CN110305903A

CN110305903A - 重组人促卵泡激素及其制备方法

Info

Publication number: CN110305903A
Application number: CN201910704414.5A
Authority: CN
Inventors: 彭红卫; 张玉晶; 张磊; 王冲; 叶凡; 俞峻红; 赵家跟; 李晓鹏; 俞亚波
Original assignee: Chengdu Zeyan Biotechnology Co Ltd; Upper Seascape Pool Bioisystech Co Ltd; Jiangsu Jingze Biomedical Co Ltd
Current assignee: Chengdu Jingze Biopharmaceutical Co ltd; Jingze Biomedical Hefei Co ltd; Shanghai Jingze Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2039-07-31
Also published as: CN110305903B

Abstract

本发明提供了一种重组人促卵泡激素及其制备方法。具体地，包括步骤：(1)将用于表达FSHα亚基的第一表达盒和用于表达FSHβ亚基的第二表达盒可操作地插入真核表达载体中，获得能表达FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白的转染载体；(2)将所述转染载体转入真核细胞，从而获得染色体中整合有所述第一表达盒和第二表达盒的经转化的真核细胞；(3)在适合表达的条件下，培养所述的经转化的真核细胞，表达所述的FSHα亚基和FSHβ亚基,从而获得含重组促卵泡激素的发酵产物；(4)对所述发酵产物进行分离纯化，从而制得重组促卵泡激素。本发明的方法可以替代现有人FSH的使用和制备方法，获得的活性和纯度均显著提高的rhFSH。

Description

重组人促卵泡激素及其制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质技术领域，尤其涉及卵泡激素活性的多肽、多肽的制备方法。

背景技术

由于FSH合成和分泌不足所致的FSH浓度过低是女性和男性不孕不育的主要原因。在女性中，这一状态的特征表现为不排卵或排卵异常；在男性中，可能会由于没有足够量的有活力的精子产生而导致不育。在不孕不育的诊断和治疗中，FSH是发挥着重要作用的生物活性分子，在人类辅助生殖技术中FSH 扮演着重要的角色，是目前市场上常见的用于治疗男女不孕症的主要药物之一。

FSH是一种异源二聚体糖蛋白，分子量约为31KD，由非共价结合的α亚基和β亚基组成，其中α亚基相对分子质量约14KD，由92个氨基酸残基组成，含 2个N糖链、5个二硫键；β亚基相对分子质量约17KD，由111个氨基酸残基组成，含2个N糖链、6个二硫键。α亚基和β亚基在转录后都经过糖基化，研究表明该蛋白质糖基化对其生物活性十分重要，是其发挥活性作用的关键。因此，必须采用真核细胞系统表达，该蛋白才有活性。

FSH骨架上糖链数目的多少及单糖组成在一定程度上决定着其体内生物活性的高低与半衰期的长短。采用化学或酶解的方法解离除去糖链，FSH的生物活性降低，直到消失，且α链上糖链的解离对激素的影响比β链更大。FSH 在脱去糖链后，FSH与受体的结合能力反而会增强，但几乎完全失去体内生物学活性，成为FSH的天然拮抗剂。FSH的糖基侧链主要包含己糖、氨基己糖、岩藻糖及唾液酸4类分子，其中唾液酸的含量与FSH的体内生物学活性及半衰期密切相关。唾液酸含量高的FSH等电点较低，体内生物活性较高，半衰期也稍长；高唾液酸结构能够降低FSH等电点，低等电点FSH蛋白在血液循环过程中与肝网状内皮细胞表面特异性蛋白受体结合能力降低而不易被肝脏摄取降解，从而延长体内半衰期。

已经从垂体和绝经后尿液中分离出人FSH(EP 322,438、 CN200910051483.7、CN200910048954.9、CN200910053274.6、 CN200910048718.7、CN02136493.1)，

尿源提取的FSH在糖基结构上的差异而造成的FSH异构体生物活性上的差异，产品的质量和产量不高，污染大及潜在病原微生物感染。对于其制备， CN88103966号公开了采用免疫层析和逆相HPLC步骤从绝经后尿促性腺激素中纯化人FSH(hFSH)。

目前，利用DNA重组技术生产的重组人卵泡刺激素(rhFSH)已问世，分别是瑞士雪兰诺公司的果纳芬和荷兰欧加农公司的普丽康。在中国市场上，2004 年上市的雪兰诺公司的果纳芬占垄断地位，欧加农公司的普丽康2006年2月在中国上市，与雪兰诺展开了激烈的市场争夺。果纳芬和普丽康属于重组人促卵泡生成素，其中促卵泡生成素纯度超过99％，作用稳定，因此具有很大优势。由于技术力量和经费的原因，重组FSH产品明显比尿源FSH产品更昂贵，一般的患者经济上难以负担。

因此，本领域迫切需要开发一种具有高纯度和高比活性的重组FSH及其制备技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种具有高纯度和高比活性的重组FSH及其制备技术。

