工程化T細胞中一或多種耗竭標記物之表現減少至少約1.5、2、2.5、3.0、3.5、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75或100倍。在某些實施例中，過度表現c-Jun之NYESO1 TCR工程化T細胞中TIGIT之表現減少至少約1.5、2、2.5、3.0、3.5、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75或100倍。在某些實施例中，過度表現c-Jun之NY-ESO-1 TCR工程化T細胞中之PD-1表現減少至少約1.5、2、2.5、3.0、3.5、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75或100倍。在某些實施例中，過度表現c-Jun之NY-ESO-1 TCR工程化T細胞中CD39之表現減少至少約1.5、2、2.5、3.0、3.5、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75或100倍。
在某些實施例中，在持續抗原刺激14天之後，本發明之NY-ESO-1 TCR +_c-Jun細胞群體具有不超過約5%、6%、7%、8%、9%或10% TIGIT +細胞。在一些實施例中，在持續抗原刺激14天之後，如本文所述之NY-ESO-1 TCR +_c-Jun T細胞群體具有不超過約5%-10%、5%-15%、8%-12%或8%-15% TIGIT +細胞。就此而言，諸如CD4 +或CD8 +T細胞之NY-ESO-1 TCR +_c-Jun T細胞群體內之TIGIT +細胞%可藉由此項技術中已知之諸如流式細胞量測術的方法來量測。
在某些實施例中，在持續刺激約14天之後，本發明之工程化NY-ESO-1 TCR +_c-Jun T細胞群體具有不超過約2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10% PD-1 +細胞。在一些實施例中，在持續抗原刺激14天之後，本發明之工程化NY-ESO-1 TCR +_c-Jun T細胞之群體具有不超過約2%-5%之PD-1陽性細胞。就此而言，CD4+及/或CD8+ TCR +c-Jun +T細胞群體內之PD-1陽性細胞%可使用此項技術中已知之方法，諸如藉由流式細胞量測術來量測。
在某些實施例中，在持續刺激14天之後，本發明之工程化NY-ESO-1 TCR +_c-Jun T細胞之群體具有不超過約20%-60%的CD39 +細胞。在一些實施例中，在持續刺激14天之後，本發明工程化NYESO1 TCR +_c-Jun T細胞群體具有不超過約20%-40%或25%-45%或30%-40%的CD39 +細胞。T細胞群體內之CD39 +細胞之百分比可藉由例如流式細胞量測術來量測。
在某些實施例中，相較於不過度表現c-Jun之工程化NY-ESO-1 TCR +T細胞，本發明工程化NY-ESO-1 TCR +_c-Jun T細胞(例如，CD8 +T細胞)之群體在持續刺激7天之後具有減少之FOXP3及CD25表現。減少之FOXP3或CD25表現可為例如10%、20%、30%、40%、50%或更高百分比。FOXP3之表現可藉由細胞內染色來量測，且CD25之表現可藉由例如流式細胞量測術來量測。
在某些實施例中，與不過度表現c-Jun的對照工程化T細胞群體相比，本發明之工程化NY-ESO-1 TCR +_c-Jun T細胞群體分泌至少多約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125或150倍之IL-2、INF-γ及/或TNF-α。在特定實施例中，與不過度表現c-Jun的對照工程化T細胞群體相比，在以1: 1、1: 5、1: 10或1: 20 E:T比率持續抗原刺激的第0天及/或第14天，本發明工程化NY-ESO-1 TCR +_c-Jun T細胞群體表現至少多約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10或15倍之IL-2、INF-γ及/或TNF-α。細胞介素分泌可藉由此項技術中已知之方法，諸如ELISA及中尺度發現(Meso Scale Discovery，MSD)分析來量測。
在某些實施例中，與不過度表現c-Jun之對照工程化CD8 +T細胞群體相比，本發明工程化NY-ESO-1 TCR+_c-Jun T細胞群體表現出至少高約2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、75或100倍之增強型細胞毒性效率，例如正如藉由曲線下面積(AUC)所定量。
在一些實施例中，與不過度表現c-Jun之對照工程化T細胞群體相比，本發明之工程化NY-ESO-1 TCR+_c-Jun T細胞群體表現出約相同或至少多約1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、8、10、15、20、25、30、50、75、100、125、150、200、225、250、300、400或500倍的對抗原起反應之增強型增殖。抗原誘導之增殖可藉由此項技術中已知之增殖分析(諸如本文所描述之彼等分析)來測試。
可用於量測耗竭、細胞表型、持久性、細胞毒性及/或殺死、增殖、細胞介素釋放及基因表現譜的分析係此項技術中已知的，且包括例如流式細胞量測術、細胞內細胞介素染色(ICS)、IncuCyte®免疫細胞殺死分析、MSD或類似分析、持續抗原刺激分析、依序抗原刺激分析(類似於持續抗原刺激分析，但每輪再刺激不重置E:T細胞比率)、整體及單細胞RNA-seq、細胞毒性分析、ELISA、西方墨點法以及其他標準分子及細胞生物學方法。參見例如Geraci等人, Fron Genet.(2020) 11:220；Sturm等人, Bioinformatics(2019) 35(14):i436-45；Van den Berge等人, Ann Rev Biomed. (2019) 2:139-73)； Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons, Inc., 1999-2021)。 III. 醫藥組合物及用途
本發明提供醫藥組合物，其包含使用本文所述之表現構築體的工程化T細胞。醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之載劑，其適合於在引入患者體內之前保持細胞健康。
在一些實施例中，工程化細胞可自培養基採集，洗滌且在載劑中濃縮至治療有效量。例示性載劑包括鹽水、緩衝鹽水(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、生理鹽水、水、漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、Nonnosol-R (Abbott Labs)、Plasma-Lyte A(R) (Baxter Laboratories, Inc., Morton Grove, IL)、甘油、乙醇及其組合。較佳地，載劑為等張的。在一些實施例中，載劑可補充有諸如人類血清白蛋白(HSA)或其他人類血清組分，5%葡萄糖或右旋糖的成分。亦可包括其他等張劑，包括多羥基糖醇，包括三元或更高級糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
可以向癌症患者全身性(例如經由靜脈內或門靜脈注射)或局部(例如經由瘤內注射)投與治療有效量之醫藥T細胞組合物。在一些實施例中，組合物(諸如靶向NY-ESO-1之彼等組合物)用於治療患有以下疾病之患者：轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌、骨髓瘤、食道癌、滑膜肉瘤、黏液樣圓細胞脂肪肉瘤、胃癌、乳癌、肝細胞癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌。如本文所用，術語「治療」或「治療」係指用於在經治療個體中獲得有益或期望結果之方法。此類結果包括但不限於：減輕由疾病引起的一或多種症狀、減輕疾病的程度(例如，減少腫瘤體積)、穩定疾病(例如，預防或延緩疾病惡化)、預防或延遲疾病的傳播(例如轉移)、預防或延遲疾病的復發或再發、改善疾病狀態、緩解(部分或全部)疾病，減少一或多種治療疾病所需之其他藥物的劑量、改善生活品質、恢復體重及/或延長存活期(例如，總存活期或無進展存活期)。
組合物之治療有效量係指足以實現所需臨床終點之工程化T細胞的數目。在一些實施例中，治療有效量含有超過10 4、10 5、10 6、10 7、10 8或10 9個工程化細胞。在某些實施例中，向個體投與範圍為約10 6-10 11個之工程化細胞。
在一些實施例中，醫藥組合物包含有效治療或預防疾病或病狀之量的細胞，諸如治療有效量或預防有效量。在一些實施例中，治療或預防功效係藉由定期評定所治療之個體來監測。對於經數天或更長時間之重複投與，視病狀而定，重複治療直至出現疾病症狀之所需抑制為止。然而，其他給藥方案可適用且可確定。所需劑量可藉由單次推注投與組合物、藉由多次推注投與組合物或藉由連續輸注投與組合物來遞送。
在一些實施例中，細胞及組合物係使用標準投藥技術、調配物及/或裝置來投與。提供調配物及用於儲存及投與組合物之裝置，諸如注射器及小瓶。投藥可為自體或異源的。舉例而言，免疫反應性細胞或先驅細胞可自一位個體獲得且向同一個體或不同的相容個體投與。來源於周邊血液之免疫反應性細胞或其後代(例如活體內、離體或活體外來源)可經由局域化注射進行投與，包括導管投藥、全身性注射、局域化注射、靜脈內注射或非經腸投藥。當投與本發明之治療性組合物(例如含有經基因修飾之細胞的醫藥組合物)時，其通常調配成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)。
在一個態樣中，本發明提供包含用於表現TCR及c-Jun之核酸分子的醫藥組合物。核酸分子可以如上所述，例如上述病毒載體(例如，慢病毒載體)。醫藥組合物離體用於工程化T細胞或先驅細胞，然後將其引入患者。醫藥組合物包含核酸分子或重組病毒，其基因體包含TCR和c-Jun之表現卡匣，及醫藥學上可接受之載劑，諸如緩衝溶液，其視情況包含其他試劑，諸如防腐劑、穩定劑及其類似物。
醫藥組合物可以提供為製品，諸如套組，其包括包含生物材料(細胞或核酸分子或重組病毒)之小瓶(例如，單劑量小瓶)及視情況存在之使用說明書。
除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般熟習技術者通常理解之含義。儘管可使用類似於或等效於本文中所描述之彼等的方法及材料來實踐或測試本發明，但下文描述例示性方法及材料。在有矛盾的情況下，將以本發明(包括定義)為準。一般而言，與本文所述之免疫學、醫學、藥物及醫藥化學以及細胞生物學結合使用之命名法及其技術為此項技術中熟知且常用者。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數術語且複數術語應包括單數術語。在本說明書及實施例通篇中，詞語「具有(have)」及「包含(comprise)」或諸如「具有(has/having)」、「包含(comprises/comprising)」之變化形式應理解為暗示包括陳述的整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。本文所提及之所有公開案及其他參考文獻均以全文引用之方式併入本文中。儘管本文中引用多個文獻，但此引用不構成此等文獻中之任一者形成此項技術中公共常識之部分的許可。如本文所使用，術語「大致」或「約」當應用於所關注之一或多個值時係指類似於所陳述參考值的值。在某些實施例中，除非另外說明或另外自上下文顯而易見，否則該術語係指在陳述參考值之任一方向(大於或小於)上在10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或小於1%內的值範圍。
為了能更好地理解本發明，闡述以下實例。此等實例僅為達成說明之目的且不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。 實例
首先描述本發明工作實例中所述之實驗的材料及方法。 材料及方法 慢病毒載體
產生慢病毒載體(LVV)構築體用以遞送 圖 1中所示之表現卡匣。細胞巨大病毒(CMV)啟動子/強化子驅動載體基因體RNA之組成型非Tat依賴性轉錄。部分Gag序列涵蓋包裝信號(ψ)及Rev反應元件，之後為含有中央多嘌呤區的區域。此等元件係有效製造功能性LVV所需的。長末端重複序列(LTR)之U3區域缺失(ΔU3)，以消除其啟動子/強化子活性，如自不活化載體所需的。在3' LTR下游包括SV40多腺苷酸化信號，以改善載體基因體RNA在製造過程中之轉錄終止。SV40複製起點被認為能夠在經傳染之HEK293T細胞中進行質體擴增，從而可能增加載體力價。高複本(pUC)複製起點及康黴素(kanamycin)抗性卡匣為質體骨幹中所包含之基本特徵，以允許質體在大腸桿菌中分別進行擴增及選擇。 T 細胞 產生
使用標準的LVV轉導方案，將LVV載體用於轉導人類T細胞。一般而言，用MOI為1至4之LVV製劑轉導T細胞。
使用自HLA-A*02 +健康供體(小於50歲)分離出來之CD4 +及CD8 +細胞生成T細胞產物，且在供應商(例如AllCells, Alameda, CA, USA)處冷凍。供應商經由血球分離術收集樣品，自其中分別分離出CD4 +及CD8 +細胞，順序為先陽性選擇CD8 +細胞，隨後對來自CD8選擇的流過物(flow-through)進行CD4 +細胞的陽性選擇。使用Miltenyi CliniMACS®珠粒在CliniMACS®機器上分離CD4 +及CD8 +細胞。經分離CD4 +或CD8 +細胞在供應商專有之含有IMDM、FBS、二甲亞碸(DMSO)及羥乙基澱粉(hetstarch)的冷凍培養基中以每瓶約30E+06個細胞冷凍。 六孔 G-Rex T 細胞產生
第0天，CD4 +及CD8 +細胞在TexMACS TM培養基中解凍且以50: 50之CD4: CD8比率組合。對於所有供體，將細胞以2E+06個細胞/mL之濃度，4 mL(即總共8E+06個細胞)塗鋪於6孔G-Rex板中，且用CD3/CD28 TransAct TM珠粒(Miltenyi)在補充有100 IU/mL IL-2 (Sigma)之TexMACS TM培養基中以1:100最終稀釋度活化24小時。在第1天，根據第1天之細胞計數，以1至4的MOI用編碼測試或對照轉基因之LVV轉導T細胞。第3天，用補充有IL-2之新鮮培養基稀釋細胞，使其在35 mL中的最終濃度等於100 IU/mL。在第6天，將新鮮IL-2添加至每個孔中，以使每孔35 mL中之最終濃度等於100 IU/mL。在第8天，進行培養基更換，其中移出樣品中的30 mL培養基，且用含有足夠IL-2之30 mL新鮮培養基置換，以使35 mL中之總濃度達到100 IU/mL。在第10天，將新鮮IL-2添加至每個孔中，以使每孔35 mL中之最終濃度等於100 IU/mL。在第13天，使用標準方案採集、計數及冷凍細胞。 100M G-Rex T 細胞生產方案
第0天，CD4 +及CD8 +細胞在TexMACS TM培養基中解凍且以50: 50之CD4: CD8比率組合。將細胞以2E+06個細胞/mL之濃度，50 mL(即總共100E+06個細胞)塗鋪於100M G-Rex瓶中，且用CD3/CD28 TransAct TM珠粒(Miltenyi)在補充有100 IU/mL IL-2 (Sigma)之TexMACS TM培養基中以1:100最終稀釋度活化24小時。在第1天，根據第1天之細胞計數，以1至4的MOI用LVV轉導T細胞。在第3天，用補充有IL-2之950 mL新鮮TexMACS TM培養基將細胞稀釋至每100M G-Rex瓶1 L總體積中的最終濃度為100 IU/mL。在第6、8及10天，將新鮮IL 2添加至每個100M G-Rex瓶中，使1 L中之最終濃度等於100 IU/mL。在第13天，採集、計數及冷凍細胞且冷凍於CS10中。在某些情況下，根據轉導效率，藉由在冷凍前添加模擬細胞在每個供體內對T細胞產物進行標準化，以解釋T細胞產物之間的變異性。 藉由流式細胞量測術評定 NY-ESO-1 TCR 及 c-Jun 表現
使用經PE標記之NY-ESO-1特異性肽-I類MHC dextramer或經PE標記之抗TCRvβ13.1抗體(Ab)藉由對模擬T細胞進行閘控，偵測表面NY-ESO-1 TCR表現。使用經AF647標記之抗c-Jun Ab在固定及透化細胞中偵測細胞內轉殖基因c-Jun表現。所有Ab及染色試劑係市售可得，例如來自BD Bioscience (San Jose, CA)、Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)、Beckman Coulter (Indianapolis, IN)、BioLegend (San Diego, CA)及Cell Signaling Technology (Danvers，MA)。 評定 NY-ESO-1 TCR 表面表現以進行標準化及評估轉導效率
為了用PE-TCRvβ13.1進行表面染色，將約2E+05個細胞在CSB FACS緩衝液(Biolegend®)中在室溫下於暗處培育25分鐘，且用CSB FACS緩衝液洗滌。為了用PE-NY-ESO-1 dextramer進行表面染色，將約2E+05個細胞在FBS FACS緩衝液(BD Biosciences)中在室溫下於暗處培育25分鐘，且用FBS FACS緩衝液洗滌。使用活/死染色試劑eBioscience TM7-胺基放線菌素D (7AAD)偵測死細胞。在TCRvβ13.1或dextramer染色後，在室溫下用CSB FACS緩衝液中之7AAD將細胞染色5分鐘，然後使用Bio-Rad ZE5 TM細胞分析儀進行資料收集。 評定 NY-ESO-1 TCR 加 c-Jun 表現以評估轉導效率及表現量
一般而言，使用活/死可固定染料偵測死細胞。大約2E+05個細胞在室溫下於暗處用活-死可固定染料染色10分鐘，隨後用FACS緩衝液洗滌。然後在室溫下於暗處用針對表面標記物之Ab對細胞染色25分鐘，隨後用FACS緩衝液洗滌。對於用PE-NY-ESO-1 dextramer進行表面染色，細胞在室溫下於暗處染色25分鐘且用FACS緩衝液洗滌，然後如上所述用額外表面標記物染色。表面染色後，用True-Nuclear TM固定/透化緩衝液(BioLegend®)在室溫下於暗處固定及透化細胞30分鐘，且用True-Nuclear透化洗滌緩衝液(BioLegend®)洗滌。然後在室溫下於暗處用兔及小鼠血清阻斷細胞10至15分鐘，然後在室溫下於暗處在True-Nuclear TM透化洗滌緩衝液中用針對細胞內標記物之Ab染色30分鐘。細胞用True-Nuclear TM透化洗滌緩衝液洗滌，隨後在FACS緩衝液中洗滌。將樣品再懸浮於FACS緩衝液中且使用BioRad ZE5 TM細胞分析儀或Cytek TM奧洛拉光譜流動式細胞儀(Aurora Spectral Flow Cytometer)獲取。 T 細胞產物之表型評定
表型評定係使用市售可得之抗體進行。使用活/死可固定eFluor TM780偵測死細胞。細胞在表面染色前，在室溫下於暗處用活/死可固定eFluor TM780染色10分鐘，或包括於表面Ab混合物中。用FACS緩衝液洗滌大約2E+05個細胞，且在37℃下於暗處用小鼠血清及人類IgG阻斷10分鐘，然後在37℃於暗處用抗CCR7 Ab染色15分鐘。然後用FACS緩衝液洗滌細胞，在室溫下於暗處用含有剩餘表面標記物之Ab混合物染色25分鐘。表面染色後，用FACS緩衝液洗滌細胞，在室溫下於暗處用Foxp3固定/透化緩衝液(Thermo Fisher Scientific)固定及透化30分鐘，且用Foxp3透化洗滌緩衝液(Thermo Fisher Scientific)洗滌。然後在室溫下於暗處用兔及小鼠血清阻斷細胞10至15分鐘，然後在室溫下於暗處在Foxp3透化洗滌緩衝液中用針對細胞內標記物之Ab染色30分鐘。細胞用Foxp3透化洗滌緩衝液洗滌，隨後在FACS緩衝液中洗滌。將樣品再懸浮於FACS緩衝液中且用Cytek TM奧洛拉光譜流動式細胞儀獲取。 流式細胞量測術分析
所有樣品均使用BioRad ZE5 TM細胞分析儀或Cytek TM奧洛拉光譜流動式細胞儀獲取且使用FlowJo TM10.6.1版軟體進行分析。對於所有樣品，TE確定為基於相應模擬T細胞樣品閘之dextramer陽性細胞%。NY-ESO-1 TCR及c-Jun之表現量報導為中值螢光強度(MFI)。基於對照樣品中之內源性c-Jun閘確定NY-ESO-1 TCR +群體之c-Jun MFI。
為了評定T細胞表型，將活NY-ESO-1 TCR +CD4 +或CD8 +T細胞閘控為活-死可固定eFluor TM780低、CD3 +、CD45 +，及CD4 +或CD8 +，及TCRvβ13.1 +。在可能的情況下基於陰性群體或使用螢光減一(Fluorescence Minus One，FMO)對照對額外表型標記物進行閘控。適用時，表型標記物之表現量報導為中值螢光強度(MFI)。
為了評定在目標細胞刺激之前(第0天)及目標細胞刺激之後(第7天)之FOXP3及CD25表現，將T細胞閘控為活的(即cPARP及活-死可固定eFluor780低)單細胞，隨後為CD3 +CD45 +，然後為CD4 +或CD8 +閘控。TCRvβ13.1 +細胞係基於模擬T細胞樣品進行閘控。FOXP3 +細胞係基於FMO對照進行閘控。CD25 高閘係基於第0天EF1α_NY-ESO-1 T細胞樣品進行閘控。 藉由西方墨點法評定 c-Jun 表現
使用-80℃凍融循環，在補充有1×無EDTA Halt蛋白酶抑制劑混合物之RIPA裂解緩衝液中裂解來自每個樣品的1E+06個總T細胞。在解凍期間，將溶解物在冰上培育，每5至10分鐘渦旋一次，隨後藉由離心清除細胞碎片。根據製造商的指南，使用Pierce BSA蛋白質分析套組測定已清除溶解物中之總蛋白質濃度。將來自每種溶解物之等效濃度之總蛋白與1× EZ標準主混合物(Protein Simple)結合，在95℃下變性5分鐘，且根據製造商的指南靜置於冰上。遵循製造商指南將變性溶解物與抗c-Jun抗體(CST，純系#60A8，1:20最終稀釋度)及用於Jess(Protein Simple)之來自抗兔偵測模組的試劑一起加載於12-230 kDa Jess分離模組(Separation Module)(Protein Simple)上。使用製造商的標準設置，用自動化Jess Protein Simple Western system在約50 kDA處對c-Jun蛋白質條帶進行可視化。c-Jun蛋白質條帶強度係用Compass分析軟體(4.0.0版)獲得且對應於在約50 kDA鑑別出的c-Jun蛋白質條帶的峰面積強度。 IncuCyte® 殺死分析
