CN104098698B - 一种抗cd3抗体及其制法和应用 - Google Patents
一种抗cd3抗体及其制法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗CD3抗体及其制法和应用。具体地，本发明公开了一种抗CD3抗体，它具有选自下组的互补决定区的重链可变区：SEQ ID NO:11所示的CDR1，SEQ ID NO:12所示的CDR2，和SEQ ID NO:13所示的CDR3。它具有特异性结合CD3阳性细胞的特性，可用于分离人CD3阳性细胞及用于制备分离人CD3阳性细胞用的产品，经分离的细胞能够可用于临床。
Description
技术领域
本发明涉及生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及一种新的抗CD3抗体及其制法和用途。
背景技术
CD3分子广泛分布于人成熟T细胞表面，与T细胞膜表面受体TCR形成CD3-TCR复合物，在细胞内信号传导过程中起着重要的作用。CD3分子具有五种肽链，即γ、δ、ε、ζ及η链，均为跨膜蛋白，跨膜区具有带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸)，与TCR跨膜区带有正电荷的氨基酸残基形成盐桥。γ、δ和ε链的胞膜外区各有一个形成Ig样折叠的结域区。通过这些结域区之间的相互作用，γ链与ε链、δ链与ε链结合，分别形成γε和δε二聚体。与γ、δ和ε链不同，ζ和η链的胞膜外区很短，并以二硫键连接，形成ζζ二聚体或ζη二聚体。γ、δ、ε、ζ和η肽链的胞质区较长，均含有免疫受体酪氨酸活化模体(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif，ITAM)。ITAM由18个氨基酸残基组成，其中含有2个YxxL/V(x代表任意氨基酸，即酪氨酸-2个任意氨基酸-亮氨酸或缬氨酸)保守序列。该保守序列的酪氨酸残基(Y)被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化后，可募集其他含有SH2结构域的酪氨酸蛋白激酶(例如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号，CD3肽链缺陷或缺失，可导致T细胞活化缺陷。
抗CD3mAb作为T细胞的增殖剂、免疫抑制剂等生物活性分子受到广泛重视，在肿瘤治疗、预防和拮抗器官移植免疫排斥反应等临床治疗中具有良好的效果。近年来研究发现，抗CD3mAb在一些自身免疫病的治疗中亦有良好的应用前景。但是鼠源性mAb应用于人体治疗时，其免疫原性可引起人抗鼠抗体反应(HAMA)而严重影响治疗效果。
由于CD3分子广泛分布于人成熟T细胞表面，抗CD3mAb还可用于分离T淋巴细胞，偶联荧光素或化学标记物还可用于检测CD3阳性的T细胞。单克隆抗体的出现和发展，使细胞分离技术出现了质的飞跃，极大地提高了细胞分离纯化的效率，并且使得分离纯化一些含量极少的细胞群成为可能。抗CD3mAb用于分离T淋巴细胞被广泛应用于基础和临床实验研究中。近年来，用于分离人CD3阳性细胞的抗CD3mAb得到迅速的发展，但大多数用来分离人来源细胞的抗CD3mAb都是鼠源性，尤其是以单克隆抗体为基础用于分离细胞的免疫磁珠，其主要采用的是鼠抗人单克隆抗体包被的免疫磁珠，因此目前还未有能获得国家食品药品监督管理局的临床应用批文的相关产品，无法应用于临床治疗用的细胞分选，在很大程度上限制了细胞分离技术临床应用的发展。
因此，急需一种用于具有如分离人CD3阳性细胞或制备分离相关产品等用途且具有低免疫原性的CD3抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的CD3特异性抗体或其片段。
本发明的另一目的是提供上述抗体或其片段的制备方法和用途。
在本发明的第一方面中，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:11所示的CDR1，
SEQ ID NO:12所示的CDR2，和
SEQ ID NO:13所示的CDR3。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在本发明第二方面中，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述的重链具有如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面中，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的CDR1'，
SEQ ID NO:17所示的CDR2'，和
SEQ ID NO:18所示的CDR3'。
在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本发明第四方面中，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的轻链具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链的恒定区和/或所述轻链的恒定区是人源的。
在本发明第五方面中，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗CD3的抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。
在本发明第六方面中，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗CD3。
在另一优选例中，所述的重组蛋白选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
(b)具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
(c)将SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、由(a)或(b)衍生的且特异性抗CD3的多肽。
