CN114585646A - Mage-a4 t细胞受体及其使用方法 - Google Patents

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C·古雷尔
J·汉森
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Abstract

本发明提供了与HLA呈递癌‑睾丸抗原黑色素瘤相关抗原A4(MAGE‑A4)肽特异性结合的分离T细胞受体(TCR)以及使用这些分离TCR的治疗和诊断方法。本发明提供了在MHC(HLA‑A2)的情况下为对抗MAGE‑A4肽抗原而产生的T细胞受体(TCR)。在报告基因检测中，已确定的独特TCR序列可与HLA分子沟中的小肽MAGE‑A4特异性结合，并活化T细胞。

Description

MAGE-A4 T细胞受体及其使用方法
相关专利申请
本申请要求2019年6月18日提交的第62/862,726号美国临时申请以及2019年7月9日提交的第62/871,793号美国临时专利申请的优先权和权益。上述各申请的全部内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。
序列表
本申请包含一个序列表，此序列表采用ASCII格式通过电子方式提交，并通过本发明的整体引用成为本发明的一部分。所述ASCII副本创建于2020年6月15日，名称为118003_00320_SL.txt，大小为344832千字节。
背景技术
T细胞受体(TCR)为膜结合异二聚体，包含一条类似于免疫球蛋白可变区(V)和恒定区(C)的α链和β链。所述TCRα链包含一条共价连接至C-α链的V-α链，而所述β链包含一条共价连接至C-β链的V-β链。所述V-α链和V-β链形成一个囊袋或裂缝，在主要组织相容性复合物(MHC)(在人类中称为HLA复合体)的情况下可结合抗原。(Davis，《免疫学年评》，3:537(1985年)；《基础免疫学》第3版，W.Paul(编辑)，纽约(1993年))。
TCR是免疫系统的主要效应子，作为治疗药物开发平台，具有独特的优势。虽然抗体治疗药物仅限于识别血液和胞外空间中的病原体，或细胞表面的蛋白靶点，但是，T细胞受体可识别随细胞表面MHC分子呈递的抗原，包括源自胞内蛋白的抗原。根据识别所呈递的抗原并被激活的T细胞亚型，TCR可参与各种免疫应答控制。例如，T细胞通过诱导B细胞分化成抗体产生细胞，参与体液免疫应答调控。此外，活化T细胞可启动细胞介导免疫应答。此外，据报告，TCR可介导细胞杀伤作用、增加B细胞增殖并影响癌症、过敏、病毒感染和自身免疫性障碍等各种障碍的发展和严重程度。
鉴于TCR的功能，已对抗原特异性TCR在免疫疗法中使用时使T细胞重定向至抗原表达肿瘤的能力进行了评估。TCR将结合长度仅为8-12个氨基酸的小肽，通过主要组织相容性复合物(MHC)结合在靶细胞的表面。因此，TCR可识别源自癌症或病毒蛋白的胞内抗原，因为在表面MHC的情况下，这些抗原经加工并以肽的形式呈递。因此，TCR可识别抗体或疗法(不能穿透细胞)无法识别的其他内部细胞靶点。
但是，此行业所面临的挑战是如何设计TCR，使其在向患者施用时缺乏免疫原性，并对特定目标肽抗原具有良好的特异性，且不会与MHC上的其他肽或天然蛋白库中的相似表位发生交叉反应。
MAGE-A4或黑色素瘤相关抗原A4是X染色体上的一种众所周知的癌-睾丸抗原(CTA)。MAGE-A4的功能未知，但其可能参与细胞周期进程/调控、转录控制、细胞存活和/或凋亡。例如，MAGE-A4过表达会促进自发转化口腔角化细胞的生长；并抑制G1中的细胞生长阻滞(Bhan等人(2012年)，《肿瘤报告》，28(4):1496)。
许多不同组织学类型的肿瘤均大量表达MAGE-A4，如头颈部鳞状细胞癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、食管鳞状细胞癌、结肠癌、膀胱癌、黏膜和皮肤黑色素瘤、卵巢癌(如浆液性癌)和子宫癌，但是，在正常的健康成体组织中，仅睾丸表达MAGE-A4。
MAGE-A4抗原可引起免疫应答，并且采用限制性表达模式，因此，MAGE-A4是一种很好的候选癌症免疫疗法。
在本领域，对基于T细胞受体(与MAGE-A4抗原特异性结合)的新靶向剂以及治疗和诊断环境中此类靶向剂的生产和使用方法的需求仍未得到满足。
发明内容
本发明提供了在MHC(HLA-A2)的情况下为对抗MAGE-A4肽抗原而产生的T细胞受体(TCR)。在报告基因检测中，已确定的独特TCR序列可与HLA分子沟中的小肽MAGE-A4特异性结合，并活化T细胞。此外，本发明所述的TCR不会与其他“类似”肽发生交叉反应。
因此，一方面，本发明提供了一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO:609))(MAGE-A4 286-294)特异性结合的T细胞受体(TCR)(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)，其中，所述TCR包含一个α链可变结构域，所述α链可变结构域包含一个互补决定区(CDR)3，其中，所述CDR3包含公式I的氨基酸序列：
N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15(公式I)，其中：
N1为非极性氨基酸；
N2为Val，可能存在，也可能不存在；
N3为Tyr、Gly、Leu、Val、Glu、Met、Ala或Phe；
N4为Arg、Glu、Ser、Asn、Gln、Lys、Asp、Gly或Met，可能存在，也可能不存在；
N5为Ser、Arg、Glu、Leu、Ala、Asp、Pro、Met、Gly或Lys，可能存在，也可能不存在；
N6为Ala、Asp、Gly、Ser、Val、Pro、Leu、Tyr或Thr，可能存在，也可能不存在；
N7为Thr、Pro、Ser、Glu、Asp、Trp、Arg、Asn、Ile、Gln或Leu；
N8为His、Trp、Thr、Lys、Tyr或Ala；
N9为Asn、Gly、Lys、Ile、Ser或Arg；
N10为Gln、Lys、Gly、Thr、Leu、Asp或Ser，可能存在，也可能不存在；
N11为Phe、Asn、Thr、Tyr、Ala、Leu、Met或Glu，可能存在，也可能不存在；
N12为Lys、Phe、Tyr或Asp，可能存在，也可能不存在；
N13为Lys或Gly，可能存在，也可能不存在；
N14为Thr、Leu或Tyr，可能存在，也可能不存在；以及
N15为Tyr、Gln、Ile、Thr、Val或Arg。
在一个实施例中，N1为Ala、Ile或Gly。
另一方面，本发明提供了一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO:609))(MAGE-A4 286-294)特异性结合的分离T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含一个β链可变结构域，所述β链可变结构域包含互补决定区(CDR)3，其中，所述CDR3包含公式II的氨基酸序列：
N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15-N16-N17-N18(公式II)，
其中：
N1为Ala或Ser；
N2为Ala、Ser或Thr；
N3为Ser、Gly或Trp；
N4为Leu、Tyr、Trp、Asp、Phe、Gly、Pro或His；
N5为Gly或Asp，可能存在，也可能不存在；
N6为Phe或Arg，可能存在，也可能不存在；
N7为Trp、Phe、Asp、Pro、Tyr、Gly、Thr、Ser或Val，可能存在，也可能不存在；
N8为Pro、Arg、Asp、Tyr、Gln、Asn或Gly，可能存在，也可能不存在；
N9为Asp，可能存在，也可能不存在；
N10为Arg，可能存在，也可能不存在；
N11为Gly、Ala或Thr，可能存在，也可能不存在；
N12为Ser、Trp、Thr、Gly、Val、Leu、Arg、Met、Tyr或Gln；
N13为Gly，可能存在，也可能不存在；
N14为Asn、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或His，可能存在，也可能不存在；
N15为Thr、Ser、Glu、Asn、Tyr、Gln、Asp或Pro，可能存在，也可能不存在；
N16为Glu、Pro、Lys、Thr、Ala、Gly或Gln，可能存在，也可能不存在；
N17为Ala、Leu、Ile、Tyr或Gln，可能存在，也可能不存在；以及
N18为Phe、His、Tyr或Thr。
在一个实施例中，所述α链可变结构域进一步包含一个CDR1和一个CDR2，其中，所述CDR1包含表2中所列的任一α链可变结构域CDR1氨基酸序列，所述CDR2单独包含表2中所列的任一α链可变结构域CDR2氨基酸序列。
在另一个实施例中，所述β链可变结构域进一步包含一个CDR1和一个CDR2，其中，所述CDR1包含表2中所列的任一β链可变结构域CDR1氨基酸序列，所述CDR2单独包含表2中所列的任一β链可变结构域CDR2氨基酸序列。
所述TCR可包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域；或所述TCR可包含一个TCRα链可变结构域和一个TCRβ链可变结构域。
在一个实施例中，所述TCR包含α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一α链可变结构域序列内)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一β链可变结构域序列内)。
在另一个实施例中，所述TCR包含一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
在另一个实施例中，所述TCR包含一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
在一个实施例中，所述TCR包含(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
在一个实施例中，所述TCR包含(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577和593；(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482、498514、530、546、562、578和594；(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579和595；(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、393、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585和601；(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474、490、506、522、538、554、570、586和602；以及(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、395、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587和603。
在一个实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159、167/175、183/191、199/207、215/223、231/239、247/255、263/271、279/287、295/303、311/319、327/335、343/351、359/367、375/383、391/399、407/415、423/431、439/447、455/463、471/479、487/495、503/511、519/527、535/543、551/559、567/575、583/591和599/607。
在一个实施例中，所述TCR包含CDR序列，所述CDR序列包含在一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对内：SEQ ID NO:7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159、167/175、183/191、199/207、215/223、231/239、247/255、263/271、279/287、295/303、311/319、327/335、343/351、359/367、375/383、391/399、407/415、423/431、439/447、455/463、471/479、487/495、503/511、519/527、535/543、551/559、567/575、583/591和599/607。
在另一个实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:87/31、23/95、231/607、231/223、231/591、231/255、231/271、231/79、231/47、231/399、599/239、599/223、599/591、599/255、599/271、599/79、599/47、599/399、215/239、215/607、215/591、215/255、215/271、215/79、215/47、215/399、583/239、583/607、583/223、583/255、583/271、583/79、583/47、583/399、247/239、247/607、247/223、247/591、247/271、247/79、247/47、247/399、263/239、263/607、263/223、263/591、263/255、263/79、263/47、263/399、71/239、71/607、71/223、71/591、71/255、71/271、71/47、71/399、39/239、39/607、39/223、39/591、39/255、39/271、39/79、39/399、391/239、391/607、391/223、391/591、391/255、391/271、391/79、391/47、439/127、439/319、439/287、439/15、439/111、439/383、439/191、439/511、439/527、439/559、439/207、119/447、119/319、119/287、119/15、119/111、119/383、119/191、119/511、119/527、119/559、119/207、311/447、311/127、311/287、311/15、311/111、311/383、311/191、311/511、311/527、311/559、311/207、279/447、279/127、279/319、279/15、279/111、279/383、279/191、279/511、279/527、279/559、279/207、7/447、7/127、7/319、7/287、7/111、7/383、7/191、7/511、7/527、7/559、7/207、103/447、103/127、103/319、103/287、103/15、103/383、103/191、103/511、103/527、103/559、103/207、375/447、375/127、375/319、375/287、375/15、375/111、375/191、375/511、375/527、375/559、375/207、183/447、183/127、183/319、183/287、183/15、183/111、183/383、183/511、183/527、183/559、183/207、503/447、503/127、503/319、503/287、503/15、503/111、503/383、503/191、503/527、503/559、503/207、519/447、519/127、519/319、519/287、519/15、519/111、519/383、519/191、519/511、519/559、519/207、551/447、551/127、551/319、551/287、551/15、551/111、551/383、551/191、551/511、551/527、551/207、199/447、199/127、199/319、199/287、199/15、199/111、199/383、199/191、199/511、199/527和199/559。
在另一个实施例中，所述TCR包含CDR序列，所述CDR序列包含在一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对内：SEQ ID NO:87/31、23/95、231/607、231/223、231/591、231/255、231/271、231/79、231/47、231/399、599/239、599/223、599/591、599/255、599/271、599/79、599/47、599/399、215/239、215/607、215/591、215/255、215/271、215/79、215/47、215/399、583/239、583/607、583/223、583/255、583/271、583/79、583/47、583/399、247/239、247/607、247/223、247/591、247/271、247/79、247/47、247/399、263/239、263/607、263/223、263/591、263/255、263/79、263/47、263/399、71/239、71/607、71/223、71/591、71/255、71/271、71/47、71/399、39/239、39/607、39/223、39/591、39/255、39/271、39/79、39/399、391/239、391/607、391/223、391/591、391/255、391/271、391/79、391/47、439/127、439/319、439/287、439/15、439/111、439/383、439/191、439/511、439/527、439/559、439/207、119/447、119/319、119/287、119/15、119/111、119/383、119/191、119/511、119/527、119/559、119/207、311/447、311/127、311/287、311/15、311/111、311/383、311/191、311/511、311/527、311/559、311/207、279/447、279/127、279/319、279/15、279/111、279/383、279/191、279/511、279/527、279/559、279/207、7/447、7/127、7/319、7/287、7/111、7/383、7/191、7/511、7/527、7/559、7/207、103/447、103/127、103/319、103/287、103/15、103/383、103/191、103/511、103/527、103/559、103/207、375/447、375/127、375/319、375/287、375/15、375/111、375/191、375/511、375/527、375/559、375/207、183/447、183/127、183/319、183/287、183/15、183/111、183/383、183/511、183/527、183/559、183/207、503/447、503/127、503/319、503/287、503/15、503/111、503/383、503/191、503/527、503/559、503/207、519/447、519/127、519/319、519/287、519/15、519/111、519/383、519/191、519/511、519/559、519/207、551/447、551/127、551/319、551/287、551/15、551/111、551/383、551/191、551/511、551/527、551/207、199/447、199/127、199/319、199/287、199/15、199/111、199/383、199/191、199/511、199/527和199/559。
在某些实施例中，本发明提供了一种包含CDR的TCR，所述CDR包含在一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对内：SEQ ID NO:668/676、103/111、439/447和503/511。在某些实施例中，本发明所述的TCR包含α链可变结构域互补决定区(CDR)CDR1、CDR2和CDR3以及β链可变结构域互补决定区(CDR)CDR1、CDR2和CDR3，其包含以下相应氨基酸序列：a)SEQ ID NO:662、663、664、670、671和672；b)SEQ IDNO:97、98、99、105、106和107；c)SEQ ID NO:433、434、435、441、442和443；以及d)SEQ IDNO:497、498、499、505、506和507。
本发明还提供了一种竞相与本发明所述一个或多个TCR结合的TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)。
在某些实施例中，本发明所述的TCR进一步包含一个可检测部分。
本发明进一步提供了药物合成物(包含本发明所述的任何TCR和一种可药用载体或稀释剂)以及呈递本发明所述任何TCR的分离细胞。
一方面，本发明提供了包含一个多核苷酸序列(对本发明所述任何TCR的α链可变结构域进行编码)的分离多核苷酸分子。
另一方面，本发明提供了包含一个多核苷酸序列(对本发明所述任何TCR的β链可变结构域进行编码)的分离多核苷酸分子。
本发明还提供了包含本发明所述多核苷酸分子的载体以及表达本发明所述载体的细胞。
一方面，本发明提供了一种MAGE-A4相关疾病或障碍受试者的治疗方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)、药物合成物或多个细胞，从而对受试者进行治疗。
在一个实施例中，所述MAGE-A4相关疾病或障碍为MAGE-A4相关癌症。
在一个实施例中，所述MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。
在本发明的某些实施例中，向受试者联合施用本发明所述的TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)、药物合成物或多个细胞以及第二治疗剂。
可通过皮下、静脉内、皮内、腹腔内、口服、肌肉内或颅内途径向受试者施用所述TCR、药物合成物或多个细胞。
一方面，本发明提供了一种对T细胞受体(TCR)进行编码的分离核酸分子，其中，所述TCR与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO:609))(MAGE-A4 286-294)特异性结合，其中，所述TCR具有从包括以下几项的一组中选择的一种特性：(a)不与表达预测脱靶肽的细胞结合(通过发光检测确定)；(b)T细胞应答激活作用约是源自患者的MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)；以及(c)T细胞应答激活作用约是亲和力成熟的(例如，通过噬菌体呈递)MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)。
在一个实施例中，所述分离核酸分子对至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域进行编码。
在一个实施例中，所述TCR包含α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一α链可变结构域序列内)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一β链可变结构域序列内)。
在另一个实施例中，所述TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)包含α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
在另一个实施例中，所述TCR包含β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
在一个实施例中，所述TCR包含(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
在一个实施例中，所述分离抗原结合蛋白包含(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577和593；(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482、498、514、530、546、562、578和594；(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579和595；(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、393、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585和601；(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474、490、506、522、538、554、570、586和602；以及(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、395、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587和603。
在一个实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159、167/175、183/191、199/207、215/223、231/239、247/255、263/271、279/287、295/303、311/319、327/335、343/351、359/367、375/383、391/399、407/415、423/431、439/447、455/463、471/479、487/495、503/511、519/527、535/543、551/559、567/575、583/591和599/607。