IncuCyte®分析之示意圖展示於圖 4中。IncuCyte®殺死分析在96孔平底溝分析盤中設置3種不同的NucLight TMRed(NLR)目標細胞株，T細胞效應子: NLR目標細胞(E：T)比率為1:1、1: 5、1:10或1:20。根據製造商指南，使用NucLight TMRed (NLR)慢病毒試劑(Essen Bioscience)生成NLR目標細胞株A375(高NY-ESO-1抗原含量)、H1703(中等NY-ESO-1抗原含量)及Colo205(NY-ESO-1抗原陰性)。將NLR目標細胞解凍且在R10培養基中保持至少兩次繼代，然後用於分析中。對於半黏著Colo205 NLR細胞株，分析盤塗佈有50 µL聚-L-鳥胺酸。在分析設置當天，使用阿庫酶(accutase)採集NLR目標細胞株，用新鮮R10培養基洗滌且計數。將5E+04個目標細胞塗鋪於分析盤上，且使其在37℃及5% CO 2下黏著約6小時，然後以指定的E:T比率(例如，1:1、1:5、1:10及1:20)添加T細胞。NY-ESO-1 TCR +T細胞之數目係基於獲得的總T細胞計數及冷凍前或採集時確定之NY-ESO-1 TCR +T細胞%來計算。對於1: 1之E: T比率，向5E+04個NLR目標細胞中添加5E+04個NY-ESO-1 TCR +T細胞。對於1: 5、1: 10或1: 20之E: T比率，將T細胞再稀釋於新鮮R10培養基中，且將1E+04、0.5E+04或0.25E+04個NY-ESO-1 TCR +T細胞分別添加至5E+04個NLR目標細胞中。各樣品一式兩份地設置。將分析盤在37℃及5% CO 2下於加濕的IncuCyte® S3活細胞分析系統中培育，且計劃在7天(約162小時)內每隔6小時獲取一次圖像。共培養24小時後，自每個樣品中收集上清液等分試樣且儲存於-80℃以進行後續細胞介素分析，且將IncuCyte®分析盤放回IncuCyte® S3。 藉由 MSD 偵測共培養上清液中的 IFN- γ 、 IL2 及 TNF- α
MSD分析設置之示意圖展示於圖 4中。IFN-γ、IL-2及TNF-α細胞介素分析係根據製造商的指南使用來自V-plex®促發炎第1組人類套組(Meso Scale Diagnostics)之經修正3-plex型式進行，且使用MSD Sector® S 600成像儀讀取盤。使用MSD工作台軟體基於上清液之稀釋因子及校準物之濃度計算細胞介素濃度。 用於連續再刺激分析之共培養設置
連續(持續)再刺激分析之示意圖展示於圖 8中。每3或4天在24孔組織培養盤中以1:1的NY-ESO-1 TCR+ T細胞效應子:目標細胞(E:T)比率用經照射A375目標細胞連續再刺激模擬T細胞及NY-ESO-1 TCR T細胞，總共4輪刺激。在每輪分析設置前一天，分析盤每孔塗佈有300 μL聚-L-鳥胺酸。在分析設置當天，使用阿庫酶分離親代A375目標細胞，再懸浮於中PBS中，且根據製造商的指南使用RAD Source Quastar® RS 1800 Q照射器以10 Gy照射。照射後立即將細胞洗滌且以每孔1.5E+05個細胞塗鋪於24孔板中，使其在加濕之37℃及5% CO 2培育箱中黏著約4小時，然後以1:1之E:T比率添加T細胞。對於分析之第0天，將T細胞解凍且靜置約30分鐘，洗滌且再懸浮於含有IL-2之新鮮R10培養基中，最終濃度為10 IU/mL。NY-ESO-1 TCR +T細胞之數目係根據總T細胞計數及NY-ESO-1 TCR +T細胞%來計算，該百分比係在完成生產後冷凍前確定的。對於分析之第3、7及10天，自上一輪刺激之24孔盤中採集T細胞，計數，且再懸浮於含有IL-2的新鮮R10培養基中，最終濃度為10 IU/mL。NY-ESO-1 TCR +T細胞之數目係基於總T細胞計數及在活T細胞上確定之TCRvβ13.1 +%計算。如先前所述進行IncuCyte®殺死評定及IFN-γ、IL-2及TNF-α細胞介素偵測。 用於 T2 劑量反應分析之共培養設置
T2劑量反應分析之示意圖展示於圖 13中。T2劑量反應分析在96孔平底盤中設置。將T2細胞株解凍且在R10培養基中保持至少兩次繼代，然後用於T2劑量反應分析中。兩種HLA-A*02限制性肽係購自Cambridge Research Biochemicals，Discovery®肽(Billingham，England)。NY-ESO-1 157-165SLLMWITQC(SEQ ID NO:19)肽用作目標肽，且HPV16 E7 86-93TLGIVCPI(SEQ ID NO: 20)肽用作陰性對照肽(表7)。在實驗前立即將肽在DMSO中稀釋至10 mM之儲備濃度，結合每批所提供的肽資料表中列出之「淨肽含量」的差異。將肽備料在含有GlutaMax TM之無血清RPMI 1640培養基中以1:1000進一步稀釋至起始濃度10 μM(即10 -5M)用於T2細胞之肽脈衝。然後將肽在無血清RPMI 1640培養基中連續稀釋10倍，總共8次。T2細胞在37℃及5% CO 2下用經稀釋之肽製劑在無血清RPMI 1640培養基中洗滌及脈衝2小時，每30分鐘渦旋一次。脈衝後，用新鮮R10培養基洗滌T2細胞，計數，且以每孔5E+04個經肽脈衝之T2細胞塗鋪至96孔平底盤中。之後立即以1:1或1:5的E:T比率將T細胞添加到盤中。NY-ESO-1 TCR +T細胞效應細胞之數目係基於總T細胞計數及總活T細胞上之NY-ESO-1 dextramer+%(即總活T細胞上之轉導效率)來計算，該百分比係在完成生產後冷凍前對於T細胞產物確定的。對於1:1之E:T比率，將5E+04個NY-ESO-1 TCR +T細胞添加至5E+04個經肽脈衝之T2細胞中。對於1:5之E:T比率，將NY-ESO-1 TCR T細胞產物在R10培養基中1:5稀釋，然後將1E+04個NY-ESO-1 TCR +T細胞添加至5E+04個經肽脈衝之T2細胞中。將共培養盤在37℃及5% CO 2下培育24小時，將上清液收集至96孔U形底盤中且儲存於-80℃下用於後續細胞介素分析，如先前描述。 抗原非依賴性生長分析
非抗原依賴性生長分析係在TexMACS TM培養基中進行，使用3種不同的培養條件：1)不含細胞介素之TexMACS TM，2)補充有100 IU/mL IL-2之TexMACS TM，或3)補充有1200 IU/mL IL-7及200 IU/mL IL-15之TexMACS TM。非抗原依賴性生長分析之工作流程包括每3或4天計數一次，每7天再接種至新鮮培養基中，直至細胞計數下降且沒有足夠的細胞繼續該分析。
第0天，將T細胞產物解凍且計數，將1x10 6個細胞轉移至24孔G-Rex盤中的每個孔中以進行分析設置。對於「無細胞介素」培養條件，加入7 mL無細胞介素之TexMACS TM培養基，每孔總體積為8 mL。對於IL-2培養條件，添加7 mL含有IL-2之TexMACS TM培養基，最終濃度為100 IU/mL IL-2，總共8 mL樣品。對於IL-7+IL-15培養條件，添加7 mL含有IL-7及IL-15之TexMACS TM培養基，最終濃度為1200 IU/mL IL-7及200 IU/mL IL-15，總樣品量為8 mL。每個T細胞樣品一式兩份設置。將24孔G-Rex盤在加濕的37℃及5% CO 2培育箱中培育4天。在第4天，自每個T細胞樣品中移出4 mL培養基，且用4 mL含有或不含有細胞介素之預熱TexMACS TM培養基置換。添加IL-2，最終濃度為100 IU/mL，添加IL-7+IL-15，最終濃度為1200 IU/mL IL-7及200 IU/mL IL-15，總樣品量為8 mL。輕輕混合T細胞樣品且使用Attune TMNxT細胞計數器進行計數。在第7天，輕輕地再懸浮T細胞樣品，且使用Attune TMNxT細胞計數器進行計數。由於細胞計數低，停止「無細胞介素」培養條件，將IL-2及IL-7+IL-15重複樣品合併到一個50 mL管中，在室溫下以300 × g離心5分鐘，且再懸浮於不含細胞介素之TexMACS TM培養基中，濃度為1x10 6個細胞/mL(供體3035610)或0.5x10 6個細胞/mL(供體3035680及3035702)。將來自每個樣品之1x10 6個細胞(供體3035610)或0.5x10 6個細胞(供體3035680及3035702)轉移至新的24孔G-Rex®盤中，且添加7 mL含有IL-2或IL-7+IL-15細胞介素之新鮮TexMACS TM培養基，每孔總體積為8 mL，如上文所描述。由於細胞計數低，沒有足夠的細胞在第7天設置一式兩份地分析。如上所述，在第11天進行培養基更換，正如在第4天進行的那樣。在第14天，輕輕地混合T細胞樣品且計數。在第14天，來自IL-2及IL 7+IL 15培養條件之細胞不足以繼續該分析。 實例 1 ： 產生表現高親和力 NY-ESO-1 TCR +/- c-Jun 之人類 T 細胞
研究c-Jun過度表現對表現重組高親和力NY-ESO-1 TCR之人類T細胞的影響。特定而言，測試兩種不同的啟動子，以鑑別在重組TCR情況下研究c-Jun過度表現之主要候選者。
製得之構築體具有親和力增強之識別SLLMWITQC (SEQ ID NO:19)/HLA-A*02肽複合物之NY-ESO-1 TCR(Robbins等人, J Immunol.(2008) 180(9):6116-31)以及密碼子最佳化之人類野生型c-Jun(c-JunWT)或c-JunAA，在人類c-Jun的N端區域之位置63及73包含兩個絲胺酸至丙胺酸之突變。SLLMWITQC (SEQ ID NO:19)肽(NY-ESO-1157-164)係來源於NY-ESO-1及LAGE-1a家族之癌症/睾丸抗原，且與HLA-A*02複合表現於多種惡性腫瘤上，包括非小細胞肺癌(NSCLC)、滑膜細胞肉瘤、黑色素瘤及多發性骨髓瘤(D'Angelo等人, Cancer Discov. (2018) 8(8):944-57；Mackall等人, J Clin Oncol.(2016) 34:TPS3101-TPS3101；Robbins等人, J Clin Onco.(2011) 29:917-24；Robbins等人(2015) Clin Cancer Res.21(5):1019-27；Stadtmauer等人, Blood Advances(2019) 3(13):2022-34)。
進行最初實驗以鑑別最佳密碼子使用以增加c-Jun轉基因表現。此等實驗在模型系統中進行，該模型系統使用具有抗ROR1特異性CAR與截短EGFR(EGFRt)之多順反子構築體。人類EGFR之結構化域III為FDA許可的生物製劑西妥昔單抗(Erbitux®)之目標。藉由選擇性截短受體將EGFR之西妥昔單抗結合能力與其生物活性分開，有可能產生一種惰性的、完全人類細胞表面標記物(Li等人, Cancer Cell(2005) 7(4):301-11；Wang等人, Blood(2011) 118(5):1255-63)。因此，EGFRt充當安全開關以用西妥昔單抗消除經修飾細胞。
使用多種算法生成密碼子最佳化之變異體，然後藉由流式細胞量測術來測試c-Jun表現。2次篩檢之結果如 下表 1中所示(MFI：平均螢光強度)。 表 1 ： c-Jun 之密碼子最佳化
樣品 MFI c-Jun MFI R12 EGFRt +R12 +% MFI EGFRt
密碼子最佳化篩檢1
LP_2071 2607 7869 56.2 57276
LP_2532 2143 7750 60.3 57434
LP_2519 2340 7917 62.9 51705
密碼子最佳化篩檢2
LP_2071 528 859 41 9204
LP_2544 370 309 32.9 3467
LP_2545 463 497 34.3 5097
LP_2547 467 842 40.7 8844
LP_2549 (wt) 448 1074 39.2 11436
LP_2559 393 740 41.2 7980
LP_2063 255 1541 37 18856
如 表 1所示，如在流式細胞量測術中藉由MFI所量測，構築體LP_2071中經密碼子最佳化之c-Jun序列保持c-Jun、抗ROR1 CAR及EGFRt轉基因表現。LP_2071構築體中經密碼子最佳化之c-Jun編碼序列之核苷酸序列展示於SEQ ID NO: 21中。此經密碼子最佳化之c-Jun序列用於下文所述之構築體中(參見例如SEQ ID NO: 14)。出於選殖目的，在SEQ ID NO: 21之位置798進行單一T至C核苷酸取代以移除限制性位點。
如 圖 1之示意圖中所示製得若干表現構築體。特定而言，兩種不同的啟動子，延伸因子-1α(EF-1α)啟動子及MND啟動子(MND)經展示可以驅動c-Jun的高表現量。評估了c-Jun之野生型及突變型以減輕致癌轉化的潛在安全風險。c-JunAA變異體在c-Jun之N端區域的位置63及73含有不活化之絲胺酸到丙胺酸突變(即S63A及S73A)。
構築體之設計將c-Jun開放閱讀框架(cJun_gen_hum1 P05412之經密碼子最佳化之序列-野生型(WT)或含有不活化突變(AA))-置放在NY-ESO-1 c259TCR α及β的上游，所有3個編碼序列都在組成型人類EF-1α啟動子或MND啟動子的控制下。儘管轉錄成單個mRNA，但每個成分之間存在編碼之P2A核糖體跳躍序列，導致產生3個分開的多肽。此外，將弗林蛋白酶裂解位點置放在位於TCR α C端之P2A序列附近，以自TCR α次單元中移除部分核糖體跳躍蛋白質序列。 實例 2 ： 經轉導 T 細胞中之 c-Jun 與 NY-ESO-1 TCR 之高穩定表現
用含有圖1所示表現構築體的LVV轉導人類T細胞，藉由如上述材料及方法中所述的標準西方墨點法及流式細胞量測術評定重組轉基因的表現量。儘管如藉由流式細胞量測術(圖2A)或西方墨點分析( 圖 2B)，MND導致更高量之c-Jun，但EF-1α構築體在受到TransAct TM或NY-ESO-1 +目標細胞的刺激後，展示更穩定之c-Jun表現( 圖 3)。 實例 3 ： c-Jun 之過度表現增強了 T 細胞殺死及細胞介素產生
用表現圖1所示構築體之LVV轉導的人類T細胞如上述材料及方法中所述在IncuCyte®分析中受到刺激且測試殺死及細胞介素功能。功能分析之概述展示於圖4的示意圖中。
在各種E:T下NY-ESO-1 TCR +/- c-Jun T細胞之初步刺激展示，由EF-1α啟動子驅動的c-Jun構築體有更好的殺死( 圖 5A及 B)及細胞介素產生( 圖 6A及 B)。結果亦展示，c-Jun WT及AA變異體在殺死分析中的功能類似。 實例 4 ： 過度表現 c-Jun 之 細胞對目標細胞起反應增殖更多
在目標細胞刺激後7天，在c-Jun由EF-1α或MND啟動子且不由EF-1α或MND啟動子驅動的情況下，評估用NY-ESO-1 TCR構築體轉導之T細胞增殖，且報告為與EF-1α NY-ESO-1對照TCR相比之自起始培養物的倍數變化。如 圖 7A-7C所示，用EF-1α NY-ESO-1 TCR+c-Jun構築體轉導之T細胞在供體中擴增最多，而用c-Jun WT及AA變異體獲得的結果類似。
上述研究表明，當在EF-1α啟動子的控制下表現時，c-Jun尤其對NY-ESO-1 TCR轉導之T細胞提供了益處。 實例5：c-Jun NY-ESO-1 TCR細胞表現出對系列抗原刺激起反應的改進功能
鑒於實例1-4中顯示之結果，用帶有及不帶有c-Jun之EF-1α NY-ESO-1 TCR構築體進行了額外有針對性的研究。在此實例中，藉由使用連續再刺激分析在活體外模型化T細胞耗竭，其中NY-ESO-1 TCR T細胞產物每3或4天用經照射的A375目標細胞刺激一次，共刺激4輪(參見 圖 8的示意圖)。此分析提供持續抗原刺激之模型。T細胞耗竭之標誌包括諸如TIGIT、PD-1及CD39之耗竭標記物的共表現增加，以及諸如細胞毒性及細胞介素分泌之T細胞效應功能的逐漸喪失(McLane等人, Ann Rev Immunol.(2019) 37:457-95)。因此，NY-ESO-1 TCR T細胞之表型評估係在生產時、分析開始時、2輪刺激後及4輪刺激後(即分別是冷凍前、第0天、第7天及第14天)進行，包括評估T細胞分化及耗竭標記物的表現。此外，在分析開始時及4輪刺激後(即分別為第0天及第14天)對NY-ESO-1 TCR T細胞進行功能評估，包括量測對表現不同量NY-ESO-1抗原的目標細胞株起反應之細胞毒性及細胞介素分泌。
在4輪刺激期間，由EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞中的EF-1α啟動子保持高c-Jun表現量(資料未示)。與對照相比，c-Jun NY-ESO-1 TCR T細胞對抗原之反應具有類似或增加的增殖( 圖 9A-9C)。EF1α_NY-ESO-1 TCR T細胞在4輪NY-ESO-1抗原刺激後顯示出耗竭之特徵，因為觀察到耗竭標記物TIGIT、PD-1及CD39的共表現增加( 圖 10A-10E)。應注意，資料在供體之間及CD8 +與CD4 +群體內類似。
功能異常之T細胞的標誌之一為多種耗竭標記物的共表現(McLane等人，同上)。在第14天(即，經過4輪刺激後)，使用在NY-ESO-1 TCR +CD8 +及CD4 +T細胞群體中獲得之TIGIT +、PD-1 +及CD39 +閘進行使用布爾型閘控的多標記物分析。來自EF1α_NY-ESO-1 TCR T細胞產物之約17-29%的CD8 +T細胞群體及約20-71%的CD4 +T細胞群體共表現兩種或更多種耗竭標記物( 圖 10D及 10E)(『總多標記物 +』)。共表現多種耗竭標記物之大多數CD8 +T細胞係CD39 +TIGIT +，而大多數CD4 +T細胞係CD39 +PD-1 +或CD39 +PD-1 +TIGIT +(圖10D及E)。在EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物中觀察到共表現多種耗竭標記物之CD8+(即在約2-7%範圍內)及CD4 +(即在約5-38%範圍內)T細胞群體的比例顯著下降。此等結果共同表明，c-Jun之過度表現降低了表現耗竭標記物TIGIT、PD-1及CD39之CD8+與CD4+ NY-ESO-1 TCR T細胞的比例，此係由持續抗原刺激引起。
此外，EF1α_NY-ESO-1 TCR T細胞對NY-ESO-1 +目標細胞株A375及H1703起反應展示出降低的殺死能力( 圖 11A-11L)及細胞介素產生( 圖 12A-12F)。相比之下，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞之耗竭標記物表現降低( 圖 10A-10C)，CD39表現之降低在兩個供體或CD4細胞中沒有那麼劇烈，且保持即使在4輪NY-ESO-1抗原刺激後，仍具有殺死( 圖 11A-11F)及產生細胞介素( 圖 12A-12F)的能力。 圖 11A-11L及 圖 12A-12F展示來自代表性供體之A375目標細胞的結果。在供體中對於H1703目標細胞可見類似資料(資料未示出)。
總之，此等數據表明，c-Jun過度表現可以防止持續抗原暴露後NY-ESO-1 TCR T細胞產物的功能異常狀態。 實例 6 ： c-Jun 過度表現增加 NY-ESO-1 TCR 細胞產物之抗原敏感性
本實驗之目標為評估與不含c-Jun的NY-ESO-1 TCR產物相比，c-Jun過度表現是否會改變NY-ESO-1 TCR之抗原敏感性。此研究係使用帶有或不帶有c-Jun之EF1α_NY-ESO-1 TCR構築體進行。
用於此實驗之T2劑量-反應分析之示意圖展示於 圖 13中。T2細胞表現HLA-A*02，但缺乏與抗原加工相關之轉運體(TAP)，因此不能呈遞與HLA-A*02複合的內源性(經加工)肽。當用肽脈衝時，T2細胞將呈遞與HLA-A*02複合之經脈衝肽。因此，此等細胞可用於評估T細胞在非競爭環境中對不同量之所關注外源性抗原的反應。特定而言，對此分析，將NY-ESO-1肽新鮮稀釋，使用的陰性對照肽係HPV16 E7 (AA 86-93)。T2細胞在37℃下在無血清RPMI培養基中脈衝，在R10培養基中洗滌，隨後塗鋪於96孔平底盤中。塗鋪後，即刻向T2細胞中添加NY-ESO-1 TCR+ T細胞。共培養後約24小時，自盤移出上清液用於細胞介素分析。
結果顯示c-Jun過度表現增加NY-ESO-1 TCR T細胞產物之抗原敏感性。特別地，c-Jun過度表現在與NY-ESO-1脈衝的T2細胞共培養後會增加IL-2產生，而在與HPV16 E7脈衝的T2細胞共培養後則沒有觀察到增加( 圖 14A-14C)。E: T比為1: 5。下 表 2中所總結之半數最大有效濃度(EC 50)之計算展示出，c-Jun過度表現會增加NY-ESO-1 TCR產物的抗原敏感性。 表 2 ：工程化 T 細胞之 EC 50 值
T細胞產物 3035610 3035680 3035702
R 2 EC 50 R 2 EC 50 R 2 EC 50
EF1α_NYESO-1 0.9958 1.07E-08 0.99 2.38E-08 0.9935 2.30E-08
EF1α_c-JunWT_NYESO1 0.9937 5.87E-09 0.984 6.15E-09 0.9821 5.78E-09
EF1α_c-JunAA_NYESO1 0.9965 4.36E-09 0.9968 4.73E-09 0.9978 6.59E-09
R 2：用於計算EC50值之線性回歸模型之確定係數。
c-Jun過度表現亦在與NY-ESO-1脈衝的T2細胞共培養後增加IFN-γ產生，而在與HPV16 E7脈衝的T2細胞共培養後則沒有觀察到增加( 圖 15A-15C)。
總之，與NY-ESO-1 TCR對照相比，c-Jun之過度表現持續增加NY-ESO-1 TCR T細胞對抗原起反應的IL-2及IFN-γ產生的含量及臨界值。當NY-ESO-1 TCR T細胞過度表現c-Jun時，對抗原起反應之TNF-α表現之變化沒有以一致的方式發生改變。 實例 7 ：非抗原依賴性生長分析
本研究之目的為評估EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR在有或沒有細胞介素支持的情況下隨時間變化的非抗原依賴性細胞生長，作為臨床前安全評定的一部分。