在本发明的第一方面，提供了一种重组促卵泡激素的制备方法，其包括，

(1)将用于表达FSHα亚基的第一表达盒和用于表达FSHβ亚基的第二表达盒可操作地插入真核表达载体中，获得能表达FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白的转染载体；

(2)将所述转染载体转入真核细胞，从而获得染色体中整合有所述第一表达盒和第二表达盒的经转化的真核细胞；

(3)在适合表达的条件下，培养所述的经转化的真核细胞，表达所述的FSHα 亚基和FSHβ亚基,从而获得含重组促卵泡激素的发酵产物；

(4)对所述发酵产物进行分离纯化，从而制得重组促卵泡激素。

在另一优选例中，在步骤(4)中，包括步骤：对所述发酵产物的上清液依次进行：

(b1)硫酸铵沉淀；

(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；

(b3)低PH孵育灭活病毒；和

(b4)反相色谱层析(RPC)；

其中，步骤(b1)、(b2)、(b3)和(b4)不可以以任意次序进行。

在另一优选例中，所述重组人促卵泡激素的比活性大于12200IU/mg。

在另一优选例中，所述重组人促卵泡激素的比活性大于12300IU/mg。

在另一优选例中，所述重组人促卵泡激素的比活性为12350～12400IU/mg。

在另一优选例中，所述重组人促卵泡激素的比活性为12390IU/mg。

在另一优选例中，所获得的重组人促卵泡激素的纯度大于，更优选 >99.90％w/w，甚至更优选>99.99％w/w。

在另一优选例中，所述FSHα亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在另一优选例中，所述FSHβ亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在另一优选例中，FSHα亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，FSHβ亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在另一优选例中，所述真核表达载体是哺乳动物表达载体。

在另一优选例中，所述真核表达载体是PGM载体。

在另一优选例中，将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因分别插入PGM载体中的 Not I/Apa I酶切位点之间和Hind III/BamH I酶切位点之间。

在另一优选例中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述真核细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

在另一优选例中，所述真核细胞是CHO-S细胞。

在另一优选例中，所述的硫酸铵沉淀的条件包括：pH为7.1-8.5，较佳地7.2至8.0，最佳地7.3至7.6。

在另一优选例中，在步骤(b1)中，用无机酸和/或碱进行pH调节。

在另一优选例中，在步骤(b1)中，用氨水和/或硫酸进行pH调节。

在另一优选例中，所述的硫酸铵沉淀的条件包括：硫酸铵浓度40％-60％，较佳地42％-49％，更佳地43％-47％,最佳地44％-45％。

在另一优选例中，在步骤(b2)中，疏水相互作用色谱法使用的选自下组的层析介质：Capto Phenyl(HS)、Capto Butyl、Butyl Sepharose 4FF、Butyl Sepharose 4FF (HS)、Octyl Sepharose 4FF、Phenyl Sepharose 6 FF(LS)、Phenyl Sepharose 6 FF(HS)、Phenyl Sepharose Big Beads、Phenyl Sepharose 6 FF、Phenyl Sepharose HP、ButylSepharose HP、Butyl Sepharose 4B、Octyl Sepharose CL-4B、Phenyl Sepharose CL-4B，或其组合。

在另一优选例中，在步骤(b2)中，所述疏水层析是phenyl sepharose 6 fastflow(high sub)疏水层析，并且分子排阻层析是Superdex 75 prep grade分子排阻层析。

在另一优选例中，在步骤(b3)中，低PH孵育灭活病毒的条件包括：pH2.5-4.5，较佳地pH3-4。

在另一优选例中，在步骤(b3)中，用无机酸和/或有机酸进行pH调节。

在另一优选例中，在步骤(b3)中，用柠檬酸进行pH调节。

在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)使用选自下组的基质填料：硅胶、氧化铝、氧化锆等作基质材料，包覆无机基质填料的高聚物如聚苯乙烯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯、聚丁二烯、聚环氧乙烷、聚硅氧烷、琼脂糖、聚氯甲基苯乙烯-二乙氧基甲基乙烯基硅烷、气相沉积碳、或其组合。

在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)使用的基质填料为聚苯乙烯/二乙烯苯。

在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)配体聚苯乙烯类树脂。

在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)缓冲溶液有机溶剂是乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮。

在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)缓冲溶液有机溶剂是异丙醇。

在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)缓冲溶液pH在7至8，较佳的7.2至7.8，最佳地7.4-7.6。

在另一优选例中，所述步骤(4)进一步包括(b5)反相色谱层析(RPC)。

在另一优选例中，所述步骤(4)包括步骤：

(b1)硫酸铵沉淀；

(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；

(b3)低PH孵育灭活病毒；和

(b4)反相色谱层析(RPC)。

(b5)反相色谱层析(RPC)

在另一优选例中，所述步骤(4)包括步骤：

(b1)硫酸铵沉淀；

(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；

(b3)低PH孵育灭活病毒；和

(b4)反相色谱层析(RPC)。

(b5)凝胶过滤层析(GFC)

在另一优选例中，所述步骤(4)包括步骤：

(b1)硫酸铵沉淀；

(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；

(b3)低PH孵育灭活病毒；和

(b3a)疏水相互作用色谱法(HIC)

