CN103374067A - 一种在哺乳细胞中制备he4重组蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在哺乳细胞中制备HE4重组蛋白的方法。具体地，本发明提供了一种分离的重组表达的糖基化人HE4蛋白及其制备方法。将人胚胎肾细胞(较佳地，人胚胎肾细胞HEK293)作为表达系统，能非常适宜地表达具有天然活性的糖基化的HE4蛋白，所述宿主细胞可以指导HE4蛋白质的正确折叠，并提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等翻译后加工功能，表达的HE4蛋白具有天然蛋白的构象及生物学特性，其分子结构、理化特性和生物学功能方面非常接近于天然HE4蛋白质，其表观分子量为11kDa-22kDa。

Description

一种在哺乳细胞中制备HE4重组蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种在哺乳细胞中制备HE4重组蛋白的方法。

背景技术

卵巢癌是常见的女性生殖器官的肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌，居于第二位。目前I期卵巢癌患者5年生存率可达90％以上，而晚期患者仅低于20％。由于卵巢深藏在骨腔内，不易检测；且患者早期常无症状，部分患者只有轻度不适反应，如腹部不适、腹部包块、压迫症状、月经紊乱及内分泌症状、消瘦等。正是由于患者早期症状不明显，故常常导致早期诊断失败。可见提高卵巢癌患者生存率的最好办法是及时准确的早期诊断。

人附睾蛋白4(HE4)编码基因最早是由Kichhoff等人于1991年从附睾上皮远端分离出来，是一种分泌的糖基化蛋白，位于染色体20q上，全长为12kb左右；通过cDNA微阵列分析，发现HE4的mRNA在卵巢癌组织中高表达，而在癌旁组织中不表达，其后越来越多的实验说明HE4具有卵巢癌诊断的价值，在中国人群中HE4与CA125联用能极大地提高诊断卵巢癌的特异性和准确性。因此HE4是卵巢癌诊断具有突破性的新标志物。

体外诊断试剂产品质量最密切相关包括各种活性抗原、重组抗原、单克隆抗体和多克隆抗体等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、中和反应用抗原或抗体、制备校准品(标准品)等。糖基化和高纯度的HE4重组蛋白是卵巢癌诊断试剂研发的重要基础，但目前的现有生产技术还不够完善。中国专利申请CN101802014A公开了一种使用杆状病毒表达系统生产HE4蛋白的方法，虽然杆状病毒表达系统属于真核表达系统，具有真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力，但这种蛋白的修饰有一定限度，也无法产生复杂的糖基侧链，造成生产的HE4蛋白无法保持其天然状态。

因本领域目前上没有成熟稳定的用于卵巢癌诊断的体外表达HE4的方法，因此迫切需要开发一种可以大量制备分子结构、理化特性和生物学功能都接近于天然HE4蛋白质的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种在哺乳细胞中制备HE4重组蛋白的方法。

本发明的另一目的是提供一种分离的、重组表达的糖基化人HE4蛋白。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的、重组表达的糖基化人HE4蛋白，所述蛋白的表观分子量为11kDa-22kDa。

在另一优选例中，所述蛋白的表观分子量约为19kDa-22kDa。

在另一优选例中，所述蛋白的表观分子量约为21kDa。

在另一优选例中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示。

在另一优选例中，所述蛋白具有或不具有His标签。

在本发明的第二方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为人胚胎肾细胞，且所述宿主细胞的染色体整合有编码HE4多肽的多核苷酸，或所述宿主细胞含有编码HE4多肽的多核苷酸的表达载体。

在另一优选例中，所述的人胚胎肾细胞为人胚胎肾细胞HEK293。

在另一优选例中，所述的HE4多肽来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自下组：鼠、兔、猪、牛、或羊。