在另一个实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:87/31、23/95、231/607、231/223、231/591、231/255、231/271、231/79、231/47、231/399、599/239、599/223、599/591、599/255、599/271、599/79、599/47、599/399、215/239、215/607、215/591、215/255、215/271、215/79、215/47、215/399、583/239、583/607、583/223、583/255、583/271、583/79、583/47、583/399、247/239、247/607、247/223、247/591、247/271、247/79、247/47、247/399、263/239、263/607、263/223、263/591、263/255、263/79、263/47、263/399、71/239、71/607、71/223、71/591、71/255、71/271、71/47、71/399、39/239、39/607、39/223、39/591、39/255、39/271、39/79、39/399、391/239、391/607、391/223、391/591、391/255、391/271、391/79、391/47、439/127、439/319、439/287、439/15、439/111、439/383、439/191、439/511、439/527、439/559、439/207、119/447、119/319、119/287、119/15、119/111、119/383、119/191、119/511、119/527、119/559、119/207、311/447、311/127、311/287、311/15、311/111、311/383、311/191、311/511、311/527、311/559、311/207、279/447、279/127、279/319、279/15、279/111、279/383、279/191、279/511、279/527、279/559、279/207、7/447、7/127、7/319、7/287、7/111、7/383、7/191、7/511、7/527、7/559、7/207、103/447、103/127、103/319、103/287、103/15、103/383、103/191、103/511、103/527、103/559、103/207、375/447、375/127、375/319、375/287、375/15、375/111、375/191、375/511、375/527、375/559、375/207、183/447、183/127、183/319、183/287、183/15、183/111、183/383、183/511、183/527、183/559、183/207、503/447、503/127、503/319、503/287、503/15、503/111、503/383、503/191、503/527、503/559、503/207、519/447、519/127、519/319、519/287、519/15、519/111、519/383、519/191、519/511、510/559、519/207、551/447、551/127、551/319、551/287、551/15、551/111、551/383、551/191、551/511、551/527、551/207、199/447、199/127、199/319、199/287、199/15、199/111、199/383、199/191、199/511、199/527和199/559。
在一个实施例中，所述分离抗原结合蛋白包含(a)一个α链可变结构域CDR1，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、420、436、452、468、484、500、516、532、548、564、580和596；(b)一个α链可变结构域CDR2，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373、389、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、581和597；(c)一个α链可变结构域CDR3，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、422、438、454、470、486、502、518、534、550、566、582和598；(d)一个β链可变结构域CDR1，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、428、444、460、476、492、508、524、540、556、572、588和604；(e)一个β链可变结构域CDR2，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、573、589和605；以及(f)一个β链可变结构域CDR3，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414、430、446、462、478、494、510、526、542、558、574、590和606。
在一个实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域核酸序列对：SEQ ID NO:8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、376/384、392/400、408/416、424/432、440/448、456/464、472/480、488/496、504/512、520/528、536/544、552/560、568/576、584/592、600/608。
本发明还提供了包含本发明所述分离核酸分子的载体以及包含本发明所述载体的分离细胞。
一方面，本发明提供了一种MAGE-A4相关疾病或障碍受试者的治疗方法，包括向受试者施用权利要求42所述的多个细胞，从而对受试者进行治疗。
在一个实施例中，所述MAGE-A4相关疾病或障碍为MAGE-A4相关癌症。
在一个实施例中，所述MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。
在一个实施例中，向受试者联合施用所述多个细胞以及第二治疗剂。
一方面，本发明提供了一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO:609))(MAGE-A4 286-294)特异性结合的T细胞受体(TCR)(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)，其中，所述TCR具有从包括以下几项的一组中选择的一种特性：(a)不与表达预测脱靶肽的细胞结合(通过发光检测确定)；(b)T细胞应答激活作用的信噪比大于或等于源自患者的MAGE-A4特异性TCR(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)；以及(c)T细胞应答激活作用约是亲和力成熟的(例如，通过噬菌体呈递)MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)。
在某些实施例中，所述TCR的T细胞应答激活作用约是源自患者的MAGE-A4特异性TCR的两倍、三倍或四倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)。在某些实施例中，所述TCR的T细胞应答激活作用约是亲和力成熟的(例如，通过噬菌体呈递)MAGE-A4特异性TCR的两倍、三倍或四倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)。
一方面，本发明提供了一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列GVYDGREHTV(SEQ ID NO:612))(MAGE-A4 230-239)特异性结合的T细胞受体(TCR)(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)，其中，所述TCR包含一个互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区3(CDR3)包含在以下任一序列的一个α链可变结构域内：SEQID NO:620、636、652、668、684、700、716、732、748、764、780、796、812、828、844和860。
一方面，本发明提供了一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列GVYDGREHTV(SEQ ID NO:612))(MAGE-A4 230-239)特异性结合的T细胞受体(TCR)(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)，其中，所述TCR包含一个互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区3(CDR3)包含在以下任一序列的一个β链可变结构域内：SEQID NO:628、644、660、676、692、708、724、740、756、772、788、804、820、836、852和868。
在某些实施例中，所述α链可变结构域进一步包含一个CDR1和一个CDR2，其中，所述CDR1包含表6中所列的任一α链可变结构域CDR1氨基酸序列，所述CDR2单独包含表6中所列的任一α链可变结构域CDR2氨基酸序列。在某些实施例中，所述β链可变结构域进一步包含一个CDR1和一个CDR2，其中，所述CDR1包含表6中所列的任一β链可变结构域CDR1氨基酸序列，所述CDR2单独包含表6中所列的任一β链可变结构域CDR2氨基酸序列。在某些实施例中，所述TCR包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。在某些实施例中，所述TCR包含一个TCRα链可变结构域和一个TCRβ链可变结构域。
在某些实施例中，所述TCR包含α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一α链可变结构域序列内)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一β链可变结构域序列内)。在某些实施例中，所述TCR包含一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。在某些实施例中，所述TCR包含一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。在某些实施例中，所述TCR包含：(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
在某些实施例中，所述TCR包含(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838和854；(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839和855；(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840和856；(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846和862；(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:623、639、655、671、687、703、719、735、751、767、783、799、815、831、847和863；以及(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848和864。
在某些实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、636/644、652/660、668/676、684/692、700/708、716/724、732/740、748/756、764/772、780/788、796/804、812/820、828/836、844/852和860/868。在某些实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、620/644、620/660、620/676、620/692、620/708、620/724、620/740、620/756、620/772、620/788、620/804、620/820、620/836、620/852、620/868、636/628、636/644、636/660、636/676、636/692、636/708、636/724、636/740、636/756、636/772、636/788、636/804、636/820、636/836、636/852、636/868、652/628、652/644、652/660、652/676、652/692、652/708、652/724、652/740、652/756、652/772、652/788、652/804、652/820、652/836 652/852、652/868、668/628、668/644、668/660、668/676、668/692、668/708、668/724、668/740、668/756、668/772、668/788、668/804、668/820、668/836、668/852、668/868、684/628、684/644、684/660、684/676、684/692、684/708、684/724、684/740、684/756、684/772、684/788、684/804、684/820、684/836、684/852、684/868、700/628、700/644、700/660、700/676、700/692、700/708、700/724、700/740、700/756、700/772、700/788、700/804、700/820、700/836、700/852、700/868、716/628、716/644、716/660、716//676、716/692、716/708、716/724、716/740、716/756、716/772、716/788、716/804、716/820、716/836、716/852、716/868、732/628、732/644、732/660、732/676、732/692、732/708、732/724、732/740、732/756、732/772、732/788、732/804、732/820、732/836、732/852、732/868、748/628、748/644、748/660、748/676、748/692、748/708、748/724、748/740、748/756、748/772、748/788、748/804、748/820、748/836、748/852、748/868、764/628、764/644、764/660、764/676、764/692、764/708、764/724、764/740、764/756、764/772、764/788、764/804、764/820、764/836、764/852、764/868、780/628、780/644、780/660、780/676、780/692、780/708、780/724、780/740、780/756、780/772、780/788、780/804、780/820、780/836、780/852、780/868、796/628、796/644、796/660、796/676、796/692、796/708、796/724、796/740、796/756、796/772、796/788、796/804、796/820、796/836、796/852、796/868、812/628、812/644、812/660、812/676、812/692、812/708、812/724、812/740、812/756、812/772、812/788、812/804、812/820、812/836、812/852、812/868、828/628、828/644、828/660、828/676、828/692、828/708、828/724、828/740、828/756、828/772、828/788、828/804、828/820、828/836、828/852、828/868、844/628、844/644、844/660、844/676、844/692、844/708、844/724、844/740、844/756、844/772、844/788、844/804、844/820、844/836、844/852、844/868、860/628、860/644、860/660、860/676、860/692、860/708、860/724、860/740、860/756、860/772、860/788、860/804、860/820、860/836、860/852和860/868。
在某些实施例中，所述TCR包含一个可检测部分。在某些实施例中，所述TCR的靶上结合值/脱靶结合值大于2.5、大于3、大于3.5、大于4、大于4.5、大于5、大于10、大于15、大于20、大于50、大于100、大于200、大于300、大于400、大于500、大于600、大于700、大于800、大于900或大于1000。在某些实施例中，所述TCR的靶上结合值/脱靶结合值大于10。在某些实施例中，所述TCR的靶上结合值/脱靶结合值大于500。在某些实施例中，所述TCR竞相与本文所述的TCR结合(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)。
一方面，本发明提供了一种药物合成物，所述药物合成物包含本文所述的一种TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)以及一种可药用载体或稀释剂。一方面，本发明提供了一种呈递本文所述TCR的分离细胞。一方面，本发明提供了一种包含一个多核苷酸序列(对本文所述TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)的α链可变结构域进行编码)的分离多核酸。一方面，本发明提供了一种包含一个多核苷酸序列(对本文所述TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)的β链可变结构域进行编码)的分离多核酸。一方面，本发明提供了一种包含本文所述多核苷酸序列的载体。一方面，本发明提供了一种表达所述载体的分离细胞。
一方面，本发明提供了一种MAGE-A4相关疾病或障碍受试者的治疗方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)、药物合成物或分离细胞，从而对受试者进行治疗。在某些实施例中，所述MAGE-A4相关疾病或障碍为MAGE-A4相关癌症。在某些实施例中，所述MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。在某些实施例中，向受试者联合施用所述TCR、药物合成物或细胞以及第二治疗剂。在某些实施例中，所述施用采用胃肠外途径。
一方面，本发明提供了一种对T细胞受体(TCR)进行编码的分离核酸分子，其中，所述TCR与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列GVYDGREHTV(SEQ ID NO:612))(MAGE-A4 230-239)特异性结合，其中，所述TCR具有从包括以下几项的一组中选择的一种特性：(a)不与表达预测脱靶肽的细胞结合(通过发光检测确定)；(b)不与表达预测脱靶肽的细胞结合(通过流式细胞术检测确定)；(c)T细胞应答激活作用约是源自患者的MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)；以及(d)T细胞应答激活作用约是亲和力成熟的(例如，通过噬菌体呈递)MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)。在某些实施例中，所述分离核酸分子对至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域进行编码。
在某些实施例中，所述TCR包含α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一α链可变结构域序列内)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一β链可变结构域序列内)。在某些实施例中，所述TCR包含α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。在某些实施例中，所述TCR包含一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
在某些实施例中，所述TCR包含(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。在某些实施例中，所述TCR包含：(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838和854；(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839和855；(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840和856；(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846和862；(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:623、639、655、671、687、703、719、735、751、767、783、799、815、831、847和863；以及(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848和864。
在某些实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、636/644、652/660、668/676、684/692、700/708、716/724、732/740、748/756、764/772、780/788、796/804、812/820、828/836、844/852和860/868。在某些实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、620/644、620/660、620/676、620/692、620/708、620/724、620/740、620/756、620/772、620/788、620/804、620/820、620/836、620/852、620/868、636/628、636/644、636/660、636/676、636/692、636/708、636/724、636/740、636/756、636/772、636/788、636/804、636/820、636/836、636/852、636/868、652/628、652/644、652/660、652/676、652/692、652/708、652/724、652/740、652/756、652/772、652/788、652/804、652/820、652/836 652/852、652/868、668/628、668/644、668/660、668/676、668/692、668/708、668/724、668/740、668/756、668/772、668/788、668/804、668/820、668/836、668/852、668/868、684/628、684/644、684/660、684/676、684/692、684/708、684/724、684/740、684/756、684/772、684/788、684/804、684/820、684/836、684/852、684/868、700/628、700/644、700/660、700/676、700/692、700/708、700/724、700/740、700/756、700/772、700/788、700/804、700/820、700/836、700/852、700/868、716/628、716/644、716/660、716//676、716/692、716/708、716/724、716/740、716/756、716/772、716/788、716/804、716/820、716/836、716/852、716/868、732/628、732/644、732/660、732/676、732/692、732/708、732/724、732/740、732/756、732/772、732/788、732/804、732/820、732/836、732/852、732/868、748/628、748/644、748/660、748/676、748/692、748/708、748/724、748/740、748/756、748/772、748/788、748/804、748/820、748/836、748/852、748/868、764/628、764/644、764/660、764/676、764/692、764/708、764/724、764/740、764/756、764/772、764/788、764/804、764/820、764/836、764/852、764/868、780/628、780/644、780/660、780/676、780/692、780/708、780/724、780/740、780/756、780/772、780/788、780/804、780/820、780/836、780/852、780/868、796/628、796/644、796/660、796/676、796/692、796/708、796/724、796/740、796/756、796/772、796/788、796/804、796/820、796/836、796/852、796/868、812/628、812/644、812/660、812/676、812/692、812/708、812/724、812/740、812/756、812/772、812/788、812/804、812/820、812/836、812/852、812/868、828/628、828/644、828/660、828/676、828/692、828/708、828/724、828/740、828/756、828/772、828/788、828/804、828/820、828/836、828/852、828/868、844/628、844/644、844/660、844/676、844/692、844/708、844/724、844/740、844/756、844/772、844/788、844/804、844/820、844/836、844/852、844/868、860/628、860/644、860/660、860/676、860/692、860/708、860/724、860/740、860/756、860/772、860/788、860/804、860/820、860/836、860/852和860/868。