如材料及方法中所述，使用3種不同之培養條件，在非抗原依賴性生長分析中評估了自3個健康供體產生的EF1α_NY-ESO-1及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物：1)不含細胞介素之TexMACS TM，2)補充有100 IU/mL IL-2之TexMACS TM，或3)補充有1200 IU/mL IL-7及200 IU/mL IL-15之TexMACS TM。每3或4天對來自每種培養條件之T細胞進行計數，每7天將培養物再接種至新鮮培養基中，直至細胞計數減少且沒有足夠的細胞來繼續該分析。沒有細胞介素之實驗在第7天中止，而有細胞介素(IL-2或IL-7+IL-15)之實驗由於細胞數量不足在第14天中止。
自 圖 16A-16C所示之3個供體中獲得的資料，沒有證據表明c-Jun過度表現驅動NY-ESO-1 TCR T細胞產物不受控制之非抗原依賴性細胞生長。T細胞在IL-2或IL-7+IL-15細胞介素支持下持續更長時間，EF1α_c JunWT_NY-ESO-1及EF1α_NY-ESO-1 TCR T細胞產物總體上表現出類似的細胞數量動力學。總之，此等資料表明，在有或沒有細胞介素支持的情況下，c-Jun之過度表現不會促進NY-ESO-1 TCR T細胞產物之非抗原依賴性生長。
總之，上述實例提供的資料表明，可以成功生成過度表現c-Jun之NY-ESO-1 TCR T細胞，c-Jun過度表現可以防止NY-ESO-1 TCR T細胞之功能性耗竭，以及在有或沒有細胞介素支持的情況下，c-Jun之過度表現不會促進NY-ESO-1 TCR T細胞產物的非抗原依賴性生長。c-Jun過度表現對NY-ESO-1 TCR工程化T細胞之功能性影響似乎大於對CAR T細胞所觀察到的影響。總體而言，過度表現c-Jun之NY-ESO-1 TCR T細胞為改善治療實體腫瘤之過繼性T細胞療法提供了一個新的臨床候選者。 實例 8 ： EF1 α _NY-ESO-1 及 EF1 α _c-JunWT_NY-ESO-1 TCR +T 細胞對 A-375 CDX 負載腫瘤小鼠之腫瘤生長的比較
此實例描述了評估EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1 TCR+ T細胞以及MND_c-JunWT_NY-ESO-1與MND_NY-ESO-1 TCR+ T細胞在小鼠模型中對NY-ESO-1陽性癌細胞之功效的研究。上述活體外研究展示，儘管如藉由流式細胞量測術( 圖 2A)或藉由西方墨點分析( 圖 2B)確定，MND導致更高含量c-Jun，但EF-1α構築體在用TransAct TM或NY-ESO-1 +目標細胞刺激後展示出更穩定的c-Jun表現( 圖 3)。
為了評定NY-ESO-1 TCR T細胞產物在實體腫瘤模型中之活體內療效及功能，使用表現NY-ESO-1之腫瘤細胞株A-375來建立皮下腫瘤異種移植模型。一旦皮下A-375源性腫瘤建立起來，就用5x10 6個TCR +T細產物(EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1；MND_c-JunWT_NY-ESO-1；EF1α_NY-ESO-1；或MND_NY-ESO-1)或未經轉導之(NTD；亦稱為未轉導)T細胞靜脈內治療小鼠。T細胞產物之表型特徵分析係在活體內輸注之前進行，在研究終點對固定的腫瘤進行目標抗原(NY-ESO-1)及T細胞浸潤的組織病理學分析。 8.1 ： 材料及方法 ：
為了評定EF1α/MND_NY-ESO-1與EF1α/MND_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR-T細胞對活體內腫瘤細胞之療效，吾人使用表現NY-ESO-1抗原之黑色素瘤細胞株A-375。
功效研究之主要讀數是對腫瘤生長及小鼠存活期的影響。次要讀數為(a)血液PK分析以研究T細胞隨時間的持久性；(b)藉由CD3 IHC及NY-ESO-1 TCR RNAscope®評定腫瘤及鼠類組織中TCR +T細胞之存在；(c)藉由IHC評估腫瘤中之NY-ESO-1抗原表現；以及(d)單細胞RNA定序以研究基因表現。 用 於接種之 T 細胞及 A-375 腫瘤細胞製備
如上所述製備TCR +T細胞。在接種至小鼠中之前，按比例擴大腫瘤細胞。在接種前採集腫瘤細胞且收集上清液進行人類及鼠類病原體測試，以確認細胞之無病原體狀態。對採集之腫瘤細胞進行計數且在預冷之PBS：基質膠(1:1)中再懸浮於冰上，最終濃度為每隻小鼠100 μL中5x10 6個細胞。將細胞保存於冰上，隨後用於將細胞皮下接種至每隻NSG雌性小鼠的右側腹。 給藥準備( 腫瘤隨機化及 T 細胞製備)
在將小鼠隨機分組以進行T細胞治療之前，使用測徑規量測每個小鼠之腫瘤體積。根據此等量測值，計算每個籠子的平均腫瘤體積，且將其歸類為低體積(＜中位平均腫瘤體積)或高體積(≥中位平均腫瘤體積)。
將TCR +T細胞及未經轉導之T細胞解凍且轉移至含有經預熱之RPMI培養基的50 mL管中，輕輕上下移液以繼續解凍過程。細胞用PBS洗滌且計數。根據TCR轉導效率，將細胞懸浮液在無菌PBS中調節至5x10 6個TCR +T細胞/100 µL，用於靜脈內注射至每隻NSG雌性小鼠之尾部靜脈中。
在解凍當天，藉由流式細胞量測術評定NY-ESO-1 TCR T細胞之轉導效率及表型(方法描述於下面的「T細胞表型分型」部分中)。 腫瘤細胞接種
在第II類無菌櫃中進行皮下(s/c)腫瘤植入。所有使用之設備在使用前都經過滅菌。藉由異氟烷-氧氣混合物在腔室中將動物短暫麻醉且移動至面部錐體。對右側腹刮毛，隨後用酒精擦拭物進行擦拭。每隻小鼠皮下(s/c)注射總體積為100 µL之含有細胞之基質膠及PBS溶液。動物移至恢復區進行監測，直到完全恢復，然後再放回家裏的籠子且進行監測。 T 細胞給藥
當在研究第7天可觸及腫瘤(約100 mm 3)時，經由尾部靜脈注射以每隻小鼠5x10 6個TCR +T細胞的劑量給予TCR +T細胞。如前面實例所述，在冷凍前預先確定總活T細胞上NY-ESO-1 TCR +的%。對於這兩個供體，使用總活T細胞上之NY-ESO-1dextramer +%進行計算。靜脈內(i.v.)劑量之療法係在第II類無菌櫃中進行。下 表 3展示出在活體內測試之每個TCR +T細胞構築體及治療組的細節。 表 3 ：給藥方案
治療 -T 細胞 劑量 (TCR + T 細胞 ) 小鼠 / 組
供體1：3035610 EF1α_NY-ESO-1 5x10 6 15
供體3：3035702 EF1α_NY-ESO-1 5x10 6 15
供體1：3035610 EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 5x10 6 15
供體3：3035702 EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 5x10 6 15
供體1：3035610 MND_NY-ESO-1 5x10 6 10
供體3：3035702 MND_NY-ESO-1 5x10 6 10
供體1：3035610 MND_c-JunWT_NY-ESO-1 5x10 6 10
供體3：3035702 MND_c-JunWT_NY-ESO-1 5x10 6 10
供體1：未經轉導之3035610 5x10 6 10
供體3：未經轉導之3035702 5x10 6 10
腫瘤量測值、研究計劃及終點
藉由測徑規量測所有小鼠之腫瘤尺寸，每週記錄三次，隨後每週記錄兩次體重。腫瘤體積如下所示計算： 腫瘤體積 = 腫瘤長度 * (腫瘤寬度^2) * 0.5
根據預先確定的標準，包括最大腫瘤體積，在各個終點對小鼠進行揀選且採集組織。此外，對於選定之TCR +T細胞治療組，在研究之第20-21天採集腫瘤以進行分離及進一步的T細胞特徵分析(n=5隻/組)。對於所有組，都收集了腫瘤及脾臟且分離，以進行T細胞特徵分析(n=5)或固定以進行組織病理學檢查(n=5)，如下所述。
在接種T細胞後24小時及之後每週收集研究中的所有小鼠之血樣。每隻小鼠收集約100 μL血液，每份樣品再加5 μL的血液作為損耗。亦經由心臟穿刺收集血液作為終末取樣之一部分。 T 細胞表型分型
為了在輸注至小鼠體內之前確定T細胞表型，使用分化及耗竭免疫組(耗竭：CD45、CD4、CD8、TCRvβ13.1、CD223、CD279、CD336及分化：CD45、CD4、CD8、TCRvβ13.1、CD45RA、CD197、CD95)進行基於流式細胞量測術之分析。將T細胞(2x10 5)轉移至96孔V型底盤中，離心，再懸浮於阻斷溶液中，且在4℃下培育15分鐘。將10 μL稀釋於FACS緩衝液中之抗體添加至每個孔中。細胞於暗處在4℃下與抗體一起培育30分鐘。培育30分鐘後，細胞洗滌一次，且將120 μL稀釋之7AAD活/死染料添加至每個孔中，在室溫下於暗處持續5-10分鐘。亦為每種抗體製備FMO對照，且由分析盤在CytoFLEX S流式細胞儀上運作。
對於各免疫組，進行補償調整。在96孔V型底盤中，將每種抗體與一滴REA或UltraComp eBeads TM補償珠粒混合，且於暗處在冰上培育15分鐘。對於活/死染色，將等分試樣之細胞在95℃下培育5分鐘以誘導細胞死亡，與活T細胞以1:1的比率混合，且進一步用7AAD染色。未染色珠粒及細胞用作陰性對照。用100 μL洗滌孔，離心，然後再懸浮於100 μL PBS中且在CytoFLEX流式細胞儀上運行。 磷脂結合蛋白 (Annexin)V/Helix NP 染色
細胞使用在磷脂結合蛋白V結合緩衝液中稀釋之磷脂結合蛋白V-APC，於暗處在室溫下培育15分鐘。細胞在磷脂結合蛋白V結合緩衝液中洗滌，且用Helix NP TM藍死細胞染料染色，然後獲取數據。對總細胞群體進行圈選，且使用象限圖圈選「活細胞群體」(磷脂結合蛋白V-/Helix NP -)、「凋亡細胞群體」(磷脂結合蛋白V+/Helix NP -)及「死細胞群體」(磷脂結合蛋白V+ & - /Helix NP +)。使用BD Biosciences Fortessa TMX-20獲取數據且使用Flowlogic TM流式細胞量測術分析軟體進行分析。 細胞毒性分析
將A375-NucLight TM目標細胞(4x10 4個/孔)塗鋪於96孔盤中，且使其在50 μL共培養基(不含酚紅之RPMI，補充有10% FBS、1% NEAA、1% GlutaMAX TM及1% NaPyruvate)中附著3-4小時。將來自每一組之供體1(3035610)及供體3(3035702)T細胞(4x10 4個/孔)添加至50 μL共培養基中的目標細胞中。對於1:1之效應子與目標比率，每孔添加4x10 4個T細胞。對於1:5之效應子與目標比率，每孔塗鋪8x10 3個T細胞。A375-NucLight目標細胞僅用作對照。T細胞塗鋪完成後，將96孔板負載至IncuCyte® S3，其中計劃以2小時為間隔進行圖像獲取，帶有紅色螢光及相位通道。 T 細胞 PK 流式細胞量測術
將血液轉移至V形底96孔盤中。使用150 µL紅血球裂解緩衝液進行兩次紅血裂解，且用200 µL細胞染色緩衝液洗滌細胞。裂解後，將細胞再懸浮於補充有10%小鼠血清及100 μg/mL人類IgG之50 μL細胞染色緩衝液中，且在室溫下培育10分鐘。將50 µL抗體主混合物(活/死DRAQ7、CD3 FITC、mCD45 BV421、CD4 BV786、CD8 BUV395、TCRvb PE及Dextramer APC)或螢光減一(fluorescent minus one，FMO；對於TCR或Dextramer)混合物添加至細胞中且在室溫下培育25分鐘。細胞用細胞染色緩衝液洗滌兩次。在每個樣品中加入50 μL的123count™ eBeads TM主混合物。所有樣品均使用Fortessa TMX-20流式細胞儀獲取。FCS文件自FACSDiva TM導出且在FlowJo TM中分析，主要指標以csv.格式導出且在GraphPad Prism中可視化。 組織病理學
自所有動物採集脾臟和腫瘤組織，將其一分為二，一半速凍，另一半在福爾馬林中固定24小時，加工隔夜且包埋在石蠟塊中。所有福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)腫瘤組織均以4 μm切片且用蘇木精及伊紅染色以進行組織形態評定。 CD3 及 NY-ESO-1 之免疫組織化學 (IHC)
以4 μm連續切片之FFPE腫瘤組織係對於CD3使用抗CD3(純系2GV6)兔單株抗體，且對於NY-ESO-1使用抗NY-ESO-1(純系E978)小鼠單株抗體藉由IHC進行染色。使用來自Indica Labs(Albuquerque, NM, USA)之HALO™軟體(v3.2.1851.229)對腫瘤及腫瘤基質區域中的人類CD3 T細胞浸潤及NY-ESO-1表現進行數位組織病理學定量。HALO TM軟體註釋及IHC定量由一名研究人員及兩名病理學家審查。 NY-ESO-1 TCR 之雙 CD3 IHC 及 RNAscope 原位雜交 (ISH) 分析
以4 μm連續切片之FFPE腫瘤組織用於雙重CD3 IHC及RNAscope® Ventana (VS) Universal Red ISH分析。分析之IHC部分使用抗CD3(純系2GV6)兔單株抗體，且用於分析之RNAscope® ISH部分的預處理條件包括16分鐘之抗原修復及16分鐘之蛋白酶。首先使用人類親環蛋白B(PPIB)管家基因探針作為陽性對照評定組織RNA品質，而在較小的樣品集中使用細菌基因探針(dapB)以評定可能的背景染色。獲得所有樣品之半定量分數(0-4)以確定QC通過/失敗。隨後對具有良好RNA品質之樣品進行NY-ESO-1 TCR染色，且使用來自Indica Labs(Albuquerque，NM，USA)之HALO軟體(v3.2.1851.229)進行定量。 腫瘤生長曲線
線性混合模型與腫瘤體積擬合，對構築體、時間及小鼠腫瘤基線體積具有固定效應。隨機效應用於籠子、供體及小鼠。腫瘤體積經log 10轉換以確保方差同質性(homoskedasticity)。在每個時間點計算每個構築體組之邊緣平均腫瘤體積。構建線性對比以比較任意時間點之腫瘤體積。此等為腫瘤體積log 10轉換之倍數變化。 存活期分析
資料係重新格式化為「達到1000 mm 3腫瘤體積之時間」，若小鼠退出(死亡)或首先達到研究結束，則認為它們「被審查」。存活分析(參數存活回歸)適合於此資料，具有構築體及供體之效應。報告每個構築體中之邊緣平均值(為達到任意腫瘤體積之中位時間)，且以線性對比(轉換回倍數變化)進行組間比較。單獨地，此資料亦可以卡本-麥爾曲線形式可視化。 腫瘤浸潤性淋巴球分離
用RPMI清洗腫瘤，且用乾淨之鑷子移除任何額外的結締組織或皮膚。用乾淨之鑷子將每個腫瘤切成2-4 mm的小塊。將腫瘤塊放入含有4.85 mL RPMI-1640培養基之gentleMACS™ C管中且添加100 µL酶H、50 µL酶R及12.5 µL酶A。將密封之C管置放於gentleMACS™解離器上，且根據製造商之方案針對特定的腫瘤類型運行適當程式。培育完成後，細胞溶液通過70 µm過濾器，用35 mL RPMI-1640將過濾器洗滌兩次且離心。將粒料再懸浮於30 mL之RPMI中。使用13 mL Ficoll-Pague進一步分離細胞懸浮液，Ficoll-Pague與30 mL細胞懸浮液仔細分層。兩個不同的層係可見的，並且避免了任何混合。細胞用緩慢加速離心且停止。收集含有免疫細胞之層且用RPMI洗滌。根據細胞集結粒尺寸，將粒料再懸浮於1-5 mL之FACS緩衝液(1xPBS + 2% FBS + 1 mM EDTA)中且計數。按照製造商之方案，使用磁珠藉由CD45 +選擇進一步分離免疫細胞。 單細胞 RNA 定序
腫瘤浸潤性淋巴球在冰上用Curiox Laminar盤中之散列抗體染色30分鐘，以允許樣品之多工。然後使用Curiox系統使用細胞染色緩衝液洗滌細胞。然後合併細胞，再懸浮於500 µL含0.5% BSA之PBS溶液中，且經由40 µm Flowmi®細胞過濾器過濾。每種乳液負載20,000或25,000個細胞。NovaSeq 6000上之乳液、cDNA加工、文庫製備及定序係根據鉻單細胞V(D)J試劑套組用細胞表面蛋白之特徵條碼技術進行。 單細胞 RNA 序列分析
以下QC度量值及(全局)臨界值用於細胞QC：a)每個細胞之偵測基因數≥800，b)每個細胞之總計數≥2000，及c)線粒體基因中的計數百分比≤10%。使用基於臨界值之方法對細胞進行解多工，表現/未表現之抗體定義如下：表現之抗體：≥ 200個計數；未表現：＜ 50個計數。使用Seurat套裝軟體v.3.1.3中之SCTransform方法對資料進行標準化。主成分分析結果係藉由其他降維方法(UMAP)得到證實。具有預設選項(分辨率 = 0.5)及20台PC之FindClusters函數(Seurat v3.1.3)用於集群。不表現T細胞標記物且表現上皮細胞、骨髓細胞及基質細胞標記物的叢集與TRAB/TRBV基因一起被移除。其餘資料按照上述相同步驟重新處理。
對假主體樣品(細胞計數總和)進行差異性表現分析。分析中不考慮低表現基因(＜10個計數)。根據使用DESeq2進行差異性表現分析之指南且考慮資料中之供體效應，將資料針對文庫大小進行標準化。 用於耗竭標記物表現之單細胞 RNA 定序
對自腫瘤樣品中分離之T細胞進行單細胞RNA定序，以分析RNA表現，諸如耗竭標誌物。在活體內研究結束時測定來自小鼠之T細胞的基因表現，且展示兩個供體之結合( 圖 22)。關鍵耗竭標誌物為PD1(PDCD1基因)及CTLA4，與EF1α_NY-ESO-1 T細胞相比，這兩者在EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 T細胞中均顯著下調。此外，轉錄因子Tox，一種驅動耗竭之關鍵基因，在EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 T細胞中表現較少。 8.2 ： T 細胞特徵分析及血液 PK 概況
在活體內投藥之前，進行流式細胞量測術分析以確定T細胞產物之耗竭概況及細胞子集組成。對於供體與細胞條件，大多數經轉導之T細胞係CD8 +( 圖 17A)，CD4 +細胞在8-24%範圍內。在所有供體樣品中測定NY-ESO-1 TCR產物之轉導效率(TE)%，並且在所有條件下平均為57%( 圖 17B)。儘管低百分比之TCR +CD8 +T細胞表現耗竭標記物LAG3及PD-1(＜10%)，但大多數細胞表現TIM-3( 圖 17C)。高含量之TCR +CD4 +T細胞亦表現耗竭標記物TIM-3，在所有條件下表現LAG-3之細胞百分比非常低(＜5%) ( 圖 17D)。EF1α_NY-ESO-1(46.2%)及NTD(43.2%)T細胞組中較高百分比之TCR +CD4 +表現PD-1，而EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR +CD4 +PD-1 +T細胞含量顯著較低(20.3%)( 圖 17D)。使用MND構築體亦觀察到類似結果。所觀察到之另一個關鍵差異為MND_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1 TCR+ T細胞組中之TIM-3 +群體顯著減少。
為了深入瞭解T細胞產物之組成且區分記憶群體，使用細胞表面標記物，諸如CD45RA、CCR7及CD95。TCR +CD8 +與CD4 +細胞都具有主要的幹細胞記憶、中樞記憶及效應表型。與NTD、MND_NY-ESO-1及EF1α_NY-ESO-1 TCR+ T細胞相比，MND_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR +CD8 +T細胞呈現出更加分化之表型，Tcm百分比較高，Tscm減少( 圖 17E)。在EF1α與MND c-JunWT NY-ESO-1組之間觀察到CD8 +T細胞亞群之顯著差異( 圖 17E)。特定而言，與EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1組相比，MND_c-JunWT_NY-ESO-1組具有顯著增加之Teff百分比及減少之Tscm群體百分比( 圖 17E)。CD4 +T細胞亞群百分比之差異不顯著( 圖 17F)。
為了評估EF1α_NY-ESO-1及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 T細胞介導之殺死潛力，設置基於IncuCyte®之細胞毒性分析，使用來源於相同離體擴增過程之新鮮解凍的T細胞。更詳細地，A375-NucLight TM細胞及T細胞以1:1或1:5之效應子與目標的比率共培養，每2小時拍攝一次圖像。EF1α_NY-ESO-1與EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 T均表現出顯著之殺死潛力，在構築體或供體之間未觀察到差異( 圖 18A及 18B)。
除了給藥前細胞之T細胞表型分型外，量測細胞生存力，藉由磷脂結合蛋白V/Helix NP染色來測定。生存力狀態展示出經由細胞計數器及流式細胞儀獲得的活細胞百分比具有類似水準，其中凋亡部分占總群體之＜2%( 圖 19A)。另外，輸注後24小時血液中T細胞之血液PK流式細胞量測術分析展示各組之間的TCR +T細胞數量相等，對於每個供體，在治療組之間沒有觀察到顯著差異( 圖 19B)。此等資料為活體內功效研究中遞送給小鼠之總細胞劑量的準確性提供了信心。
在活體內研究期間監測TCR +T細胞之PK概況，且展示出血液中細胞之持久性，治療組的總TCR +T細胞數量在研究終點增加( 圖 19C及 19D)。對每個存在資料之時間點進行多重t檢定比較。組間未見顯著差異。 8.3 ： c-Jun 過度表現對 NY-ESO-1 TCR T 細胞治療 A-375 負載腫瘤小鼠之抗腫瘤功效的影響
活體內研究表明EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1在第14天或第28天之平均腫瘤體積方面與EF1α_NY-ESO-1治療沒有顯著差異，儘管在較晚時間點用EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1治療之腫瘤體積有所減少。EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1治療在中間時間點第21天導致顯著更小的腫瘤( 圖 20A)。然而，在MND治療組中，c-Jun表現導致在第14天時顯著較大之腫瘤，及在中間點及終點(第21天&第28天)時腫瘤體積之名義上的增加( 圖 20B)。
