CN112048019B - 抗人cd47单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物领域，公开了一种小鼠抗人CD47单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。具体地，本发明所述的分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株为3D8。本发明所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2。本发明提供的抗体亲和力高，阻断人SIRPα与人CD47信号可以促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，在人类肿瘤治疗方面发挥重要作用。

Description

抗人CD47单克隆抗体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗人CD47单克隆抗体。
背景技术
分化簇蛋白47(CD47)也称为整合素相关蛋白(IAP)，是一种广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。
CD47分子量在47-55KD之间，在结构上包括一个氨基端细胞外可变区域，一个由3-5个高度疏水的跨膜片段构成的跨膜区域和一个亲水的羧基端胞质尾区。其与多种配体如整联蛋白、SIRP-α(信号调节蛋白α)，SIRPγ和血小板反应蛋白相互作用。
抗CD47单克隆抗体治疗肿瘤与多种机制有关。首先，抗CD47单克隆抗体通过阻断肿瘤细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPα结合而使肿瘤细胞被吞噬。其次，与抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用和补体依赖性的细胞毒作用有关，研究发现抗CD47抗体可诱导NK细胞参与的抗头颈肿瘤细胞的细胞毒作用。再次，通过直接诱导凋亡而清除肿瘤细胞。最后，对有免疫活性的小鼠进行研究发现抗CD47单克隆抗体可激活CD8+T细胞，引起获得性T细胞免疫反应，进一步杀伤肿瘤细胞。
RAUH(Immunity，2005，23(4):361-374)等人通过体内外实验证实阻断性抗CD47单克隆抗体能促进巨噬细胞对肿瘤细胞进行吞噬，抑制急性粒细胞白血病(AML)在小鼠体内形成，并消除已在体内移植成功的AML，还可靶向清除白血病干细胞(LCS)。
为进一步证实抗CD47单克隆抗体对肿瘤的作用，WILLINGHAM(Proc Natl AcadSci USA，2012，109(17):6662-6667)等人用有免疫活性的小鼠建立移植瘤模型，抗鼠及抗人CD47单克隆抗体均可显著抑制肿瘤的生长，并证实抗CD47抗体可消除多种实体瘤肿并抑制肿瘤的转移及复发，此外抗CD47单克隆抗体对肿瘤干细胞(csc)及其分化亚型也有抗瘤作用，并能将致瘤性的TAM、转变成抗瘤性的效应因子并增强其吞噬作用。抑制小鼠CD47的表达还能增强肿瘤细胞对放疗的敏感性，而对正常组织具有保护作用，这一作用可能诱导宿主免疫细胞产生保护性自噬反应有关。
CD47的表达包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、卵巢癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤等，斯坦福大学的Weissman系统的研究了多种实体瘤中CD47的表达水平，结果表明，所有人类实体瘤细胞中的CD47都呈高表达，其平均表达水平是对应正常细胞的3.3倍左右。而且，他们发现实体瘤病人CD47Mrna的水平与预后指数呈负相关。此外，CD47被确认为白血病和实体瘤两者的癌干细胞标记。
然而，已报道CD47抗体引起血小板聚集和红细胞的血细胞凝集。血小板聚集和血细胞凝集是同型相互作用的示例，其中两个表达CD47的细胞在用二价CD47结合实体处理时发生聚集或凝集。例如，已报道抗体MABL作为全长IgG或F(ab’)2导致红细胞的血细胞凝集并且仅当MABL变成scFv或二价scFv时该效应减轻。类似地，已报道CD47抗体B6H12诱导如下某些受试者的血小板直接聚集：具有Fc受体FcγRII的某些多态性(polymormisphms)。因此，血小板聚集和红细胞的血细胞凝集代表了用现有CD47抗体治疗学上靶向CD47的主要限制。
目前，国内外已经获得了多种CD47的单克隆抗体，专利CN106084052公开了一种抗CD47单克隆抗体，其亲和力常数KD值介于14至44nM之间，抗体阻断人SIRPα与人CD47的结合效力EC50值不低于850nM；专利CN108495863公开了一种抗CD47单克隆抗体，其候选物亲和力常数KD值介于0.9至15.7nM之间，候选物抑制Raji细胞上表达的hCD47上的hSIRPα，其IC50值范围为0.14至2.46nM；专利CN108503708公开了一种抗CD47单克隆抗体，其重组人源化抗体hS2C3的突变体亲和力常数KD值介于0.8至2.3nM之间，突变体抑制hCD47和hCD172a-D1M1结合的IC50值不低于3.52nM。虽然抗CD47单克隆抗体的活性越来越高，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的抗CD47的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高亲和性的、可用于治疗的抗CD47单克隆抗体。
本发明所述抗CD47单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
本发明采用的确定单克隆抗体CD47的重链和轻链可变区序列的方法是：根据抗体基因恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体CD47重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pMD19-T(simple)载体中，转化大肠杆菌E.coli DH5α后挑取阳性克隆，抽提质粒后测序。
本发明第二个目的还提供了编码所述抗CD47单克隆抗体的核苷酸序列，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明第三个目的是提供了一种表达载体，包括本发明提供的编码抗CD47单克隆抗体的核苷酸。
在一个优选方案中，将目的基因序列及载体pCHO1.0均用限制性内切酶AvrII、BstZ17I酶切，并回收目的片段，用T4连接酶连接，构建pCHO1.0-CD47-mFc载体。
本发明第四个目的还提供了一种宿主细胞，转化本发明所述的表达载体，所述的宿主细胞可选自CHO、BHK或HEK293。
在一个优选方案中，所述的宿主细胞为CHO细胞。
本发明第五个目的是提供一种抗原，其具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；利用基因合成技术合成编码此段蛋白的目的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
本发明第六个目的是提供一种杂交瘤细胞株。以真核表达的CD47蛋白为抗原免疫小鼠后获得的分泌CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为3D8。
所述的杂交瘤细胞株是保藏号为CGMCC No：17293的细胞株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2019年02月15日，分类命名：小鼠杂交瘤细胞株。
本发明第七个目的是提供一种所述抗CD47单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
a、构建真核表达载体，转染宿主细胞，获得抗原；
b、以本发明提供的抗原免疫小鼠后，获得小鼠脾细胞；
c、采用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株，筛选能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在一个优选方案中，步骤a所述真核表达载体为pCHO1.0-CD47-mFc