在另一优选例中，所述的HE4多肽具有天然序列、或变异序列，或重组序列。

在另一优选例中，所述的HE4多肽具有如SEQ ID NO：3所示的序列。

在另一优选例中，所述的编码HE4多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列。

在另一优选例中，所述的宿主细胞含有1-20个含有编码HE4多肽的多核苷酸的表达载体，或1-20个拷贝的编码HE4多肽的多核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了第二方面所述宿主细胞的用途，所述的宿主细胞用于制备HE4重组蛋白。

在本发明的第四方面，提供了一种制备本发明第一方面所述HE4重组蛋白的方法，包括步骤：(1)在合适条件下培养本发明的第二方面所述的宿主细胞，获得含有HE4重组蛋白的培养物；(2)从步骤(1)的培养物中分离和/或纯化所述的HE4重组蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为对制备的HE4蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

图2为重组HE4蛋白质谱图谱局部放大图。

图3为对制备的重组HE4蛋白质谱图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，提供了一种分离的重组表达的糖基化人HE4蛋白及其制备方法。具体地，将人胚胎肾细胞，特别是人胚胎肾细胞HEK293作为表达系统，非常适宜表达具有天然活性的HE4蛋白，所述细胞能指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等翻译后加工功能，表达的HE4蛋白具有天然蛋白的构象及生物学特性，分子结构、理化特性和生物学功能方面非常接近于天然的人HE4蛋白质分子。所述HE4蛋白的表观分子量为11kDa-22kDa。在此基础上完成了本发明。

蛋白质糖基化

天然的蛋白质除了肽链外，还要进行肽链的修饰，如糖基化等，才能成为有功能的活性蛋白。根据糖链和肽链的连接方式的不同，蛋白质的糖基化可分为N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化是通过糖链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖(Glc2NAc)和肽链中某些Asn侧链酰氨基上的氮原子相连。能接有糖链的Asn必须处于Asn-X-Ser/Thr3残基构成的基序中，X可为除Pro的任意的氨基酸残基。O-糖基化的结构比N-糖基化简单，糖链较短，但是种类比N-糖基化多。肽链中可以糖基化的主要是Ser和Thr，此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸，连接的位点是这些残基侧链上的羟基氧原子。

蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分子的结构产生深远的影响：糖基化影响蛋白质分子的生物活性；对于某些蛋白质分子如人绒毛膜促性腺激素，糖基化是其发挥生物学活性必需的；改变蛋白质的糖基化可以使蛋白分子产生新的生物学活性；糖基化与蛋白质的免疫原性密切相关：糖链可诱发特定的免疫反应，又可以遮盖蛋白质表面的某些表位，从而降低其免疫原性，因此糖基化蛋白制备的抗体与非糖基化蛋白制备的抗体可能有极大的差别；糖链还参与抗原与抗体及抗体Fc段与其受体FcR的相互识别；糖基化还能增加蛋白质的稳定性以及改变加蛋白质对于蛋白酶的抗性；糖基化还可影响蛋白药物在体内的半衰期和靶向性。

蛋白质表达系统

如本文所用，术语“蛋白质表达系统”是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。目前蛋白质表达系统包括：原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物表达系统等。

大肠杆菌和枯草杆菌是最为常用的原核表达系统。该系统易操作、产量高、基因背景清晰，但是常用的细菌表达株均无糖基化能力。

酵母表达系统利用酵母表达和分泌外源蛋白，该系统虽然可以进行糖基化，但其N型和O型糖基化作用机制与高等真核细胞不同。酵母表达的人甲状旁腺素尽管有全部的生物活性，但其糖链修饰是酵母中特有的O-甘露糖基化方式。人尿激酶-纤溶酶原激活物中EGF样结构域，在天然产物和哺乳动物细胞中表达为特殊的O-岩藻糖基化，而在啤酒酵母中表达无此糖基化。此外，酵母表达系统在蛋白糖链上添加α-1，3甘露糖基，此抗原表位在人体内可以引起强烈的免疫反应。酵母表达系统对外源蛋白还可能存在过度糖基化修饰方式，以及缺乏复杂糖链修饰，因此极大影响糖蛋白的生物学功能。