經由EF1α( 圖 20C)及MND( 圖 20D)組之時間與目標體積圖所繪示之達到任意腫瘤體積(1000 mm 3)所花時間的分析展示，與EF1α_NY-ESO-1治療相比，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1組小鼠存活期及達到目標體積之時間增加，表明腫瘤生長較慢，因此在此組中增強了功效( 圖 20C)。觀察到EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1治療相比之達到1000 mm 3之時間之比率的顯著差異(p = 0.014)。MND_c-JunWT_NY-ESO-1組觀察到相反之作用，其中與MND_NY-ESO-1治療相比，觀察到腫瘤生長顯著更快，達到目標體積之時間縮短，表明此組缺乏功效(p = 0.002)( 圖 20D)。 8.4 取自 A-375 負載腫瘤小鼠之固定腫瘤的 NY-ESO-1 目標抗原表現及 TCR +T 細胞 浸潤之組織病理學檢查
進行H&E及IHC以確認不同治療組的A-375皮下腫瘤中存在腫瘤及NY-ESO-1抗原表現。組織病理學檢查確認了在不同治療組之A-375亞切腫瘤中存在腫瘤及NY-ESO-1抗原之中度至強表現(H評分在140-240之間)( 圖 21A)。在NTD與兩個TCR T細胞治療組之間觀察到NY-ESO-1表現的顯著減少。
對NY-ESO-1 TCR進行CD3 IHC及RNAscope TM以確定人類CD3 +TCR +T細胞在腫瘤中之浸潤程度。NTD組中人類T細胞之存在量較低，且在兩個TCR T細胞治療組中的大多數都觀察到顯著較高水準之T細胞浸潤( 圖 21B及 圖 21C)。未發現EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1及EF1α_NY-ESO-1治療組之間的CD3 +TCR +T細胞腫瘤浸潤有顯著差異。 8. 5 ：概述
上述資料展示，與NTD及MND_NY-ESO-1或EF1α_NY-ESO-1 T細胞相比，MND_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR +及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR+ T細胞組內之PD-1 +CD4 +細胞存在統計學上顯著之減少。
此外，在T細胞之CD8 +亞群內，與MND_NY-ESO-1及EF1α_NY-ESO-1 TCR T細胞相比，在MND_c-JunWT_NY-ESO-1及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞中觀察到Tscm%總體減少及Tcm%增加。MND_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞組表現出最高水準之分化細胞亞群。
基於IncuCyte®之細胞毒性分析的觀察結果為T細胞之細胞毒性潛力提供了信心，在供體或EF1α_NY-ESO-1及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞之間沒有觀察到差異。
輸注前T細胞活力狀態展示解凍後凋亡細胞分數沒有增加，且輸注後24小時血液中T細胞之血液PK流式細胞量測術分析展示各組之間TCR +T細胞數量相等，對投與每個治療組之TCR +T細胞劑量給予總體信心。
活體內研究表明，與NTD對照細胞相比，NY-ESO-1 TCR產物展示出增強之抗腫瘤功效及增加之T細胞在血液中的持久性。此外，在研究終點獲取之固定腫瘤內，組織學分析展示人類T細胞的存在在NTD組中低至可忽略不計，且在TCR +T細胞治療組中觀察到顯著較高水準之T細胞浸潤。此外，與對照組相比，在TCR +T細胞治療組中觀察到NY-ESO-1抗原表現之顯著減少。
治療組之比較展示，與EF1α_NY-ESO-1治療相比，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1在第21天及第28天時間點時的腫瘤較小，在第21天達到統計顯著性。對達到1000 mm 3任意腫瘤體積所花時間之分析展示，與EF1α_NY-ESO-1治療相比，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1組達到目標體積之時間顯著增加，表明腫瘤生長較慢，因此增強此組中之功效。此增強之功效並非由於腫瘤中T細胞含量的增加，因為在EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1治療組之間沒有發現CD3 +TCR +T細胞腫瘤浸潤之組織學分析的顯著差異。在MND治療中觀察到相反之作用，其中c-Jun表現導致第14天時顯著較大之腫瘤，及在中間點及終點(第21天&第28天)時腫瘤體積之名義上的增加。此外，與MND_NY-ESO-1治療相比，MND_c-JunWT_NY-ESO-1組展示出顯著較快之腫瘤生長，達到目標體積之時間縮短，表明此組中缺乏功效。
腫瘤浸潤性淋巴球之單細胞RNA定序表明，在活體內研究結束時，與EF1α_NY-ESO-1相比，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 T細胞之耗竭標記物表現降低。
總之，此等資料支持這樣的假設，即在EF1α啟動子的情況下c-Jun過度表現可以防止NY-ESO-1 TCR T細胞產物之功能異常狀態，且產生針對表現NY-ESO-1之腫瘤模型的增強功效。 實例 9 ： EF1 α _NY-ESO-1 及 EF1 α _c-JunWT_NY-ESO-1 TCR +T 細胞對 A-375 CDX 負載腫瘤小鼠之腫瘤生長及離體讀數的比較
用兩個劑量之T細胞及額外離體讀數重複實例8中描述之實驗，以量測在研究結束時自腫瘤中移除T細胞時T細胞反應是否保留。 9.1 ：材料及方法 腫瘤及 T 細胞製備及接種
活體內研究如實例8中所述進行，例外如下： -   如前所述分離T細胞，但有以下變化：使用Miltenyi CliniMACS Prodigy®將CD4 +及CD8 +T細胞一起(而不是單獨)分離；CD4:CD8比率沒有調節至50:50，而是保持在最初分離之比率，且在供體之間變化； -   僅對EF1α_NY-ESO-1與EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR-T細胞進行比較； -   功效研究之主要讀數是對腫瘤生長及小鼠存活期的影響。次要讀數為(a)血液PK分析以研究T細胞隨時間的持久性；(b)藉由CD3 IHC及NY-ESO-1 TCR RNAscope®評定腫瘤及鼠類組織中TCR +T細胞之存在；(c)藉由IHC評估腫瘤中之NY-ESO-1抗原表現；以及(d)評定腫瘤浸潤性淋巴球之離體活性。 -   除了實例8中評定之5x10 6個細胞的劑量外，評定3x10 6個T細胞之劑量；及 -   在研究第20至21天未採集。
使用了以下供體、構築體及小鼠數量，且未經轉導之細胞以每個供體的最高劑量注射( 表 4)： 表 4 ：構築體及給藥方案
治療 -T 細胞 劑量 (TCR + T 細胞 ) 小鼠 / 組
供體1：149622 EF1α_NY-ESO-1 3x10 6 12
供體1：149622 EF1α_NY-ESO-1 5x10 6 12
供體3：141220 EF1α_NY-ESO-1 3x10 6 12
供體3：141220 EF1α_NY-ESO-1 5x10 6 12
供體1：149622 EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 3x10 6 12
供體1：149622 EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 5x10 6 12
供體3：141220 EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 3x10 6 12
供體3：141220 EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 5x10 6 12
供體1：未經轉導之149622 7.4x10 6 12
供體3：未經轉導之141220 8.7x10 6 12
離體刺激及細胞介素量測
如上文實例8中所述進行T細胞:腫瘤細胞共培養，除了使用3:1比率的T細胞:腫瘤細胞代替1:1比率。
如上文實例8中所述進行MSD，不同之處在於使用U-Plex CAR-T細胞聯合1(hu)套組代替V-plex®促發炎組1人類套組(Meso Scale Diagnostics)。 9.2: T 細胞特徵分析及血液 PK 概況
在活體內投藥之前，進行流式細胞量測術及細胞毒性分析，且產生如上文實例8中所述的類似資料。
輸注後24小時血液中T細胞之血液PK流式細胞量測術分析展示，與較高劑量之EF1a_NY-ESO-1相比，TCR +T細胞數量減少，尤其對於供體1 EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1( 圖 23A-23B)。此等差異可能是由於輸注時之技術問題或不同的活體內命運造成的。在研究終點觀察到治療組之總TCR +T細胞數量增加，類似於在實例8中觀察到的情況。 9.3 ： c-Jun 過度表現對 NY-ESO-1 TCR T 細胞治療 A-375 負載腫瘤小鼠之抗腫瘤功效的影響
活體內研究展示所有構築體對供體1之低腫瘤生長控制，表明此供體之技術問題( 圖 24)。對於供體3，所有構築體之功效都是可見的，構築體之間沒有顯著差異。當評定卡本麥爾存活曲線之達到1000 mm 3之任意腫瘤體積的時間時，產生了類似的觀察結果( 圖 25)。 9.4: c-Jun 過度表現對 NY-ESO-1 TCR T 細胞治療 A-375 負載腫瘤小鼠之血清 IFN-γ 的影響
量測小鼠血清中之IFN-γ作為正在進行中的免疫反應之指示。在研究之前2週內，與EF1a_NY-ESO-1及未經轉導之(NTD)細胞相比，在兩種T細胞劑量下，用EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1觀察到IFN-γ之初始峰值( 圖 26)。在稍後時間點，所有構築體及未經轉導之T細胞之IFN-γ增加，這可能指示新出現的移植物抗宿主反應。 9.5 ： 離體刺激腫瘤浸潤性淋巴球以評定細胞介素產生
在活體內研究結束時對腫瘤浸潤性淋巴球進行了額外的離體刺激，以評定T細胞功能是否保留。儘管EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1之TCR +T細胞百分比較低(括號中的數字， 圖 27)，但細胞介素分泌增加，表明與EF1a_NY-ESO-1相比，EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1之功能性增加。 9.6 ： 概述
與實例8中之活體內研究結果相反，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1相比在功效上沒有觀察到顯著差異。然而，缺乏增加之功效可能係由於此等小鼠模型罹患移植物抗宿主病的事實。
在早期時間點觀察到之血清IFN-γ表明EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1相比之反應增加，在研究結束時升高的IFN-γ掩蓋了這一現象，指示移植物抗宿主反應。
離體刺激腫瘤浸潤性T細胞時的IFN-γ分泌表明EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1相比之反應增加，因此c-Jun過度表現保留功能性。
總之，所觀察到之增強的T細胞功能及保留之T細胞活性的次要終點指示，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1相比之功能性增加，這可能導致在更合適的不罹患移植物抗宿主疾病之小鼠模型中效應功能增加。 實例 10 ： EF1 α _NY-ESO-1 及 EF1 α _c-JunWT_NY-ESO-1 TCR +T 細胞對 A-375 CDX 負載腫瘤小鼠靜脈內注射腫瘤細胞後腫瘤生長的比較
使用與實例8及9中描述的相同小鼠模型，不同之處在於靜脈內而非皮下注射腫瘤細胞以允許在內臟中建立腫瘤。 10.1 ： 材料及方法 ： 腫瘤及 T 細胞製備及接種
活體內研究如實例8中所述進行，例外如下： -   使用螢光素酶 +A-375代替A-375腫瘤細胞； -   功效研究之主要讀數是對腫瘤生長的影響。次要讀數為(a)藉由CD3 IHC及NY-ESO-1 TCR RNAscope®評定腫瘤及鼠類組織中TCR +T細胞存在，及(b)評定腫瘤浸潤性淋巴球之離體活性； -   使用Bruker活體內Xtreme成像系統藉由生物發光量測腫瘤負荷，且藉由信號強度隨機分組； -   未評定解凍當天之轉導效率及表型；以及 -   靜脈內注射細胞以在內臟中建立腫瘤，且使用以下構築體及小鼠數量( 表 5)： 表 5 ：構築體及給藥方案
治療 -T 細胞 劑量 (TCR+ T 細胞 ) 小鼠 / 組
供體1：3035610 EF1a_NY-ESO-1 1x10 6 10
供體3：3035702 EF1a_NY-ESO-1 1x10 6 10
供體1：3035610 EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1 1x10 6 10
供體3：3035702 EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1 1x10 6 10
供體1：未經轉導之3035610 1x10 6 10
供體3：未經轉導之3035702 1x10 6 10
10.2 ： c-Jun 過度表現 對 靜脈內注射 A-375 後 NY-ESO-1 TCR T 細胞治療 負載腫瘤 小鼠之抗腫瘤功效的影響
腫瘤細胞之靜脈內注射導致內臟中出現腫瘤。此模型用於評定EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1a_NY-ESO-1及未經轉導之(NTD)T細胞相比的功效。與未經轉導之T細胞相比，兩種構築體都展示出顯著增加的腫瘤控制( 圖 28)。然而，與EF1a_NY-ESO-1相比，EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1在腫瘤生長控制方面沒有差異。
進行CD3 IHC及RNAscope TM，與實例8類似，腫瘤細胞表現抗原且經轉導之T細胞浸潤至腫瘤中，但構築體之間沒有差異。
量測血清中是否存在IFN-γ作為主動免疫反應之讀數。與未經轉導之細胞相比，兩種構築體都展示出更高的血清細胞介素含量，且與EF1a_NY-ESO-1相比，EF1a_c-JunWT_NY-ESO-1具有更高含量之IFN-γ，尤其在活體內研究即將結束之際( 圖 29)。 10.3 ： 概述
與實例8中之活體內研究結果相反，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1相比在功效上沒有觀察到顯著差異。
血清IFN-γ表明EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1相比之反應增加，在研究結束時進一步升高。
總之，如藉由血清IFN-γ評定之T細胞功能增強的次要終點指示，EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1與EF1α_NY-ESO-1相比之功能性增加，這可能導致在更合適的不具有移植物抗宿主反應之小鼠模型中效應功能增加。 實例 11 ： 藉由流式細胞量測術評定 T 細胞產物刺激後之 FOXP3 及 CD25 表現
此實例描述了在不存在或存在TGF-β的情況下藉由A-375目標細胞刺激後評估EF1α_NY-ESO-1 TCR與EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞中FOXP3之表現的研究。
FOXP3(一種已知用來控制調節性T細胞(Treg)分化及功能之轉錄因子)的表現已展示在活體外及活體內TCR刺激後在CD8 +T細胞中被誘導，且可在TGF-β存在下增加(Lozano等人, Cancer Letters(2022) 528:45-58)。CD8 +T細胞增加之FOXP3表現與增殖、細胞介素產生、裂解活性及抗腫瘤功效以及免疫抑止功能的損害有關(Kiniwa等人, Clin Cancer Res.(2007) 13(23):6947-58; Bisikirska等人, J Clin Invest.(2005) 115:2904-13)。已活體外暴露於持續抗原刺激之EF1α_NY-ESO-1 TCR及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物之轉錄圖譜展示，c-Jun過度表現降低了表現FOXP3之CD8 +T細胞的比例。
在刺激前的第0天，來自模擬物之CD4 +及CD8 +T細胞以及EF1α_NY-ESO-1 TCR及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物表現低含量之FOXP3(即觀察到介於2-5%之間的FOXP3 +CD4 +T細胞及介於1-4%之間的FOXP3 +CD8 +T細胞)( 表 6)。 表 6 ： 第 0 天 FOXP3 + 值
CD8 +T 細胞(FOXP3 +%)
供體 模擬物 EF1α_NY-ESO-1 EF1α _c-JunWT_NY-ESO-1
3048935 2 2 3
3048947 2 3 4
3048957 1 2 2
CD4 +T 細胞(FOXP3 +%)
供體 模擬物 EF1α_NY-ESO-1 EF1α _c-JunWT_NY-ESO-1
3048935 3 2 3
3048947 5 4 5
3048957 3 2 3
然而，在A-375目標細胞刺激7天後，來自EF1α_NY-ESO-1 TCR及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物之CD4 +與CD8 +T細胞中的FOXP3表現增加( 圖 30A- 30C)。發現在目標細胞刺激7天後，來自表現FOXP3之EF1α_NY-ESO-1 TCR及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物的大多數CD4 +及CD8 +T細胞亦表現高含量之CD25( 圖 30A-30C)。在TGF-β不存在或存在下目標細胞刺激7天後，與EF1α_NY-ESO-1 TCR T細胞產物相比，自EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物中觀察到CD25 高FOXP3 +CD8 +T細胞之比例減少(即在TGF-β不存在下分別為2-8%相比於14-30%；及在TGF-β存在下分別為5-19%相比於20-35%)，在TGF-β存在下觀察到顯著減少(配對t檢定之p = 0.0174)( 圖 30A-30D及 表 7)。 表 7 ： 第 7 天 CD25 高 FOXP3 + 值
CD8 +T 細胞(%CD25 高FOXP3 +)
供體 模擬物 EF1α_NY-ESO-1 EF1α _c-JunWT_NY-ESO-1
3048935 0.5 15 5
3048947 0.2 30 8
3048957 0.3 14 2
CD8 +T 細胞 + TGF-β (%CD25 高FOXP3 +)
供體 模擬物 EF1α_NY-ESO-1 EF1α _c-JunWT_NY-ESO-1
3048935 0.6 20 9
3048947 0.1 35 19
3048957 0.2 22 5
CD4 +T 細胞(%CD25 高FOXP3 +)
供體 模擬物 EF1α_NY-ESO-1 EF1α _c-JunWT_NY-ESO-1
3048935 0.6 5 5
3048947 1 17 15
3048957 0.2 9 6
CD4 +T 細胞 + TGF-β (%CD25 高FOXP3+)
供體 模擬物 EF1α_NY-ESO-1 EF1α _c-JunWT_NY-ESO-1
3048935 0.3 4 4
3048947 0.2 12 8
3048957 0.1 9 3
相比之下，在TGF-β不存在或存在下，與EF1α_NY-ESO-1 TCR T細胞產物相比，自EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物觀察到CD25 高FOXP3 +CD4 +T細胞百分比幾乎沒有差異(即在TGF-β不存在下分別為5-15%相比於5-17%，及在TGF-β存在下分別為3-8%相比於4-12% ) ( 圖 30A-30D及 表 7)。在與A-375目標細胞共培養後未接受TCR介導之刺激的模擬T細胞中，CD4 +與CD8 +T細胞群體內CD25 高FOXP3 +細胞之百分比低於2%( 表 7)。
此等結果一起展示，在TGF-β不存在或存在下，A-375目標細胞刺激NY-ESO-1 TCR T細胞產物可以增加CD4 +及CD8 +T細胞之FOXP3表現，且c-Jun過度表現可以減少來自NY-ESO-1 TCR T細胞產物之CD8 +T細胞在刺激後變為FOXP3陽性的比例。 序列 SEQ ID NO:1- NY-ESO-1 TCR α鏈編碼序列
Figure 02_image007
SEQ ID NO:2- NY-ESO-1 TCR β鏈編碼序列
Figure 02_image009
SEQ ID NO:3- NY-ESO-1 TCR α鏈胺基酸序列(方框中之信號肽)
Figure 02_image011
Figure 02_image013
SEQ ID NO:4- NY-ESO-1 TCR β鏈胺基酸序列(方框中之信號肽)
Figure 02_image015
SEQ ID NO:5- NY-ESO-1 TCR α鏈可變域
Figure 02_image017
SEQ ID NO:6- NY-ESO-1 TCR β鏈可變域
Figure 02_image019
SEQ ID NO:7- NY-ESO-1 TCR α CDR1
Figure 02_image021
SEQ ID NO:8- NY-ESO-1 TCR α CDR2
Figure 02_image023
SEQ ID NO:9- NY-ESO-1 TCR α CDR3
Figure 02_image025
SEQ ID NO:10- NY-ESO-1 TCR β CDR1
Figure 02_image027
SEQ ID NO:11- NY-ESO-1 TCR β CDR2
Figure 02_image029
SEQ ID NO:12- NY-ESO-1 TCR β CDR3
Figure 02_image031