在另一优选例中，所述的重组蛋白选自下组：
(i)具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；
(ii)具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；
(iii)将SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、由(i)或(ii)衍生的且特异性抗CD3多肽。
在本发明第七方面中，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的蛋白质：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:14的DNA序列。
在本发明第八方面中，提供了一种载体，它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在另一优选例中，所述的载体为pIRES等。
在本发明第九方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。
在本发明第十方面中，提供了一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
在本发明第十一方面中，提供了一种药物组合物，它含有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或本发明第六方面所述的重组蛋白；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
在本发明第十二方面中，提供了一种如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或如本发明第六方面所述的重组蛋白的用途，用于：
(a)细胞的分离、制备、提取、检测；或
(b)制备分离、制备、提取、检测细胞用的产品。
在另一优选例中，所述的细胞为表达CD3分子的细胞；较佳地为人表达CD3分子的细胞。
在另一优选例中，所述的分离、制备、提取、检测细胞用的产品包括：介质、磁珠、荧光标记抗体、化学标记物标记抗体、放射性同位素标记抗体、胶体金标记抗体、酶标记抗体等。
在另一优选例中，所述的分离、制备、提取、检测细胞用的产品包括：装置、试剂盒等。
在本发明第十三方面中，提供了一种体外分离人表达CD3分子的细胞的方法，包括步骤：将如本发明第五方面所述的抗体(或其产品)与人表达CD3分子的细胞共孵育或结合，分离(如洗脱或纯化)出与所述的抗体结合的细胞，从而实现人表达CD3分子的细胞的分离。
在另一优选例中，所述的分离、制备、提取、检测细胞用的产品包括：介质、磁珠、荧光标记抗体、化学标记物标记抗体、放射性同位素标记抗体、胶体金标记抗体、酶标记抗体等。
在本发明第十四方面中，提供了一种治疗与CD3分子相关的病症的方法，包括步骤：给需要抑制或需要治疗的对象施用本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白或本发明第十一方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的与CD3分子相关的疾病包括肿瘤、拮抗器官移植免疫排斥反应。
在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明用于合成人鼠嵌合型单克隆抗体的重组VH和VL编码序列的PCR示意图。
图2显示了本发明中构建的载有人鼠嵌合型单克隆抗体重组编码序列的表达载体pIRES-hc3E3的图谱。
图3显示了本发明的单克隆抗体与CD3阳性细胞结合的亲合性检测及与同类抗体的亲和力比较。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现与现有的鼠源CD3抗体相比，本发明的CD3特异性鼠源抗体具有与抗原更强的亲和力；较本发明的鼠源抗体相比，本发明的CD3特异性人鼠嵌合抗体有效降低了鼠源抗体的免疫原性，且具有相当(甚至更强的)抗原亲和力。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合CD3的抗体，例如具有重链的氨基酸序列(如SEQ ID NO:10)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明提供了一种抗CD3的抗体(单克隆抗体)或其片段。
优选地，所述抗体的重链可变区可具有选自下组的互补决定区CDR：SEQ ID NO:11所示的CDR1，SEQ ID NO:12所示的CDR2，和SEQ ID NO:13所示的CDR3。
更佳地，所述的重链可变区可具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或具有SEQ IDNO:9所示的DNA序列。
优选地，所述抗体的轻链可变区可具有选自下组的互补决定区CDR：SEQ ID NO:16所示的CDR1'，SEQ ID NO:17所示的CDR2'，和SEQ ID NO:18所示的CDR3'。
更佳地，所述的轻链可变区可具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或具有SEQ IDNO:14所示的DNA序列。
在另一优选例中，所述的抗体为抗CD3人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明鉴定的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90%以上(较佳地95%以上，最佳地98%以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有人CD3结合活性的、且具有SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:15所示序列的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、具有SEQ ID NO:10和/或SEQID NO:15所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异多肽”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
| Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
| His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
| Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
| Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:14所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:15的蛋白质，但与SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:14所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:15的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:10和/或SEQ IDNO:15所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的单克隆抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合人CD3分子，因而可用于预防和治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于：
(1)提供了一种新型的抗CD3抗体，所述抗体与CD3分子具有很强的亲和力，可特异性结合抗原分子，尤其是人鼠嵌合抗体有效降低了鼠抗的免疫原性。
(2)还提供所述新型抗体的制备方法和用途。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。
试剂或材料
CD3蛋白：购自ACROBiosystems；
SP2/0小鼠骨髓瘤细胞：购自中科院上海分院细胞库；
pMD18-T载体：购自Takara公司；
CHO细胞：购自ATCC
实施例1鼠抗人CD3单克隆抗体的制备与鉴定
采用购置的CD3蛋白作为免疫原，初次免疫按照1:1加入完全弗氏佐剂，充分研磨至完全乳化，采用常规的皮下多点注射6-8周龄Balb/c小鼠，每点注射100μl，共10点，后每隔一周重复注射加强免疫，共5次，均按照1:1加入不完全弗氏佐剂，充分研磨至完全乳化后免疫小鼠，免疫剂量及方式同初次免疫，期间监测血清抗体水平。末次免疫采用脾内注射，剂量同前，3日后处死小鼠，取出脾脏。采用常规方法获得脾脏单细胞悬液，经检测细胞活性＞90%。
将脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞以10:1比例混合，离心，共沉淀，将含有混合细胞的离心管置于置37℃水浴中，在45秒左右用l ml吸管加入l ml预热至40℃的50%PEG(1400MW)，边加边轻轻摇动，在90秒内加20-30ml预热至37℃的新鲜无血清培养基，静置10分钟，离心沉淀后将细胞加入到20%FCS的RPMI-1640培养基中，转入96孔细胞培养板进行培养，24小时后加入1×HAT选择培养液，置37℃、5%CO2培养箱中培养。每3天更换新鲜培养基1次，直至长出克隆。
选取单克隆形成孔，2周后取上清，用ELISA方法测定抗体表达量，经初筛得到的阳性克隆转移到24孔板培养，然后经过再次筛选鉴定上清，如果还是所需要的阳性克隆，则进行亚克隆，在常规条件下传代，稳定至第5代，据此挑选出表达量最高的编号为3E3的细胞系，冻存，作为后续研究的材料。
采用试纸快速测定(Argen公司)法，鉴定上述所获得的单克隆抗体为Ig亚类，结果显示上述杂交瘤细胞系3E3分泌的单克隆抗体m3E3为小鼠IgG1。
实施例2鼠抗人CD3单克隆抗体可变区的测序与扩增
2.1确定鼠抗人CD3单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列
由于抗体基因下游的恒定区序列为已知，所以选择抗体重链和轻链恒定区的适当位置，分别设计3条基因特异性引物(如表1所示)，用5'RACE(cDNA末端快速扩增)的方法来获取抗CD3鼠源单抗m3E3的可变区基因(扩增方法如图1)。
表1合成引物(购自由上海生工公司)
| 引物名称 | 引物序列 | SEQ ID NO: |
| GSP1-H： | 5'-TCATCCTTGCTGATGTCTACCACA-3' | 1 |
| GSP2-H： | 5'-AGTAATGGTGAGCACATCCTT G-3' | 2 |
| GSP3-H： | 5'-GGGAAGATGAAGACAGATGA-3' | 3 |
| GSP1-L： | 5'-TTCCACTTGACATTGATGTCTTTGG-3' | 4 |
| GSP2-L： | 5'-GCACACGACTGAGGCACCTCCA-3' | 5 |
| GSP3-L： | 5'-ACTGCTCACTGGATGGTGGGAA-3' | 6 |
| AAP： | 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGTTGGGTTGGGTTG-3' | 7 |
| AUAP： | 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' | 8 |
表中，GSP为基因特异性引物，AAP为5'RACE截断锚定引物，AUAP为截断通用扩增引物。GSP1距离可变区基因最远，用于逆转录反应，GSP2和GSP3用于巢式PCR反应，其中GSP3在GSP2内。