昆虫细胞表达系统：昆虫细胞能以真核生物方式高效率地生产重组蛋白，其中杆状病毒转染的昆虫细胞是最重要的昆虫表达系统。但昆虫细胞表达系统的糖基化修饰也不够完全。Sf9细胞表达的重组人绒毛膜促性腺素β亚基与天然糖蛋白上唾液酸化的O-糖链不同；在Sf9细胞中表达的重组人白介素-2和重组人α2-干扰素，也仅有Gal-GalNAc和GalNAc糖基；昆虫细胞仅能表达高甘露糖型N-糖链(Man2-9GlcNAc2)，缺乏延长五糖核心结构生成复杂型或杂合型糖链的能力。

哺乳动物细胞表达系统：哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，其表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白质。已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达、大量制备和生产，如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子VIII、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素III，集落刺激因子等。

本发明利用人胚胎肾细胞HEK293成功表达并成功纯化接近天然糖基化修饰的HE4蛋白。所述宿主细胞表达重组HE4蛋白的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，表达的HE4蛋白具有天然蛋白的构象及生物学特性，表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子，在活性方面远胜于其他表达系统。

HE4蛋白和基因

天然HE4的cDNA基因全长375bp，编码125个氨基酸残基，在本发明中，术语“HE4蛋白”或“HE4多肽”可互换使用，它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的，也可以包含或不包含his标签序列。此外，该术语还包括全长的HE4及其片段，尤其是分泌性片段(或分泌性蛋白)。本发明所指的HE4多肽包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。HE4分泌性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示。本发明的HE4蛋白包括糖基化和非糖基化的蛋白，较佳地为糖基化蛋白。为提高重组蛋白产物纯度，体外重组的HE4蛋白C端具有加入8×His tag。

在本发明中，术语“HE4基因”是指编码HE4蛋白的核苷酸序列，较佳地，HE4基因的序列如SEQ ID NO：1所示。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了HE4的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的HE4核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列，然后可将该DNA序列引入DNA载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含HE4编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，转化本发明的表达系统，生产重组的HE4蛋白，一般来说有以下步骤：

(1)用编码HE4多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导本发明的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化HE4蛋白质。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、电穿孔、脂质体包装，腺病毒和慢病毒转导等。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

蛋白鉴定

生物材料的生产和鉴定具有严格的标准，如纯度和分子量，蛋白质浓度、效价、功能试验等。从外观来看，大部分优质生物原料为澄清透明液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含有其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。从纯度和分子量方面来讲，利用适宜的方法(如电泳扫描仪或高效液相法)进行测定。在蛋白浓度方法，可以通过Lowry法、280nm光吸收法、双缩脲方法等进行检测。效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等。本领域的普通技术人员可以熟练使用通用方法进行以上的鉴定操作。

本发明的主要优点在于：

(1)采用完整的全长蛋白，提供完整的蛋白抗原分子和标准品蛋白真核哺乳细胞表达平台保证天然结构和天然修饰的重组蛋白制备；

(2)以最天然的方式表达和分泌HE4蛋白，保证蛋白的结构正确；

(3)优化蛋白表达流程保证高效表达；

(4)优化纯化技术，非常迅捷高效的亲和纯化保证蛋白的特异性和高纯度高纯化得率；

(5)从基因到蛋白的全流程管理和优化保证重组蛋白的结构和活性，保证优质高效的重组蛋白制备。

(6)本发明的充分糖基化重组HE4蛋白可以用于制备特异性抗体，或用于肿瘤患者HE4蛋白的临床检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1构建表达载体