(b4)反相色谱层析(RPC)。

(b5)凝胶过滤层析(GFC)

在另一优选例中，所述步骤(4)进一步包括一个或多个超滤和/或纳米过滤步骤。

在另一优选例中，所述步骤(4)中不进行免疫亲和纯化。

在另一优选例中，所述步骤(4)中不进行凝集素亲和纯化。

在本发明的第二方面，提供了可用于本发明第一方面所述的重组促卵泡激素的制备方法中的中间体，其选自下组：

(a)FSHα亚基基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(b)FSHβ亚基基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

(c)载体，其包含(a)和/或(b)所述的基因；

(d)细胞，其包含(a)和/或(b)所述的基因，或者其转染入了(c)所述的载体；或(e)细胞上清液，其为培养(d)所述的细胞所得的上清液。

本发明还涉及药物组合物，包含本发明的重组促卵泡激素和药学上可接受的载体或/和稀释剂。优选本发明通过注射途径来给药，更优是皮下注射。故所述药物组合物优选是粉针剂(如冻干粉针剂)和液体制剂。该药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，来治疗由于FSH不足而引起的疾病。给药方式包括，注射、口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药，优选皮下、肌内或静脉内注射。

本发明还涉及重组促卵泡激素的制备方法。优选所述制备方法包括：

(1)构建能同时表达FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因，且含有DHFR表达单元和KTPA-CMW的真核表达载体PGM。

(2)将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因可操作地插入PGM，获得能同时表达 FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白的转染载体PGM/rhFSH，其中，FSHα亚基基因包含编码FSHα亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，FSHβ亚基基因包含编码FSHβ亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列；

(3)将转染载体转染入真核细胞并培养；和

(4)将培养上清液依次经超滤、硫酸铵沉淀、疏水层析、低pH灭活病毒、反相层析、分子排阻层析、纳米膜过滤。

本发明优选亚基基因序列接近(或优选等于)其天然基因序列，优选FSHα亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，FSHβ亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还涉及一种真核表达载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体，可以是串联表达载体，但更优选是双顺反子表达载体。在本发明的具体实施方式中，真核表达载体是自行构建的PGM载体。

本发明还涉及将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因分别插入自行构建的PGM 载体中的Not I/Apa I酶切位点之间和Hind III/BamhI酶切位点之间。

本发明还涉及一种真核细胞，优选中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。在本发明的具体实施方式中，真核细胞最优选是CHO-DG44细胞株。

本发明还涉及疏水层析是phenyl sepharose 6 fast flow(high sub)(GE)；本发明涉及反相层析是Amersham SOURCE 30 RPC反相色谱填料；本发明涉及分子排阻层析是Superdex 75 prep grade；本发明涉及纳米膜过滤是采用Millipore公司的缩小规模的纳米膜滤器(Viresolve Pro)。5

另外，本发明还提供了基因、载体、细胞以及细胞培养物等，其可以作为本发明的制备方法中的中间体。

具体而言，本发明还涉及一种FSHα亚基基因，其包含编码FSHα亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，优选FSHα亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在本发明的具体实施方式中，FSHα亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还涉及一种FSHβ亚基基因，其包含编码FSHβ亚基蛋白的的cDNA 序列和上游内含子序列，优选FSHβ亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。在本发明的具体实施方式中，FSHβ亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还涉及一种载体，其包含本发明FSHα亚基和/或FSHβ亚基基因，优选包含本发明列举出来的基因。在本发明的具体实施方式中，最优选的载体是 PGM-FSHα/β。

本发明还涉及一种细胞，其包含本发明FSHα亚基和/或FSHβ亚基基因，或者其转染入了本发明PGM-FSHα/β。所述细胞优选是CHO细胞，更优选是 CHO-DG44细胞株。

本发明还涉及一种细胞上清液，其为培养本发明FSHα亚基和/或FSHβ亚基基因，或者其转染入了本发明PGM-FSHα/β的细胞所得的上清液。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了dhfr表达单元PCR产物电泳图。

图2显示了载体PBF的图谱。

图3显示了载体PGM的图谱。

图4显示了CHO-BF08工程细胞构建流程图。

图5显示了悬浮生长的CHO-BF08细胞显微形态(40X)。

图6显示了CHO-BF08细胞表达FSH的免疫斑点检测。

图7显示了纯化步骤中的疏水层析图。其中，蓝色为280nm的紫外吸收图 (UV280)。

图8显示了纯化步骤中的反相层析图。其中，蓝色为280nm的紫外吸收图 (UV280)。

图9显示了纯化步骤中的凝胶过滤层析图。其中，蓝色为280nm的紫外吸收图(UV280)，先出峰为“峰1”，后出峰为“峰2”。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种rhFSH 的制备方法。具体地，本发明人通过重组DNA技术，将本发明中的包括氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的FSHα亚基蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示的FSHβ亚基蛋白的FSH的编码基因转染至真核细胞CHO，并使用 SFM4CHO培养基悬浮培养以表达rhFSH，以及使用本发明的方法将培养上清液依次经超滤、硫酸铵沉淀、疏水层析、低pH灭活病毒、反相层析、分子排阻层析、纳米膜过滤纯化。实验数据表明，本发明中获得的最终产物正确，FSH 的生物活性高、纯度高。在此基础上完成了本发明。