在一个优选方案中，步骤b具体为经四次免疫小鼠后，获得小鼠脾细胞。
在一个优选方案中，步骤c具体包括将小鼠的脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞株。
在一个优选方案中，步骤c具体包括用ELISA法筛选能产生高效价抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
以下内容详述一种所述抗CD47单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
a、将CD47基因序列(NCBI序列编号XP005247966.1，在本发明中编号为SEQ ID NO：25)及其信号肽送至上海生物工程有限公司进行序列优化并合成获得目的基因，将目的基因构建真核表达载体pCHO1.0-CD47-mFc，转染CHOS细胞，加压筛选并扩大培养，收集细胞培养上清，采用Protein A亲和层析法纯化CD47-mFc蛋白，获得抗原；
b、选用雌性Balb/c小鼠，进行三次皮下注射免疫，小鼠脾脏直接注射进行加强免疫，两天后取小鼠脾脏；
c、脾脏放在无血清培养基中，用注射器内芯压挤脾脏，制备脾细胞悬液；将同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:5～10混合，进行细胞融合，然后分装到含巨噬细胞的细胞培养板中进行培养，2～3天换一次培养基，从而获得杂交瘤细胞株；用ELISA方法筛选能产生高效价抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，制得抗CD47单克隆抗体。
在一个优选方案中，步骤a具体包括将目的基因用限制性内切酶AvrII、BstZ17I酶切、T4连接酶连接，构建pCHO1.0-CD47-mFc载体。
在一个优选方案中，步骤a具体包括pCHO1.0-CD47-mFc重组质粒转染宿主细胞，用嘌呤霉素和MTX进行加压筛选，得到表达CD47-mFc的细胞库，从而获得抗原。
在一个优选方案中，所述步骤b第一次皮下注射免疫抗原为CD47-mFc抗原蛋白与完全弗式佐剂混合、乳化，更优选地，两者质量比为1:1第二次、第三次皮下注射免疫抗原为CD47-mFc抗原蛋白与不完全弗式佐剂混合、乳化，加强免疫抗原为CD47-mFc抗原蛋白。
在一个优选方案中，所述步骤b第一次免疫抗原浓度为80～120ug/只，更优选地，第一次免疫抗原浓度为100ug/只；第二次、第三次免疫抗原浓度为120～180ug/只，更优选地，第二次、第三次免疫抗原浓度为150ug/只；加强免疫抗原浓度为40～60ug/只，更优选地，加强免疫抗原浓度为50ug/只。
在一个优选方案中，所述步骤c通过聚乙二醇进行细胞融合，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞株。
以下内容进一步详述本发明所述抗CD47单克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
a、构建真核表达载体，转染宿主细胞，获取抗原：
将CD47的基因序列(NCBI序列编号XP005247966.1，在本发明中编号为SEQ ID NO：25)及其信号肽进行序列优化并合成获得目的基因；将目的基因及载体pCHO1.0用限制性内切酶AvrII、BstZ17I酶切，并回收目的片段，用T4连接酶连接，构建pCHO1.0-CD47-mFc载体；将重组质粒转化E.coli DH5α感受态，挑取单克隆，提取质粒获得重组表达质粒，用限制性内切酶PvuI进行线性化，转染CHOS细胞，并用嘌呤霉素和MTX进行加压筛选，得到表达CD47-mFc的细胞库，扩大培养，收集细胞培养上清，采用Protein A亲和层析法纯化CD47-mFc蛋白，获得抗原。
b、以本发明提供的抗原免疫小鼠后，获得小鼠脾细胞：
(1)免疫动物：
首次免疫，CD47-mFc抗原蛋白，按80～120ug/只剂量皮下注射免疫，10～14天后按120～180ug/只剂量进行二次免疫，14天后按120～180ug/只剂量进行三次免疫。三次免疫后，细胞融合前两天，小鼠脾脏直接注射CD47-mFc抗原蛋白，按40～60ug/只剂量进行加强免疫。
(2)小鼠脾细胞的获得：
加强免疫后两天，摘除小鼠眼球，取血。脱颈处死小鼠，70％酒精浸湿消毒。腹部切口，撕开至腹壁完全暴露，70％酒精清洗腹壁。剪开腹膜去脾脏。脾脏放在8ml无血清培养基中，注射器内芯压挤脾脏。制备脾细胞悬液，70um滤网过滤，将细胞转移至50ml离心管。吹打3次，静置10min，使组织块沉淀。将上清吸至另一试管。加30ml DMEM，1000rpm离心5min，去上清，加3～5倍体积红细胞裂解液，静置1～2min。1000rpm离心5min，加20ml DMEM洗3遍，细胞计数。
c、采用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株，筛选能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞株：
将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1：5～10)，并加入聚乙二醇。加完聚乙二醇后，37℃水浴静置90秒，2～4分钟内加入15ml无血清RPMI-1640培养基，1000rpm离心10min，弃上清，加35ml HAT选择性培养基，分装至已有巨噬细胞的96孔板进行培养。2～3天换一次HAT选择性培养基，连续两周观察杂交瘤是否出现。2周后，用HT培养基培养。ELISA方法检测96孔板杂交瘤细胞培养上清，将筛选到的阳性细胞孔细胞转移至6孔板，扩大培养后，通过有限稀释法，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆，扩大培养该克隆获得抗体蛋白。
d、制备得到抗体蛋白后进一步纯化，测定抗体的纯度，测定纯化抗体的亲和力、血细胞凝集效果、SIRPα阻断效力和促吞噬作用。
在一个优选实施方案中，步骤d所述抗体纯化方法为亲和层析法，具体步骤为：首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，将离心并过滤的细胞培养上清过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，用甘氨酸-盐酸缓冲溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析后备用。
在一个优选实施方案中，步骤d所述测定抗体纯度的方法为SDS-PAGE法，具体步骤为：按照中国药典2015年版第四部的方法进行电泳，电泳图灰度扫描，鉴定其分子量和表达量。
在一个优选实施方案中，步骤d所述测定抗体亲和力的方法为ForteBio法，具体步骤为：ProteinA传感器固化纯化后的CD47抗体，将稀释后的CD47蛋白与固化CD47抗体的ProteinA传感器结合，解离，分别得到结合常数，解离常数，最后得出CD47单克隆抗体的亲和力常数。
在一个优选实施方案中，步骤d所述测定抗体阻断人CD47与人SIRPa的结合的方法为ELISA法，在CD47抗体量增加的条件下监控融合至人IgG的Fc结构域的重组SIRPα的结合。使用HRP偶联的抗人IgG(Fc特异性)二抗确定结合的SIRPα。
在一个优选实施方案中，步骤d所述测定抗体促吞噬作用的方法为流式细胞术，具体步骤为：将巨噬细胞接种在细胞板中并使其附着24小时，用CFSE染料标记靶人类癌细胞(Jurkat)并与不同抗CD47单抗或无抗体共孵育，随后将其添加到巨噬细胞培养液中共同孵育，用PBS洗去未被吞噬的靶细胞，收集巨噬细胞，利用抗人CD14-APC对巨噬细胞进行染色，用流式细胞仪进行分析。
本发明的优点和有益效果：
本发明应用重组人的CD47蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗CD47的杂交瘤细胞株，命名为3D8。将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用ProteinA亲和层析法对CD47单克隆抗体进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95％以上；抗体抗凝集效果较好；SIRPα阻断效力强；促吞噬作用明显；ForteBio检测抗体亲和力常数，KD值不高于1.29×10-11M，抗体亲和力高。
本发明所述抗CD47单克隆抗体、结合物和/或偶联物在制备阻断CD47与SIRPα结合的制剂中的应用，抗CD47单抗阻断CD47与SIRPα结合的EC50值不低于0.17nM，作用效果显著。
本发明所述抗CD47单克隆抗体、结合物和/或偶联物在促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用中的应用，该效果通过流式细胞术测定，结果以吞噬率表示。本发明提供抗体对jurkat细胞的吞噬率85％以上。
附图说明
图1是SDS-PAGE分析纯化后的抗CD47单克隆抗体的电泳图。
图2是血红细胞凝集试验结果图。
具体实施方式
本发明提供了抗CD47单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下实施方式所需试剂无特殊说明均可来自商业途径(市售可得)。
实施例1杂交瘤细胞株的获得
a、抗原的制备
(1)获得目的基因
在该实施例中，从NCBI上查找CD47的基因序列(NCBI序列编号XP005247966.1，在本发明中编号为SEQ ID NO：25)及其信号，在两端加酶切位点AvrII、BstZ17I，kozak序列，连接肽鼠源抗体-mFc序列(NCBI序列编号AAK53870.1，在本发明中编号为SEQ ID NO：26)；或在两端加酶切位点AvrII、BstZ17I，kozak序列，-his标签，其中His-tag是由6个组氨酸组成的短肽。将序列送至上海生物工程有限公司进行序列优化并合成，氨基酸序列设计如SEQID NO：17，18所示。利用基因合成技术合成编码此段蛋白的目的基因，其核苷酸序列如SEQID NO：19，20所示。
(2)构建重组真核表达载体
将序列及载体pCHO1.0均用限制性内切酶AvrII、BstZ17I酶切，并回收目的片段，用T4连接酶连接，CD47蛋白胞外区氨基酸序列与连接肽-mFc或-his融合，构建pCHO1.0-CD47-mFc、pCHO1.0-CD47-his载体。
(3)获得含重组表达质粒的菌株及获得重组表达质粒
将步骤(2)获得的重组质粒转化E.coli DH5α感受态，用含有卡那霉素的固体LB培养基筛选，挑取单克隆，培养并小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的序列。将测序正确的重组质粒大量提取，保存部分质粒及菌株。
(4)获得表达重组蛋白的细胞库
提取质粒，用限制性内切酶PvuI进行线性化，转染CHOS细胞，并用嘌呤霉素和MTX进行加压筛选，得到表达CD47-mFc(SEQ ID NO：17)、CD47-his(SEQ ID NO：18)的细胞库。
(5)蛋白表达及纯化
扩大培养该细胞库2L，维持嘌呤霉素和MTX加压，37℃，110rpm，5％CO2摇床培养14天，4500rpm离心5min，收集细胞培养上清，采用ProteinA亲和层析法纯化CD47-mFc、CD47-his蛋白，作为抗原。
b、小鼠脾细胞的制备
(1)免疫动物
选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，进行四次免疫注射。
首次免疫。用PBS稀释抗原蛋白，然后与完全弗式佐剂1：1混合、乳化，100ug/只，皮下注射免疫。
二次免疫。首次免疫10～14天后进行二次免疫，用PBS稀释抗原蛋白，然后与不完全弗式佐剂1：1混合、乳化，150ug/只，皮下注射免疫。
二次免疫后第4天，断尾采血ELISA测抗体滴度，滴度值约1:64000，阴性对照没有产生抗体。
三次免疫。二次免疫14天后进行三次免疫，用PBS稀释抗原蛋白，然后与不完全弗式佐剂1：1混合、乳化，150ug/只，皮下注射免疫。
三次免疫后第3天，断尾采血ELISA测抗体滴度，滴度值达到1:128000，阴性对照没有产生抗体。选择效价最高的用于细胞融合。
加强免疫。细胞融合前两天，小鼠脾脏直接注射抗原蛋白，50ug/只，两天后，取小鼠脾脏融合。
(2)小鼠腹腔细胞的制备
细胞融合24小时前，制备饲养细胞。脱臼处死小鼠，70％酒精浸湿消毒。腹部切口，撕开，70％酒精清洗腹壁。用镊子提起腹壁，腹腔注射4.5～5.5ml DMEM培养基。按摩腹部，抽回4～5ml液体。1000rpm离心7min，弃上清。细胞培养液悬浮至105/ml细胞，将细胞铺96孔板，0.1ml/孔。
(3)小鼠脾细胞的制备
加强免疫后两天，摘除小鼠眼球，取血。脱颈处死小鼠，70％酒精浸湿消毒。腹部切口，撕开至腹壁完全暴露，70％酒精清洗腹壁。剪开腹膜去脾脏。脾脏放在8ml无血清培养基中，注射器内芯压挤脾脏。制备脾细胞悬液，70um滤网过滤，将细胞转移至50ml离心管。吹打3次，静置10min，使组织块沉淀。将上清吸至另一试管。加30ml DMEM，1000rpm离心5min，去上清，加3～5倍体积红细胞裂解液，静置1～2min。1000rpm离心5min，加20ml DMEM洗3遍，细胞计数。
c、杂交瘤细胞株的制备
(1)细胞融合
将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1：5～1：10)，并加入聚乙二醇。加完聚乙二醇后，37℃水浴静置90秒，2～4分钟内加入15ml无血清RPMI-1640培养基，1000rpm离心10min，弃上清，加35ml HAT选择性培养基，分装至已有巨噬细胞的96孔板进行培养。2～3天换一次HAT选择性培养基，连续两周观察杂交瘤是否出现。2周后，用HT培养基培养。
(2)筛选阳性细胞
ELISA方法检测96孔板杂交瘤细胞培养上清：以纯化的CD47-his蛋白包被酶标板，每孔100ul，4℃包被过夜。去掉包被液，每孔200ul 5％脱脂奶粉37℃封闭，PBST洗涤3次，加杂交瘤细胞培养上清100ul，37℃孵育1～2h。PBST洗涤3遍后，加二抗羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h。PBST洗涤3遍，加显色液显色5min，终止显色。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。
(3)筛选单克隆细胞株
将筛选到的阳性细胞孔细胞转移至6孔板，扩大培养后，通过有限稀释法，分别获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆3D8、3D5(抗原CD47-mFc免疫小鼠获得)和1C6、3E7(抗原CD47-his免疫小鼠获得)。扩大培养该克隆并冻存保种。
实施例2抗体的制备及纯化
将实施例1获得的细胞株3D8、3D5、1C6、3E7进行复苏、传代扩培，并收集细胞培养上清。采用Protein A亲和层析法纯化抗体。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，将离心并0.4um滤膜过滤的细胞培养上清过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LpH7.5的甘氨酸-盐酸缓冲溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析后备用。
实施例3SDS-PAGE检测目的蛋白分子量和表达量
SDS-PAGE还原电泳检测目的蛋白大小及纯度。按照中国药典2015年版第四部的方法进行电泳，电泳图灰度扫描，鉴定单克隆抗体分子量和表达量。根据电泳结果图1所示，轻链约25KD、重链约50KD，蛋白纯度均大于95％。
实施例4单克隆抗体可变区测序
根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物：
VH-F：CCTAGGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG(SEQ ID NO：21)；
VH-R：CATATGTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG(SEQ ID NO：22)；
VL-F：CCTAGGGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA(SEQ ID NO：23)；
VL-R：CATATGGTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC(SEQ ID NO：24)。
用TAKARA的RNA提取试剂盒提取杂交瘤细胞株的总RNA，将RNA逆转录为cDNA。用引物VH-F、VH-R PCR扩增单克隆抗体重链可变区，用引物VL-F、VL-R PCR扩增轻链可变区。PCR条件：94℃5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟；72℃10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并胶回收目的片段。把目的片段连接至T载体pMD19-T，转化大肠杆菌E.coli DH5α，涂布在氨苄霉素抗性的LB平板上，挑取阳性克隆，小提质粒，测序。得到抗CD47的单克隆抗体的可变区序列。
表1抗CD47的单克隆抗体的可变区氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0002087370530000101
实施例5抗体亲和力的测定试验
用Fortebio测目的蛋白亲和力。ProteinA传感器固化纯化后的CD47抗体，将CD47蛋白倍比稀释6个浓度，与固化CD47抗体的ProteinA传感器结合，解离，分别得到结合常数，解离常数，最后得出CD47单克隆抗体的亲和力常数。抗体的亲和力测定结果见表2。表2显示与市售抗体B6H12相比，本发明的抗体3D8具有高亲和力，KD值不高于1.29×10-11M。
表2抗体亲和力测定
抗体 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
3D8 <![CDATA[1.29×10<sup>-11</sup>]]> <![CDATA[8.53×10<sup>5</sup>]]> 1.10×10-5
3D5 <![CDATA[4.48×10<sup>-11</sup>]]> <![CDATA[1.99×10<sup>6</sup>]]> <![CDATA[3.81×10<sup>-4</sup>]]>
1C6 <![CDATA[2.58×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[1.00×10<sup>5</sup>]]> <![CDATA[2.58×10<sup>-4</sup>]]>
3E7 <![CDATA[6.22×10<sup>-8</sup>]]> <![CDATA[3.15×10<sup>4</sup>]]> <![CDATA[1.96×10<sup>-3</sup>]]>
B6H12 <![CDATA[7.16×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[6.47×10<sup>4</sup>]]> <![CDATA[4.63×10<sup>-4</sup>]]>
实施例6抗体剂量依赖性阻断人CD47与人SIRPa的结合
通过ELISA测量CD47抗体的SIRPα阻断效力。在CD47抗体量增加的条件下监控融合至人IgG的Fc结构域的重组SIRPα-His融合蛋白，使用HRP标记的抗His的二抗确定结合的SIRPα。将重组CD47-Fc融合蛋白倍比稀释6个浓度后包被在微孔板上，于4℃反应12个小时。用含1％BSA的PBST于室温封闭1小时后，将SIRPα-His融合蛋白加入到有或没有CD47抗体的微孔中，在室温下反应1小时。连续洗涤微孔板3次并加入HRP缀合的抗His的二抗在室温孵育2小时。洗涤后，向每个微孔加入TMB溶液反应30分钟，并用2.0M H2SO4终止反应，并在490nm处测量OD值，计算抗体的EC50值，结果见表3。由表3可知，与市售抗体B6H12相比较，本发明的抗体均显示出增强的SIRPα阻断效力。
表3抗体阻断CD47与SIRPα结合的测定
抗体 EC50(nM)
3D8 0.17
3D5 0.70
1C6 3.65
3E7 1.81
B6H12 143.21
实施例7抗CD47抗体促进吞噬细胞的吞噬作用
将巨噬细胞接种在12孔板中并且使其附着24小时，用CFSE染料标记靶人类癌细胞(Jurkat)并与不同抗CD47单抗或无抗体共孵育15-30min，随后将其添加到巨噬细胞培养液中，共同孵育3h后，用PBS洗去未被吞噬的靶细胞，收集巨噬细胞，利用抗人CD14-APC对巨噬细胞进行染色，用流式细胞仪进行分析。以巨噬细胞本底的吞噬率作为起始，计算出各个样品的吞噬率。结果如表4所示，本申请的抗CD47单克隆抗体均能够促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，抗体3D8效果最佳。
表4抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的测定
抗体 吞噬率/％
3D8 85
3D5 79
1C6 35
3E7 41
B6H12 18
无抗体 6
实施例8血细胞凝集实验
抗CD47单抗是否导致红细胞凝集主要取决于单抗在CD47分子上的识别表位。本实施例利用经典的血凝实验对抗CD47单抗导致红细胞凝聚的能力进行了分析。采集人外周血，用DPBS洗两遍细胞后，用含1mM钙离子、镁离子的DPNS重选细胞后，铺U型底96孔板，与待测样品混匀，37℃，5％CO2培养箱中静置1h后，凝胶成像仪拍照，得到实验结果。分别用市售抗体B6H12和CC-90002作为阳性和阴性对照，结果如图2所示3D5、3D8抗体不引起该血凝集，1C6、3E7抗体高浓度引起该血凝集。
本发明杂交瘤细胞株3D8分泌的单克隆抗体具有高亲和力，KD值为1.29×10-11M；阻断CD47与SIRPα结合的EC50值不低于0.17nM，作用效果显著；能够促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，jurkat细胞的吞噬率达85％以上；不引起血细胞凝集。该细胞株于2019年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No：17293。
序列表
<110> 鲁南制药集团股份有限公司
<120> 抗人CD47单克隆抗体
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Gly Leu Leu Arg Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser His Met
        115
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Arg Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
            20                  25                  30
Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys
        35                  40                  45
Leu Trp Ile Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser
65                  70                  75                  80
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly
                85                  90                  95
Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys Arg Arg
            100                 105                 110
Phe Leu
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggtgaagc tgcaggagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt cgctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagac atcttacctg gaactagtaa tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagatt catcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagacgaggt 300
ttactacggt ttgactgctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc acatatg 357
<210> 4
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctagggaca ttcagctgac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggaaaag 60
gtcaccatga cctgcagggc cagctcaagt gtaagttcca gttacttgca ctggtaccag 120
cagaagtcag gtgcctcccc caaactctgg atttatagca gttccacctt ggcttctgga 180
gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagt 240
gtggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccagcagt acagtggtta cccactcacg 300
ttcggctcgg ggacaaagtt gggaataaaa cgcaggtttt tg 342
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Tyr
1               5                   10                  15
Ala Val Lys Ile Ser Cys Lys Pro Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Asp Ser Ser Ser Lys Gly Phe Trp
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Gly Leu Leu Arg Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser His Met
        115
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Pro Arg Asp Ile His Leu Thr Gln Ser Pro Pro Gln Met Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Val Lys Thr Gln Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
            20                  25                  30
Ser Ser Tyr Leu His Trp Phe Thr Gln Lys Ser Gly Ser Ser Pro Lys
        35                  40                  45
Leu Trp Ile Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Lys
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ala Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gln
65                  70                  75                  80
Lys Ile Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly
                85                  90                  95
Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys Arg Arg
            100                 105                 110
Phe Leu
<210> 7
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaagtccaac tgcaagagag tggagccgag cttatgaagc caggatacgc agtcaaaatt 60
tcatgcaaac caactggcta tacctttagc cgatactgga tcgagtgggt aaagcaaagg 120
cctgggcacg gtttggagtg gattggggac atcctcccag gtacttcaaa tactaactac 180
aacgaaaaat tcaagggtgg ctacgcattt accgcagata gttcctccaa aggtttctgg 240
atgcagttga gtagcctcac ctccgaggac tcagcaatat actattgtgc aagacgcggt 300
ctgttgcgct ttgattgctg gggacaaggg actactgtaa ctgtgtcctc acacatg 357
<210> 8
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctagggaca ttcacctgac ccagtctcca ccacaaatgt ctgcatctcc aggggtcaag 60
acgcagatga cctgcagggc cagctcaagt gtaagttcca gttacttgca ctggttcacg 120
cagaagtcag gttcgtcccc caaactctgg atttatagca gttccacctt ggcttctgga 180
gtccctgcta agttcagtgg cagtaaatct gggaccgcat actctctcac aatcagccag 240
aagatacggg aagatgctgc cacttattac tgccagcagt acagtggtta cccactcacg 300
ttcggctcgg ggacaaagtt gggaataaaa cgcaggtttt tg 342
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Lys Leu His Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Thr Gly Gln Gln Cys Lys Pro Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Thr Gln Ser Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Val Asn Val Pro Gln Arg Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Gly Leu Leu Arg Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser His Met
        115
<210> 10
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Pro Arg Asp Ile His Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ile Met Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
            20                  25                  30
Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys
        35                  40                  45
Leu Trp Ile Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Ala Ser Gly Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gln
65                  70                  75                  80
Val Glu Arg Glu Asp Ala Pro Gly Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly
                85                  90                  95
Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu His Gln Lys Arg Arg
            100                 105                 110
Phe Leu
<210> 11
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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ttactacggt ttgactgctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc acatatg 357
<210> 12
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctagggaca ttcacctgac ccagtctcca ccgatcatgt ctgcatctcc aggggaaaag 60
gtcaccatga cctgcagggc cagctcaagt gtaagttcca gttacttgca ctggtaccag 120
cagaagtcag gtgcctcccc caaactctgg atttatagca gttccacctt ggcttctgga 180
gaatctgggg tccctagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcaa gatcagccag 240
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser His Arg Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Val Asn Val Pro Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Gly Leu Leu Arg Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Gln
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Val Thr Val Ser Ser His Met
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<210> 14
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Pro Arg Gln Ile His Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
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            20                  25                  30
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Phe Leu
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt cgctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagac atcttacctg gaactagtaa tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcta tgcgacattc actgcagatt catcctccaa cacagcctac 240
gtaaacgtcc cgagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagacgaggt 300
ttactacggt ttgactgctg gggccaaggg acccaggtca ccgtctcctc acatatg 357
<210> 16
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccaagacaga ttcatctcac ccagagccca gccgcatcaa gcgccagccc aggggcctgc 60
agcacaatga catgtcgcgc ttcttcttct gtctcaagta gctacttgca ttggtatcag 120
cagaaaagcg gagccagtcc caagttgtgg atctactcaa gttcaacact cgcaagcggt 180
gtgcccgcac gctttaagct gcgaggtagt ggaacaagtt attcactcaa gatttcctca 240
gtggaggcag agtctcagaa gggctactat tgccaacagt acagcggtta tccccttact 300
ttcggtagtg gcactaagct ccatcaaaag agaagatttc tg 342
<210> 17
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr
            20                  25                  30
Phe Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu
        35                  40                  45
Ala Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg
    50                  55                  60
Asp Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp
                85                  90                  95
Ala Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn
            100                 105                 110
Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile
        115                 120                 125
Glu Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val
                165                 170                 175
Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val
        195                 200                 205
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
    210                 215                 220
Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu
225                 230                 235                 240
Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala
                245                 250                 255
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro
            260                 265                 270
Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys
        275                 280                 285
Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr
    290                 295                 300
Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr
305                 310                 315                 320
Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu
                325                 330                 335
Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser
            340                 345                 350
Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser
        355                 360                 365
His Ser Pro Gly Lys Glu
    370
<210> 18
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr
            20                  25                  30
Phe Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu
        35                  40                  45
Ala Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg
    50                  55                  60
Asp Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp
                85                  90                  95
Ala Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn
            100                 105                 110
Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile
        115                 120                 125
Glu Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile
    130                 135                 140
His His His His His His
145                 150
<210> 19
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cctaggccgc caatgggctg gagcctgatc ctgctgttcc tggtggccgt ggccaccaga 60
gtgctgtccc agctgctgtt taataagaca aagtctgtgg agttcacatt ttgtaatgat 120
accgttgtga tcccttgttt cgtgacaaat atggaggctc agaacacaac agaggtgtac 180
gtgaagtgga agtttaaggg cagagacatc tacacctttg atggagccct gaacaagtct 240
acagtgccta ctgatttttc ttctgccaag attgaggtga gccagctgct gaagggcgat 300
gcctctctga agatggataa gagcgatgct gtgtctcaca caggcaatta cacatgtgag 360
gtgacagagc tgacaagaga gggagagaca attatcgagc tgaagtacag agtggtgtct 420
tggtttagcc ctaatgagaa catcggaggc ggaggcggag gctctggagg aggcggctct 480
ggcggcggag gatctgaggt gtcttctgtg ttcatctttc cacctaagcc taaggatgtg 540
ctgaccatca cactgacccc taaggtgaca tgtgtggtgg tggacatctc taaggatgat 600
cctgaggtgc agttctcttg gtttgtggat gatgtggaag tgcacacagc tcagacccag 660
cctagagagg agcagtttaa ctctaccttt agatccgtgt ctgagctgcc tatcatgcat 720
caggattggc tgaacggcaa ggagtttaag tgtagagtga actctgccgc ctttcctgcc 780
cctatcgaga agaccatcag caagaccaag ggaagaccta aggctcctca ggtgtacact 840
atcccacctc ctaaggagca gatggctaag gataaggtgt ctctgacctg tatgattacc 900
gatttcttcc ctgaggacat cacagtggag tggcagtgga atggccagcc tgctgagaac 960
tataagaaca cacagcctat catggataca gatggcagct actttgtgta ctctaagctg 1020
aacgtgcaga agtctaattg ggaggccggc aacaccttta catgttctgt gctgcacgag 1080
ggcctgcaca accatcacac agagaagtct ctgtctcaca gccctggcaa ggagtgatga 1140
gtatac 1146
<210> 20
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cctaggccgc caatgggttg gtccctcata cttcttttct tggtggcagt tgccacccgc 60
gtacttagcc aactcctgtt caataagacc aagtctgttg aatttacctt ctgtaacgac 120
acagtggtta ttccttgttt cgtcaccaac atggaagcac agaatacaac agaagtgtac 180
gttaaatgga aatttaaggg ccgggatata tatacttttg acggagcact gaataaaagt 240
accgtaccca ctgatttttc ttccgcaaag attgaggtaa gccagttgct gaaaggtgat 300
gctagtctca agatggataa atcagatgcc gtctcacata caggcaatta cacctgcgaa 360
gtaactgaat tgacaagaga aggggaaact attattgaac tcaagtaccg ggtagtcagt 420
tggttttccc caaacgaaaa tattcatcat caccaccacc attgatgagt atac 474
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 21
cctaggaggt smarctgcag sagtcwgg 28
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 22
catatgtgag gagacggtga ccgtggtccc ttggccccag 40
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 23
cctagggaca ttcagctgac ccagtctcca 30
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 24
catatggtta gatctccagc ttggtccc 28
<210> 25
<211> 143
<212> PRT
<213> XP005247966.1
<400> 25
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1               5                   10                  15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
            20                  25                  30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
    50                  55                  60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65                  70                  75                  80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
                85                  90                  95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
            100                 105                 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
        115                 120                 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile
    130                 135                 140
<210> 26
<211> 212
<212> PRT
<213> AAK53870.1
<400> 26
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
1               5                   10                  15
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
            20                  25                  30
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
        35                  40                  45
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
    50                  55                  60
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
65                  70                  75                  80
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
                85                  90                  95
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
            100                 105                 110
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
        115                 120                 125
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
    130                 135                 140
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
145                 150                 155                 160
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
                165                 170                 175
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
            180                 185                 190
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
        195                 200                 205
Ser Pro Gly Lys
    210

Claims (6)

1.一种抗CD47单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1所述的抗CD47单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，具有SEQ ID NO：3所示的重链可变区的多核苷酸序列，并具有SEQ ID NO：4所示的轻链可变区的多核苷酸序列。
4.一种杂交瘤细胞株3D8，以真核表达的CD47蛋白为抗原免疫小鼠后获得的分泌权利要求1所述的抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No：17293。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2或3所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，转化权利要求5所述的表达载体。
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