1.1确定基因序列

选择下面的cDNA序列作为待表达的HE4核苷酸序列：

atgcctgctt gtcgcctagg cccgctagcc gccgccctcc tcctcagcct gctgctgttc       60

ggcttcaccc tagtctcagg cacaggagca gagaagactg gcgtgtgccc cgagctccag       120

gctgaccaga actgcacgca agagtgcgtc tcggacagcg aatgcgccga caacctcaag       180

tgctgcagcg cgggctgtgc caccttctgc tctctgccca atgataagga gggttcctgc       240

ccccaggtga acattaactt tccccagctc ggcctctgtc gggaccagtg ccaggtggac       300

agccagtgtc ctggccagat gaaatgctgc cgcaatggct gtgggaaggt gtcctgtgtc       360

actcccaatt tcgaattcca tcatcaccat caccaccatc attaa                       405

(SEQ ID NO.：1)。

其HE4_His前体蛋白序列为：

MPACRLGPLAAALLLSLLLFGFTLVSGTGAEKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPNDKEGSCPQVNINFPQLGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNFEFHHHHHHHH

(SEQ ID NO.：2)。

HE4_His去除前30个信号肽后蛋白序列为：

EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPNDKEGSCPQVNINFPQLGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNFEFHHHHHHHH

(SEQ ID NO.：3)。

1.2根据核苷酸序列设计克隆用引物

引物1：AAACGGATCTCTAGCGAATTCATGCCTGCTTGTCGCCTAGG(SEQ ID NO.：4)；

引物2：

CGAGCGGCCGCTAGCAAGCTTAATGATGGTGGTGATGGTGATGATGGAATTCGAAATTGGGAGTGACACAGG(SEQ ID NO.：5)

1.3PCR扩增和PCR产物纯化

PCR扩增体系见表1。

表1

PCR体系反应组分	体积(μl)
		10×PCR buffer	5
dNTPs	1
		高保真Taq酶	1
5‘引物	1
		3‘引物	1
模版质粒	1
		Milliq H2O	40
反应体系总体积(μl)	50

PCR体系加入5倍体积的PB，将Spin柱放于2ml收集管上，加样品溶液，14Krpm，离心1min，弃去排出液。加0.75ml PE，14Krpm，离心1min；弃去排出液，14Krpm，离心1min；将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中；往Spin柱的膜中央加入50μl的洗脱缓冲液(或milliq H₂O)，静置2min，14Krpm，离心1min，收集样品。

1.4酶切和酶切产物纯化

双酶切；市售的pM载体和PCR产物分别进行双酶切(反应体系均为30μl，37℃水浴酶切2小时)：双酶切后的载体和PCR产物用胶回收试剂盒割胶回收，割胶并称重，加3倍体积的QG(胶块每100mg约合100μl的体积)，50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解，将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中，加样品溶液，14Krpm，离心1min，弃去排出液，加0.75ml PE，14Krpm，离心1min，弃去排出液，14Krpm，离心1min，将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中，向Spin柱的膜中央加入50μl的洗脱缓冲液(或milliq H₂O)，静置2min，14Krpm，离心1min，获得切好的载体片段和HE4基因片段。

1.5连接

上述双酶切产物经过纯化，在T4-DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下见表2。

表2

连接反应组分	体积(μl)
		载体	2
PCR片段	6
		10×T4连接酶buffer	1
T4-DNA连接酶	1
		反应总体积(μl)	10

1.6转化

取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min，置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1min，最后均匀涂布在含有100ng/ml抗生素的LB平板上(100-150μl)。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。

1.7抽提质粒

使用市售的质粒抽提试剂盒进行：用1.5ml管离心收集细菌，加入250μl的预冷的P1，打匀后在震荡仪上高速震荡1min；加入250μl P2，温和颠倒数次混匀；加入冰上预冷的溶液N3 350μl，迅速温和颠倒混匀，至出现分散的絮状沉淀；冰上静置2min后离心，13000rpm，10min；小心吸取上清于蓝色的spin柱中；离心13000rpm，1min，弃流出液，加入75μl PE，离心13000rpm，1min，弃流出液；再离心一次，离心13000rpm，1min，弃流出液，以让管内彻底干燥；将spin柱拿出，置于一干净的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入30μl MilliQ H²O，或者洗脱缓冲液，室温静置2min；13000rpm，1min，收好流出液，测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，计算质粒浓度。