在某些实施例中，所述TCR包含：(a)一个α链可变结构域CDR1，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:617、633、649、665、681、697、713、729、745、761、777、793、809、825、841和857；(b)一个α链可变结构域CDR2，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:618、634、650、666、682、698、714、730、746、762、778、794、810、826、842和858；(c)一个α链可变结构域CDR3，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:619、635、651、667、683、699、715、731、747、763、779、795、811、827、843和859；(d)一个β链可变结构域CDR1，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849和865；(e)一个β链可变结构域CDR2，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:626、642、658、674、690、706、722、738、754、770、786、802、818、834、850和866；以及(f)一个β链可变结构域CDR3，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:627、643、659、675、691、707、723、739、755、771、787、803、819、835、851和867。在某些实施例中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域核酸序列对：SEQ ID NO:621/629、637/645、653/661、669/677、685/693、701/709、717/725、733/741、749/757、765/773、781/789、797/805、813/821、829/837、845/853和861/869。
一方面，本发明提供了一种包含本文所述分离核酸分子多核苷酸序列的载体。一方面，本发明提供了一种包含所述载体的分离细胞。一方面，本发明提供了一种受试者MAGE-A4相关疾病或障碍的治疗方法，包括向受试者施用所述细胞，从而对受试者进行治疗。在某些实施例中，所述MAGE-A4相关疾病或障碍为MAGE-A4相关癌症。在某些实施例中，所述MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。在某些实施例中，向受试者联合施用所述细胞以及第二治疗剂。
通过以下详细说明和附图对本发明进行了进一步的说明。
附图说明
图1描述了FACS分析，其中显示了TRAC靶向MAGE-A4 TCR在原代人T细胞中的表达，使用pMHC四聚物进行定量，并在活化后第14天进行分析。这些TCR的MAGE-A4靶点为MAGE-A4(286-294)肽(KVLEHVVRV，SEQ ID NO:609；“KVLE”)或MAGE-A4(230-239)肽(GVYDGREHTV，SEQ ID NO:612；“GVY”)。通过人TRAC位点处的腺相关病毒(AAV)载体插入定点靶向，将转基因TCR序列引入原代人T细胞。使用所示肽MHC四聚物试剂(y轴)和表面抗原标志物抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。对活的单CD8+T细胞进行图表门控。
图2A和图2B描述了MAGE-A4 TCR对MAGE-A4表达A375黑色素瘤细胞(供体1，2小时检测)的细胞毒活性。在钙黄绿素AM染料释放检测中，测试表达TCR(对抗两种不同的HLA-A2限制性MAGE-A4衍生肽抗原)的原代人T细胞对HLA-A2*01MAGE-A4表达A375黑色素瘤细胞的细胞毒活性。这些TCR的MAGE-A4靶点为MAGE-A4(286-294)肽(KVLEHVVRV，SEQ ID NO:609；“KVLE”)(图2A)或MAGE-A4(230-239)肽(GVYDGREHTV，SEQ ID NO:612；“GVY”)(图2B)。将使用对抗无关抗原的TCR所转导的对照细胞用作TCR靶点特异性的对照品。
图3A和图3B描述了MAGE-A4 TCR对MAGE-A4表达A375黑色素瘤细胞(供体2，2.5小时检测)的细胞毒活性。这些TCR的MAGE-A4靶点为MAGE-A4(286-294)肽(KVLEHVVRV，SEQ IDNO:609；“KVLE”)(图3A)或MAGE-A4(230-239)肽(GVYDGREHTV，SEQ ID NO:612；“GVY”)(图3B)。在钙黄绿素AM染料释放检测中，测试表达TCR(对抗两种不同的HLA-A2限制性MAGE-A4衍生肽抗原)的原代人T细胞对HLA-A2*01MAGE-A4表达A375黑色素瘤细胞的细胞毒活性。将未转导(UTD)T细胞用作TCR靶点特异性的对照品。
图4描述了TCR信号传导(通过激活AP1-RE-萤光素酶报告基因测量)。
图5描述了平均干扰素γ信号+/-n＝3个供体均值(SEM)的标准误差，并显示本发明所述的MAGE-A4(230-239)特异性TCR对负载MAGE-A4(230-239)肽的T2细胞具有特异性活性。
图6描述了平均干扰素γ信号+/-n＝3个供体均值(SEM)的标准误差，并显示本发明所述的MAGE-A4(230-239)特异性TCR对表达HLA-A2和MAGE-A4的肿瘤细胞具有特异性活性。
图7描述了平均干扰素γ信号+/-n＝3个供体均值(SEM)的标准误差，并显示本发明所述的MAGE-A4(230-239)特异性TCR对表达HLA-A2和MAGE-A4的肿瘤细胞具有特异性活性。
图8描述了平均干扰素γ信号+/-n＝3个供体均值(SEM)的标准误差，并显示本发明所述的MAGE-A4(230-239)特异性TCR对HLA-A2表达肿瘤细胞(甚至仅表达较低或中等内源性水平的MAGE-A4)具有特异性活性。
具体实施方式
本发明提供了在MHC(HLA-A2)的情况下为对抗MAGE-A4肽抗原而产生的T细胞受体(TCR)。在报告基因检测中，已确定的独特TCR序列可与HLA分子沟中的小肽MAGE-A4特异性结合，并活化T细胞。此外，本发明所述的TCR不会与其他“类似”肽发生交叉反应。
I.定义
为了更容易理解本发明，首先对某些术语进行了定义。此外，应注意，当列举参数值或参数值范围时，介于所列举数值之间的数值和范围也是本发明的一部分。
在以下说明中，出于解释的目的，列举了具体的数量、材料和配置，以便对本发明进行透彻理解。但是，对于本领域的普通技术人员，显然，在没有这些具体细节的情况下，也可实施本发明。在某些情况下，可省略或简化众所周知的特征，以免使本发明模糊不清。此外，在本说明书中，对“一个实施例(one embodiment)”或“一个实施例(an embodiment)”等短语的引用意味着与实施例有关的所述特定特征、结构或特性至少包括在本发明的一个实施例中。说明书各处所出现的“在一个实施例中”等短语不一定全部指代同一实施例。
在本文中，冠词“一个(a)”和“一个(an)”是指冠词的一个或不止一个(即至少一个)语法对象。例如，“一个元素”是指一个元素或不止一个元素。
在本文中，术语“包括(comprising)”或“包括(comprises)”是指对本发明至关重要的合成物、方法及其各自的组成部分，也可包含未指定的重要或不重要元素。
术语“由……组成(consisting of)”是指本文所述的合成物、方法及其各自的组成部分，不包含实施例说明中未列举的任何元素。
在本文中，术语“T细胞受体”(TCR)是指免疫球蛋白超家族成员，包含一个可变结合结构域、一个恒定结构域、一个跨膜区和一个短胞质尾区；参见Janeway等人，《免疫生物学：健康与疾病中的免疫系统》，第3版，当代生物学出版社，第4页第33行，1997年)，能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽。可在细胞表面发现TCR，其通常由一个包含α链和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或γ链和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体组成。与免疫球蛋白一样，TCR链(例如，α链、β链)的胞外部分包含两个免疫球蛋白区、一个可变区(例如，TCR可变α区或Vα和TCR可变β区或Vβ；在N端，根据Kabat编号，通常为氨基酸1-116)以及一个与细胞膜相邻的恒定区(例如，TCR恒定结构域α或Cα，根据Kabat，通常为氨基酸117-259；TCR恒定结构域β或Cβ，根据Kabat，通常为氨基酸117-295)。此外，与免疫球蛋白一样，所述可变结构域包含互补决定区(CDR)，由构架区(FR)分离。在某些实施例中，在T细胞(或T淋巴细胞)表面发现TCR，其与CD3复合物结合。本发明所述的TCR可源自各种动物物种，如人类、小鼠、大鼠、家兔或其他哺乳动物。在优选实施例中，本发明所述TCR的来源为小鼠，此小鼠经基因工程化改造，可产生包含人α链和β链的TCR(参见第WO 2016/164492号PCT出版物，所述出版物的全部内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分)。
在本文中，术语“可变区”(α链可变区(Vα)、β链可变区(Vβ))表示直接参与TCR和抗原结合的每个α链和β链。
α链和β链“恒定区”不直接参与TCR和抗原结合，但具有各种效应子功能。
在本文中，术语“抗原”是指使免疫系统对其产生抗体或特异性细胞介导免疫应答的任何物质。疾病相关抗原是与使免疫系统对其产生抗体或特异性细胞介导免疫应答的任何疾病有关的任何物质。
术语“MAGE-A4”、“MAGEA4”或“黑色素瘤相关抗原A4”是指在多种癌症类型中重复表达的一种众所周知的癌-睾丸抗原(CTA)。
在GenBank中，提供了全长MAGE-A4的核苷酸序列和氨基酸序列，登录号为NM_001011548(DNA序列：SEQ ID NO:870；RNA序列：SEQ ID NO:610；氨基酸序列：SEQ ID NO:611)。术语“MAGE-A4”包括重组MAGE-A4或其片段。此术语也包括偶联到组氨酸标签、小鼠或人Fc或信号序列(如ROR1)的MAGE-A4或其片段。在某些实施例中，在HLA-A2的情况下，此术语包括连接至HLA-A2或HLA-A2所呈递的MAGE-A4或其片段。在本文中，全长MAGE-A4序列内的某些MAGE-A4氨基酸残基编号与SEQ ID NO:611有关。
术语“HLA”是指人类白细胞抗原(HLA)系统或复合物，是一种对人类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白进行编码的基因复合物。这些细胞表面蛋白负责调控人体免疫系统。对应于MHC I类的HLA(A、B和C)从细胞内呈递肽。
术语“HLA-A”是指一组由HLA-A位点进行编码的人类白细胞抗原(HLA)。HLA-A是人MHC I类细胞表面受体的三种主要类型之一。所述受体是一种异二聚体，由一条α重链和小β链组成。所述α链由变异HLA-A基因编码，所述β链(β2微球蛋白)是一种恒定β2微球蛋白分子。
术语“HLA-A2”(也称为“HLA-A2*01”)是HLA-A位点处的一个特定I类主要组织相容性复合物(MHC)等位基因组；所述α链由HLA-A*02基因进行编码，所述β链由β2微球蛋白或B2M位点进行编码。
术语“特异性结合”或“与……特异性结合”等是指TCR与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。特异性结合的特征在于，平衡解离常数至少约为1×10-8M或更小(例如，KD越小，结合越紧密)。确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域众所周知，包括平衡透析和表面等离子体共振等。在本文中，本发明所述的TCR与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原A4(MAGE-A4)肽，例如，包含MAGE-A4(例如，全长MAGE-A4序列SEQ ID NO:611)的氨基酸残基230-239或286-294的肽。
术语“脱靶肽”是指1个、2个、3个、4个、5个或更多氨基酸与靶肽(例如，MAGE-A4230-239肽或MAGE-A4 286-294肽)不同的一种肽。在某些实施例中，此术语包括少于或等于3个氨基酸与靶肽不同的一种肽。例如，对于9-mer肽，如果1个、2个或3个氨基酸与靶肽不同，则将其视为“脱靶”肽。在某些实施例中，用“相似度”(DoS)表示氨基酸一致性。如果9-mer肽内的6个或更多氨基酸相同，则DoS为6。在某些实施例中，将DoS≤6的肽视为“脱靶”肽。术语“脱靶”肽也指在序列同源性方面与靶肽相似、预计与HLA-A2结合并包含在蛋白(在必要的正常组织中表达)中的一种肽。
术语“分离”是指通过人工从天然状态改变而来的合成物、化合物、物质或分子。例如，如果天然合成物或物质已被改变和/或离开其原始环境，则认为其已分离。例如，天然存在于活体动物中的多核苷酸或多肽未分离，但是，从其天然状态的共存材料中分离出的相同多核苷酸或多肽则已分离(正如本文所使用的术语一样)。更特别地是，分离TCR是指已从细胞中取出的TCR(例如已纯化的TCR)。TCR也可由分离细胞(例如，已从动物中分离的细胞或细胞培养物中的细胞)表达。在这种情况下，所述分离细胞可在其表面表达TCR(即，所述细胞可“呈递”TCR)。
在本文中，术语“重组”是指通过本领域已知的各种技术和方法产生、表达、分离或获得本发明所述的TCR，如重组DNA技术，包括DNA剪接和转基因表达。此术语是指在非人类哺乳动物(包括转基因非人类哺乳动物，例如转基因小鼠)或细胞(例如，CHO细胞)表达系统中表达或从重组组合人抗体库中分离的TCR。
在本文中，术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换使用，是指任何长度的聚合型核苷酸。多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。核苷酸可采用任何三维结构，可执行任何已知或未知功能。术语“多核苷酸”包括单链、双链和三螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、反义分子、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、适配子、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。核酸分子也可包括修饰核酸分子(例如，包含修饰碱基、糖和/或核苷酸间连接物)。
术语“多肽”是指任何聚合物，本质上优选由20种天然氨基酸(无论尺寸如何)中的任何一种组成。虽然术语“蛋白”通常用于指相对较大的蛋白，但是“肽”通常用于指较小的多肽，在本领域中，经常重叠使用这些术语。除非另有说明，否则术语“多肽”通常是指蛋白、多肽和肽。根据标准分子大小筛分技术(如离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，适用于本发明的肽通常在约0.1至100KD之间或更大(达1000KD)，优选在约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30和50KD之间。
术语“载体”是一种核酸分子，能够在宿主细胞中自主复制，并且可接受外源性DNA。载体携带其自己的复制起点、一个或多个限制性核酸内切酶的独特识别位点(可用于插入外源性DNA)，通常携带可选标志物(如针对抗生素抗性进行编码的基因)，还经常携带表达插入DNA的识别序列(例如启动子)。常用载体包括质粒载体和噬菌体载体。
在某些实施例中，本发明所述的TCR可与配体、可检测部分或治疗部分等一个部分偶联(“免疫偶联物”)，如细胞毒素、抗癌药物或用于治疗MAGE-A4相关疾病或障碍(如MAGE-A4相关癌症)等疾病或状况的任何其他治疗部分。
在本文中，术语“表面等离子体共振”是指一种光学现象，使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB(瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡塔韦))检测生物传感器矩阵内的蛋白浓度变化，即可分析实时生物分子相互作用。
术语“KD”也称为KD或Kd，是指特定生物分子及其结合伴侣的平衡解离常数。KD测量特别适用于评估蛋白间相互作用，例如，就像在抗原结合蛋白-抗原相互作用中一样。KD值越小，抗原结合蛋白与抗原(例如，靶点)之间的结合相互作用或亲和力越大(或例如，越强)。KD值越大，抗原结合蛋白与抗原之间的结合相互作用或亲和力越弱。
当指核酸或其片段时，术语“实质一致性”或“实质相同”表示，当与另一个核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失最佳比对时，核苷酸序列一致性为至少约90％，更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基(根据任何众所周知的序列一致性算法测量，如下所述)。在某些情况下，与参考核酸分子具有实质一致性的核酸分子可对氨基酸序列与参考核酸分子所编码的多肽相同或实质相似的多肽进行编码。
可使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch(1970年)，《分子生物学杂志》，48:443-453)(全局比对)或Smith Waterman算法(Smith和Waterman(1981年)，《分子生物学杂志》，147:195-197)(局部比对)等算法计算序列一致性。Dufresne等人于2002年在《自然生物技术》(第20卷，第1269-71页)中对另一种优选算法进行了说明，可在软件GenePAST(GQ生命科学公司(马萨诸塞州波士顿))中使用此算法。
与应用于多肽时一样，术语“实质一致性”或“实质相同”是指，当使用默认空位权重，通过程序GAP或BESTFIT实现最佳比对时，两个肽序列的序列一致性为至少90％，甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％。优选地，不同残基位置的保守氨基酸取代不同。“保守氨基酸取代”是一种过程，即一种氨基酸残基被另一种包含侧链(R基团)(电荷或疏水性等化学特性相似)的氨基酸残基取代。一般而言，保守氨基酸取代实质上不会改变蛋白的功能特性。如果两个或多个氨基酸序列因保守取代而各不相同，则可上调相似百分比或相似度，以校正取代的保守性。本领域的技术人员均熟知进行这种调整的方式。参见Pearson(1994年)，《分子生物学方法》，24:307-331，所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分。包含侧链(化学特性相似)的氨基酸基团示例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。优选保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是PAM250对数似然矩阵中呈正值的任何变化(参见Gonnet等人(1992年)，《科学》，256:1443 45，所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分)。或者，“中度保守”替换是PAM250对数似然矩阵中呈非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性。蛋白分析软件使用分配给各种取代、缺失及其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含GAP和BESTFIT等程序，可结合默认参数用于确定密切相关多肽(如来自不同物种生物体的同源多肽)之间或野生型蛋白和其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见GCG版本6.1。也可使用FASTA(GCG版本6.1中的一个程序)以及默认或建议参数进行多肽序列比较。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000年)，见上文)。也可使用Smith-Waterman同源性搜索算法进行序列比较，此算法利用仿射空位搜索，空位开放罚分为12，空位扩展罚分为2，BLOSUM矩阵为62。将本发明所述的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选算法为计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN(使用默认参数)。参见Altschul等人(1990年)，《分子生物学杂志》，215:403-410和(1997年)《核酸研究》，25:3389-3402，所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分。
“源自患者的TCR”是一种通过分离MAGE-A4反应性TCR(从介导MAGE-A4相关癌症受试者肿瘤体内消退的T淋巴细胞中分离)的α链和β链而产生的TCR。
“亲和力成熟的TCR”是一种通过体外诱变和选择而产生的TCR。例如，可进行非靶向或靶向(例如，寡核苷酸定点)诱变，使TCR序列发生变异，然后，通过噬菌体呈递，可对后续TCR进行靶点亲和力筛选。
术语“激活T细胞应答(信噪比强于或等于源自患者的MAGE-A4特异性TCR)”或“激活T细胞应答(信噪比强于或等于亲和力成熟的MAGE-A4特异性TCR)”是指生理活性(即，T细胞信号传导)增加约2倍或更多倍、加强约2倍、增强约2倍或增长约2倍(通过发光生物检测测量)。对较大T细胞应答或较强T细胞应答或激活信号的引用可互换使用。本领域的技术人员熟知各种T细胞应答或T细胞活化测量及检测。
短语“治疗有效量”是指在施用后产生预期效果的剂量。确切剂量将取决于治疗目的，可由本领域的技术人员使用已知技术来确定(参见Lloyd(1999年)，《药物配制的艺术、科学和技术》)。术语“有效量”旨在包括药物有效量或治疗有效量等情况。例如，在某些实施例中，所述有效量能够在筛选检测中实现有利状态、有利结果、功能活性或改善临床状况。
在本文中，术语“受试者”是指需要改善、预防和/或治疗MAGE-A4相关疾病或障碍(如MAGE-A4相关癌症(例如，MAGE-A4阳性癌症))的动物，优选哺乳动物。此术语包括患有或有可能患有MAGE-A4相关疾病或障碍(如MAGE-A4相关癌症)的人类受试者。
在本文中，“抗癌药物”是指用于治疗、改善或抑制癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒素以及抗代谢物、烷化剂、蒽环类、抗生素、抗有丝分裂剂、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、环磷酰胺、米托坦(O,P'-(DDD))、生物制剂(例如，抗体和干扰素)和放射剂等药剂。在本文中，“细胞毒素或细胞毒性剂”也指化学治疗剂，还指对细胞有害的任何药剂。示例包括
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(紫杉醇)、替莫唑胺、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、顺铂、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。
术语“预防”和“预防性治疗”等是指降低受试者(尚未出现但有可能或容易出现某种障碍或状况)出现某种障碍或状况的可能性。预防并不意味着可永远防止受试者患上特殊疾病或障碍。可能需要多次给药，才能达到预防目的。预防可包括预防所有疾病症状均已消除的受试者疾病复发，或预防复发缓解型疾病复发。
II.MAGE-A4 T细胞(TCR)以及包含MAGE-A4 TCR的合成物
T细胞是一种细胞亚群，与其他免疫细胞类型(多形核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、B细胞、NK细胞)共同构成免疫系统的细胞组分。在生理条件下，T细胞具有免疫监测和外源性抗原消除功能。但是，在病理条件下，有强有力的证据表明，T细胞在疾病诱因和传播中发挥主要作用。在这些障碍中，自身免疫性疾病诱因的一个基本过程是中枢或外周T细胞免疫耐受性受到破坏。
T细胞与抗原呈递细胞(与主要组织相容性复合物(MHC；在小鼠中)或人类白细胞抗原(HLA；在人类中)复合物有关)表面小抗原决定簇上的表位结合。T细胞通过T细胞表面的T细胞受体(TCR)复合物与这些表位结合。T细胞受体采用异二聚体结构，由两种链组成：α链和β链或γ链和δ链。α链由α位点(也包含整个δ位点)内的核酸序列进行编码(在人类或小鼠染色体14上)，β链由β位点内的核酸序列进行编码(在小鼠染色体6或人类染色体7上)。大多数T细胞包含αβTCR；而少数T细胞则包含γδTCR。
T细胞受体α和β多肽(同样，γ和δ多肽)通过二硫键相互连接。组成TCR的两种多肽均包含一个胞外结构域(包含恒定区和可变区)、一个跨膜结构域和一个短胞质尾区(所述跨膜结构域和短胞质尾区也是恒定区的一部分)。TCR的可变区决定了其抗原特异性，与免疫球蛋白类似，包含三个互补决定区(CDR)。TCR在体内的大多数T细胞上表达，已知参与MHC限制性抗原识别。所述TCRα链包含一个共价连接的Vα和Cα区，而所述β链包含一个共价连接至Cβ区的Vβ区。所述Vα区和Vβ区形成一个囊袋或裂缝，在主要组织相容性复合物(MHC)(或HLA；在人类中)的情况下可结合抗原。TCR为检测分子，具有良好的特异性，与抗体一样，也具有极大的多样性。
本文公开了TCR分子的一般结构及其产生和使用方法，包括与肽(主要组织相容性复合物)结合。参见PCT/US98/04274；PCT/US98/20263；WO99/60120。
可对啮齿动物(如小鼠或大鼠)等非人类动物进行基因工程化改造，使其表达人类或人源化T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体包含一个由至少一个人类TCR可变区基因片段进行编码的可变结构域(如第WO 2016/164492号PCT出版物所述，所述出版物的全部内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分)。例如，可采用
Figure BDA0003488232650000231
小鼠技术(再生元公司)(一种基因修饰小鼠，可产生对抗肿瘤和/或病毒抗原的全人治疗性TCR)，产生本发明所述的TCR。通过标准诱变技术，并结合本文所述的检测，本领域的技术人员可获得变异TCR序列，并对其进行特殊结合亲和力和/或特异性测试。在本领域中，已知的适用诱变技术包括但不限于从头基因合成、寡核苷酸定点诱变、区域特异性诱变、连接物扫描诱变和PCR定点诱变(参见Sambrook等人(1989年)以及Ausubel等人(1999年))。
简而言之，在一个实施例中，MAGE-A4 230-239肽或MAGE-A4 286-294肽的TCR产生方法可包括使用MAGE-A4 230-239肽或MAGE-A4 286-294肽使啮齿动物(如小鼠或大鼠)等非人类动物(如在其基因组中包含一个未重排人类TCR可变基因位点的基因工程化非人类动物)免疫；让动物对所述肽产生免疫应答；从动物中分离对所述肽有反应的T细胞；确定人类TCR可变区(由T细胞表达)的核酸序列；将人类TCR可变区克隆到核苷酸构建体(包含人类TCR恒定区的一个核酸序列)中，使人类TCR可变区可连接至人类TCR恒定区；以及从构建体中表达分别对MAGE-A4 230-239肽或MAGE-A4 286-294肽具有特异性的人T细胞受体。在一个实施例中，使用本领域的技术人员所熟知的标准技术来执行各步骤：分离T细胞、确定人类TCR可变区(由T细胞表达)的核酸序列、将人类TCR可变区克隆到核苷酸构建体(包含人类TCR恒定区的一个核酸序列)中以及表达人T细胞受体。
在一个实施例中，在细胞中表达对T细胞受体(对目标抗原具有特异性)进行编码的核苷酸序列。在一个实施例中，表达TCR的细胞选自：CHO、COS、293、HeLa、PERC.6TM细胞等。
在获得变异TCR编码序列时，本领域的普通技术人员将认识到，在不丧失或降低生物活性的情况下，可通过某些氨基酸取代、添加、缺失和翻译后修饰，对TCR衍生蛋白进行修饰。特别是，众所周知，保守氨基酸取代(即，用一种氨基酸取代另一种大小、电荷、极性和构象相似的氨基酸)不太可能显著改变蛋白功能。可将20种标准氨基酸(蛋白成分)大致分为如下四种保守氨基酸基团：非极性(疏水)基团包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸；极性(不带电，中性)基团包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；正电荷(碱性)基团包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸；以及负电荷(酸性)基团包括天冬氨酸和谷氨酸。用蛋白中的一种氨基酸取代相同基团内的另一种氨基酸，不太可能对蛋白的生物活性产生不利影响。
在某些实施例中，本发明所述的TCR可包含一个CDR序列(例如，一个CDR3序列，如一个VαCDR3或一个VβCDR3)，与表6的CDR序列(例如，一个CDR3序列，如一个VαCDR3或一个VβCDR3)相比，包含1个或更多取代。例如，本发明所述的TCR可包含一个CDR序列，与表6的CDR序列相比，包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多取代。一般而言，本发明所述的TCR通过与HLA-A2呈递MAGE-A4 230-239肽或HLA-A2呈递MAGE-A4 286-294肽结合来发挥功能。在本文中，HLA呈递肽(如HLA-A2呈递肽)是指与人类白细胞抗原(HLA)蛋白(例如，在细胞表面表达的一种HLA蛋白)结合的一种肽。因此，与HLA呈递肽结合的TCR会与HLA所结合的肽结合，也可选与HLA自身结合。与HLA的相互作用可提供与特定HLA呈递肽的结合特异性。在某些实施例中，所述TCR与分离HLA呈递肽结合。在某些实施例中，所述TCR与细胞表面的HLA呈递肽结合。
本发明包括MAGE-A4 TCR，在HLA-A2的情况下，其以高特异性与MAGE-A4 230-239肽或MAGE-A4 286-294肽结合。在某些实施例中，在没有HLA-A2的情况下，MAGE-A4 TCR不会与MAGE-A4 230-239肽或MAGE-A4 286-294肽结合，或此类结合最少。此外，在某些实施例中，在HLA-A2的情况下，MAGE-A4 TCR不会与脱靶肽结合，或此类结合最少。在本文中，脱靶肽是指1个、2个、3个、4个、5个或更多氨基酸与靶肽不同的一种肽。在某些实施例中，可通过以下方式确定结合特异性：a)测量靶上结合情况(例如，与HLA-A2呈递MAGE-A4(230-239)肽或HLA-A2呈递MAGE-A4(230-239)肽结合)；b)测量脱靶结合情况；以及c)通过计算比值，量化两者之间的差异。可除以在a)和b)中获得的数值，计算此比值。可通过测量与肽/HLA四聚物试剂(例如，MAGE-A4/HLA四聚物试剂或MAGE-A8/HLA四聚物试剂)的结合百分比(％)或通过本领域已知的其他技术进行靶上和脱靶结合测量。在某些实施例中，本发明所述TCR的靶上结合值/脱靶结合值(例如，通过除以在上述a)和b)中获得的数值而获得的一个数值)可大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于11、大于12、大于13、大于14、大于15、大于16、大于17、大于18、大于19、大于20、大于21、大于22、大于23、大于24、大于25、大于26、大于27、大于28、大于29、大于30、大于35、大于40、大于45、大于50、大于55、大于60、大于65、大于70、大于75、大于80、大于85、大于90、大于95、大于100、大于110、大于120、大于130、大于140、大于150、大于160、大于170、大于180、大于190、大于200、大于225、大于250、大于275、大于300、大于325、大于350、大于375、大于400、大于425、大于450、大于475、大于500、大于550、大于600、大于650、大于700、大于750、大于800、大于850、大于900、大于950、大于1000、大于1100、大于1200、大于1300、大于1400、大于1500、大于1600、大于1700、大于1800、大于1900或大于2000。在某些实施例中，靶上结合值/脱靶结合值(例如，通过除以在上述a)和b)中获得的数值而获得的一个数值)可以为约5至约20、约10至约30、约20至约80、约30至约70、约40至约60、约50至约250、约100至约200、约100至约1000、约300至约700、约500至约1500、约800至约1200、约900至约1100、约800至约1500、约1000至约1400或约1100至约1300。
在一个实施例中，本发明提供了一种与HLA-A2呈递人MAGE-A4(286-294)肽的构象表位或HLA-A2呈递人MAGE-A4(230-239)肽的构象表位特异性结合的重组抗原结合蛋白(即，分离抗原结合蛋白)，其中，所述抗原结合蛋白具有从包括以下几项的一组中选择的一种特性：(a)结合单体HLA-A2：MAGE-A4(286-294)肽或单体MAGE-A4(230-239)肽，结合解离平衡常数(KD)小于约20nM(在25℃下，在表面等离子体共振检测中测量)；(b)结合单体HLA-A2：MAGE-A4(286-294)肽或单体MAGE-A4(230-239)肽，结合解离平衡常数(KD)小于约25nM(在25℃下，在表面等离子体共振检测中测量)；(c)结合HLA-A2：MAGE-A4(286-294)肽表达细胞或MAGE-A4(230-239)肽表达细胞，EC50小于约6nM，并且不与表达预计脱靶肽的细胞结合(通过发光检测确定)；(d)结合HLA-A2：MAGE-A4(286-294)肽表达细胞或MAGE-A4(230-239)肽表达细胞，EC50小于约1nM，并且实质上不与表达预计脱靶肽的细胞结合(通过发光检测确定)；(e)结合HLA-A2：MAGE-A4(286-294)肽表达细胞或MAGE-A4(230-239)肽表达细胞，EC50小于约30nM(通过流式细胞术检测确定)；(f)结合HLA-A2：MAGE-A4(286-294)肽表达细胞或MAGE-A4(230-239)肽表达细胞，EC50小于约75nM(通过流式细胞术检测确定)；(g)以剂量依赖的方式介导癌细胞(例如，黑色素瘤细胞)杀伤(通过钙黄绿素AM染料释放检测确定)；以及(h)构象表位包含一个或多个SEQ ID NO:611或SEQ ID NO:612氨基酸。
在某些实施例中，本发明所述的MAGE-A4 TCR对MAGE-A4(230-239)或MAGE-A4(286-294)具有特异性活性或亲和力(通过体外检测测量)。例如，表达HLA的细胞(如T2细胞)可负载MAGE-A4(230-239)或MAGE-A4(286-294)多肽或脱靶多肽，从而诱导细胞呈递与HLA结合的多肽。除将脱靶多肽用作对照品之外，还可使用脱靶HLA(除目标TCR所识别的HLA之外的HLA)。例如，可使用脱靶HLA来呈递MAGE-A4肽，以测试与HLA-A2呈递MAGE-A4肽的结合特异性。此外，对照品可以是既不表达MAGE-A4也不表达靶HLA(例如，HLA-A2)的细胞系。可将细胞与表达目标TCR的T细胞群共培养，将活性作为细胞所产细胞因子(如干扰素γ)量的函数进行测量。在某些实施例中，所述检测可包括按1:1的效应细胞:靶细胞比率将TCR表达T细胞群与10-10M肽负载T2细胞进行体外共培养(1×105个效应细胞/96孔)，在共培养后24小时进行干扰素γ测量(例如，使用Meso Scale Discovery
Figure BDA0003488232650000261
扇区成像仪)。在某些实施例中，所述检测可包括按5:1的效应细胞:靶细胞比率将TCR表达T细胞群与效应细胞进行体外共培养(2.5×105个效应细胞:5×104个靶细胞)，在共培养后24小时进行干扰素γ测量(例如，使用Meso Scale Discovery
Figure BDA0003488232650000262
扇区成像仪)。在某些实施例中，替换内源性位点(例如，内源性TRAC位点(KO/KI))以及使用CRISPR、TALEN、锌指或其他靶向破坏系统破坏内源性位点(例如，TRBC位点(KO))，在原代T细胞(例如，细胞毒性T细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞或其任何组合)中表达TCR。体外检测(包括此类细胞)可包括在钙黄绿素AM染料释放检测中对HLA-A2*01MAGE-A4表达A375黑色素瘤细胞的细胞毒活性。
检测到的细胞因子量增加可作为一种活性指标。目标TCR对其靶肽的活性或特异性(与对照(脱靶)多肽相比)或目标TCR对其靶上HLA结合靶肽的活性或特异性(与脱靶HLA结合靶肽相比)可以为2倍或更高、3倍或更高、4倍或更高、5倍或更高、6倍或更高、7倍或更高、8倍或更高、9倍或更高、10倍或更高、15倍或更高、20倍或更高、30倍或更高、40倍或更高、50倍或更高、100倍或更高、200倍或更高、300倍或更高、400倍或更高、500倍或更高、600倍或更高、700倍或更高、800倍或更高、900倍或更高、1000倍或更高、1500倍或更高、2000倍或更高、2500倍或更高、3000倍或更高、4000倍或更高、5000倍或更高、10000倍或更高、20000倍或更高、30000倍或更高、40000倍或更高、50000倍或更高、60000倍或更高、70000倍或更高、80000倍或更高、90000倍或更高或100000倍或更高。
在某些实施例中，当向有需要的受试者预防性施用时，本发明所述的MAGE-A4 TCR有助于抑制肿瘤生长或延缓癌症进展，可延长受试者的生存期。例如，施用本发明所述的MAGE-A4TCR可使原发性肿瘤缩小，并预防继发性肿瘤转移或发展。在某些实施例中，当向有需要的受试者治疗性施用时，本发明所述的MAGE-A4 TCR有助于抑制肿瘤生长，可延长受试者的生存期。例如，向受试者施用治疗有效量的本发明所述MAGE-A4 TCR，可使受试者的已确诊肿瘤缩小并消失。
在一个实施例中，本发明提供了一种与HLA-A2呈递MAGE-A4 286-294肽特异性结合的TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)，其中，所述抗原结合蛋白具有以下一种或多种特性：(i)包含一个α链可变结构域，所述α链可变结构域包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中，所述CDR3区包含公式I的氨基酸序列：N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15(公式I)，其中，N1为Ala、Ile或Gly；N2为Val，可能存在，也可能不存在；N3为Tyr、Gly、Leu、Val、Glu、Met、Ala或Phe；N4为Arg、Glu、Ser、Asn、Gln、Lys、Asp、Gly或Met；N5为Ser、Arg、Glu、Leu、Ala、Asp、Pro、Met、Gly或Lys，可能存在，也可能不存在；N6为Ala、Asp、Gly、Ser、Val、Pro、Leu、Tyr或Thr，可能存在，也可能不存在；N7为Thr、Pro、Ser、Glu、Asp、Trp、Arg、Asn、Ile、Gln或Leu，可能存在，也可能不存在；N8为Gly、Trp、Thr、Lys、Tyr或Ala；N9为Asn、Gly、Lys、Ile、Ser或Arg；N10为Gln、Lys、Gly、Thr、Leu、Asp或Ser，可能存在，也可能不存在；N11为Phe、Asn、Thr、Tyr、Ala、Leu、Met或Glu，可能存在，也可能不存在；N12为Lys、Phe、Tyr或Asp，可能存在，也可能不存在；N13为Lys或Gly，可能存在，也可能不存在；N14为Thr、Leu或Tyr，可能存在，也可能不存在；以及N15为Tyr、Gln、Ile、Thr、Val或Arg；(ii)包含一个β链可变结构域，所述β链可变结构域包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中，所述CDR3区包含公式II的氨基酸序列：N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15-N16-N17-N18(公式II)，其中，N1为Ala或Ser；N2为Ala、Ser或Thr；N3为Ser、Gly或Trp；N4为Leu、Tyr、Trp、Asp、Phe、Gly、Pro或His；N5为Gly或Asp，可能存在，也可能不存在；N6为Phe或Arg，可能存在，也可能不存在；N7为Trp、Phe、Asp、Pro、Tyr、Gly、Thr、Ser或Val，可能存在，也可能不存在；N8为Pro、Arg、Asp、Tyr、Gln、Asn或Gly，可能存在，也可能不存在；N9为Asp，可能存在，也可能不存在；N10为Arg，可能存在，也可能不存在；N11为Gly、Ala或Thr，可能存在，也可能不存在；N12为Ser、Trp、Thr、Gly、Val、Leu、Arg、Met、Tyr或Gln；N13为Gly，可能存在，也可能不存在；N14为Asn、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或His，可能存在，也可能不存在；N15为Thr、Ser、Glu、Asn、Tyr、Gln、Asp或Pro，可能存在，也可能不存在；N16为Glu、Pro、Lys、Thr、Ala、Gly或Gln，可能存在，也可能不存在；N17为Ala、Leu、Ile、Tyr或Gln，可能存在，也可能不存在；以及N18为Phe、His、Tyr或Thr；以及(iii)包含α链可变结构域的一个CDR1(包含表2中所列的任一CDR1氨基酸序列，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)以及α链可变结构域的一个CDR2(独立包含表2中所列的任一CDR2氨基酸序列，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)；(iv)包含β链可变结构域的一个CDR1(包含表2中所列的任一CDR1氨基酸序列，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)以及β链可变结构域的一个CDR2(独立包含表2中所列的任一CDR2氨基酸序列，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)；(v)包含一个α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一α链可变结构域序列内，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一β链可变结构域序列内，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)；(vi)包含一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的氨基酸一致性；(vii)包含一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的氨基酸一致性；(viii)包含(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的氨基酸一致性；(ix)包含(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577和593，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482、498 514、530、546、562、578和594，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579和595，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、393、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585和601，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474、490、506 522、538、554、570、586和602，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；以及(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、395、411、427、443、459、475、491、507 523、539、555、571、587和603，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(x)包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159、167/175、183/191、199/207、215/223、231/239、247/255、263/271、279/287、295/303、311/319、327/335、343/351、359/367、375/383、391/399、407/415、423/431、439/447、455/463、471/479、487/495、503/511、519/527、535/543、551/559、567/575、583/591、599/607，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(xi)包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:87/31、23/95、231/607、231/223、231/591、231/255、231/271、231/79、231/47、231/399、599/239、599/223、599/591、599/255、599/271、599/79、599/47、599/399、215/239、215/607、215/591、215/255、215/271、215/79、215/47、215/399、583/239、583/607、583/223、583/255、583/271、583/79、583/47、583/399、247/239、247/607、247/223、247/591、247/271、247/79、247/47、247/399、263/239、263/607、263/223、263/591、263/255、263/79、263/47、263/399、71/239、71/607、71/223、71/591、71/255、71/271、71/47、71/399、39/239、39/607、39/223、39/591、39/255、39/271、39/79、39/399、391/239、391/607、391/223、391/591、391/255、391/271、391/79、391/47、439/127、439/319、439/287、439/15、439/111、439/383、439/191、439/511、439/527、439/559、439/207、119/447、119/319、119/287、119/15、119/111、119/383、119/191、119/511、119/527、119/559、119/207、311/447、311/127、311/287、311/15、311/111、311/383、311/191、311/511、311/527、311/559、311/207、279/447、279/127、279/319、279/15、279/111、279/383、279/191、279/511、279/527、279/559、279/207、7/447、7/127、7/319、7/287、7/111、7/383、7/191、7/511、7/527、7/559、7/207、103/447、103/127、103/319、103/287、103/15、103/383、103/191、103/511、103/527、103/559、103/207、375/447、375/127、375/319、375/287、375/15、375/111、375/191、375/511、375/527、375/559、375/207、183/447、183/127、183/319、183/287、183/15、183/111、183/383、183/511、183/527、183/559、183/207、503/447、503/127、503/319、503/287、503/15、503/111、503/383、503/191、503/527、503/559、503/207、519/447、519/127、519/319、519/287、519/15、519/111、519/383、519/191、519/511、510/559、519/207、551/447、551/127、551/319、551/287、551/15、551/111、551/383、551/191、551/511、551/527、551/207、199/447、199/127、199/319、199/287、199/15、199/111、199/383、199/191、199/511、199/527和199/559，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；和/或(xii)不与表达预测脱靶肽的细胞结合。