SEQ ID NO:13-人類野生型c-Jun(S63及S73展示於方框中)
Figure 02_image033
Figure 02_image035
SEQ ID NO:14-用於表現野生型人類c-Jun及NY-ESO-1 TCR之三順反子慢病毒表現構築體之核苷酸序列(EF-1α啟動子：加下劃線；SV40 poly(A)信號：加點線下劃線；編碼序列(經密碼子最佳化之)如下標註：c-Jun，粗體及斜體；NY-ESO-1 TCRα鏈，斜體；NY-ESO-1 TCR β鏈，粗體；P2A加上連接子(亦粗體)，加框；弗林蛋白酶裂解位點(亦加雙下劃線)及締合連接子(亦粗體)，大寫字母)
Figure 02_image037
Figure 02_image039
Figure 02_image041
SEQ ID NO:15-自SEQ ID NO: 14轉譯之胺基酸序列(c-JunWT，加下劃線；P2A加上連接子(亦粗體)，加框；NY-ESO-1 TCR α鏈，粗體及斜體；弗林蛋白酶裂解一致序列，加雙下劃線；NY-ESO-1 TCR β鏈，直字體；連接子，斜體)
Figure 02_image043
SEQ ID NO:16-  2A裂解後之c-Jun蛋白質產物(P2A殘粒加上連接子(亦粗體)，加框)
Figure 02_image045
SEQ ID NO:17-  2A及弗林蛋白酶裂解後之TCR α鏈蛋白質產物(P2A殘粒，加框；弗林蛋白酶位點殘粒，加雙下劃線；連接子，加下劃線)
Figure 02_image047
SEQ ID NO:18- 2A及弗林蛋白酶裂解後之TCR β鏈蛋白質產物(P2A殘粒，加框)
Figure 02_image049
SEQ ID NO:19- NY-ESO-1 157-165肽
Figure 02_image051
SEQ ID NO:20- HPV16 E7 86-93肽
Figure 02_image053
SEQ ID NO:21-經密碼子最佳化之c-Jun核苷酸序列LP_2071
Figure 02_image055
圖1為展示用於下述實驗的多順反子c-Jun NY-ESO-1 TCR構築體之示意圖。評估兩種不同之啟動子(EF-1α啟動子及合成MND啟動子)驅動高c-Jun表現量的能力。對人類c-Jun之野生型(「WT」)與突變型式(S63A/S73A；「AA」)進行評估，以評定致癌轉化之潛在安全風險。P2A：P2A自裂解肽。弗林蛋白酶：弗林蛋白酶裂解位點。NY-ESO-1 TCR：對由I類MHC分子呈現之NY-ESO-1肽具有特異性之TCR。
圖 2A 及圖 2B為展示來自圖1所示構築體之c-Jun表現的圖。 圖 2A展示細胞內(「IC」)c-Jun表現量，如藉由流式細胞量測術在用如 圖 1所示之MND啟動子或EF-1α啟動子構築體轉導之CD8 +T細胞中所測量。 圖 2B展示藉由使用西方墨點分析所量測之c-Jun表現量。MFI：平均螢光強度。MND啟動子來源於骨髓增殖性肉瘤病毒強化子，其陰性對照區缺失，dl587rev引子結合位點經取代。
圖 3為一組流式細胞量測術點圖，展示與MND啟動子構築體相比，EF-1α啟動子構築體在刺激後顯示出更穩定之c-Jun表現。對照或經轉導細胞未經刺激(上圖)、用CD3/CD8 TransAct TM珠粒(Miltenyi Biotec)(中圖)刺激或用NY-ESO-1 +目標細胞(下圖)刺激。
圖 4為展示IncuCyte®免疫細胞殺死及MSD(Meso Scale Discovery)細胞介素功能分析之概覽圖。
圖 5A 及 5B為多組圖，展示在EF-1α啟動子( 圖 5A)或MND啟動子( 圖 5B)的情況下用模擬物、NY-ESO-1、c-JunWT_NY-ESO-1及c-JunAA_NY-ESO-1構築體轉導之T細胞的IncuCyte®免疫細胞殺死資料。使用IncuCyte® S3活細胞分析系統在162小時的時程中，在E:T比率為1:10或1:20(A375及H1703)及1:40或1:80 (TCCSup)的情況下，藉由追蹤A375(高Ag)、H1703(中Ag)及TCCSup(低Ag)癌細胞清除之動力學來確定殺死效率。殺死資料代表五名供體。較低之E:T比率展示了類似的研究結果，且未在圖上展示。Ag：抗原。E: T：效應細胞與目標細胞之比率。目標細胞經穩定轉導以表現NucLight TM紅(NLR)，以便使用IncuCyte®或類似儀器進行定量。
圖 6A 及 6B為描繪在A375 NLR目標細胞與在EF1α啟動子或MND啟動子的情況下用模擬物、NY-ESO-1 TCR、c-JunWT_NY-ESO-1 TCR及c-JunAA_NY-ESO-1 TCR構築體轉導之T細胞共培養24小時後上清液中之IFN-γ( 圖 6A)及IL-2( 圖 6B)含量的條形圖。E: T比率為1: 1。
圖 7A-7C為條形圖，展示來自三個健康人類供體的在EF-1α啟動子或MND啟動子的情況下用NY-ESO-1 TCR、c-JunWT_NY-ESO-1 TCR及c-JunAA_NY-ESO-1構築體轉導之受刺激T細胞數量之倍數變化(增殖)(分別為 圖 7A、 7B及 7C)。
圖 8為模型化持續抗原刺激之連續再刺激分析的示意圖。共培養盤在每次共培養設置前一天塗佈有聚-L-鳥胺酸；在添加T細胞之前，塗鋪照射過之親代(pA375)目標細胞且靜置約4小時；在每次共培養重置時添加10 IU/mL(1,000 pg/mL) IL-2，但不用於IncuCyte®實驗；根據每個採集日之T細胞計數及活T細胞上TCRvβ13.1+%，以1:1之E:T比率重置共培養。
圖 9A-9C為展示來自三個人類供體之c-Jun NY-ESO-1 TCR T細胞的圖(分別為 圖 9A、 9B及 9C)，與對照相比對抗原起反應具有類似或增加之增殖。
圖 10A-10E為展示在連續再刺激後c-Jun過度表現減少表現耗竭標記物之NY-ESO-1TCR +T細胞之百分比的圖。對於 圖 10A-10C，T細胞來自供體3035680。 圖 10A：CD8 +TCR +細胞中之TIGIT%； 圖 10B：CD8 +TCR +細胞中之PD-1%； 圖 10C：CD8 +TCR +細胞中之CD39%。資料具有代表性，且對於PD-1及TIGIT在供體中類似。CD39表現之減少在兩個供體或CD4 +細胞中沒有那麼劇烈。TCR +係指NY-ESO-1 TCR +。對於 圖 10D及 10E，基於在連續再刺激分析之第14天自三個供體獲得之每種T細胞產物之TIGIT +群體%、PD-1 +群體%及CD39 +群體%，進行使用布爾型(Boolean)閘控之多標記物分析。每個統計分析中之灰色條(c-Jun)藉由配對t檢定比較EF1α_NY-ESO-1 TCR及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物上指定標記物之表現%，結果在p＜0.05時定義為顯著。
圖 11A-11L展示評估NY-ESO-1 TCR T細胞細胞毒性之結果。使用IncuCyte™ S3活細胞分析系統，在162小時之時程中，藉由在1:1( 圖 11A及 11B)、1:5( 圖 11D及 11E)、1:10( 圖 11G及 11H)，或1:20( 圖 11J及 11K)之E:T比率下，追蹤A375及H1703 NLR癌細胞清除來測定在連續再刺激分析之第0天及第14天的來自代表性供體(供體3035610)之模擬物、EF1α_NY-ESO-1、EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR或EF1α_c-JunAA_NY-ESO-1 T細胞的殺死效率。該等圖展示來自代表性供體(供體3035610)之A375目標細胞的結果。在供體中對於H1703目標細胞可見類似資料(資料未示出)。 圖 11C、 11F、 11I及 11L展示EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR與EF1α_NY-ESO-1 TCR相比在第0天及第14天的曲線下面積(AUC)之倍數變化(值越低，殺死更多)。
圖 12A-12F為展示在1:1、1:5、1:10或1:20之E:T比率下，與A375 NLR癌細胞共培養24小時後所確定之連續再刺激分析的第0天( 圖 12A-C)及第14天( 圖 12D-F)由模擬物、EF1α_NY-ESO-1 TCR、EF1α_c-JunWT_NY-ESO TCR或EF1α_c-JunAA_NY-ESO-1 T細胞分泌之IFN-γ( 圖 12A及 12D)、IL-2( 圖 12B及 12E)及TNF-α( 圖 12C及 12F)的圖。該等圖展示來自供體3035680之A375目標細胞的結果。在供體中對於H1703目標細胞可見類似資料(資料未示出)。
圖 13為T2劑量反應分析之示意圖。
圖 14A-14C為展示與用NY-ESO-1 157-165脈衝之T2細胞共培養後，來自三個供體(分別為 圖 14A、 14B及 14C)之經轉導T細胞中c-Jun的過度表現增加IL-2產生之圖，而在與用HPV16 E7 86-93(不相關肽)脈衝之T2細胞共培養後未觀察到增加。所測試之T細胞為模擬物或經EF1α_NY-ESO-1 TCR、EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR或EF1α_c-JunAA_NY-ESO-1構築體轉導。
圖 15A-15C為展示與用NY-ESO-1 157-165脈衝之T2細胞共培養後，來自三個供體(分別為 圖 15A、 15B及 15C)之經轉導T細胞中的c-Jun過度表現增加IFN-γ產生之圖，而在與用HPV16 E7 86-93脈衝之T2細胞共培養後未觀察到增加。所測試之T細胞為模擬物或經EF1α_NY-ESO-1 TCR、EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR或EF1α_c-JunAA_NY-ESO-1構築體轉導。
圖 16A-16C為展示非抗原依賴性生長分析之結果的圖，表明c-Jun過度表現在有或沒有細胞介素支持的情況下不會驅動不受控制之細胞生長。展示供體3035610之資料，其為代表性的(資料在供體中一致)。
圖 17A-17F為展示c-Jun過度表現在來自供體1(3035610)之經轉導T細胞中之影響的圖。細胞針對耗竭及分化標記物進行染色以確定CD4 +及CD8+群體之百分比( 圖 17A)；TCR +細胞之百分比( 圖 17B)；CD8 +T細胞之細胞耗竭概況( 圖 17C)；CD4 +T細胞之細胞耗竭概況( 圖 17D)；以及CD8 +( 圖 17E)或CD4 +( 圖 17F)T細胞當中未處理T細胞(「Tnaive」；CD45RA +CCR7 +CD95 -)、T記憶幹細胞(「Tscm」；CD45RA +CCR7 +CD95 +)、中樞記憶T細胞(「Tcm」；CD45RA -CCR7 +)、效應記憶T細胞(「Tem」；CD45RA -CCR7 -)及效應T細胞(「Teff」；CD45RA +CCR7 -)之相對比例。
圖 18A-18B為展示來自供體1(3035610； 圖 18A)及供體3(3035702； 圖 18B)之經轉導T細胞之細胞毒性的圖。將T細胞與A375-NucLight細胞以1:1或1:5之效應子與目標之比率共培養，且在基於IncuCyte®之分析中評定細胞毒性120小時。
圖 19A-19D為展示來自供體1及供體3之經轉導T細胞的特徵分析的圖。 圖 19A展示解凍之T細胞內未經轉導、表現NY-ESO-1 TCR或表現c-JunWT-NY-ESO-1 TCR之活細胞、凋亡細胞及死細胞亞群的百分比，如藉由流式細胞量測術所測定。 圖 19B展示在T細胞輸注後24小時藉由流式細胞量測術所量測到之每毫升血液的TCR +T細胞總數。 圖 19C及 19D展示在研究的不同時間點藉由流式細胞量測術所量測到之每毫升血液的TCR +T細胞總數。
圖 20A-20D為展示皮下植入5×10 6A-375(人類黑色素瘤)細胞之NSG小鼠(每組n＝10或15)中腫瘤生長的圖。在植入後第7天，用EF1α_NY-ESO-1、MND_NY-ESO-1、EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1或MND_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞治療動物，總劑量為5x10 6TCR +T細胞。未經轉導之T細胞用作對照。 圖 20A及 20B展示腫瘤體積之倍數變化。EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1相對於EF1α_NY-ESO-1組在第21天時注意到腫瘤生長之顯著差異(p = 0.033)。 圖 20C及 20D展示每組達到目標腫瘤體積(1000 mm 3)的預計時間(天)及時間與目標體積之比率分析，其展示EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1相對於EF1α_NY-ESO-1治療組之間的顯著差異。
圖 21A-21C為展示用來自兩個供體之EF1α_NY-ESO-1)或EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR+T細胞治療的A-375皮下腫瘤中NY-ESO-1抗原表現及T細胞浸潤之組織病理學定量分析的圖。未經轉導之T細胞用作對照。 圖 21A展示出治療組中跨瘤內(腫瘤及腫瘤基質)區域之NY-ESO-1的組織學H評分定量。 圖 21B 及 21C展示治療組中跨瘤內(腫瘤及腫瘤基質)區域之CD3 +及CD3 +TCR +T細胞浸潤的定量。
圖 22是一組圖，展示自CDX小鼠模型分離之腫瘤浸潤性淋巴球上耗竭標記物(PDCD1、CTLA4及TOX)的單細胞RNA定序資料，比較了NY-ESO-1 TCR及c-JunWT_NY-ESO-1 TCR。
圖 23A-23B為展示在研究之不同時間點對於兩種T細胞劑量如藉由流式細胞量測術所量測到之每毫升血液之TCR +T細胞總數的圖。 圖 23A：來自供體1之T細胞。 圖 23B：來自供體3之T細胞。
圖 24為一對展示皮下注射A-375細胞之CDX小鼠模型之腫瘤體積隨時間變化的圖，比較了兩種T細胞劑量及未經轉導之細胞。T細胞來自兩個供體。NTD：未經轉導(未轉導)。
圖 25為展示在皮下注射A-375細胞之CDX小鼠模型中達到1000 mm 3任意腫瘤體積之時間之卡本-麥爾(Kaplan-Meier)存活曲線的一對圖，比較了兩種T細胞劑量及未經轉導之細胞。T細胞來自兩個供體。
圖 26為一對展示皮下注射A-375細胞之CDX小鼠模型之血清IFN-γ含量的圖，比較了兩種T細胞劑量及未經轉導之細胞。T細胞來自兩個供體。
圖 27為展示腫瘤浸潤性淋巴球在自小鼠中分離且與A-375腫瘤細胞一起培養後分泌IFN-γ之圖。TCR +T細胞之百分比指示於每隻小鼠識別號後面的括號中。
圖 28為展示靜脈內注射A-375細胞之CDX小鼠模型之腫瘤體積隨時間變化的圖，比較了兩種T細胞劑量及未經轉導之細胞。T細胞來自兩個供體。
圖 29為展示靜脈內注射A-375細胞之CDX小鼠模型之血清IFN-γ含量的圖，比較了兩種T細胞劑量及未經轉導之細胞。T細胞來自兩個供體。
圖 30A-30D為展示刺激後NY-ESO-1 TCR T細胞產物中FOXP3及CD25表現的圖。在存在及不存在TGF-β下用A-375目標細胞刺激7天後，測定模擬T細胞(未轉導)及NY-ESO-1 TCR T細胞產物上之FOXP3及CD25表現。展示的為來自EF1α_NY-ESO-1 TCR及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物之TCRvβ13.1 +CD4 +及CD8 +T細胞亞群或來自模擬T細胞樣品之TCRvβ13.1 -CD4 +及CD8 +T細胞亞群的供體3048935( 圖 30A)、3048947( 圖 30B)及3048957 ( 圖 30C)之CD25 高FOXP3 +象限閘。 圖 30D展示CD25 高FOXP3 +%值(即， 圖 30A-30C中所示之來自EF1α_NY-ESO-1 TCR及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物之TCRvβ13.1 +CD4 +及CD8 +T細胞亞群或來自模擬T細胞樣品之TCRvβ13.1 -CD4 +及CD8 +T細胞亞群的Q10象限閘)。該等圖展示來自3個供體之平均值±SD。使用配對ｔ檢定進行比較EF1α_NY-ESO-1 TCR及EF1α_c-JunWT_NY-ESO-1 TCR T細胞產物之統計分析，僅展示p值≤0.05 (*p = 0.0174，CD8 +，加TGF-β)。 

          <![CDATA[<110> 美商萊爾免疫藥物股份有限公司(LYELL IMMUNOPHARMA, INC.)]]>
                英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司(GLAXOSMITHKLINE INTELLECTUAL PROPERTY DEVELOPMENT LIMITED)
          <![CDATA[<120> 靶向NY-ESO-1之增強免疫細胞療法]]>
          <![CDATA[<130> 026225.TW017]]>
          <![CDATA[<140> TW 111107142]]>
          <![CDATA[<141> 2022-02-25]]>
          <![CDATA[<150> 63/236,789]]>
          <![CDATA[<151> 2021-08-25]]>
          <![CDATA[<150> 63/153,939]]>
          <![CDATA[<151> 2021-02-25]]>
          <![CDATA[<160> 21    ]]>
          <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 822]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          atggagaccc tgctgggcct gctgatcctg tggctgcagc tccagtgggt gtccagcaag       60
          caggaggtga cccagatccc tgccgccctg agcgtgcccg agggcgagaa cctggtgctg      120
          aactgcagct tcaccgactc cgccatctac aacctgcagt ggttccggca ggaccccggc      180
          aagggcctga ccagcctgct gctgatccag agcagccagc gggagcagac cagcggacgg      240
          ctgaacgcca gcctggacaa gagcagcggc cggagcaccc tgtacatcgc cgccagccag      300
          cccggcgaca gcgccaccta cctgtgcgct gtgcggcctc tgtacggcgg cagctacatc      360
          cccaccttcg gcagaggcac cagcctgatc gtgcacccct acatccagaa ccccgacccc      420
          gccgtgtacc agctgcggga cagcaagagc agcgacaagt ctgtgtgcct gttcaccgac      480
          ttcgacagcc agaccaatgt gagccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgacaag      540
          accgtgctgg acatgcggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggagcaac      600
          aagagcgact tcgcctgcgc caacgccttc aacaacagca ttatccccga ggacaccttc      660
          ttccccagcc ccgagagcag ctgcgacgtg aaactggtgg agaagagctt cgagaccgac      720
          accaacctga acttccagaa cctgagcgtg atcggcttca gaatcctgct gctgaaggtg      780
          gccggattca acctgctgat gaccctgcgg ctgtggagca gc                         822
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 939]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          aggatgagca tcggcctgct gtgctgcgcc gccctgagcc tgctgtgggc aggacccgtg       60
          aacgccggag tgacccagac ccccaagttc caggtgctga aaaccggcca gagcatgacc      120
          ctgcagtgcg cccaggacat gaaccacgag tacatgagct ggtatcggca ggaccccggc      180
          atgggcctgc ggctgatcca ctactctgtg ggagccggaa tcaccgacca gggcgaggtg      240
          cccaacggct acaatgtgag ccggagcacc accgaggact tccccctgcg gctgctgagc      300
          gctgccccca gccagaccag cgtgtacttc tgcgccagca gctatgtggg caacaccggc      360
          gagctgttct tcggcgaggg ctccaggctg accgtgctgg aggacctgaa gaacgtgttc      420