重组FSH

应用DNA重组技术生产的重组人卵泡刺激素(rhFSH)具有标准化的分子量和生物学活性，安全性高而得到广泛应用，如在哺乳动物细胞中重组生产。DNA 重组制备的hFSH(rhFSH)的方法也有报道。例如，CN98807811号致力于通过引入二硫键来稳定FSH，而CN99808813和CN200480032665则通过引入一些突变来提高性能及稳定性，US60759486和US60499802通过糖基化来提高性能，但是这些蛋白结构的改变将增加该突变的FSH被机体识别为异源蛋白的隐患，从而在体内使用时带来免疫风险。

本发明人研制了不同于现有技术的FSH制备方法，在DNA水平上做了大幅度的优化，但不在最终产物的蛋白质水平上引入新的突变，即最终产物与天然hFSH的蛋白质一级结构相同，翻译产物正确，避免了体内用药时的免疫风险；另外在转染、培养以及后期纯化中进行了全面优化。最终，本发明人不但获得了表达水平高的rhFSH，更令人意想不到的是，获得的rhFSH的活性进一步得到了提高，比活和高纯度高于现有技术所报道的。

本发明所提供的高比活和纯度性的重组促卵泡激素，其比活性大于 12200IU/mg，优选大于12300IU/mg，最优选为12350～12400IU/mg，如12390IU/mg。其纯度大于99.80％w/w，优选大于99.90％w/w，最优选为大于99.99％w/w。

重组促卵泡激素优选是哺乳动物的重组促卵泡激素，最优选是重组人促卵泡激素(rhFSH)，该重组人促卵泡激素包括氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的FSH α亚基蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的FSHβ亚基蛋白。在本文中，重组是指通过使用重组DNA技术产生的FSH，而不是通过从天然来源分离提取的，例如不是从尿液中提取的，例如不是从血液中提取。

本发明方法

本发明提供了一种重组促卵泡激素的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建能同时表达FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因，且含有DHFR表达单元和KTPA-CMV的真核表达载体PGM。

(2)将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因可操作地插入PGM，获得能同时表达FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白的转染载体PGM/rhFSH，其中，FSHα亚基基因包含编码FSHα亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，FSHβ亚基基因包含编码FSHβ亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列；

(3)将转染载体转染入真核细胞并培养；和

在本文中，可操作地插入表示根据基因序列和载体序列将基因插入载体从而能够进行表达。通常，将基因置于启动子序列和转录终止序列之间并保持阅读框一致。

根据蛋白序列可以推导出大量的基因序列，但是不同基因序列的转录和表达的效率会有很大差异。尽管有基于表达宿主的密码子使用频率的优化密码子的手段，但是基因序列的优化仍旧带有很大的经验性。本发明涉及亚基基因序列接近(或优选等于)其天然基因序列，基于基因序列优化设计技术，对FSHα亚基基因和FSH β亚基基因做了18个序列(8个FSHα亚基基因和10个FSHβ亚基基因)，优选包括以下2个序列，

FSHα亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，FSHβ亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

atggattactacagaaaatatgcagctatctttctggtcacattgtcggtgtttctgcatgttctccattccgctcctgatgtg caggattgcccagaatgcacgctacaggaaaacccattcttctcccagccgggtgccccaatacttcagtgcatgggctgctg cttctctagagcatatcccactccactaaggtccaagaagacgatgttggtccaaaagaacgtcacctcagagtccacttgctgt gtagctaaatcatataacagggtcacagtaatggggggtttcaaagtggagaaccacacggcgtgccactgcagtacttgttatt atcacaaatcttaa(SEQ ID NO:3)

atgaagacactccagtttttcttccttttctgttgctggaaagcaatctgctgcaatagctgtgagctgaccaacatcacca ttgcaatagagaaagaagaatgtcgtttctgcataagcatcaacaccacttggtgtgctggctactgctacaccagggatctggt gtataaggacccagccaggcccaaaatccagaaaacatgtaccttcaaggaactggtatacgaaacagtgagagtgcccggc tgtgctcaccatgcagattccttgtatacatacccagtggccacccagtgtcactgtggcaagtgtgacagcgacagcactgatt gtactgtgcgaggcctggggcccagctactgctcctttggtgaaatgaaagaataa(SEQ ID NO:4)

在另一优选例中，所述FSHα亚基基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示， FSHβ亚基基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHSAPDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQ CMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENH TACHCSTCYYHKS(SEQ ID NO:1)

MKTLQFFFLFCCWKAICCNSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTR DLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCD SDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE*(SEQ ID NO:2)