在一个实施例中，本发明提供了一种与HLA-A2呈递MAGE-A4 230-239肽特异性结合的TCR(例如，分离TCR或在分离细胞上表达的TCR)，其中，所述抗原结合蛋白具有以下一种或多种特性：(i)包含α链可变结构域的一个CDR1(包含表6中所列的任一CDR1氨基酸序列，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)以及α链可变结构域的一个CDR2(独立包含表6中所列的任一CDR2氨基酸序列，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)；(iv)包含β链可变结构域的一个CDR1(包含表6中所列的任一CDR1氨基酸序列，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)以及β链可变结构域的一个CDR2(独立包含表6中所列的任一CDR2氨基酸序列，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)；(v)包含一个α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一α链可变结构域序列内，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一β链可变结构域序列内，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)；(vi)包含一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的氨基酸一致性；(vii)包含一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的氨基酸一致性；(vii i)包含(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的氨基酸一致性；(ix)包含(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838和854，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839和855，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840和856，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846和862，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:623、639、655、671、687、703、719、735、751、767、783、799、815、831、847和863，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；以及(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ ID NO:624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848和864，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(x)包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、636/644、652/660、668/676、684/692、700/708、716/724、732/740、748/756、764/772、780/788、796/804、812/820、828/836、844/852和860/868，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；(xi)包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、620/644、620/660、620/676、620/692、620/708、620/724、620/740、620/756、620/772、620/788、620/804、620/820、620/836、620/852、620/868、636/628、636/644、636/660、636/676、636/692、636/708、636/724、636/740、636/756、636/772、636/788、636/804、636/820、636/836、636/852、636/868、652/628、652/644、652/660、652/676、652/692、652/708、652/724、652/740、652/756、652/772、652/788、652/804、652/820、652/836 652/852、652/868、668/628、668/644、668/660、668/676、668/692、668/708、668/724、668/740、668/756、668/772、668/788、668/804、668/820、668/836、668/852、668/868、684/628、684/644、684/660、684/676、684/692、684/708、684/724、684/740、684/756、684/772、684/788、684/804、684/820、684/836、684/852、684/868、700/628、700/644、700/660、700/676、700/692、700/708、700/724、700/740、700/756、700/772、700/788、700/804、700/820、700/836、700/852、700/868、716/628、716/644、716/660、716//676、716/692、716/708、716/724、716/740、716/756、716/772、716/788、716/804、716/820、716/836、716/852、716/868、732/628、732/644、732/660、732/676、732/692、732/708、732/724、732/740、732/756、732/772、732/788、732/804、732/820、732/836、732/852、732/868、748/628、748/644、748/660、748/676、748/692、748/708、748/724、748/740、748/756、748/772、748/788、748/804、748/820、748/836、748/852、748/868、764/628、764/644、764/660、764/676、764/692、764/708、764/724、764/740、764/756、764/772、764/788、764/804、764/820、764/836、764/852、764/868、780/628、780/644、780/660、780/676、780/692、780/708、780/724、780/740、780/756、780/772、780/788、780/804、780/820、780/836、780/852、780/868、796/628、796/644、796/660、796/676、796/692、796/708、796/724、796/740、796/756、796/772、796/788、796/804、796/820、796/836、796/852、796/868、812/628、812/644、812/660、812/676、812/692、812/708、812/724、812/740、812/756、812/772、812/788、812/804、812/820、812/836、812/852、812/868、828/628、828/644、828/660、828/676、828/692、828/708、828/724、828/740、828/756、828/772、828/788、828/804、828/820、828/836、828/852、828/868、844/628、844/644、844/660、844/676、844/692、844/708、844/724、844/740、844/756、844/772、844/788、844/804、844/820、844/836、844/852、844/868、860/628、860/644、860/660、860/676、860/692、860/708、860/724、860/740、860/756、860/772、860/788、860/804、860/820、860/836、860/852和860/868，或其实质相似序列的序列一致性为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；和/或(xii)不与表达预测脱靶肽的细胞结合。
本发明所述的TCR可具有一种或多种上述生物学特性或其任何组合。从本发明的回顾(包括本文的工作示例)中，本领域的普通技术人员将清楚了解本发明所述抗原结合蛋白的其他生物学特性。
在某些实施例中，将多核苷酸(对本文所述的MAGE-A4 TCR进行编码)插入载体中。在本文中，术语“载体”是指一种运载体，可将多核苷酸(对蛋白进行编码)共价插入其中，以表达蛋白和/或克隆多核苷酸。此类载体也称为“表达载体”。可采用本领域已知的适当方法将分离多核苷酸插入载体中，包括但不限于，可使用适当的限制酶水解所述载体，然后，可将其与包含匹配限制端的分离多核苷酸连接。表达载体可包含并表达编码基因产物(能够在细胞中转录)至少一个部分的异源或修饰核酸序列。在大多数情况下，随后将RNA分子翻译成蛋白。表达载体可包含各种控制序列，控制序列是指在特定宿主生物体中转录和翻译可连接编码序列所需的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可包含提供其他功能以及下文所讨论的核酸序列。表达载体可包含其他元件，例如，表达系统可包含两个复制系统，因此可维持在两个生物体中，例如，在人类细胞(用于表达)中以及在原核宿主(用于克隆和扩增)中。
表达载体可包含必要的5’上游和3’下游调控元件，如启动子序列(如CMV、PGK和EF1α启动子、核糖体识别和结合TATA盒)以及3'UTR AAUAAA转录终止序列，以在其各自的宿主细胞中实现高效基因转录和翻译。其他适当的启动子包括猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、HIV LTR启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EBV立即早期启动子和劳斯氏肉瘤病毒启动子的组成型启动子。也可使用人类基因启动子，包括但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。在某些实施例中，诱导型启动子也是嵌合抗原受体表达载体的一部分。因此将提供一种分子开关，能够开启/关闭目标多核苷酸序列表达。诱导型启动子示例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕激素启动子或四环素启动子。
表达载体包含附加序列，如6x-组氨酸(SEQ ID NO:871)、c-Myc和FLAG标签，它们均包含在表达TCR中。因此，可对表达载体进行工程化改造，使其包含5’和3’未翻译调控序列，此类序列有时可用作增强子序列、启动子区和/或终止子序列，可促进或增强表达载体所携带的目标核酸的高效转录。也可对表达载体进行工程化改造，使其在特定细胞类型、细胞位置或组织类型中具有复制和/或表达功能(例如，转录和翻译)。表达载体可包含一种可选标志物，用于将载体保留在宿主或受体细胞中。
载体示例包括质粒、自主复制序列和转座因子。其他示例性载体包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC))、噬菌体(如λ噬菌体或M13噬菌体)以及动物病毒。用作载体的动物病毒类别示例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。表达载体示例为Lenti-XTM双顺反子表达系统(新)载体(Clontrch公司)、pClneo载体(Promega公司)(在哺乳动物细胞中表达)；pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2N5-GW/lacZ(英杰公司)(用于慢病毒介导的基因转移并在哺乳动物细胞中表达)。本文所公开的TCR编码序列可连接至此类表达载体，以在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白。
在某些实施例中，所述核酸(对本发明所述的TCR进行编码)包含在病毒载体中。病毒载体可源自逆转录病毒、慢病毒或泡沫病毒。在本文中，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，包含至少一个病毒源性元件，并且可包装成病毒载体颗粒。所述病毒载体可包含本文所述各种蛋白的编码序列，以代替非必要病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将DNA、RNA或其他核酸转移到细胞中。多种形式的病毒载体在本领域众所周知。
在某些实施例中，包含本文所述TCR编码序列的病毒载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。术语“逆转录病毒载体”是指包含结构和功能遗传元件(主要源自逆转录病毒)的一种载体。术语“慢病毒载体”是指包含LTR以外的结构和功能遗传元件(主要源自慢病毒)的一种载体。
本文所用的逆转录病毒载体可源自任何已知的逆转录病毒，例如，c型逆转录病毒(如莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、Friend、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯氏肉瘤病毒(RSV)。本发明所述的逆转录病毒还包括人类T细胞白血病病毒HTLV-1和HTLV-2、逆转录病毒的慢病毒家族(如人类免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV))以及其他类别的逆转录病毒。
本文所用的慢病毒载体是指源自慢病毒(逆转录病毒的一个分组(或属)，可引发缓慢发展的疾病)的一种载体。此组内的病毒包括HIV(人类免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV2型)；维斯纳-梅迪病毒；山羊关节炎脑炎病毒；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。可使用Dull等人和Zufferey等人所述的方法制备重组慢病毒(Dull等人，《病毒学杂志》，1998年；72:8463-8471以及Zufferey等人，《病毒学杂志》，1998年；72:9873-9880)。
可采用标准克隆技术，按本文所述的顺序和方向组合所需DNA序列，形成本发明所用的逆转录病毒载体(即，慢病毒和非慢病毒)(《现代分子生物学实验指南》，Ausubel,F.M.等人(编辑)，Greene Publishing Associates，(1989年)，第9.10节-第9.14节以及其他标准实验室手册；Eglitis等人(1985年)，《科学》，230:1395-1398；Danos和Mulligan(1988年)，《美国国家科学院院刊》，85:6460-6464；Wilson等人(1988年)，《美国国家科学院院刊》，85:3014-3018；Armentano等人(1990年)，《美国国家科学院院刊》，87:6141-6145；Huber等人(1991年)，《美国国家科学院院刊》，88:8039-8043；Ferry等人(1991年)，《美国国家科学院院刊》，88:8377-8381；Chowdhury等人(1991年)，《科学》，254:1802-1805；vanBeusechem等人(1992年)，《美国国家科学院院刊》，89:7640-7644；Kay等人(1992年)，《人类基因疗法》，3:641-647；Dai等人(1992年)，《美国国家科学院院刊》，89:10892-10895；Hwu等人(1993年)，《免疫学杂志》，150:4104-4115；第4,868,116号美国专利；第4,980,286号美国专利；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；以及PCT申请WO92/07573)。
用于形成载体的逆转录病毒(即，慢病毒和非慢病毒)序列的适当来源包括商业可用来源(包括美国模式培养物保藏所(ATCC)(马里兰州罗克维尔))所提供的基因组RNA和cDNA。也可化学合成这些序列。
为了表达MAGE-A4 TCR，可将载体引入宿主细胞中，以在宿主细胞内表达多肽。表达载体可包含各种表达控制元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选标志物和信号序列。如上所述，可由本领域的普通技术人员适当选择这些元件。例如，可选择启动子序列来促进多核苷酸在载体中的转录。适当的启动子序列包括但不限于T7启动子、T3启动子、SP6启动子、β-肌动蛋白启动子、EF1a启动子、CMV启动子和SV40启动子。可选择增强子序列来增强多核苷酸转录。可选择可选标志物，以从未插入载体的宿主细胞中选择已插入载体的宿主细胞，例如，可选标志物可以是提供抗生素抗性的基因。可选择信号序列，以将表达多肽运输到宿主细胞外部。
为了克隆多核苷酸，可将载体引入宿主细胞(分离宿主细胞)中，使载体自身复制，从而扩增其中包含的多核苷酸数量。克隆载体可包含序列组分，通常包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和可选标志物。可由本领域的普通技术人员适当选择这些元件。例如，可选择复制起点来促进载体在宿主细胞中的自主复制。
在某些实施例中，本发明提供了分离宿主细胞(包含本文所提供的载体)。包含载体的宿主细胞可用于表达或克隆载体中包含的多核苷酸。适当的宿主细胞包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞(如哺乳动物细胞)。用于此目的的适当原核细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科(如埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷白氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属(例如鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌属(例如粘质沙雷氏菌)和志贺氏菌属)以及杆菌(如枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌)、假单胞菌属(如铜绿假单胞菌)和链霉菌属。
采用本领域已知的转染和/或转导技术，将本发明所述的TCR引入宿主细胞中。在本文中，术语“转染”和“转录”是指一种过程，通过此过程，可将外源性核酸序列引入宿主细胞中。可将核酸整合到宿主细胞DNA中，并使其位于染色体外。可瞬时保留或稳定引入核酸。可通过本领域已知的各种方法实现转染，包括但不限于磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导转染、聚凝胺介导转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪。转导是指通过病毒感染(而不是转染)的方式使用病毒或逆转录病毒载体输送基因。在某些实施例中，在与细胞接触前，将载体包装成病毒颗粒，从而对逆转录病毒载体进行转导。例如，可通过感染和前病毒整合，将对本发明所述MAGE-A4 TCR(由逆转录病毒载体携带)进行编码的核酸转导到细胞中。
在本文中，术语“基因工程化改造”或“基因修饰”是指以DNA或RNA的形式向细胞的总遗传物质中添加额外的遗传物质。术语“基因修饰细胞”、“修饰细胞”和“重定向细胞”可互换使用。
特别是，将本发明所述的TCR引入免疫效应细胞并进行表达，以便将其对目标靶抗原(例如，HLA-A2呈递MAGE-A4肽，如MAGE-A4的氨基酸残基230-239或286-294)的特异性进行重定向。
本发明提供了免疫效应细胞(表达本文所述的TCR)产生方法。在一个实施例中，所述方法包括转染或转导免疫效应细胞，例如从受试者(如MAGE-A4相关疾病或障碍受试者)中分离的免疫效应细胞，使免疫效应细胞表达本文所述的一种或多种TCR。在某些实施例中，从个体中分离所述免疫效应细胞，并进行基因修饰，但不在体外进行进一步的操作。然后，直接向个体重新施用此类细胞。在其他实施例中，首先活化并刺激所述免疫效应细胞，以在进行基因修饰以表达TCR前，进行体外增殖。在这方面，在进行基因修饰(转导或转染，以表达本文所述的TCR)之前或之后，可对所述免疫效应细胞进行培养。
在对本文所述的免疫效应细胞进行体外操作或基因修饰前，可从受试者体内获得细胞来源。特别是，适用于本文所述TCR的免疫效应细胞包括T细胞。
可从外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤等多个来源获得T细胞。在某些实施例中，可采用本领域的技术人员所熟知的任何技术(如FICOLL分离技术)，从于受试者体内收集的单位血液中获得T细胞。在一个实施例中，通过单采术，从个体循环血液中获得细胞。单采产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施例中，可对通过单采术收集的细胞进行洗涤，去除血浆部分，并将细胞放在适当的缓冲液或培养基中，以进行后续处理。在本发明的一个实施例中，使用PBS洗涤细胞。在一个替代实施例中，洗涤液缺少钙，还可能缺少镁，或缺少许多(即便不是全部)二价阳离子。正如本领域的普通技术人员所理解的那样，可通过本领域的技术人员所熟知的方法(如使用半自动直流离心机)来完成洗涤步骤。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容缓冲液或其他盐溶液(含有或不含缓冲液)中。在某些实施例中，可在直接重悬细胞的培养基中去除单采样本的不良组分。
在某些实施例中，通过红细胞裂解和单核细胞耗竭(例如，通过PERCOLLTM梯度离心)，从外周血单核细胞(PBMC)中分离T细胞。通过阳性和阴性选择技术，可进一步分离T细胞的特定亚群(如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞)。例如，使用阴性选择细胞的独特表面标志物的定向抗体组合，即可通过阴性选择来富集T细胞群。本文所用的一种方法为通过负向磁性免疫粘附或流式细胞术(使用阴性选择细胞的细胞表面标志物的定向混合单克隆抗体)进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，混合单克隆抗体通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8抗体。流式细胞术和细胞分选术也可用于分离目标细胞群，以便用于本发明。
在使用本文所述的方法以及TCR进行基因修饰时，可直接使用PBMC。在某些实施例中，在分离PBMC后，进一步分离T淋巴细胞；在某些实施例中，可在基因修饰和/或扩增之前或之后，将细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞分为初始T细胞亚群、记忆T细胞亚群和效应T细胞亚群。
在分离后，可使用已知方法对免疫效应细胞(如T细胞)进行基因修饰，或者，可在进行基因修饰前，在体外活化并扩增(或在祖细胞的情况下分化)免疫效应细胞。在另一个实施例中，使用本文所述的嵌合抗原受体对所述免疫效应细胞(如T细胞)进行基因修饰(例如，使用包含核酸(对TCR进行编码)的病毒载体进行转导)，然后进行体外活化和扩增。T细胞活化和扩增方法在本领域众所周知，参见第6,905,874号美国专利；第6,867,041号美国专利；第6,797,514号美国专利；WO2012079000、US 2016/0175358。
本发明提供了一种修饰免疫效应细胞群，用于治疗MAGE-A4相关疾病或障碍(例如，癌症)，所述修饰免疫效应细胞包含本文所公开的MAGE-A4 TCR。
根据已知技术或其变化(根据本发明，对于本领域的技术人员显而易见)，TCR表达免疫效应细胞(如本文所述制备)可用于过继性免疫疗法的方法和合成物。参见Gruenberg等人的第2003/0170238号美国专利申请出版物；另参见Rosenberg的第4,690,915号美国专利。
III.药物合成物
本发明提供了包含本发明所述MAGE-A4 TCR的治疗合成物或包含本发明所述MAGE-A4 TCR的免疫效应细胞。使用适当的载体、赋形剂以及制剂中所包含的其他药剂(用于改善转移、输送、耐受性等)来施用本发明所述的治疗合成物。在所有药物化学家所熟知的处方集中，可找到许多适当的制剂：《雷明顿药物科学》，马克出版公司(宾夕法尼亚州伊斯顿)。这些制剂包括粉剂、糊剂、软膏、胶浆剂、蜡、油剂、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTINTM)、DNA偶联物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、卡波蜡乳剂(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有卡波蜡的半固体混合物。另参见Powell等人，“胃肠外制剂用赋形剂纲要”，PDA(1998年)，《药物科学与技术杂志》，52:238-311。
根据状况的严重程度，可调整治疗频率和持续时间。
在某些实施例中，在初始剂量之后，可第二次或多次施用后续剂量的本发明所述MAGE-A4TCR或免疫效应细胞(包含本发明所述的MAGE-A4 TCR)，剂量大约等于或小于初始剂量。
在某些情况下，可在控释系统中输送所述药物合成物。在一个实施例中，可使用泵。
注射制剂可包括静脉内、皮下、皮内、颅内、腹膜内和肌肉注射、滴注等剂型。可通过胃肠外给药来施用本文所述的TCR、药物合成物和细胞。可通过公知的方法制备本发明所述的制剂。例如，可通过在常用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上文所述的抗原结合蛋白或其盐来制备所述制剂。注射用水性介质包括生理盐水(一种含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液)等，可与适当的增溶剂(如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇))、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50)(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等联合使用。油性介质包括芝麻油、大豆油等，可与苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶剂联合使用。因此，优选将所制备的注射剂装在适当的安瓿瓶中。
在某些实施例中，首先从培养基中收获细胞，然后在介质和容器系统(用于按治疗有效量给药)(“可药用”载体)中洗涤并浓缩细胞，从而配制TCR表达免疫效应细胞。适当的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常为正常的盐水、Normosol R(雅培公司)或Plasma-Lyte A(巴克斯特公司)，但是，也可使用5％葡萄糖水溶液或乳酸林格氏液。可在输注介质中补充人血清白蛋白。
合成物中的治疗有效细胞数通常大于102个细胞，最多可达106个细胞，最多可达并包括108个或109个细胞，可以大于1010个细胞。细胞数将取决于合成物的最终用途，其中所包含的细胞类型也将取决于合成物的最终用途。
对于接受治疗的患者来说，细胞可以是自体的或异源的。如需要，所述治疗也可包括施用有丝分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18、TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)(如本文所述)，以增强免疫应答诱导。
可单独施用或以药物合成物的形式与稀释剂和/或其他组分(如IL-2或其他细胞因子或细胞群)组合施用本发明所述的TCR表达免疫效应细胞群。简而言之，本发明所述的药物合成物可包含一种TCR表达免疫效应细胞群(如T细胞)(如本文所述)以及一种或多种可药用或生理上可用的载体、稀释剂或赋形剂。此类合成物可包含缓冲剂(如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等)；碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇)；蛋白；多肽或氨基酸(如甘氨酸)；抗氧化剂；螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)；佐剂(如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明所述的合成物优选配制用于静脉内给药。
IV.MAGE-A4 TCR或免疫效应细胞(包含MAGE-A4 TCR)的治疗用途
通过本文所述的方法或本领域已知的其他方法施用本文所述的TCR表达T细胞，在受试者体内诱导抗肿瘤免疫应答，此类免疫应答可包括由细胞毒性T细胞(能够杀死感染细胞)、调节性T细胞、辅助性T细胞介导的细胞免疫应答。也可诱导体液免疫应答，此类免疫应答主要由辅助性T细胞(能够活化B细胞，因此产生抗体)介导。可采用各种技术来分析由本发明所述的合成物诱导的免疫应答类型(在本领域，已对此进行了详细描述)；例如，《现代免疫学实验指南》，编辑：John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,EthanM.Shevach,Warren Strober(2001年)，约翰·威利父子出版公司(纽约州纽约)。
因此，本发明所述的MAGE-A4 TCR用于治疗、预防和/或改善与MAGE-A4相关或由MAGE-A4介导的任何疾病或障碍。例如，本发明提供了MAGE-A4相关疾病或障碍(如MAGE-A4相关癌症(例如，MAGE-A4阳性癌症))(肿瘤生长抑制)的治疗方法(即向需要接受此类治疗的患者施用本文所述的MAGE-A4 TCR(或包含MAGE-A4 TCR的药物合成物或包含MAGE-A4TCR的多个细胞))以及用于治疗MAGE-A4相关癌症的MAGE-A4 TCR(或包含MAGE-A4 TCR的药物合成物)。本发明所述的抗原结合抗体用于治疗、预防和/或改善MAGE-A4相关癌症等疾病、障碍或状况，和/或用于改善与此类疾病、障碍或状况相关的至少一种症状。在本文所述的治疗方法中，可采用单一疗法来施用(即，作为唯一的治疗剂)或与一种或多种其他治疗剂(其示例见本文其他部分)组合施用所述MAGE-A4 TCR(或药物合成物或多个细胞)。
因此，本发明提供了确诊患有、疑似患有或有可能患有MAGE-A4相关疾病或障碍(例如，MAGE-A4相关癌症)个体的治疗方法，包括向个体施用治疗有效量的本文所述TCR表达免疫效应细胞。
在一个实施例中，本发明提供了一种确诊患有MAGE-A4阳性癌症的受试者的治疗方法，包括从确诊患有MAGE-A4阳性癌症的受试者体内取出免疫效应细胞；使用包含核酸(对本发明所述的TCR进行编码)的载体对所述免疫效应细胞进行基因修饰，从而产生修饰免疫效应细胞群；以及向此受试者施用所述修饰免疫效应细胞群。在一个实施例中，所述免疫效应细胞包括T细胞。
本文所述细胞合成物的施用方法包括有效重引入离体修饰免疫效应细胞(在受试者中或在重引入免疫效应细胞的基因修饰祖细胞(在引入受试者体内时分化成成熟免疫效应细胞(表达所述TCR))时直接表达本发明所述的TCR)的任何方法。一种方法包括根据本发明使用核酸构建体离体转导外周血T细胞，并将转导细胞送回受试者体内。
在本发明的某些实施例中，本文所述的合成物用于治疗患有原发性或复发性癌症的受试者，此类癌症包括但不限于MAGE-A4相关癌症，例如MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。在一个实施例中，所述MAGE-A4相关癌症为卵巢癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、结直肠癌、食管鳞状细胞癌、食管腺癌、胃癌、膀胱癌、头颈癌、滑膜肉瘤或黏液样圆细胞脂肪肉瘤。
所述TCR可用于治疗MAGE-A4相关癌症的早期或晚期症状。在一个实施例中，本发明所述的TCR可用于治疗晚期或转移性癌症。所述TCR用于减缓、抑制或放缓肿瘤生长。在某些实施例中，使用本发明所述的TCR治疗时，受试者的肿瘤消退40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上。在某些实施例中，所述TCR可用于预防肿瘤复发。在某些实施例中，所述TCR用于延长MAGE-A4相关癌症受试者的无进展生存期或总生存期。在某些实施例中，所述TCR用于降低因化疗或放疗而产生的毒性，同时延长MAGE-A4相关癌症患者的生存期。
可施用本发明所述的一种或多种TCR，以缓解、预防或降低疾病或障碍的一种或多种症状或状况的严重程度。
在本文中，也考虑向有可能患有MAGE-A4相关疾病或障碍(例如，MAGE-A4相关癌症)的患者预防性使用本发明所述的一种或多种TCR。
在另一个实施例中，本TCR用于制备一种用于治疗MAGE-A4相关疾病或障碍(例如，MAGE-A4相关癌症)患者的药物合成物。在本发明的另一个实施例中，将本TCR用作本领域的技术人员所熟知的任何其他药剂或任何其他疗法(治疗MAGE-A4相关癌症)的辅助疗法。
联合疗法可包括本发明所述的MAGE-A4 TCR(如包含本发明所述TCR的免疫效应细胞)或本发明所述的药物合成物以及可与本发明所述的TCR有利组合的任何其他治疗剂。本发明所述的TCR可与用于治疗或抑制MAGE-A4相关疾病或障碍(如MAGE-A4阳性癌症)的一种或多种抗癌药物或疗法联合协同使用，例如脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。
在本文中，考虑联合使用本发明所述的TCR以及免疫刺激和/或免疫支持疗法，以抑制肿瘤生长和/或延长癌症患者的生存期。所述免疫刺激疗法包括直接免疫刺激疗法，通过对抑制免疫细胞“松开制动踏板”或“踩油门”来激活免疫应答，从而增强免疫细胞活性。示例包括靶向其他检查点受体、疫苗接种和佐剂。所述免疫支持疗法可通过促进免疫原性细胞死亡或炎症反应来增加肿瘤的抗原性，或具有其他间接作用，即促进抗肿瘤免疫应答。示例包括放疗、化疗、抗血管生成剂和外科手术。
在各个实施例中，本发明所述的一种或多种TCR可与PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体(如纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、BGB-A317或REGN2810))、PD-L1抑制剂(例如，抗PD-L1抗体(如阿维鲁单抗、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、MDX-1105或REGN3504))、CTLA-4抑制剂(例如，伊匹单抗)、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、GITR抑制剂、另一种T细胞共抑制剂或配体的拮抗剂(例如，CD-28、2B4、LY108、LAIR1、ICOS、CD160或VISTA抗体)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂[例如，“VEGF-Trap”(如阿柏西普或US 7,087,411中所列的其他VEGF抑制融合蛋白)或抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐单抗或兰尼单抗)或VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼)]、Ang2抑制剂(例如，奈伐苏单抗)、转化生长因子β(TGFβ)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(例如，埃罗替尼、西妥昔单抗)、CD20抑制剂(例如，抗CD20抗体(如利妥昔单抗))、肿瘤特异性抗原抗体[例如，CA9、CA125、黑色素瘤相关抗原3(MAGE3)、癌胚抗原(CEA)、波形蛋白、肿瘤M2-PK、前列腺特异性抗原(PSA)、黏蛋白-1、MART-1和CA19-9]、疫苗(例如，卡介苗、癌症疫苗)、增加抗原呈递的佐剂(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、特异性抗体(例如，CD3xCD20双特异性抗体或PSMAxCD3双特异性抗体)、细胞毒素、化学治疗剂(例如，达卡巴嗪、替莫唑胺、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、顺铂、卡铂、吉西他滨、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇和长春新碱)、环磷酰胺、放疗、外科手术、IL-6R抑制剂(例如，全人源化白介素6受体单抗)、IL-4R抑制剂(例如，度匹鲁单抗)、IL-10抑制剂、细胞因子(如IL-2、IL-7、IL-21和IL-15)、抗体药物偶联物(ADC)(例如，抗CD19-DM4 ADC和抗DS6-DM4 ADC)、抗炎药(例如，皮质类固醇和非甾体抗炎药)、膳食补充剂(如抗氧化剂)或治疗癌症的任何其他疗法。在某些实施例中，本发明所述的TCR可与癌症疫苗(包括树突状细胞疫苗、溶瘤病毒、肿瘤细胞疫苗等)联合使用，以增强抗肿瘤反应。
可与本发明所述的TCR联合使用的癌症疫苗示例包括黑色素瘤和膀胱癌MAGE3疫苗、乳腺癌MUC1疫苗、脑癌(包括多形性成胶质细胞瘤)EGFRv3(例如，Rindopepimut)或ALVAC-CEA(用于CEA+癌症)。
在某些实施例中，本发明所述的MAGE-A4 TCR可与方法中的放疗联合施用，以产生长期持久的抗肿瘤反应和/或延长癌症患者的生存期。在某些实施例中，可在向癌症患者进行放疗之前、同时或之后，施用本发明所述的MAGE-A4 TCR。例如，可一次或多次对肿瘤病灶进行放疗，然后一次或多次施用本发明所述的MAGE-A4 TCR。在某些实施例中，可对肿瘤病灶进行局部放疗，以增强患者肿瘤的局部免疫原性(辅助性放射)和/或杀死肿瘤细胞(消融性放射)，然后全身施用本发明所述的MAGE-A4 TCR。
可在施用本发明所述的MAGE-A4 TCR之前、同时或之后施用其他治疗活性剂/组分。在本发明中，此类施用方案为“联合”施用MAGE-A4 TCR以及第二治疗活性组分。
可在施用本发明所述的MAGE-A4 TCR之前，向受试者施用其他治疗活性组分。在其他实施例中，可在施用本发明所述的MAGE-A4 TCR之后，向受试者施用其他治疗活性组分。在其他实施例中，可向受试者同时施用本发明所述的MAGE-A4 TCR以及其他治疗活性组分。在本发明中，“同时”施用包括以单一剂型(例如，共制备)或按小于约30分钟或更短的时间间隔以不同剂型向受试者施用MAGE-A4 TCR以及其他治疗有效组分。以不同剂型施用时，可通过相同途径施用每个剂型；或者，也可通过不同途径施用每个剂型。在任何情况下，在本发明中，通过相同途径以单一剂型或不同剂型或通过不同途径以不同剂型施用所述组分均属于“同时施用”。在本发明中，在施用其他治疗有效组分“之前”、“同时”或“之后”(这些术语的定义见上文)施用MAGE-A4 TCR均属于“联合”施用MAGE-A4 TCR以及其他治疗有效组分。
通过以下示例对本发明进行了进一步的说明，但这些示例并不旨在以任何方式进行限制。本申请中引用的所有出版物、专利和已发表专利申请的全部内容以及附图通过本发明的引用，成为本发明的一部分。
示例
示例1 MAGE-A4特异性T细胞受体识别
使用MAGE-A4(286-294)肽(KVLEHVVRV，SEQ ID NO:609)(由人类HLA-A2特异性呈递、在PBS中稀释并与佐剂混合(例如，与弗氏完全佐剂(CFA；Chondrex公司)等体积混合))，使细胞免疫系统组分人源化小鼠
Figure BDA0003488232650000412
小鼠(参见第WO 2016/164492号PCT出版物，所述出版物的全部内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分)免疫。获得并解离免疫小鼠脾脏悬浮液。在ACK裂解缓冲液(生命技术公司)中裂解红细胞，并将脾细胞悬浮于RPMI完全培养基中。对分离脾细胞进行分选，并通过荧光活化细胞分选术(FACS)分离在MHC的情况下与MAGE-A4(286-294)肽结合的单T细胞。单孔接种分离T细胞，并将其与TCRα和β链可变区特异性PCR引物混合。通过逆转录酶(RT)反应合成每个单T细胞的cDNA。然后，将每个所获RT产物分开，并转移到两个相应孔中，以便进行后续TCRα和βPCR。首先，使用TCRβ可变区前导序列的特异性5’简并引物或TCRα链可变区前导序列的特异性5’简并引物以及TCR恒定区的特异性3’引物，通过PCR扩增一组所获RT产物，形成扩增子。然后，使用TCRβ可变区构架1的特异性5’简并引物或TCRα链可变区构架1的特异性5’简并引物以及TCR恒定区的特异性3’引物，通过PCR再次对扩增子进行扩增，产生用于克隆的扩增子。将TCRβ和α衍生PCR产物分别克隆到包含β恒定区和α恒定区的表达载体中。将表达全长β和α链对的表达载体转染到CHO细胞中，并测试与商用MAGE-A4/HLA四聚物试剂(HLA-A02:01MAGE-A4四聚物；MBL国际公司)的结合情况。使用可溶HLA-A2(KVLEHVVRV)(SEQ ID NO:609)和小鼠TCR恒定区特异性抗体(克隆H57-597)(Biolegend公司(加利福尼亚州圣地亚哥))四聚物培养CHO细胞。然后，在LSRFortessa X-20(BD生物科学公司(加利福尼亚州圣荷西))上分析样本。为了计算四聚物阳性细胞的百分比，使用FlowJo(LLC(俄勒冈州阿什兰))，根据阴性对照TCR(不与HLA-A2(KVLEHVVRV)(SEQ ID NO:609)四聚物结合)设置抗原阳性(Ag+)门。所有Ag+TCR的FlowJo标准均为：Ag+门中的细胞≥1％，平均荧光强度(MFI)>250。通过下一代测序技术确定Ag+TCR，表达相同TCRα和β核苷酸序列的TCR总数如以下表1所示。
表1
Figure BDA0003488232650000411
Figure BDA0003488232650000421
表2提供了TCR(如上所述确定)的β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列以及α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的详细列表。表3提供了TCR(如上所述确定)的β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3核苷酸序列以及α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3核苷酸序列的详细列表。表4提供了TCR的β链可变区和α链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
表2 MAGE-A4(286-294)/HLA-A2特异性
Figure BDA0003488232650000432
TCR的氨基酸CDR序列
Figure BDA0003488232650000431
Figure BDA0003488232650000441
Figure BDA0003488232650000451
表3 MAGE-A4(286-294)/HLA-A2特异性
Figure BDA0003488232650000453
TCR的核酸CDR序列
Figure BDA0003488232650000452
Figure BDA0003488232650000461
Figure BDA0003488232650000471
Figure BDA0003488232650000481
Figure BDA0003488232650000491
Figure BDA0003488232650000501
表4 MAGE-A4(286-294)/HLA-A2特异性
Figure BDA0003488232650000503
TCR的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0003488232650000502
Figure BDA0003488232650000511
Figure BDA0003488232650000521
Figure BDA0003488232650000531
Figure BDA0003488232650000541
Figure BDA0003488232650000551
Figure BDA0003488232650000561
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Figure BDA0003488232650000581
Figure BDA0003488232650000591
Figure BDA0003488232650000601
Figure BDA0003488232650000611
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Figure BDA0003488232650000671
Figure BDA0003488232650000681
Figure BDA0003488232650000691
示例2MAGE-A4特异性T细胞受体识别
使用MAGE-A4(230-239)肽(GVYDGREHTV，SEQ ID NO:612)(由人类HLA-A2特异性呈递、在PBS中稀释并与佐剂混合(例如，与弗氏完全佐剂(CFA；Chondrex公司)等体积混合))，使细胞免疫系统组分人源化小鼠
Figure BDA0003488232650000692
小鼠(参见第WO 2016/164492号PCT出版物，所述出版物的全部内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分)免疫。获得并解离免疫小鼠脾脏悬浮液。在ACK裂解缓冲液(生命技术公司)中裂解红细胞，并将脾细胞悬浮于RPMI完全培养基中。对分离脾细胞进行分选，并通过荧光活化细胞分选术(FACS)分离在MHC的情况下与MAGE-A4(230-239)肽结合的单T细胞。单孔接种分离T细胞，并将其与TCRα和β链可变区特异性PCR引物混合。通过逆转录酶(RT)反应合成每个单T细胞的cDNA。然后，将每个所获RT产物分开，并转移到两个相应孔中，以便进行后续TCRα和βPCR。首先，使用TCRβ可变区前导序列的特异性5’简并引物或TCRα链可变区前导序列的特异性5’简并引物以及TCR恒定区的特异性3’引物，通过PCR扩增一组所获RT产物，形成扩增子。然后，使用TCRβ可变区构架1的特异性5’简并引物或TCRα链可变区构架1的特异性5’简并引物以及TCR恒定区的特异性3’引物，通过PCR再次对扩增子进行扩增，产生用于克隆的扩增子。将TCRβ和α衍生PCR产物分别克隆到包含β恒定区和α恒定区的表达载体中。将表达全长β和α链对的表达载体转染到CHO细胞中，并测试与商用MAGE-A4/HLA四聚物试剂(HLA-A02:01MAGE-A4四聚物；MBL国际公司)或商用MAGE-A8/HLA四聚物试剂(HLA-A02:01MAGE-A8四聚物；MBL国际公司)的结合情况。使用小鼠TCR恒定区特异性抗体(克隆H57-597)(Biolegend公司(加利福尼亚州圣地亚哥))以及可溶HLA-A2 MAGE-A4(GVYDGREHTV)(SEQ ID NO:612)四聚物或可溶HLA-A2 MAGE-A8(GLYDGREHSV)(SEQ ID NO:613)培养CHO细胞。然后，在LSRFortessa X-20(BD生物科学公司(加利福尼亚州圣荷西))上分析样本。为了计算MAGE-A4(230-239)四聚物阳性细胞的百分比，根据阴性对照TCR(不与HLA-A2(GVYDGREHTV)(SEQ ID NO:612)四聚物结合)设置抗原阳性(Ag+)门。为了计算MAGE-A8四聚物阳性细胞的百分比，使用FlowJo(LLC(俄勒冈州阿什兰))，根据阴性对照TCR(不与HLA-A2(GLYDGREHSV)(SEQ ID NO:613)结合)设置抗原阳性(Ag+)门。所有Ag+TCR的FlowJo标准均为：Ag+门中的细胞≥1％，平均荧光强度(MFI)>250。但是，可使用3％等更加严格的截止值，以分离在结合检测中表现更好的Ag+TCR。通过下一代测序技术确定Ag+TCR。表5显示了表达相同TCRα和β核苷酸序列的TCR总数、Ag+门中四聚物的百分比(％)(MAGE-A4(230-239))、Ag+门中四聚物的百分比(％)(MAGE-A8(232-241))以及后两个数字的比值(Ag+门中四聚物的百分比(％)(MAGE-A4(230-239))除以Ag+门中四聚物的百分比(％)(MAGE-A8(232-241)))。此比值是MAGE-A4(230-239)结合特异性的指标。
表5 TCR抗原靶上和脱靶结合
Figure BDA0003488232650000701
Figure BDA0003488232650000711
表6提供了TCR(如上所述确定)的β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列以及α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的详细列表，表7提供了相应的核酸序列。表8提供了TCR的β链可变区和α链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
表9提供了分离TCR的α和β可变区及连接区的TCR基因家族，表10提供了α和β可变链及CDR的氨基酸和多核酸序列标识符。
表6 MAGE-A4(230-239)/HLA-A2特异性
Figure BDA0003488232650000713
TCR的氨基酸序列
Figure BDA0003488232650000712
Figure BDA0003488232650000721
表7 MAGE-A4(230-239)/HLA-A2特异性
Figure BDA0003488232650000723
TCR的核酸CDR序列
Figure BDA0003488232650000722
Figure BDA0003488232650000731
Figure BDA0003488232650000741
表8 MAGE-A4(230-239)/HLA-A2特异性
Figure BDA0003488232650000743
TCR的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0003488232650000742
Figure BDA0003488232650000751
Figure BDA0003488232650000761
Figure BDA0003488232650000771
Figure BDA0003488232650000781
Figure BDA0003488232650000791
Figure BDA0003488232650000801
Figure BDA0003488232650000811
Figure BDA0003488232650000821
表9 MAGE-A4(230-239)/HLA-A2特异性
Figure BDA0003488232650000823
TCRα链和β链的可变(V)和连接(J)区基因家族
Figure BDA0003488232650000822
Figure BDA0003488232650000831
表10 TCRα和β可变链及CDR的氨基酸和多核酸序列标识符
Figure BDA0003488232650000832
Figure BDA0003488232650000841
示例3 MAGE-A4 TCR对A375黑色素瘤细胞的细胞毒性
本示例对本发明某些MAGE-A4 TCR的A375黑色素瘤细胞选择性杀伤能力进行了说明。
方法
T细胞操作
使用EasySep人T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，17951)，通过阴性选择从人外周血单核细胞(PBMC)中纯化全T细胞，然后冷冻保存。在实验第0天，将T细胞解冻，并在含有200U/ml人IL-2和抗CD3/抗CD28活化微珠(生命技术公司，111.32D)(微珠:细胞比率为1:1)的培养基(CTS OpTmizer培养基[生命技术公司，A1048501]，添加10mg/ml庆大霉素、4mM L-谷氨酰胺)中接种1×106个细胞/ml。在第3天，取出活化微珠，并使用Nucleofector IIb核转染仪和人T细胞核转染试剂盒(龙沙公司，VVPA-1002)以及20mg Cas9蛋白(生命技术公司，A36499)(与靶向TRAC和TRBC位点的sgRNA复合)转染5×106个细胞。在核转染后，使用腺相关病毒(AAV)载体(经工程化改造，可靶向人TRAC位点的TCRa和TCRb表达盒)对细胞进行转导。每隔2-3天，在新鲜补充的培养基中重新接种细胞，达到约1×106个细胞/ml。在TCR构建体转导后的不同时间点，使用表面标志物抗体和肽MHC四聚物试剂对细胞进行染色，然后通过流式细胞术进行分析，以对转导效率进行量化。
细胞毒性检测
通过钙黄绿素释放检测，评估抗原特异性细胞毒性T细胞功能。在存在8mM钙黄绿素AM染料(生命技术公司，C1430)的情况下，在37℃下标记靶肿瘤细胞30分钟，然后使用培养基进行洗涤。在96孔板的每个检测孔中接种1×104个靶细胞以及不同稀释度的转导T细胞或未转导(UTD)对照品。两小时后，在培养上清液中测量荧光染料释放量。在含有标记靶细胞但不含T细胞的孔中测量自发性释放量(SR)，并在存在0.5％Triton X-100的情况下，在含有标记靶细胞的孔中测量最大释放量(MR)。经确定，特异性细胞毒性百分比为100X(测试释放量–SR)/(MR-SR)。
结果
对原代人T细胞进行工程化改造，以对两种HLA-A2限制肽(MAGE-A4 286-294(KVLEHVVRV；SEQ ID NO:609)和MAGE-A4 230-239(GVYDGREHTV；SEQ ID NO:294))或无关HLA-A2限制肽(源自病毒蛋白(HPV))表达MAGE-A4特异性TCR。如图1所示，使用肽MHC四聚物试剂进行流式细胞术分析，证实了转导TCR的表达和预计抗原特异性。
为了验证TCR的细胞毒活性，在钙黄绿素AM染料释放检测中测试工程化改造T细胞对MAGE-A4表达肿瘤细胞的细胞溶解功能引导能力(图2A、图2B、图3A、图3B)。这些检测证实，所述MAGE-A4特异性TCR(对MAGE-A4 286-294和MAGE-A4 230-239肽)(而不是TCR对无关HLA-A2限制肽)以剂量依赖的方式介导A375黑色素瘤细胞杀伤。