          ccccccgagg tggccgtgtt cgagcccagc gaggccgaga tcagccacac ccagaaggcc      480
          acactggtgt gtctggccac cggcttctac cccgaccacg tggagctgtc ctggtgggtg      540
          aacggcaagg aggtgcacag cggcgtgtct accgaccccc agcccctgaa ggagcagccc      600
          gccctgaacg acagccggta ctgcctgtcc tccagactga gagtgagcgc caccttctgg      660
          cagaaccccc ggaaccactt ccggtgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgac      720
          gagtggaccc aggaccgggc caagcccgtg acccagattg tgagcgccga ggcctggggc      780
          agggccgact gcggcttcac cagcgagagc taccagcagg gcgtgctgag cgccaccatc      840
          ctgtacgaga tcctgctggg caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc tgccctggtg      900
          ctgatggcta tggtgaagcg gaaggacagc cggggctaa                             939
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 274]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 
          1               5                   10                  15      
          Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 
                          85                  90                  95      
          Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg 
                      100                 105                 110         
          Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 
              130                 135                 140                 
          Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 
                      180                 185                 190         
          Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu 
                          245                 250                 255     
          Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 
                      260                 265                 270         
          Ser Ser 
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 312]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Arg Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn 
                  35                  40                  45              
          His Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Arg Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val 
              130                 135                 140                 
          Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys 
                  195                 200                 205             
          Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala 
                          245                 250                 255     
          Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln 
                      260                 265                 270         
          Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 
                  275                 280                 285             
          Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met 
              290                 295                 300                 
          Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 
          305                 310         
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 113]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Leu Tyr 
                          85                  90                  95      
          Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu His Pro 
                      100                 105                 110         
          Tyr 
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 111]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly Gln Ser 
          1               5                   10                  15      
          Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met Ser Trp 
                      20                  25                  30          
          Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser Ala Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Val Gly Asn 
                          85                  90                  95      
          Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Ala Val Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Met Asn His Glu Tyr 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Ser Val Gly Ala Gly Ile 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Ala Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 331]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 
                  35                  40                  45              
          Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 
                  275                 280                 285             
          Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe 
                          325                 330     
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 4621]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg       60
          ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt      120
          gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca      180
          gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc      240
          gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt      300
          acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg      360
          gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg      420
          cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct      480
          ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg      540
          caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc      600
          gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga      660
          gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct      720
          ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca      780
          gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg      840
          acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg      900
          tcctcagccg tcgcttcatg tgactccact gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat      960
          tagttctcgt gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg     1020
          gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa     1080
          ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca     1140
          gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag ctagccgcca ccatgacagc     1200
          caagatggaa accacattct acgacgacgc cctgaacgcc tcattcctgc cttctgagag     1260
          cggaccttac ggctacagca atcctaagat cctgaaacag agcatgaccc ttaacctggc     1320
          tgatcctgtt ggaagcctga aacctcacct gagagccaaa aacagcgacc tgctcaccag     1380
          ccctgatgtg ggcctgctga agctggcctc tccagagctg gaacggctga tcatccagag     1440
          cagcaacggc cacatcacaa ccacccctac ccctacacaa ttcctgtgcc ctaagaacgt     1500
          gaccgacgag caggagggct tcgccgaagg ctttgtgcgg gccctggcag aactgcactc     1560
          tcagaacacc ctgcctagcg tgacctccgc cgcccagcct gtcaacggcg ccggaatggt     1620
          ggcccctgcc gtggcttctg tggccggcgg cagcggcagc ggcggattca gcgcctctct     1680
          gcactctgag cctcctgtct acgccaatct gtctaatttc aaccccggag ccctgtccag     1740
          cggcggcgga gctcctagct acggcgctgc tggactggcc ttccccgccc agccccagca     1800
          acagcagcag cctccacacc acctgcccca gcagatgccc gtgcagcacc ctagactgca     1860
          ggccctgaag gaagaacccc aaacagtgcc tgagatgcct ggcgagacac ctccactgag     1920
          ccccatcgac atggaaagcc aggagcggat caaggccgag agaaagagaa tgcggaacag     1980
          aatcgccgcc agcaagtgca gaaagcggaa gctggaaaga atcgccagac tggaagagaa     2040
          ggtgaagacc ctgaaagccc aaaatagcga gctggccagc accgccaaca tgctgcggga     2100
          acaggtggcc cagctgaagc agaaggtgat gaaccacgtg aactctggtt gtcagctgat     2160
          gctgacccag cagctccaga ccttcggtag tggtgccacc aatttctctc tgctgaaaca     2220
          ggccggcgac gtcgaggaga atcccggccc catggagacc ctgctgggcc tgctgatcct     2280
          gtggctgcag ctccagtggg tgtccagcaa gcaggaggtg acccagatcc ctgccgccct     2340
          gagcgtgccc gagggcgaga acctggtgct gaactgcagc ttcaccgact ccgccatcta     2400
          caacctgcag tggttccggc aggaccccgg caagggcctg accagcctgc tgctgatcca     2460
          gagcagccag cgggagcaga ccagcggacg gctgaacgcc agcctggaca agagcagcgg     2520
          ccggagcacc ctgtacatcg ccgccagcca gcccggcgac agcgccacct acctgtgcgc     2580
          tgtgcggcct ctgtacggcg gcagctacat ccccaccttc ggcagaggca ccagcctgat     2640
          cgtgcacccc tacatccaga accccgaccc cgccgtgtac cagctgcggg acagcaagag     2700
          cagcgacaag tctgtgtgcc tgttcaccga cttcgacagc cagaccaatg tgagccagag     2760
          caaggacagc gacgtgtaca tcaccgacaa gaccgtgctg gacatgcgga gcatggactt     2820
          caagagcaac agcgccgtgg cctggagcaa caagagcgac ttcgcctgcg ccaacgcctt     2880
          caacaacagc attatccccg aggacacctt cttccccagc cccgagagca gctgcgacgt     2940
          gaaactggtg gagaagagct tcgagaccga caccaacctg aacttccaga acctgagcgt     3000
          gatcggcttc agaatcctgc tgctgaaggt ggccggattc aacctgctga tgaccctgcg     3060
          gctgtggagc agcggctccc gggccaagag aagcggatcc ggcgccacca acttcagcct     3120
          gctgaagcag gccggagacg tggaagaaaa ccctggccct aggatgagca tcggcctgct     3180
          gtgctgcgcc gccctgagcc tgctgtgggc aggacccgtg aacgccggag tgacccagac     3240
          ccccaagttc caggtgctga aaaccggcca gagcatgacc ctgcagtgcg cccaggacat     3300
          gaaccacgag tacatgagct ggtatcggca ggaccccggc atgggcctgc ggctgatcca     3360
          ctactctgtg ggagccggaa tcaccgacca gggcgaggtg cccaacggct acaatgtgag     3420
          ccggagcacc accgaggact tccccctgcg gctgctgagc gctgccccca gccagaccag     3480
          cgtgtacttc tgcgccagca gctatgtggg caacaccggc gagctgttct tcggcgaggg     3540
          ctccaggctg accgtgctgg aggacctgaa gaacgtgttc ccccccgagg tggccgtgtt     3600
          cgagcccagc gaggccgaga tcagccacac ccagaaggcc acactggtgt gtctggccac     3660