用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取分泌抗人CD3单抗的杂交瘤细胞系3E3(5×106细胞)的总RNA，按照5'RACE试剂盒(购自Clontech公司)说明书以GSP1为引物，将总RNA反转录为cDNA，然后给第一链cDNA的3'末端加上poly(C)尾巴，然后用GSP2和AAP为引物进行PCR扩增，将扩增产物稀释100倍再以AUAP和GSP3为引物进行巢式PCR扩增。
两次PCR反应条件均为：94°C5分钟：94°C45秒，60°C45秒，72°C1分钟，30循环；72°C10分钟。产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳分离后经胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)纯化目的片段，并克隆到pMD18-T载体(购自Takara公司)中，转化常规的大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆进行全自动DNA测序分析(购自上海英俊公司)，确定m3E3的重链和轻链可变区序列。
进一步对获得的m3E3的重链和轻链可变区序列经NCBI IgBLAST等常用工具进行功能片段分析，得到了m3E3重链和轻链可变区中的功能区域划分。
m3E3的重链可变区(VH)的DNA序列(如SEQ ID NO:9)(414bp)：
5'-ATGGAGAGGCACTGGATCTTTCTCTTCCTGTGGTCAGTAACCTCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCTACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCTAGACCTGGTGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTCGCTACAAGATGCACTGGGTAAAACAGTGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATCCATTAATCCTAGCAGTGGTTATACTAACTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGCCTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCAAGATGCAACTGAGCAGTCAGACATCTACGGACTCTGCAGTCTATTATTGTACAAGATGGTACGATCACGATATCTACTTAGACTACTCGGGACAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA-3'
m3E3重链可变区编码氨基酸序列(如SEQ ID NO:10)(138氨基酸)：
MERHWIFLFLWSVTSGVHSQVLLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYKMHWVKQWPGQGLEWIGSINPSSGYTNYNQKFKDKATLPTDKSSSTAKMQLSSQTSTDSAVYYCTRWYDHDIYLDYSGQGTTLTVSS
m3E3的重链可变区中，各FR和CDR如下：
| SEQ ID NO:10中位置 | 序列 | |
| FR1 | 20-49 | QVLLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFT |
| CDR1 | 50-54 | RYKMH(SEQ ID NO:11) |
| FR2 | 55-68 | WVKQWPGQGLEWIGWVKQWPGQGLEWIG |
| CDR2 | 69-85 | SINPSSGYTNYNQKFKD(SEQ ID NO:12) |
| FR3 | 86-117 | KATLPTDKSSSTAKMQLSSQTSTDSAVYYCTR |
| CDR3 | 118-127 | WYDHDIYLDY(SEQ ID NO:13) |
| FR4 | 128-138 | SGQGTTLTVSS |
m3E3轻链可变区(VL)的DNA序列(如SEQ ID NO:14)(387bp)：
5'-ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGTTCATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGGCAAATTGTCTTCACACAGTCTCCACCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAACGTCACAATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTATGTTACATGCACTGGTACCAGCACAAGCCTGGATCCTCCGCCAAACATTGGATTTATGCCGCATCCTTGATGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCCGCGGCAGTGGCTCTGGGACCTCTTACTCTCTCAGTATCAGCAGGATGGACGCTGAAGATGCTGACACTTATTACTGCCAGCACTGGAGTAGTAGCCCATTCACGTTCGGTGGAGGCACCCAGCTGGAAACCAAACGG-3'
m3E3轻链可变区编码氨基酸序列(如SEQ ID NO:15)(129氨基酸)：
MDFQVQIFSFLFISASVIMSRGQIVFTQSPPILSASPGENVTMTCSASSSVCYMHWYQHKPGSSAKHWIYAASLMASGVPAHFRGSGSGTSYSLSISRMDAEDADTYYCQHWSSSPFTFGGGTQLETKR
m3E3轻链可变区中，各FR和CDR如下：
| SEQ ID NO:15中位置 | 序列 | |
| FR1' | 23-45 | QIVFTQSPPILSASPGENVTMTC |
| CDR1' | 46-55 | SASSSVCYMH(SEQ ID NO:16) |