示例4 Jurkat细胞TCR信号传导生物检测中的MAGE-A4(286-294)TCR
本示例对本发明所选MAGE-A4 TCR的Jurkat细胞TCR信号传导激活能力进行了说明。
方法
Jurkat细胞系产生
Jurkat细胞系缺乏内源性TCRα和TCRβ表达，通过敲除这些基因，产生此细胞系，然后进行工程化改造，以便实现转基因TCR构建体的单拷贝Cre重组酶介导插入。然后，将AP1应答元件驱动的萤光素酶报告基因包含在此亲本生物检测系中。通过定制TCRα/β表达构建体的Cre介导插入，产生TCR生物检测系。
TCR活化生物检测
根据同质性，对Jurkat生物检测系(表达TCR构建体)进行分选，然后在肽MHC刺激检测中进行测试。在检测孔中接种293T细胞(HLA-A2*01)以及不同稀释度的抗原(MAGE-A4286-294(KVLE))肽或无关(MAGE-A4 230-239(GVY))肽。培养2小时后，按3:1的Jurkat:293T细胞比率向孔内加入工程化改造Jurkat细胞，并继续培养5小时。测量检测孔中的发光输出，从而确定萤光素酶报告基因活性。
结果
在肽刺激检测中，对Jurkat生物检测系(包含AP1应答元件驱动的萤光素酶转基因，并经工程化改造，可表达MAGE-A4特异性TCR或无关抗原(NY-ESO-1)的TCR)进行测试。如图4A和图4B所示，HLA-A2*01限制性MAGE-A4(286-294(KVLE))特异性TCR仅对关联(KVLE)肽产生反应，而对无关MAGE-A4(230-239(GVY))肽不会产生反应。亲本TCR阴性(TCR-)细胞和表达无关TCR的细胞(对NY ESO)无反应性。此外，图4A和图4B表明，由MAGE-A4特异性TCR诱导的AP1报告基因活化具有剂量依赖性。
示例5 MAGE-A4(230-239)TCR在T细胞中的特异性活性
本示例对本发明所选MAGE-A4 TCR的T细胞TCR信号传导激活能力进行了说明。
活化人外周血单核细胞(PBMC)(n＝3个供体)，使用对TCR(与HLA-A2限制性MAGE-A4(230-239(GVY))结合)进行编码的慢病毒载体进行转导，并在冷冻前在体外扩增10天。解冻后，按1:1的比率使用负载MAGE-A4 230-239肽的T2细胞培养包含上述TCR的T细胞。根据共培养后24小时的干扰素γ释放量来衡量反应性。将T细胞单独用作抗原非依赖性干扰素γ释放量的对照品。将使用无负载T2细胞或负载无关肽的T2细胞培养的T细胞用作特异性对照品。图5描述了平均干扰素γ信号+/-n＝3个供体均值(SEM)的标准误差，并显示本发明所述的MAGE-A4(230-239)特异性TCR对负载MAGE-A4(230-239)肽的T2细胞具有特异性活性。
为了测试对肿瘤细胞(表达MAGE-A4)的活性，活化人PBMC(n＝3个供体)，使用对MAGE-A4(230-239)TCR进行编码的慢病毒载体进行转导，并在冷冻前在体外扩增10天。解冻后，按5:1的比例使用肿瘤细胞(表达工程化改造水平的HLA-A2和MAGE-A4(A549.A2.MAGEA4细胞)或内源性水平的HLA-A2和MAGE-A4(A375细胞))培养MAGE-A4(230-239)TCR T细胞。根据共培养后24小时的干扰素γ释放来衡量反应性。将T细胞单独用作抗原非依赖性干扰素γ释放量的对照品。将使用未修饰A549细胞(MAGE-A4阴性和HLA-A2阴性)或修饰A549细胞(可表达HLA-A2(A549.A2))培养的T细胞用作特异性对照品。图6描述了平均干扰素γ信号+/-n＝3个供体均值(SEM)的标准误差，并显示本发明所述的MAGE-A4(230-239)特异性TCR对表达HLA-A2和MAGE-A4的肿瘤细胞具有特异性活性。在一项单独的检测中，将T细胞与A549细胞、A549.A2细胞、NCI-H520(HLA-A2阴性/MAGE-A4阳性)细胞以及MCF-7(HLA-A2阳性/MAGE-A4阴性)细胞共培养，以进一步提供HLA-A2/MAGE-A4复合物的特异性对照品。图7描述了平均干扰素γ信号+/-n＝3个供体均值(SEM)的标准误差，并显示本发明所述的MAGE-A4(230-239)特异性TCR对表达HLA-A2和MAGE-A4的肿瘤细胞具有特异性活性。在另一项检测中，按5:1的比率使用肿瘤细胞(表达较低或中等内源性水平的MAGE-A4(分别为U2-OS和NCI-H1703))培养MAGE-A4(230-239)TCR表达T细胞。根据共培养后24小时的IFNg释放量来衡量反应性。图8描述了平均干扰素γ信号+/-n＝3个供体均值(SEM)的标准误差，并显示本发明所述的MAGE-A4(230-239)特异性TCR对HLA-A2表达肿瘤细胞(甚至仅表达较低或中等内源性水平的MAGE-A4)具有特异性活性。
等同
本领域的技术人员将认识到或能够仅通过常规实验确定本文所述的本发明特定实施例的许多等同。此类等同拟在以下权利要求的范围内。本申请中引用的所有出版物、专利和已发表专利申请的内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。
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Claims (90)

1.一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO:609))(MAGE-A4 286-294)特异性结合的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含一个α链可变结构域，所述α链可变结构域包含一个互补决定区(CDR)3，其中，所述CDR3包含公式I的氨基酸序列：
N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15(公式I)，其中：
N1为非极性氨基酸；
N2为Val，可能存在，也可能不存在；
N3为Tyr、Gly、Leu、Val、Glu、Met、Ala或Phe；
N4为Arg、Glu、Ser、Asn、Gln、Lys、Asp、Gly或Met，可能存在，也可能不存在；
N5为Ser、Arg、Glu、Leu、Ala、Asp、Pro、Met、Gly或Lys，可能存在，也可能不存在；
N6为Ala、Asp、Gly、Ser、Val、Pro、Leu、Tyr或Thr，可能存在，也可能不存在；
N7为Thr、Pro、Ser、Glu、Asp、Trp、Arg、Asn、Ile、Gln或Leu；
N8为His、Trp、Thr、Lys、Tyr或Ala；
N9为Asn、Gly、Lys、Ile、Ser或Arg；
N10为Gln、Lys、Gly、Thr、Leu、Asp或Ser，可能存在，也可能不存在；
N11为Phe、Asn、Thr、Tyr、Ala、Leu、Met或Glu，可能存在，也可能不存在；
N12为Lys、Phe、Tyr或Asp，可能存在，也可能不存在；
N13为Lys或Gly，可能存在，也可能不存在；
N14为Thr、Leu或Tyr，可能存在，也可能不存在；以及
N15为Tyr、Gln、Ile、Thr、Val或Arg。
2.根据权利要求1所述的TCR，其中，N1为Ala、Ile或Gly。
3.一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO:609))(MAGE-A4 286-294)特异性结合的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含一个β链可变结构域，所述β链可变结构域包含互补决定区(CDR)3，其中，所述CDR3包含公式II的氨基酸序列：
N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15-N16-N17-N18(公式II)，
其中：
N1为Ala或Ser；
N2为Ala、Ser或Thr；
N3为Ser、Gly或Trp；
N4为Leu、Tyr、Trp、Asp、Phe、Gly、Pro或His；
N5为Gly或Asp，可能存在，也可能不存在；
N6为Phe或Arg，可能存在，也可能不存在；
N7为Trp、Phe、Asp、Pro、Tyr、Gly、Thr、Ser或Val，可能存在，也可能不存在；
N8为Pro、Arg、Asp、Tyr、Gln、Asn或Gly，可能存在，也可能不存在；
N9为Asp，可能存在，也可能不存在；
N10为Arg，可能存在，也可能不存在；
N11为Gly、Ala或Thr，可能存在，也可能不存在；
N12为Ser、Trp、Thr、Gly、Val、Leu、Arg、Met、Tyr或Gln；
N13为Gly，可能存在，也可能不存在；
N14为Asn、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或His，可能存在，也可能不存在；
N15为Thr、Ser、Glu、Asn、Tyr、Gln、Asp或Pro，可能存在，也可能不存在；
N16为Glu、Pro、Lys、Thr、Ala、Gly或Gln，可能存在，也可能不存在；
N17为Ala、Leu、Ile、Tyr或Gln，可能存在，也可能不存在；以及
N18为Phe、His、Tyr或Thr。
4.根据权利要求1或2所述的TCR，其中，所述α链可变结构域进一步包含一个CDR1和一个CDR2，其中，所述CDR1包含表2中所列的任一α链可变结构域CDR1氨基酸序列，所述CDR2单独包含表2中所列的任一α链可变结构域CDR2氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的TCR，其中，所述β链可变结构域进一步包含一个CDR1和一个CDR2，其中，所述CDR1包含表2中所列的任一β链可变结构域CDR1氨基酸序列，所述CDR2单独包含表2中所列的任一β链可变结构域CDR2氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的TCR，其中，所述TCR包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。
7.根据权利要求6所述的TCR，其中，所述TCR包含一个TCRα链可变结构域和一个TCRβ链可变结构域。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的TCR，包含α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一α链可变结构域序列内)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一β链可变结构域序列内)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的TCR，包含一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的TCR，包含一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的TCR，包含：(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
12.根据权利要求3-11中任一项所述的TCR，包含：
(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577和593；
(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482、498、514、530、546、562、578和594；
(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579和595；
(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、393、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585和601；
(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474、490、506、522、538、554、570、586和602；以及
(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、395、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587和603。
13.根据权利要求12所述的TCR，包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159、167/175、183/191、199/207、215/223、231/239、247/255、263/271、279/287、295/303、311/319、327/335、343/351、359/367、375/383、391/399、407/415、423/431、439/447、455/463、471/479、487/495、503/511、519/527、535/543、551/559、567/575、583/591和599/607。
14.根据权利要求12所述的TCR，包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:87/31、23/95、231/607、231/223、231/591、231/255、231/271、231/79、231/47、231/399、599/239、599/223、599/591、599/255、599/271、599/79、599/47、599/399、215/239、215/607、215/591、215/255、215/271、215/79、215/47、215/399、583/239、583/607、583/223、583/255、583/271、583/79、583/47、583/399、247/239、247/607、247/223、247/591、247/271、247/79、247/47、247/399、263/239、263/607、263/223、263/591、263/255、263/79、263/47、263/399、71/239、71/607、71/223、71/591、71/255、71/271、71/47、71/399、39/239、39/607、39/223、39/591、39/255、39/271、39/79、39/399、391/239、391/607、391/223、391/591、391/255、391/271、391/79、391/47、439/127、439/319、439/287、439/15、439/111、439/383、439/191、439/511、439/527、439/559、439/207、119/447、119/319、119/287、119/15、119/111、119/383、119/191、119/511、119/527、119/559、119/207、311/447、311/127、311/287、311/15、311/111、311/383、311/191、311/511、311/527、311/559、311/207、279/447、279/127、279/319、279/15、279/111、279/383、279/191、279/511、279/527、279/559、279/207、7/447、7/127、7/319、7/287、7/111、7/383、7/191、7/511、7/527、7/559、7/207、103/447、103/127、103/319、103/287、103/15、103/383、103/191、103/511、103/527、103/559、103/207、375/447、375/127、375/319、375/287、375/15、375/111、375/191、375/511、375/527、375/559、375/207、183/447、183/127、183/319、183/287、183/15、183/111、183/383、183/511、183/527、183/559、183/207、503/447、503/127、503/319、503/287、503/15、503/111、503/383、503/191、503/527、503/559、503/207、519/447、519/127、519/319、519/287、519/15、519/111、519/383、519/191、519/511、519/559、519/207、551/447、551/127、551/319、551/287、551/15、551/111、551/383、551/191、551/511、551/527、551/207、199/447、199/127、199/319、199/287、199/15、199/111、199/383、199/191、199/511、199/527和199/559。
15.一种竞相与权利要求1-14中任一项所述的TCR结合的TCR。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的TCR，进一步包含一个可检测部分。
17.一种药物合成物，包含权利要求1-16中任一项所述的TCR和一种可药用载体或稀释剂。
18.一种呈递权利要求1-16中任一项所述TCR的分离细胞。
19.一种包含一个多核苷酸序列(对权利要求1-16中任一项所述TCR的α链可变结构域进行编码)的分离多核苷酸分子。
20.一种包含一个多核苷酸序列(对权利要求1-16中任一项所述TCR的β链可变结构域进行编码)的分离多核苷酸分子。
21.一种包含权利要求19或20所述多核苷酸分子的载体。
22.一种表达权利要求21所述载体的分离细胞。
23.一种MAGE-A4相关疾病或障碍受试者的治疗方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-16中任一项所述的TCR、权利要求17所述的药物合成物或权利要求18所述的多个分离细胞，从而对受试者进行治疗。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述MAGE-A4相关疾病或障碍为MAGE-A4相关癌症。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中，向受试者联合施用所述TCR、药物合成物或多个细胞以及第二治疗剂。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中，通过皮下、静脉内、皮内、腹腔内、口服、肌肉内或颅内途径向受试者施用所述TCR、药物合成物或多个细胞。
28.一种对T细胞受体(TCR)进行编码的多核苷酸分子，其中，所述TCR与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO:609))(MAGE-A4 286-294)特异性结合，其中，所述TCR具有从包括以下几项的一组中选择的一种特性：(a)不与表达预测脱靶肽的细胞结合(通过发光检测确定)；(b)T细胞应答激活作用约是源自患者的MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)；以及(c)T细胞应答激活作用约是亲和力成熟的(例如，通过噬菌体呈递)MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)。
29.根据权利要求28所述的多核苷酸分子，对至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域进行编码。
30.根据权利要求28所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一α链可变结构域序列内)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表4中所列的任一β链可变结构域序列内)。
31.根据权利要求29或30所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表4中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含：
(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577和593；
(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482、498、514、530、546、562、578和594；
(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579和595；
(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、393、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585和601；
(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474、490、506、522、538、554、570、586和602；以及
(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、395、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587和603。
35.根据权利要求34所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159、167/175、183/191、199/207、215/223、231/239、247/255、263/271、279/287、295/303、311/319、327/335、343/351、359/367、375/383、391/399、407/415、423/431、439/447、455/463、471/479、487/495、503/511、519/527、535/543、551/559、567/575、583/591和599/607。
36.根据权利要求34所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:87/31、23/95、231/607、231/223、231/591、231/255、231/271、231/79、231/47、231/399、599/239、599/223、599/591、599/255、599/271、599/79、599/47、599/399、215/239、215/607、215/591、215/255、215/271、215/79、215/47、215/399、583/239、583/607、583/223、583/255、583/271、583/79、583/47、583/399、247/239、247/607、247/223、247/591、247/271、247/79、247/47、247/399、263/239、263/607、263/223、263/591、263/255、263/79、263/47、263/399、71/239、71/607、71/223、71/591、71/255、71/271、71/47、71/399、39/239、39/607、39/223、39/591、39/255、39/271、39/79、39/399、391/239、391/607、391/223、391/591、391/255、391/271、391/79、391/47、439/127、439/319、439/287、439/15、439/111、439/383、439/191、439/511、439/527、439/559、439/207、119/447、119/319、119/287、119/15、119/111、119/383、119/191、119/511、119/527、119/559、119/207、311/447、311/127、311/287、311/15、311/111、311/383、311/191、311/511、311/527、311/559、311/207、279/447、279/127、279/319、279/15、279/111、279/383、279/191、279/511、279/527、279/559、279/207、7/447、7/127、7/319、7/287、7/111、7/383、7/191、7/511、7/527、7/559、7/207、103/447、103/127、103/319、103/287、103/15、103/383、103/191、103/511、103/527、103/559、103/207、375/447、375/127、375/319、375/287、375/15、375/111、375/191、375/511、375/527、375/559、375/207、183/447、183/127、183/319、183/287、183/15、183/111、183/383、183/511、183/527、183/559、183/207、503/447、503/127、503/319、503/287、503/15、503/111、503/383、503/191、503/527、503/559、503/207、519/447、519/127、519/319、519/287、519/15、519/111、519/383、519/191、519/511、510/559、519/207、551/447、551/127、551/319、551/287、551/15、551/111、551/383、551/191、551/511、551/527、551/207、199/447、199/127、199/319、199/287、199/15、199/111、199/383、199/191、199/511、199/527和199/559。
37.根据权利要求33所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含：
(a)一个α链可变结构域CDR1，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、420、436、452、468、484、500、516、532、548、564、580和596；
(b)一个α链可变结构域CDR2，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373、389、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、581和597；
(c)一个α链可变结构域CDR3，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、422、438、454、470、486、502、518、534、550、566、582和598；
(d)一个β链可变结构域CDR1，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、428、444、460、476、492、508、524、540、556、572、588和604；
(e)一个β链可变结构域CDR2，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、573、589和605；以及
(f)一个β链可变结构域CDR3，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414、430、446、462、478、494、510、526、542、558、574、590和606。
38.根据权利要求37所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域核酸序列对：SEQ ID NO:8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、376/384、392/400、408/416、424/432、440/448、456/464、472/480、488/496、504/512、520/528、536/544、552/560、568/576、584/592、600/608。
39.一种包含权利要求28-38中任一项所述多核苷酸分子的载体。
40.一种包含权利要求39所述载体的分离细胞。
41.一种MAGE-A4相关疾病或障碍受试者的治疗方法，包括向受试者施用权利要求40所述的多个细胞，从而对受试者进行治疗。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述MAGE-A4相关疾病或障碍为MAGE-A4相关癌症。
43.根据权利要求43所述的方法，其中，所述MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中，向受试者联合施用所述多个细胞以及第二治疗剂。
45.一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列GVYDGREHTV(SEQ ID NO:612))(MAGE-A4 230-239)特异性结合的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含一个互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区3(CDR3)包含在以下任一序列的一个α链可变结构域内：SEQ ID NO:620、636、652、668、684、700、716、732、748、764、780、796、812、828、844和860。
46.一种与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列GVYDGREHTV(SEQ ID NO:612))(MAGE-A4 230-239)特异性结合的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含一个互补决定区3(CDR3)，所述互补决定区3(CDR3)包含在以下任一序列的一个β链可变结构域内：SEQ ID NO:628、644、660、676、692、708、724、740、756、772、788、804、820、836、852和868。
47.根据权利要求45所述的TCR，其中，所述α链可变结构域进一步包含一个CDR1和一个CDR2，其中，所述CDR1包含表6中所列的任一α链可变结构域CDR1氨基酸序列，所述CDR2单独包含表6中所列的任一α链可变结构域CDR2氨基酸序列。
48.根据权利要求46所述的TCR，其中，所述β链可变结构域进一步包含一个CDR1和一个CDR2，其中，所述CDR1包含表6中所列的任一β链可变结构域CDR1氨基酸序列，所述CDR2单独包含表6中所列的任一β链可变结构域CDR2氨基酸序列。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的TCR，其中，所述TCR包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。
50.根据权利要求49所述的TCR，其中，所述TCR包含一个TCRα链可变结构域和一个TCRβ链可变结构域。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的TCR，包含α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一α链可变结构域序列内)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一β链可变结构域序列内)。
52.根据权利要求45-51中任一项所述的TCR，包含一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
53.根据权利要求45-52中任一项所述的TCR，包含一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
54.根据权利要求45-53中任一项所述的TCR，包含：(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
55.根据权利要求46-54中任一项所述的TCR，包含：
(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838和854；
(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839和855；
(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840和856；
(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846和862；
(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:623、639、655、671、687、703、719、735、751、767、783、799、815、831、847和863；以及
(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848和864。
56.根据权利要求55所述的TCR，包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、636/644、652/660、668/676、684/692、700/708、716/724、732/740、748/756、764/772、780/788、796/804、812/820、828/836、844/852和860/868。
57.根据权利要求55所述的TCR，包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、620/644、620/660、620/676、620/692、620/708、620/724、620/740、620/756、620/772、620/788、620/804、620/820、620/836、620/852、620/868、636/628、636/644、636/660、636/676、636/692、636/708、636/724、636/740、636/756、636/772、636/788、636/804、636/820、636/836、636/852、636/868、652/628、652/644、652/660、652/676、652/692、652/708、652/724、652/740、652/756、652/772、652/788、652/804、652/820、652/836 652/852、652/868、668/628、668/644、668/660、668/676、668/692、668/708、668/724、668/740、668/756、668/772、668/788、668/804、668/820、668/836、668/852、668/868、684/628、684/644、684/660、684/676、684/692、684/708、684/724、684/740、684/756、684/772、684/788、684/804、684/820、684/836、684/852、684/868、700/628、700/644、700/660、700/676、700/692、700/708、700/724、700/740、700/756、700/772、700/788、700/804、700/820、700/836、700/852、700/868、716/628、716/644、716/660、716//676、716/692、716/708、716/724、716/740、716/756、716/772、716/788、716/804、716/820、716/836、716/852、716/868、732/628、732/644、732/660、732/676、732/692、732/708、732/724、732/740、732/756、732/772、732/788、732/804、732/820、732/836、732/852、732/868、748/628、748/644、748/660、748/676、748/692、748/708、748/724、748/740、748/756、748/772、748/788、748/804、748/820、748/836、748/852、748/868、764/628、764/644、764/660、764/676、764/692、764/708、764/724、764/740、764/756、764/772、764/788、764/804、764/820、764/836、764/852、764/868、780/628、780/644、780/660、780/676、780/692、780/708、780/724、780/740、780/756、780/772、780/788、780/804、780/820、780/836、780/852、780/868、796/628、796/644、796/660、796/676、796/692、796/708、796/724、796/740、796/756、796/772、796/788、796/804、796/820、796/836、796/852、796/868、812/628、812/644、812/660、812/676、812/692、812/708、812/724、812/740、812/756、812/772、812/788、812/804、812/820、812/836、812/852、812/868、828/628、828/644、828/660、828/676、828/692、828/708、828/724、828/740、828/756、828/772、828/788、828/804、828/820、828/836、828/852、828/868、844/628、844/644、844/660、844/676、844/692、844/708、844/724、844/740、844/756、844/772、844/788、844/804、844/820、844/836、844/852、844/868、860/628、860/644、860/660、860/676、860/692、860/708、860/724、860/740、860/756、860/772、860/788、860/804、860/820、860/836、860/852和860/868。
58.根据权利要求45-57中任一项所述的TCR，进一步包含一个可检测部分。
59.根据权利要求45-57中任一项所述的TCR，其中，所述分离TCR的靶上结合值/脱靶结合值大于5、大于10、大于15、大于20、大于50、大于100、大于200、大于300、大于400、大于500、大于600、大于700、大于800、大于900或大于1000。
60.根据权利要求61所述的TCR，其中，所述分离TCR的靶上结合值/脱靶结合值大于10。
61.根据权利要求61所述的TCR，其中，所述分离TCR的靶上结合值/脱靶结合值大于500。
62.一种竞相与权利要求45-61中任一项所述的分离TCR结合的TCR。
63.一种药物合成物，包含权利要求45-61中任一项所述的TCR和一种可药用载体或稀释剂。
64.一种呈递权利要求45-61中任一项所述TCR的分离细胞。
65.一种包含一个多核苷酸序列(对权利要求45、47和49-61中任一项所述TCR的α链可变结构域进行编码)的多核苷酸分子。
66.一种包含一个多核苷酸序列(对权利要求46、48和49-61中任一项所述TCR的β链可变结构域进行编码)的分离多核苷酸分子。
67.一种包含权利要求65或66所述多核苷酸序列的载体。
68.一种表达权利要求67所述载体的分离细胞。
69.一种MAGE-A4相关疾病或障碍受试者的治疗方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求45-61中任一项所述的TCR、权利要求63所述的药物合成物或权利要求64所述的分离细胞，从而对受试者进行治疗。
70.根据权利要求69所述的方法，其中，所述MAGE-A4相关疾病或障碍为MAGE-A4相关癌症。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中，向受试者联合施用所述TCR、药物合成物或细胞以及第二治疗剂。
73.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中，所述施用采用胃肠外途径。
74.一种对T细胞受体(TCR)进行编码的多核苷酸分子，其中，所述TCR与HLA-A2呈递癌-睾丸抗原黑色素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽(包含氨基酸序列GVYDGREHTV(SEQ ID NO:612))(MAGE-A4 230-239)特异性结合，其中，所述TCR具有从包括以下几项的一组中选择的一种特性：(a)不与表达预测脱靶肽的细胞结合(通过发光检测确定)；(b)不与表达预测脱靶肽的细胞结合(通过流式细胞术检测确定)；(c)T细胞应答激活作用约是源自患者的MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)；以及(d)T细胞应答激活作用约是亲和力成熟的(例如，通过噬菌体呈递)MAGE-A4特异性TCR的两倍(通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物检测确定)。
75.根据权利要求74所述的多核苷酸分子，对至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域进行编码。
76.根据权利要求74所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一α链可变结构域序列内)；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3(包含在表8中所列的任一β链可变结构域序列内)。
77.根据权利要求75或76所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
78.根据权利要求74-77中任一项所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
79.根据权利要求74-78中任一项所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含(a)一个α链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列α链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性；以及(b)一个β链可变结构域，其氨基酸序列与表8中所列β链可变结构域氨基酸序列中任一氨基酸序列的整条氨基酸序列具有至少85％的氨基酸一致性。
80.根据权利要求74-79中任一项所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含：
(a)一个α链可变结构域CDR1结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838和854；
(b)一个α链可变结构域CDR2结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839和855；
(c)一个α链可变结构域CDR3结构域，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQID NO:616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840和856；
(d)一个β链可变结构域CDR1，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846和862；
(e)一个β链可变结构域CDR2，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:623、639、655、671、687、703、719、735、751、767、783、799、815、831、847和863；以及
(f)一个β链可变结构域CDR3，从包括以下几项的一组中选择其氨基酸序列：SEQ IDNO:624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848和864。
81.根据权利要求80所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、636/644、652/660、668/676、684/692、700/708、716/724、732/740、748/756、764/772、780/788、796/804、812/820、828/836、844/852和860/868。
82.根据权利要求80所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对：SEQ ID NO:620/628、620/644、620/660、620/676、620/692、620/708、620/724、620/740、620/756、620/772、620/788、620/804、620/820、620/836、620/852、620/868、636/628、636/644、636/660、636/676、636/692、636/708、636/724、636/740、636/756、636/772、636/788、636/804、636/820、636/836、636/852、636/868、652/628、652/644、652/660、652/676、652/692、652/708、652/724、652/740、652/756、652/772、652/788、652/804、652/820、652/836、652/852、652/868、668/628、668/644、668/660、668/676、668/692、668/708、668/724、668/740、668/756、668/772、668/788、668/804、668/820、668/836、668/852、668/868、684/628、684/644、684/660、684/676、684/692、684/708、684/724、684/740、684/756、684/772、684/788、684/804、684/820、684/836、684/852、684/868、700/628、700/644、700/660、700/676、700/692、700/708、700/724、700/740、700/756、700/772、700/788、700/804、700/820、700/836、700/852、700/868、716/628、716/644、716/660、716//676、716/692、716/708、716/724、716/740、716/756、716/772、716/788、716/804、716/820、716/836、716/852、716/868、732/628、732/644、732/660、732/676、732/692、732/708、732/724、732/740、732/756、732/772、732/788、732/804、732/820、732/836、732/852、732/868、748/628、748/644、748/660、748/676、748/692、748/708、748/724、748/740、748/756、748/772、748/788、748/804、748/820、748/836、748/852、748/868、764/628、764/644、764/660、764/676、764/692、764/708、764/724、764/740、764/756、764/772、764/788、764/804、764/820、764/836、764/852、764/868、780/628、780/644、780/660、780/676、780/692、780/708、780/724、780/740、780/756、780/772、780/788、780/804、780/820、780/836、780/852、780/868、796/628、796/644、796/660、796/676、796/692、796/708、796/724、796/740、796/756、796/772、796/788、796/804、796/820、796/836、796/852、796/868、812/628、812/644、812/660、812/676、812/692、812/708、812/724、812/740、812/756、812/772、812/788、812/804、812/820、812/836、812/852、812/868、828/628、828/644、828/660、828/676、828/692、828/708、828/724、828/740、828/756、828/772、828/788、828/804、828/820、828/836、828/852、828/868、844/628、844/644、844/660、844/676、844/692、844/708、844/724、844/740、844/756、844/772、844/788、844/804、844/820、844/836、844/852、844/868、860/628、860/644、860/660、860/676、860/692、860/708、860/724、860/740、860/756、860/772、860/788、860/804、860/820、860/836、860/852和860/868。
83.根据权利要求33所述的多核苷酸分子，其中，所述TCR包含：
(a)一个α链可变结构域CDR1，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:617、633、649、665、681、697、713、729、745、761、777、793、809、825、841和857；
(b)一个α链可变结构域CDR2，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:618、634、650、666、682、698、714、730、746、762、778、794、810、826、842和858；
(c)一个α链可变结构域CDR3，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:619、635、651、667、683、699、715、731、747、763、779、795、811、827、843和859；
(d)一个β链可变结构域CDR1，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849和865；
(e)一个β链可变结构域CDR2，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:626、642、658、674、690、706、722、738、754、770、786、802、818、834、850和866；以及
(f)一个β链可变结构域CDR3，由从包括以下几项的一组中选择的核酸序列进行编码：SEQ ID NO:627、643、659、675、691、707、723、739、755、771、787、803、819、835、851和867。
84.根据权利要求83所述的分离核酸分子，其中，所述TCR包含一个从包括以下几项的一组中选择的α链可变结构域/β链可变结构域核酸序列对：SEQ ID NO:621/629、637/645、653/661、669/677、685/693、701/709、717/725、733/741、749/757、765/773、781/789、797/805、813/821、829/837、845/853和861/869。
85.一种包含权利要求74-84中任一项所述分离核酸分子的多核苷酸序列的载体。
86.一种包含权利要求85所述载体的分离细胞。
87.一种MAGE-A4相关疾病或障碍受试者的治疗方法，包括向受试者施用权利要求86所述的细胞，从而对受试者进行治疗。
88.根据权利要求87所述的方法，其中，所述MAGE-A4相关疾病或障碍为MAGE-A4相关癌症。
89.根据权利要求88所述的方法，其中，所述MAGE-A4相关癌症为脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结直肠癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤或复发性非小细胞肺癌。
90.根据权利要求87-89中任一项所述的方法，其中，向受试者联合施用所述细胞以及第二治疗剂。
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