1.8质粒PCR鉴定和测序复核

以质粒作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在1％凝胶上进行电泳分析。PCR鉴定阳性质粒送测序复核序列和读框，结果表明，本实施例已经成功地构建了含有HE4基因的表达载体。

实施例2蛋白表达系统

本实施例选用市售的人胚胎肾细胞HEK293作为宿主细胞，HEK293每周传代两到三次，稀释程度使得下次传代前细胞处于良好状态。

细胞铺板准备：用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异，一般转染时，贴壁细胞密度为70％-90％，悬浮细胞密度为2×10⁶-4×10⁶。转染时细胞没有长满或处于静止期。

细胞转染：将细胞以1×10⁵-2×10⁵/cm²的密度接种细胞，于无菌试管中准备以下两种溶液：A液：将2μgDNA溶于100μl无血清培养液；B液：将12μl脂质体溶于100μl无血清培养液中，将A液与B液混合并混匀，室温孵育30min，以形成DNA和脂质体复合体，将此复合体加入到细胞中，轻轻混匀。将细胞放入5％CO₂，37℃培养箱中培养继续培养，72h后1000rpm离心分离细胞。

实施例3蛋白质纯化

3.1主要缓冲溶液

NTA-0Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.3M NaCl，10％Glycerol；

NTA-25Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.3M NaCl，10％Glycerol，25mMImidazole(咪唑)；

NTA-250Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.3M NaCl，10％Glycerol，250mMImidazole(咪唑)。

3.2样品准备

收集转染后细胞培养上清，培养基1000rpm离心，去除细胞碎片后置于-70度冰箱保存或立即进行层析操作。

3.2层析

将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗。将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况，层析用5倍NTA体积的NTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右；分别用5倍NTA体积的NTA-25，NTA-250Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积；SDS/PAGE电泳分析确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况；收集纯化好的目标蛋白透析到保存buffer，分装后-80℃冰箱保存备用。

实施例4HE4蛋白质的鉴定

对实施例3制备的HE4蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见高纯度蛋白(图1，E1-E6)，带型较宽，主要条带位于分子量19-22kDa之间，大于理论分子量11.4kDa，是糖基化修饰蛋白电泳的表现。

质谱分析该纯化的重组HE4蛋白，结果发现主要蛋白峰分子量在预期11.4kDa附近，但由于糖基化的存在，在分子量12750Da至16250Da之间见很多小的组分峰(图2，图3)，表明存在多种方式的糖基化修饰。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的、重组表达的糖基化人HE4蛋白，其特征在于，所述蛋白的表观分子量为11kDa-22kDa；

较佳地，所述蛋白的表观分子量约为19kDa-22kDa；更佳地所述蛋白的表观分子量约为21kDa。

2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.：3所示。

3.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有或不具有His标签。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为人胚胎肾细胞，且所述宿主细胞的染色体整合有编码HE4多肽的多核苷酸，或所述宿主细胞含有编码HE4多肽的多核苷酸的表达载体。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的人胚胎肾细胞为人胚胎肾细胞HEK293。

6.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的HE4多肽具有天然序列、或变异序列，或重组序列。

7.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的HE4多肽具有如SEQID NO：3所示的序列。

8.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的编码HE4多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列。

9.权利要求4所述宿主细胞的用途，其特征在途，所述的宿主细胞用于制备HE4重组蛋白。

10.一种制备权利要求1所述HE4重组蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)在合适条件下培养权利要求4所述的宿主细胞，获得含有HE4重组蛋白的培养物；

(2)从步骤(1)的培养物中分离和/或纯化HE4重组蛋白。

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