          cggcttctac cccgaccacg tggagctgtc ctggtgggtg aacggcaagg aggtgcacag     3720
          cggcgtgtct accgaccccc agcccctgaa ggagcagccc gccctgaacg acagccggta     3780
          ctgcctgtcc tccagactga gagtgagcgc caccttctgg cagaaccccc ggaaccactt     3840
          ccggtgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgac gagtggaccc aggaccgggc     3900
          caagcccgtg acccagattg tgagcgccga ggcctggggc agggccgact gcggcttcac     3960
          cagcgagagc taccagcagg gcgtgctgag cgccaccatc ctgtacgaga tcctgctggg     4020
          caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc tgccctggtg ctgatggcta tggtgaagcg     4080
          gaaggacagc cggggctaag tcgactctag agaattcgag ctcggtacct ttaagaccaa     4140
          tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag     4200
          ggctaattca ctcccaacga agacaagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt     4260
          tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc     4320
          aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta     4380
          actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat     4440
          gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga     4500
          acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa     4560
          ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt     4620
          a                                                                     4621
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 968]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 
                  35                  40                  45              
          Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 
                  275                 280                 285             
          Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe Gly Ser Gly Ala Thr 
                          325                 330                 335     
          Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 
                      340                 345                 350         
          Pro Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln 
                  355                 360                 365             
          Trp Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser 
              370                 375                 380                 
          Val Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu 
                          405                 410                 415     
          Thr Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly 
                      420                 425                 430         
          Arg Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr 
                  435                 440                 445             
          Ile Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 
              450                 455                 460                 
          Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr 
                          485                 490                 495     
          Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr 
                      500                 505                 510         
          Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val 
                  515                 520                 525             
          Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys 
              530                 535                 540                 
          Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala 
          545                 550                 555                 560 
          Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser 
                          565                 570                 575     
          Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr 
                      580                 585                 590         
          Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile 
                  595                 600                 605             
          Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu 
              610                 615                 620                 
          Trp Ser Ser Gly Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn 
          625                 630                 635                 640 
          Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 
                          645                 650                 655     
          Arg Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp 
                      660                 665                 670         
          Ala Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val 
                  675                 680                 685             
          Leu Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn 
              690                 695                 700                 
          His Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg 
          705                 710                 715                 720 
          Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val 
                          725                 730                 735     
          Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu 
                      740                 745                 750         
          Arg Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala 
                  755                 760                 765             
          Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser 
              770                 775                 780                 
          Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val 
          785                 790                 795                 800 
          Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala 
                          805                 810                 815     
          Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu 
                      820                 825                 830         
          Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp 
                  835                 840                 845             
          Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys 
              850                 855                 860                 
          Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg 
          865                 870                 875                 880 
          Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp 
                          885                 890                 895     
          Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala 
                      900                 905                 910         
          Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln 
                  915                 920                 925             
          Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 
              930                 935                 940                 
          Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met 
          945                 950                 955                 960 
          Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 
                          965             
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 352]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 
                  35                  40                  45              
          Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 
                  275                 280                 285             
          Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe Gly Ser Gly Ala Thr 
                          325                 330                 335     
          Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 
                      340                 345                 350         
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 281]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          Pro Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Trp Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Val Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser 
                  35                  40                  45              
          Ala Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Thr Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 
                      100                 105                 110         
          Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr 
              130                 135                 140                 
          Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys 
                      180                 185                 190         
          Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala 
                  195                 200                 205             
          Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile 
                          245                 250                 255     
          Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu 
                      260                 265                 270         
          Trp Ser Ser Gly Ser Arg Ala Lys Arg 
                  275                 280     
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 313]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          Pro Arg Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Trp Ala Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met 
                  35                  40                  45              
          Asn His Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro 
                          85                  90                  95      