这些基因序列与现有报道的相应基因序列有差异，直接来自天然状态的基因序列，这可能是本发明的rhFSH能够高表达的原因之一。

本发明中，FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因优选包括KOZAK序列。

FSH的糖基对其生物活性有着至关重要的影响，因此需要在能够糖基化的真核生物细胞中表达的载体。本发明真核表达载体优选哺乳动物表达载体，或串联表达载体，更优选是双顺反子表达载体。

在本发明的具体实施方式中，真核表达载体是自行构建的PGM载体。该载体与CHO-DG44细胞配合，表达获得的rhFSH的糖基化模式能够获得更高的rhFSH 比活性。

本发明涉及将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因分别插入构建的PGM载体中的酶切位点之间，优选Not I/Apa I酶切位点和Hind III/BamhI酶切位点之间。这样的构建策略使得FSHα亚基和β亚基的表达尽可能不相互干扰，由此可同时表达 FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因。

FSH有两个亚基，通过多个二硫键相连，因此需要在海量的现有表达宿主细胞中选择出能够使FSH亚基正确连接的真核细胞，如哺乳动物细胞。

本发明优选真核细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，更加优选的真核细胞是 CHO-DG44细胞株。CHO-DG44细胞株相对于其他CHO细胞，表达上清液中rhFSH 的纯度更高，表达量也更高，方便了下游的纯化工作。

本发明涉及疏水层析填料是本领域已知的，包括Butyl Sepharose(GEHealthcare)，苯基Sepharose(低和高取代)，辛基Sepharose和烷基Sepharose(全部来自GE Healthcare；其它HIC树脂来源包括Biosepra，法国；E.Merck，德国； BioRad USA)。优选采用：phenyl sepharose 6 fast flow(high sub)(GE)。

本发明涉及反相层析填料包括基质填料，如硅胶、氧化铝、氧化锆，优选采用：Amersham SOURCE 30 RPC反相色谱填料。

本发明涉及分子排阻层析优选采用Superdex 75 prep grade；本发明涉及纳米膜过滤优选采用Millipore公司的缩小规模的纳米膜滤器(Viresolve Pro)。

这些下游纯化手段的组合能够生产出大大超过药品标准所需的高纯度的 rhFSH。

本发明的主要优点包括：

1)本发明提供的方法可以替代现有人FSH的使用和制备方法。

2)本发明的rhFSH的活性和纯度均很高，达到了12400IU/mg和99.99％w/w。

3)本发明的制备方法能够表达具有适宜糖基化模式的高活性rhFSH，而且表达量高，培养上清液纯度高，蛋白表达量达到67.8mg/L。

4)培养时间6-8天即结束培养，收获培养液交由下游纯化。

5)外源性DNA残留量、CHO细胞蛋白质残留量、细菌内毒素等均很低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：人FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因序列克隆

本发明人发现，FSHα亚基基因能表达最终的FSHα亚基，但是FSHα亚基的表达量不高，根据经验，通过引入酶切位点、KOZAK序列和信号肽，设计8个FSHα亚基基因序列进行表达研究，包括SEQ ID NO:1，经过研究发现设计的8个FSHα亚基序列表达量多少不一，有的表达量高，有的表达量低，其中FSHα亚基基因SEQ ID NO:1表达量最高，因此选择SEQ IDNO:1进行克隆。

此外，FSHβ亚基基因能表达最终的FSHβ亚基，但是FSHβ亚基的表达量不高，根据经验，通过引入酶切位点、KOZAK序列和信号肽，设计10个FSH β亚基基因序列进行表达研究，包括SEQ ID NO:2，经过研究发现设计的10个 FSHβ亚基序列表达量多少不一，有的表达量高，有的表达量低，其中FSHβ 亚基基因SEQ ID NO:2表达量最高，因此选择SEQ ID NO:2进行克隆。

根据实施例3的表达细胞株，这些FSHα亚基基因序列和FSHβ亚基基因序列一起小规模地在CHO-DC44细胞中瞬时表达，表达的方法与实施例4所述的方法类似。对得到的培养上清液进行ELISA分析，结果显示18个亚基基因序列有15个能够瞬时表达。FSHα亚基基因的瞬时表达水平的范围是 0-1.98μg/ml，平均值为0.67μg/ml，中值为0.51μg/ml。FSHβ亚基基因的瞬时表达水平的范围是0-1.95μg/ml，平均值为0.72μg/ml，中值为0.53μg/ml。

实施例2：PGM的产生

将pSV2-dhfr载体(ATCC 37146)上的dhfr基因表达单元克隆到pcDNA3.1(+) 载体(Invitrogen)。发明人经过设计，引入Blg II和Mlu I酶切位点，筛选得到包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO6的序列，通过常规PCR对pSV2-dhfr载体 (ATCC 37146)上的dhfr基因表达单元进行克隆。将克隆产物在1％琼脂糖凝胶 (含EB)电泳确认，其长度1.1kb，和预计相符(见图1)。dhfr基因表达单元，包括SV40早期启动子、dhfr编码区以及SV40终止及polyA信号序列。