| FR2' | 56-70 | WYQHKPGSSAKHWIY |
| CDR2' | 71-77 | AASLMAS(SEQ ID NO:17) |
| FR3' | 78-109 | GVPAHFRGSGSGTSYSLSISRMDAEDADTYYC |
| CDR3' | 110-118 | QHWSSSPFT(SEQ ID NO:18) |
| FR4' | 119-129 | FGGGTQLETKR |
将获得的m3E3重链和轻链可变区序列在Genbank数据库进行检索，结果证明：本发明获得的m3E3是新克隆的抗体基因。
2.2扩增鼠抗人CD3单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列
为了便于构建表达载体，需要给m3E3的可变区基因加上适当的酶切位点。用于重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)扩增的PCR引物如表2所示。
表2
以步骤2.1测序获得的阳性克隆质粒DNA为模板，用以上引物进行PCR扩增，其中VH正义引物和VH反义引物用于扩增重链可变区基因，VL正义引物和VL反义引物用于扩增轻链可变区基因。反应条件均为95°C30分钟；95°C15分钟，94°C50秒，58°C50秒，72°C50秒，30个循环；72°C10分钟。将PCR扩增产物回收克隆到pMD18-T载体中，筛选阳性克隆进行测序分析。
测序鉴定验证正确的克隆，分别记为pMD18-VH(含m3E3的重链可变区)和pMD18-VL(含m3E3的轻链可变区)。
实施例3含有人抗体IgG1恒定区基因的载体构建
用Triozl试剂(购自Invitrogen公司)从人脾脏细胞中抽提总RNA，Oligod(T)15反转录为cDNA后，设计特异性引物(如表3所示)进行PCR，分别扩增人IgG1的重链γ基因huCH和轻链κ基因huCκ，并为扩增序列加上酶切位点。基因大小分别约为1003bp和321bp，并克隆至pMD18-T载体中，筛选阳性克隆进行测序分析。
测序鉴定验证正确的克隆，分别记为pMD18-huCH(含人IgG1重链恒定区)和pMD18-huCκ(含人IgG1轻链恒定区)。
表3
实施例4人源化嵌合单克隆抗体表达载体的构建
4.1用Nhe I和EcoR I分别酶切含重链可变区的pMD18-VH载体及表达载体pIRES(购自Clontech)，经琼脂糖凝胶电泳分离，分别胶回收VH片段和pIRES载体片段，在T4连接酶作用下于4℃连接过夜，以连接产物转化TOP10感受态细菌，重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆，经扩增后提取并纯化含VH的重组质粒(pIRES-VH)；再用XhoI和MluI分别酶切含人IgG1重链恒定区huCH的pMD18-huCH载体以及上述含VH的阳性质粒pIRES-VH，按照常规连接、转化、筛选实验步骤构建并筛选出阳性克隆pIRES-VH-huCH。
经测序验证序列正确，该质粒中含有鼠源单克隆抗体m3E3的重链可变区序列及人IgG1的重链恒定区序列。
4.2用BamHI和SalI分别酶切含轻链可变区的pMD18-VL载体及上述含VH-huCH的阳性质粒pIRES-VH-huCH，分别胶回收VL片段和pIRES-VH-huCH载体片段，按照常规连接、转化、筛选实验步骤构建并筛选出阳性克隆pIRES-VH-huCH-VL；再用SalI和NotI分别酶切含人IgG1轻链恒定区huCκ的pMD18-huCκ载体以及上述pIRES-VH-huCH-VL载体，按照常规连接、转化、筛选实验步骤构建并筛选出阳性克隆pIRES-VH-huCH-VL-huCκ(记为pIRES-hc3E3)(如图2所示)。
经测序验证序列正确，该质粒中含有鼠源单克隆抗体m3E3的重链可变区和轻链可变区序列及人IgG1的重链恒定区和轻链恒定区序列。
该质粒含人鼠嵌合抗体hc3E3的重链(VH-huCH，如SEQ ID NO:27所示)和轻链(VL-huCκ，如SEQ ID NO:28所示)的编码序列。
SEQ ID NO:27
MERHWIFLFLWSVTSGVHSQVLLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYKMHWVKQWPGQGLEWIGSINPSSGYTNYNQKFKDKATLPTDKSSSTAKMQLSSQTSTDSAVYYCTRWYDHDIYLDYSGQGTTLTVSSLEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:28
MDFQVQIFSFLFISASVIMSRGQIVFTQSPPILSASPGENVTMTCSASSSVCYMHWYQHKPGSSAKHWIYAASLMASGVPAHFRGSGSGTSYSLSISRMDAEDADTYYCQHWSSSPFTFGGGTQLETKRVDTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
此外，还采用人工全基因合成的方法，合成SEQ ID NO:29所示的VH-huCH序列(两端含NheI位点和MluI位点)和SEQ ID NO:30所示的VL-huCκ序列(两端含BamHI位点和NotI位点)。先将VH-huCH序列与pIRES载体连接，获得pIRES-VH-huCH，再将VL-huCκ序列插入pIRES-VH-huCH(方法同4.1和4.2)，从而获得pIRES-VH-huCH-VL-huCκ(syn)(记为pIRES-hc3E3(syn))。
经测序验证，该pIRES-hc3E3(syn)与pIRES-hc3E3是完全一致的。
SEQ ID NO:29：其中，框中所示为VH序列
5'-GGAGCTAGCCACC GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCACGCGT-3'
SEQ ID NO:30：其中，框中所示为VL序列