          Leu Arg Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys 
                      100                 105                 110         
          Ala Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu 
              130                 135                 140                 
          Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu 
                          165                 170                 175     
          Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr 
                      180                 185                 190         
          Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr 
                  195                 200                 205             
          Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro 
              210                 215                 220                 
          Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr 
                      260                 265                 270         
          Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly 
                  275                 280                 285             
          Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala 
              290                 295                 300                 
          Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 
          305                 310             
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys 
          1               5                   
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α乳頭瘤病毒9]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 993]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          atgacagcca agatggaaac cacattctac gacgacgccc tgaacgcctc attcctgcct       60
          tctgagagcg gaccttacgg ctacagcaat cctaagatcc tgaaacagag catgaccctt      120
          aacctggctg atcctgttgg aagcctgaaa cctcacctga gagccaaaaa cagcgacctg      180
          ctcaccagcc ctgatgtggg cctgctgaag ctggcctctc cagagctgga acggctgatc      240
          atccagagca gcaacggcca catcacaacc acccctaccc ctacacaatt cctgtgccct      300
          aagaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gccgaaggct ttgtgcgggc cctggcagaa      360
          ctgcactctc agaacaccct gcctagcgtg acctccgccg cccagcctgt caacggcgcc      420
          ggaatggtgg cccctgccgt ggcttctgtg gccggcggca gcggcagcgg cggattcagc      480
          gcctctctgc actctgagcc tcctgtctac gccaatctgt ctaatttcaa ccccggagcc      540
          ctgtccagcg gcggcggagc tcctagctac ggcgctgctg gactggcctt ccccgcccag      600
          ccccagcaac agcagcagcc tccacaccac ctgccccagc agatgcccgt gcagcaccct      660
          agactgcagg ccctgaagga agaaccccaa acagtgcctg agatgcctgg cgagacacct      720
          ccactgagcc ccatcgacat ggaaagccag gagcggatca aggccgagag aaagagaatg      780
          cggaacagaa tcgccgctag caagtgcaga aagcggaagc tggaaagaat cgccagactg      840
          gaagagaagg tgaagaccct gaaagcccaa aatagcgagc tggccagcac cgccaacatg      900
          ctgcgggaac aggtggccca gctgaagcag aaggtgatga accacgtgaa ctctggttgt      960
          cagctgatgc tgacccagca gctccagacc ttc                                   993
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026

Claims (31)

  1. 一種表現構築體，其包含一或多個用於表現以下之表現卡匣： a) T細胞受體(TCR)，其特異性結合至與HLA-A分子複合之來自人類NY-ESO-1蛋白質的肽；及 b) 人類c-Jun多肽。
  2. 一種減少工程化免疫細胞之功能異常的方法，其包含向該工程化免疫細胞中引入增加c-Jun在該細胞中之表現的外源核酸分子，其中該工程化免疫細胞包含一或多個表現構築體，該一或多個表現構築體包含一或多個用於表現以下之表現卡匣： a) T細胞受體(TCR)，其特異性結合至與I類MHC分子複合之來自NY-ESO-1蛋白質的肽；及 b) 人類c-Jun多肽。
  3. 如請求項1之表現構築體或如請求項2之方法，其中該c-Jun為野生型人類c-Jun，視情況包含SEQ ID NO: 13或16，或與其至少90%一致之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之表現構築體或如請求項2之方法，其中該c-Jun為突變人類c-Jun，視情況在其轉錄活化域或δ域中包含不活化突變。
  5. 如請求項4之表現構築體或方法，其中該c-Jun相較於野生型c-Jun，包含(i) S63A及S73A突變或(ii)殘基2與102之間或殘基30與50之間的缺失。
  6. 如前述請求項中任一項之表現構築體或方法，其中該肽為人類NY-ESO-1 157-165(SEQ ID NO: 19)且該HLA-A分子為HLA-A*02。
  7. 如前述請求項中任一項之表現構築體或方法，其中該TCR包含α鏈及β鏈，其中該α鏈包含SEQ ID NO: 5中之CDR1-3且該β鏈包含SEQ ID NO: 6中之CDR1-3。
  8. 如請求項7之表現構築體或方法，其中該TCR α鏈CDR1-3分別包含SEQ ID NO: 7-9，且該TCR β鏈CDR1-3分別包含SEQ ID NO: 10-12。
  9. 如請求項7之表現構築體或方法，其中該TCR α鏈包含含有SEQ ID NO: 5或與其至少90%一致之胺基酸序列的可變域，且該TCR β鏈包含含有SEQ ID NO: 6或與其至少90%一致之胺基酸序列的可變域。
  10. 如請求項9之表現構築體或方法，其中該TCR α及β鏈分別包含SEQ ID NO: 3及4或分別包含SEQ ID NO: 17及18。
  11. 如前述請求項中任一項之表現構築體或方法，其中該表現構築體為病毒載體，其視情況選自慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、牛痘載體、單純疱疹病毒載體及艾司坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒載體。
  12. 如前述請求項中任一項之表現構築體或方法，其中該表現構築體包含用於表現c-Jun、TCR α鏈及TCR β鏈之三順反子表現卡匣。
  13. 一種三順反子表現構築體，其包含用於表現以下之表現卡匣： a) αβ T細胞受體(TCR)，其特異性結合至與HLA-A*02複合之人類NY-ESO-1 157-165肽；及 b) 人類c-Jun多肽。
  14. 如前述請求項之表現構築體或方法，其中該表現卡匣為包含SEQ ID NO: 13之編碼序列及SEQ ID NO: 3及4之編碼序列的三順反子表現卡匣，視情況其中該等編碼序列在框內藉由選自2A編碼序列及弗林蛋白酶裂解一致序列之序列分開。
  15. 如請求項14之表現構築體或方法，其中 該SEQ ID NO: 13之編碼序列包含SEQ ID NO: 21， 該SEQ ID NO: 3之編碼序列包含SEQ ID NO: 1， 該SEQ ID NO: 4之編碼序列包含SEQ ID NO: 2，及/或 該表現構築體包含SEQ ID NO: 14或與其至少80%一致之核苷酸序列。
  16. 如前述請求項中任一項之表現構築體或方法，其中該表現卡匣包含組成型或誘導型啟動子，視情況為EF-1α啟動子，視情況其中該表現構築體為慢病毒載體。
  17. 一種重組病毒，其包含如請求項13至16之三順反子表現構築體，視情況其中該表現構築體為慢病毒載體。
  18. 一種工程化免疫細胞之方法，其包含： a)將如請求項1及3至16中任一項之表現構築體或如請求項17之重組病毒引入起始細胞群體中， b)視情況選擇表現該TCR及該c-Jun之細胞，及 c)自步驟a)或b)之細胞得到工程化免疫細胞， 視情況其中該等免疫細胞為人類細胞。
  19. 如請求項18之方法，其中該起始細胞群體包含免疫細胞，視情況為自體或同種異體T細胞。
  20. 如請求項18之方法，其中該起始細胞群體包含多能或多潛能細胞，且步驟c)包含將步驟a)或b)之該等細胞分化成免疫細胞，視情況為T細胞。
  21. 一種人類細胞群體，其包含如請求項1及3至16中任一項之表現構築體或如請求項17之重組病毒，視情況其中該等人類細胞為免疫細胞。
  22. 一種免疫細胞群體，其藉由如請求項2至16及18至20中任一項之方法獲得，視情況其中該等免疫細胞為人類細胞。
  23. 如請求項21或22之細胞，其中該等細胞為T細胞，視情況為CD8 +T細胞。
  24. 如請求項21至23中任一項之細胞，其中該等細胞相較於不過度表現c-Jun之相應細胞 i)表現較低含量之耗竭標記物，視情況其中該耗竭標記物為CD39、PD-1、TIGIT、TIM-3或LAG-3，及/或 ii)表現較高含量之IL-2及/或IFN-γ。
  25. 如請求項24之細胞，其中該等細胞為T細胞且其中 i)在持續抗原刺激14天之後，不超過約5%-15%之該等T細胞為TIGIT陽性， ii)在持續抗原刺激14天之後，不超過約2%-5%之該等T細胞為PD-1陽性， iii)在持續抗原刺激14天之後，不超過約20%-45%之該等T細胞為CD39陽性， iv)與不過度表現c-Jun之對照工程化T細胞群體相比，在以1: 1、1: 5、1: 10或1: 20之T細胞與目標細胞比率持續抗原刺激的第0天及/或第14天，該等T細胞分泌至少超過約2倍的IL-2、INF-γ及/或TNF-α，及/或 v)與不過度表現c-Jun之對照工程化T細胞群體相比，該等T細胞對抗原起反應而增殖至少超過約2倍。
  26. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1及3至16中任一項之表現構築體、如請求項17之重組病毒或如請求項21至25中任一項之細胞，及醫藥學上可接受之載劑。
  27. 一種殺死目標細胞之方法，其包含使該等目標細胞與如請求項21至25中任一項之免疫細胞或如請求項26之醫藥組合物在允許該等免疫細胞殺死該等目標細胞之條件下接觸，其中該等目標細胞為表現NY-ESO-1之癌細胞， 視情況其中，相較於不包含導致c-Jun過度表現之外源核酸分子的相應免疫細胞，該等免疫細胞在與該等目標細胞接觸時，表現較低含量之耗竭標記物， 視情況其中該耗竭標記物為CD39、PD-1、TIGIT、TIM-3或LAG-3，且 視情況其中該等免疫細胞包含T細胞，視情況為CD8 +T細胞。
  28. 一種治療有需要之患者之方法，其包含向該患者投與如請求項21至25中任一項之人類細胞或如請求項26之醫藥組合物，視情況其中該患者為人類。
  29. 如請求項28之方法，其中該患者患有表現NY-ESO-1之癌症，視情況為轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌、骨髓瘤、食道癌、滑膜肉瘤、胃癌、乳癌、肝細胞癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌或黏液樣圓細胞脂肪肉瘤(MRCLS)。
  30. 一種如請求項1及3至16中任一項之表現構築體、如請求項17之重組病毒或如請求項21至25中任一項之人類細胞的用途，其用於製造用以在如請求項27至29中任一項之方法中治療有需要之患者，視情況人類患者的藥劑。
  31. 如請求項1及3至16中任一項之表現構築體、如請求項17之重組病毒、如請求項21至25中任一項之人類細胞或如請求項26之醫藥組合物，其用於在如請求項27至29中任一項之方法中治療有需要之患者，視情況為人類患者。
TW111107142A 2021-02-25 2022-02-25 靶向ny-eso-1之增強免疫細胞療法 TW202246511A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163153939P 2021-02-25 2021-02-25
US63/153,939 2021-02-25
US202163236789P 2021-08-25 2021-08-25
US63/236,789 2021-08-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202246511A true TW202246511A (zh) 2022-12-01

Family

ID=81326562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111107142A TW202246511A (zh) 2021-02-25 2022-02-25 靶向ny-eso-1之增強免疫細胞療法

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202246511A (zh)
WO (1) WO2022183076A1 (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ550810A (en) 2004-05-19 2009-05-31 Immunocore Ltd High affinity NY-ESO T cell receptor
WO2016054086A1 (en) * 2014-09-30 2016-04-07 The Regents Of The University Of California Codon-optimized lentiviral vector for stem cell reprogramming
GB201621889D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Autolus Ltd Cell
CN111727045A (zh) 2017-12-15 2020-09-29 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抑制t细胞衰竭的组合物和方法
CA3117539A1 (en) * 2018-10-23 2020-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ny-eso-1 t cell receptors and methods of use thereof
CA3188431A1 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 Carsten LINNEMANN Methods to enrich genetically engineered t cells

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022183076A1 (en) 2022-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2875959T3 (es) Composiciones y métodos para reprogramación de receptores de linfocitos T mediante el uso de proteínas de fusión
EP3177314B1 (en) T cell immunotherapy specific for wt-1
CN110248669B (zh) 工程化天然杀伤细胞及其用途
KR20200133370A (ko) 입양 주입된 t 세포의 지속성 강화 방법
US11090336B2 (en) Tn-MUC1 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy
Ayala et al. CXCR3 expression in regulatory T cells drives interactions with type I dendritic cells in tumors to restrict CD8+ T cell antitumor immunity
CN115151635A (zh) 用编码新的嵌合抗原受体的基因转导的基因修饰nk细胞系及其用途
WO2017193104A1 (en) T-cell immunotherapy specific for mart-1
CN114174495A (zh) 肿瘤浸润淋巴细胞疗法及其用途
EP3478711B1 (en) Herv-e reactive t cell receptors and methods of use
US20240108722A1 (en) Tumor-infiltrating lymphocytes with membrane bound interleukin 15 and uses thereof
CN114585646A (zh) Mage-a4 t细胞受体及其使用方法
Silk et al. Engineering cancer antigen-specific T cells to overcome the immunosuppressive effects of TGF-β
JP2021512637A (ja) サイクリンａ１特異的ｔ細胞受容体およびその使用
JP2023524853A (ja) 改変されたｉＰＳＣ
EP3202784A1 (en) T-cell receptor sequences for active immunotherapy
TW202246511A (zh) 靶向ny-eso-1之增強免疫細胞療法
CN117321189A (zh) 淋巴细胞的单血管扩增
CN115925985B (zh) Car-t细胞及其在非小细胞肺癌治疗中的应用
CN115960257B (zh) 靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体及其用途
WO2022232599A1 (en) Mesothelin-specific t cell receptors and methods of using same
WO2023141436A1 (en) Methods for identifying and using allogeneic tumor infiltrating lymphocytes to treat cancer
WO2023070041A1 (en) Enhanced immune cell therapy
AU2022314616A1 (en) Cellular therapies for cancer by inhibition of monocarboxylate transporter 11
KR20210141599A (ko) Cd28 t 세포의 배양액, 조성물 및 그 사용 방법