表1-寡核苷酸

运用常规酶切体系对克隆得到的dhfr基因表达单元进行双酶切(Blg II和 MluI)，酶切片段用凝胶回收试剂盒进行回收。同样对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切(Blg II和Mlu I)，酶切片段用凝胶回收试剂盒进行回收。用SolutionI(takara 公司)将上述两个双酶切片段与用Blg II和Mlu I双酶切的pcDNA3.1(+)载体连接，获得的重组载体命名为PBF，然后转化大肠杆菌DH5α。抽提转化阳性菌株中的PBF，以Blg II和MluI双酶切，验证有约1.1kb的插入片段(图3)；测序分析获得同样结果。

构建κTpA-CMV片段(SEQ ID NO：7)，同时在上下游分别带上BamH I和 Not I酶切位点，连接在pUC57载体上，同时转入了E.Coli DH5α，提取含有 κTpA-CMV片段的质粒，含有κTpA-CMV片段的质粒和PBF载体分别经BamH I和Not I双酶切，凝胶试剂盒回收酶切片段。用SolutionI(takara公司)将上述两个双酶切片段连接，连接产物转化到E.Coli DH5α，经过验证确定为阳性克隆，即得到PGM载体(图3)。κTpA-CMV含有IgGκ轻链终止子序列—人巨细胞病毒立即早期启动子，用于启动表达基因上游以及用于终止转录。

实施例3：PGM/rhFSH构建

将pUC57载体上的FSHα基因片段经Not I和Apa I双酶切回收，然后连接到同样双酶切的pGM载体上，构建可以表达FSHα亚基的pGM/FSHα重组表达质粒。将FSHβ基因片段插入pGM/FSHα载体的Hind III和BamH I位点，构建同时表达FSH两个亚基的载体PGM/rhFSH(图3)。

实施例4：rhFSH表达细胞株建立

pGM/rhFSH质粒线性化

经过研究发现，PvuⅠ单酶切质粒PGM/rhFSH，保证了待转染的基因和序列在转染后的完整性。

转化CHO DG44细胞

生长对数期的CHO DG44细胞离心，用SFM4CHO培养基(HyClone公司) 调整细胞密度为7х10⁶个/mL。加入线性化pGM/rhFSH质粒于细胞悬液中充分混匀。电转化电压280V，电容1050μF，电阻0Ω。电转后于冰上静置3min，然后将细胞转入6孔细胞培养板，加入2mL新鲜SFM4CHO培养基，于37℃， 5％CO2培养。

G418筛选

G418压力下筛选转染了质粒PGM/rhFSH的CHO DG44细胞阳性克隆，继续培养24小时后，根据敏感性实验，更换400μg/ml G418的SFM4CHO培养基。

用培养基调整细胞，使得每孔细胞数分别达到1000、500、250、125个/mL，培养20天后观察克隆生成情况，在克隆生成率小于30％的培养板上选取单克隆细胞500个，取其上清用于ELISA初步筛选。

ELISA克隆筛选高表达rhFSH的细胞

用E90830Hu 96 Tests Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit ForFollicle Stimulating Hormone(FSH)ELISA检测FSH蛋白的表达，根据ELISA测定结果，选择其中100个表达量最高的细胞株进行后续生长及表达能力进一步考察和筛选。

将96孔板上经G418筛选的100个单克隆细胞进一步在24孔、6孔细胞培养板上扩增培养，当细胞数足够时，在6孔板进行细胞生长和表达能力考察，具体方法是：接种体积每孔2mL，细胞密度约3x10⁵个/mL，静置培养。之后每天(间隔24hr)取细胞悬液80μL，进行细胞计数，然后将剩余细胞悬液离心，上清液保留于-20℃，用于ELISA检测。

采用E90830Hu 96 Tests Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit ForFollicle Stimulating Hormone(FSH)ELISA检测FSH蛋白的表达，根据ELISA 测定结果，选取其中高表达的细胞克隆20个，用于后续的MTX加压筛选。

MTX加压克隆筛选高表达FSH的细胞

加压筛选：在含MTX的SFM4CHO培养基中于T25方瓶接种密度为 3x10⁵/mL的细胞，于37℃，5％CO2孵箱中静置培养，每3天换液传代细胞，持续15天。然后按照2.4.3提供的方法对加压后的细胞克隆进行表达能力检测，选取正常生长且表达能力没有下降的细胞克隆进入下一浓度MTX加压处理，同时冻存部分细胞。

SFM4CHO中MTX设置4个梯度，分别是20nmol/L、100nmol/L、300nmol/L 和500nmol/L。

经过MTX梯度加压，5个克隆细胞的rhFSH表达量随着MTX浓度的增加有了逐步的提高，我们选择经过MTX加压扩增的FSH38D4细胞株作为后续进一步亚克隆筛选使用，该细胞株在4个MTX梯度加压下，表达分别为0.42pcd、 1.28pcd、1.30pcd和1.33pcd。

表2-MTX加压对FSH38D4细胞株表达rhFSH的影响

MTX浓度nmol/L	20	100	300	500
					表达能力pcd	0.42	1.28	1.30	1.33

亚克隆筛选：

采用有限稀释法，进行细胞克隆，选取10个单克隆，按照MTX加压克隆筛选高表达FSH的细胞提供的方法对亚克隆细胞进行表达能力检测。最终选取一株高表达的细胞株FSH38D4-1C10为工程细胞株，重新命名为CHO-BF08，以此作为后续研究的工程细胞株。工程细胞株为适应无血清悬浮生长的细胞，显微形态为圆形(图5)。

实施例5：rhFSH表达

实施例4中获得CHO-BF08工程细胞株在10ml SFM4CHO培养基悬浮后在T75方瓶中培养两天。将生长良好的细胞接种到T75方瓶，接种密度0.3×10⁶细胞/ml。第1天取混匀的细胞悬液0.2ml，检测细胞密度后留取上清。继续培养24小时后再次取样0.2ml，检测细胞密度，留取上清。采用E90830Hu 96 Tests Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit ForFollicle Stimulating Hormone (FSH)ELISA检测取样的上清液FSH浓度，根据浓度差以及细胞数计算表达量 (表达量见表3)。CHO-BF08工程细胞株表达FSH的能力为1.7pg/细胞/天。

表3-CHO-BF08工程细胞株表达FSH的能力

实施例5中获得CHO-BF08工程细胞株表达产物进行免疫斑点检测，其表达产物的α亚基和β亚基分别用α亚基单抗、β亚基单抗分别进行杂交，室温孵育2小时，用TTBS缓冲液淋洗一次，再浸洗3次，每次8min，弃去液体。然后用HRP标记的羊抗小鼠IgG-HRP二抗进行杂交，室温孵育2小时，用TTBS 缓冲液淋洗一次，再浸洗4次，每次8min，弃去液体。DAB显色。鉴别实验结果均为阳性，工程细胞株CHO-BF08表达的FSH蛋白结构完整，符合实验预期(图6)。

实施例6：rhFSH纯化

取实施例5的工程细胞株CHO-BF08的培养上清液2000ml，用分子量截断值为或约为10kD的滤膜，滤液使用45％硫酸铵饱和溶液进行沉淀，上清液经0.65μm膜过滤，3500×g离心，收集上清液。层析柱信息见表4.

表4层析柱信息

上清液直接上样于含50mmol/L NH₄AC+50％饱和度的(NH₄)₂SO₄(pH7.4)平衡液的phenyl sepharose 6 fast flow(high sub)疏水层析柱(GE Healthcare公司)，用50mmol/L NH₄AC+27.2％饱和度的(NH₄)₂SO₄(pH7.4)进行冲洗， 50mmol/LNH₄Ac(pH7.4)进行洗脱，收集洗脱峰(图7)，0.1mol/L NaOH进行样品保存。

经疏水层析收集的样品，用50mmol/LNH₄Ac,pH7.4±0.2等体积稀释，再用0.5mol/L柠檬酸调节pH 3.60，水浴孵育(23℃)2小时，每小时取样。取样后立即用“1.0mol/L Tris”缓冲液调节pH至中性。离心，收集上清液。验证报告见《中国食品药品检定研究院检验报告(报告编号：SH201501546、SH201501547、 SH201501548)》。验证结果表明，“pH3.6±0.1、20～25℃处理120分钟后，指示病毒X-Mulv、PRV的下降滴度均大于4logs。

将收集的样品上样于含50mmol/L NH₄AC(pH7.4)平衡的Source 30 RPC反相层析柱(GE Healthcare)，用50mmol/LNH₄Ac+10％异丙醇(pH7.4)进行冲洗， 50mmol/LNH₄Ac+10％异丙醇洗脱(pH7.4)，收集洗脱峰(图8)，0.1mol/L NaOH 进行样品保存。

将收集的洗脱液上样于含10mmol/L PB(pH7.0)平衡的Superdex 75 prep grade分子排阻层析柱(GE Healthcare)，用10mmol/L PB,0.6mol/L NaCl(pH7.0) 进行冲洗，用10mmol/L PB,0.3mol/L NaCl(pH7.0)进行洗脱，收集洗脱峰(图9)， 0.1mol/L NaOH进行样品保存。

样品依次使用0.1μm的预过滤器、20nm的纳米膜滤器过滤(Viresolve Pro) 过滤，收集滤液，即获得了纯化的rhFSH。

通过此步骤和方法回收纯化蛋白质rhFSH的表观回收率是14-25％，蛋白质的浓度由氨基酸组成分析确定，其中分子量根据亚基的MALDI-TOF糖型分布最初估计是31,000Da。

实施例7：rhFSH比活性

用Steelman-Pohley卵巢重量增加方法测量纯化的rhFSH生物活性。可以用生物活性除以用SEC-HPLC法测定的FSH含量来计算比活性。结果显示，该rhFSH的体内生物学比活为15956IU/mg。

用雌性出生28～30日，体重60～80g的SD大鼠，用BF08高、中、低剂量3个组，21、42、84IU/kg/d，皮下给药，1次/天，连续3天，第4天皮下给予HCG诱发排卵，对卵巢系数和输卵管排出卵子影响，观察到21、42、84IU/kg/d 注射后，大鼠卵巢重量分别为90.5±15.8mg、130.7±35.0mg和191.5±34.3mg，卵子数分别为26±11、36±10和49±9(表7)，这些数据证实通过剂量的调节，rhFSH 趋向单一排卵。

表7 BF08对卵巢系数和输卵管排出卵子影响

实施例8：rhFSH纯度

纯化的rhFSH水解后经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定，经上述过程纯化得到的rhFSH经SEC-HPLC(Agilent Technologies公司)鉴定(三批成品纯度检测结果见表8)，峰位与我们预测的理论值一致，纯度达到99.99％.

外源性DNA残留量(QPCR)3pg/mg，CHO细胞蛋白残留量(ELISA)0.1pg/ml 先使用样品稀释缓冲液(购自CYGNUS公司，货号F1028)将待测样品总蛋白浓度调整到检测浓度(0.25mg/ml)后，用商品化试剂盒(购自CYGNUS公司，货号 F550)进行检测CHO细胞蛋白质残留量(％)小于0.017％(表10)。

应用凝胶限度试验法，检测细菌内毒素，经过上述纯化得到的rhFSH三批成品的检测结果见表11。从结果可看出，内毒素均小于或等于2.5EU/mg。

表8 BF08三批成品纯度(SEC-HPLC)检测结果

样品/批号	纯度(SEC-HPLC)
		BF08成品/20140801	99.99％
BF08成品/20140802	99.99％
		BF08成品/20140901	99.99％

表9多批原液外源性DNA残留量检测结果

表10 CHO细胞蛋白质残留量检测结果

表11细菌内毒素检测结果

样品批号	Y20140502	Y20140601	Y20140701
				检测结果	＜2.5EU/mg	＜2.5EU/mg	＜2.5EU/mg

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 江苏璟泽生物医药有限公司

上海景泽生物技术有限公司

成都泽研生物技术有限公司

<120> 重组人促卵泡激素及其制备方法

<130> P2019-0846

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro

20 25 30

Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro

35 40 45

Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro

50 55 60

Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu

65 70 75 80

Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly

85 90 95

Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr

100 105 110

Tyr His Lys Ser

115

<210> 2

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile

1 5 10 15

Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys

20 25 30

Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly

35 40 45

Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys

50 55 60

Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg

65 70 75 80

Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val

85 90 95

Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys

100 105 110

Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys

115 120 125

Glu

<210> 3

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat 60

gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca 120

ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca 180

tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag 240

tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg 300

gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a 351

<210> 4

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atgaagacac tccagttttt cttccttttc tgttgctgga aagcaatctg ctgcaatagc 60

tgtgagctga ccaacatcac cattgcaata gagaaagaag aatgtcgttt ctgcataagc 120

atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc tacaccaggg atctggtgta taaggaccca 180

gccaggccca aaatccagaa aacatgtacc ttcaaggaac tggtatacga aacagtgaga 240

gtgcccggct gtgctcacca tgcagattcc ttgtatacat acccagtggc cacccagtgt 300

cactgtggca agtgtgacag cgacagcact gattgtactg tgcgaggcct ggggcccagc 360

tactgctcct ttggtgaaat gaaagaataa 390

Claims

1.一种重组促卵泡激素的制备方法，其特征在于，包括，

(1)将用于表达FSHα亚基的第一表达盒和用于表达FSHβ亚基的第二表达盒可操作地插入真核表达载体中，获得能表达FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白的转染载体，其中，在第一表达盒中用于编码FSHα亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在第二表达盒中用于表达FSHβ亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(3)在适合表达的条件下，培养所述的经转化的真核细胞，表达所述的FSHα亚基和FSHβ亚基,从而获得含重组促卵泡激素的发酵产物；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，包括步骤：对所述发酵产物的上清液依次进行：

(b1)硫酸铵沉淀；

(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；

(b3)低PH孵育灭活病毒；和

(b4)反相色谱层析(RPC)；

其中，步骤(b1)、(b2)、(b3)和(b4)不可以以任意次序进行。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组人促卵泡激素的比活性大于12200IU/mg。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组人促卵泡激素的比活性为12390IU/mg。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所获得的重组人促卵泡激素的纯度大于，更优选>99.90％w/w，甚至更优选>99.99％w/w。

6.权利要求1所述的重组促卵泡激素的制备方法，其中，FSHα亚基的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

7.权利要求1所述的重组促卵泡激素的制备方法，其中，FSHβ亚基的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

8.权利要求1所述的重组促卵泡激素的制备方法，其中，真核表达载体是PGM载体。

9.权利要求1所述的重组促卵泡激素的制备方法，其特征在于，所述真核细胞是CHO-S细胞。

10.可用于权利要求1所述的重组促卵泡激素的制备方法中的中间体，其特征在于，选自下组：

(a)FSHα亚基基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(b)FSHβ亚基基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

(c)载体，其包含(a)和/或(b)所述的基因；

(d)细胞，其包含(a)和/或(b)所述的基因，或者其转染入了(c)所述的载体；或

(e)细胞上清液，其为培养(d)所述的细胞所得的上清液。