5'-GGATCCACC ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCAcCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTAcGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGCGGCCGC-3'
实施例5人源化嵌合抗体的表达及鉴定
将实施例4中构建的pIRES-hc3E3按照常规方法进行扩增，用QIAGEN公司的Plasmid Maxi质粒DNA抽取试剂盒提取并纯化质粒DNA。
将纯化后的pIRES-hc3E3采用脂质体转染试剂盒(Invitrogen公司)转染CHO细胞，操作按照说明书进行。
转化的CHO细胞用含G418的选择培养基置于6孔板中进行筛选培养，经三次亚克隆，挑出的单克隆细胞系G418(1mg/ml)继续加压培养2周，对上清进行WESTERN-BLOT检测，选择高表达克隆进行后续研究，获得持续分泌抗人CD3人鼠嵌合抗体hc-3E3的基因转染细胞(记为hc3E3-CHO)。
采用蛋白A亲和层析的方法从上述获得的转染细胞培养上清中直接分离纯化人源化嵌合抗体hc-3E3，SDS-PAGE电泳检测产物纯度＞90%。
再将上述经亲和层析的产物经分子筛层析，获得了纯度＞95%的hc-3E3。
实施例6人鼠嵌合抗体的亲和力检测
采用荧光染色流式细胞检测并比较本发明的抗体和对照抗体同抗原的结合能力：
(1)hc-3E3嵌合单抗；
(2)m3E3鼠源单抗；
(3)商品化鼠源单抗OKT3；
(4)商品化嵌合抗体Rituxan。
用FITC标记hc-3E3、m3E3、OKT3，选取人T淋巴细胞瘤细胞系Hut78，调整浓度至1×106细胞/管，加入不同浓度的FITC-hc-3E3、FITC-m3E3、FITC-OKT3，在4℃孵育60min，将细胞用2%FCS-PBS洗涤后固定，用流式细胞仪进行检测，检测结果以平均荧光强度表示(如图3所示)。
结果显示，本发明中的嵌合抗体hc-3E3与抗原的亲和力与抗体的浓度呈正相关，并且显著高于对照鼠源抗体OKT3及对照嵌合抗体Rituxan的抗原亲和力。
通过竞争抑制实验发现，在高浓度的情况下，hc-3E3能完全阻断荧光标记的m3E3鼠源单抗与抗原的结合，其IC50值接近。
结果表明嵌合抗体hc-3E3具有与原鼠源单抗相似且更强的特异性和亲和力，而且恒定区的人源化没有影响抗体的抗原结合力。由此说明，本发明所得的人源化嵌合抗体保持了原鼠源抗体的亲和力。
而且，人源化有效减弱了原鼠源抗体的免疫原性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (16)
1.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，
其中，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:11所示的CDR1，
SEQ ID NO:12所示的CDR2，和
SEQ ID NO:13所示的CDR3；
并且，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的CDR1'，
SEQ ID NO:17所示的CDR2'，和
SEQ ID NO:18所示的CDR3'。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的重链可变区具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；和
所述抗体的重链具有如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1－3中任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括单链抗体、或双链抗体。
6.如权利要求1－3中任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
7.如权利要求1－3中任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体为嵌合抗体、或鼠源抗体。
8.如权利要求1－3中任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体为人源化抗体。
9.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)协助表达和/或纯化的标签序列。
10.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：
(1)如权利要求1所述的抗体；或
(2)权利要求9所述的重组蛋白。
11.一种载体，其特征在于，它含有权利要求10所述的多核苷酸。
12.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求11所述的载体或基因组中整合有权利要求10所述的多核苷酸。
13.一种制备重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求12所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求1所述的抗体或权利要求9所述的重组蛋白。
14.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求1所述的抗体、或权利要求9所述的重组蛋白；以及
(ii)药学上可接受的载体。
15.一种如权利要求1所述的抗体或权利要求9所述的重组蛋白的用途，其特征在于，用于：
(a)细胞的分离、制备、提取、检测；或
(b)制备分离、制备、提取、检测细胞用的产品。
16.一种体外分离人表达CD3分子的细胞的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求1所述的抗体与人表达CD3分子的细胞共孵育或结合，分离出与所述的抗体结合的细胞，从而实现人表达CD3分子的细胞的分离。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |