CN101967468A - 一种重组人胰激肽原酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组人胰激肽原酶及其制备方法。本发明的重组人胰激肽原酶利用分子生物学技术和表达重组蛋白的宿主细胞生产，进一步利用亲和层析方法纯化重组蛋白获得。重组人胰激肽原酶在临床上有多种用途，副作用明显减小。

Description

一种重组人胰激肽原酶

技术领域

本发明涉及一种重组人胰激肽原酶及其新的制备方法。更具体地说，本发明涉及利用分子生物学技术获得表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞，用大规模细胞培养或发酵方法生产宿主细胞，从细胞中或细胞外分泌物中使用亲和层析方法提取重组人胰激肽原酶，该重组人胰激肽原酶的糖链结构组成比人尿中提取的天然蛋白更为复杂，在临床上具有多种用途，具有更小的副作用。

背景技术

人激肽原酶基因是一类大的多基因家族，至少由15个基因(KLK1-KLK15)组成。但只有胰/肾激肽原酶基因(KLK1基因)编码的蛋白具有激肽原酶活性，其它家族成员几乎都没有激肽原酶活性。人胰激肽原酶能作用于激肽原底物，使之释放出具有生物活性的激肽，激肽与靶器官上特定受体结合能产生一系列生物效应，如扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用，并且还有增加红细胞的变形性和抑制血小板聚集、延长再钙化时间改善血液粘稠的作用。

目前已上市的人尿来源的激肽原酶产品，即人尿激肽原酶，是从人尿中提取的糖蛋白。其氨基酸组成与人胰激肽原酶的氨基酸序列相同，但是，从人尿中提取的激肽原酶蛋白的162位点上存在Glu/Lys两种氨基酸，这种氨基酸的多态性对酶活性的影响未知。临床上使用人尿激肽原酶发现静脉滴注过快会导致患者血压急剧下降等不良副作用，给病人带来了一定风险。另外，人尿收集困难，人尿蛋白资源十分有限。其来源范围越广，成分越复杂，可能含有病毒等成分。同时欧美等高端市场普遍不接受人尿来源产品。

分子生物学技术的发展使得利用宿主细胞表达并大规模生产重组蛋白成为可能，目前利用基因表达方法生产重组蛋白已代替了传统的从自然资源中提取天然蛋白方法。对于糖蛋白，一般是将编码糖蛋白的基因转入哺乳动物细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，以生产与天然蛋白接近并具有生物活性的重组蛋白。

KLK1基因位于染色体19q13.4，其大小为6.55kb，编码区为874bp。KLK1全长基因编码262个氨基酸组成的激肽酶原(即前体蛋白)，包括17个氨基酸信号蛋白，7个氨基酸酶原片段和238个氨基酸成熟蛋白。激肽酶原在体内进一步被蛋白酶切割和加工成为具有生物活性的成熟人胰激肽原酶。KLK1基因在胰腺、肾脏和唾液腺表达最高。

人胰激肽原酶是一种糖蛋白，分子中含有14.4％的糖，其结构中包括三个N糖基化位点，分别位于Asn78，Asn84及Asn141。研究表明，人胰激肽原酶在CHO细胞中表达时，CHO大规模培养条件影响其糖基化程度，进而也影响到其体内的活性。因此，选择适当的CHO培养条件，制备活性相似、副作用小的人胰激肽原酶成为科研者的最新攻克难题。

发明内容

本发明通过分子生物学技术克隆KLK1基因，将该基因转入宿主细胞进行表达，并用细胞培养或发酵方法大量生产含有重组蛋白的细胞，从细胞或胞外分泌液中提取重组人胰激肽原酶。优选，利用大规模培养CHO细胞制备重组人胰激肽原酶。该重组人胰激肽原酶在临床上有多种用途，与人尿来源的激肽原酶相比活性相似、副作用小，尤其是对血压下降影响更小的特点。

本发明的一个目的是通过细胞培养或发酵方法获得一种重组人胰激肽原酶。具体说，本发明是利用分子生物学技术克隆KLK1基因并获得表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞；利用大规模细胞培养或发酵方法进行表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞的大量生产，采用亲和层析方法纯化获得重组人胰激肽原酶。

本发明的另一个目的是重组人胰激肽原酶用于制备治疗脑梗塞的药物的用途。

优选，表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞是哺乳动物细胞，特别是CHO细胞，该宿主细胞的大规模培养采用灌注反应器进行灌注培养。通过优化培养条件提高了细胞生长密度和表达产物的糖基化程度。

本发明提供了一种重组人胰激肽原酶，其中所述重组人胰激肽原酶是由238个氨基酸残基组成一条单链，N-末端和C-末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，分子中含有5对S-S键，通过SDS-PAGE电泳测定，其分子量为35.0-44.0KDa，其一级结构为：

所述重组人胰激肽原酶分子中含有5对S-S键，分别为Cys7-Cys150，Cys26-Cys42，Cys29-Cys196，Cys161-Cys175以及Cys186-Cys211，等电点约为4.0，分子中含有14.4％的糖，结合位点分别位于Asn78、Asn84及Asn141。

该重组人胰激肽原酶是一种糖蛋白，糖基化结合位点分别位于Asn78、Asn84及Asn141。

该重组人胰激肽原酶一级结构中的粗体字母(Glu)表示162位点上的氨基酸。

本发明的重组人胰激肽原酶的糖基化程度主要取决于糖链中唾液酸的水平。通过SDS-PAGE电泳测定，现有的人尿激肽原酶分子量为39.0-43.0KDa，本发明的重组人胰激肽原酶为35.0-44.0KDa，重组人胰激肽原酶的电泳带区域比现有的人尿激肽原酶宽，说明重组人胰激肽原酶由于其糖基化程度的不同，尤其是唾液酸化程度的不同，即重组人胰激肽原酶比现有的人尿激肽原酶具有更复杂的糖基化组成。另外，本发明制备的重组人胰激肽原酶是由单一肽链组成的蛋白，其162位点上只表达Glu一种氨基酸；而现有的人尿激肽原酶蛋白是由两条肽链组成的蛋白混合物，其162位点上存在Glu/Lys两种氨基酸，这种氨基酸的多态性对酶活性的影响尚在研究中。

本发明的重组人胰激肽原酶制备包括利用基因重组技术克隆KLK1 DNA、构建含有编码该基因DNA序列的表达质粒、大规模细胞培养或发酵方法生产表达重组蛋白的宿主细胞和重组蛋白的纯化。

本发明重组人胰激肽原酶的制备方法如下：

1.根据KLK1的DNA序列设计引物，采用RT-PCR方法从人胰腺扩增KLK1 DNA序列，该DNA序列包括cDNA(序列表中序列1，GenBank NM_002257)、

基因组DNA(序列表中序列2)和人工合成的DNA。

2.将KLK1 DNA克隆到表达载体，构建含有KLK1 DNA的表达质粒。表达载体包括原核表达载体(如pET＝32a)、酵母表达载体(如pPIC9)或真核表达载体(如pcDNA3.1)。对于真核表达载体的情况，为了提高重组人胰激肽原酶的稳定性和延长其半衰期，在真核表达载体插入了人IgG1 Fc片段，构建含有KLK1和Fc片段的真核表达质粒。

3.将含有KLK1 DNA表达质粒转入宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞(如大肠杆菌)、酵母(如毕赤酵母)或哺乳细胞(如CHO，NS0细胞)。优选，将真核表达质粒转染CHO细胞，筛选稳定转染的细胞株

4.用发酵方法或大规模细胞培养方法大量生产表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞；优选，通过生物反应器大规模培养表达重组人胰激肽原酶的CHO细胞，其步骤如下：

a)将含有表达重组蛋白的细胞株用含有5-10％胎牛血清的DMEM培养基(pH7.20)进行培养，然后在无血清培养基中采用常规的方法进行传代适应后，小规模悬浮批次培养，置温度37℃、5％CO2培养箱内孵育生长。

接种于细胞培养罐中进行细胞连续培养，接种密度为1.0×105/ml-5.0×105/ml，优选，3.0×105/ml。培养温度37℃、pH7.2、转速50-120rpm/min，优选90rpm/min，溶解氧50％空气饱和度和通气量0.1Lpm。

b)在无血清培养基中培养24-72小时后，优选，在无血清培养基中培养48小时后，将无血清培养基灌注进入生物反应器进行灌注培养。灌注速度需根据培养基中的残糖量进行调节。保持残糖量在0.8-1.2g/L；抽取罐内少量培养液，检测和跟踪其体外活性.。培养时间为28天，从第6天起开始收液，最高细胞密度可达0.8×107/ml-2×107/ml，优选，1×107/ml。

c)收集含有表达重组人胰激肽原酶的培养基，过滤去除细胞碎片。上清液用于重组蛋白的纯化。

5.从大量培养的表达重组人胰激肽原酶的细胞中纯化重组蛋白。优选，从CHO细胞表达重组人胰激肽原酶，该蛋白的纯化包括以下步骤：

a)将含有重组人胰激肽原酶的培养基超滤浓缩后，上扩张床强阴离子交换柱(Streamline Q XL，GE Healthcare公司)，冲洗柱子至OD₂₈₀＜0.2；用含0.3M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲洗脱柱子。

b)在上述洗脱收集液加入(NH₄)₂SO₄，用HCl调整pH 7.0±0.1上苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl Sepharose 6Fast Flow，GE Healthcare公司)。洗脱液用10000MWCO膜超滤至3L。加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7.0±0.2，然后60℃恒温加热10小时。加热后将溶液调pH8.0±0.1，上苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶柱(Benzamidine Sepharose6B)，冲洗，洗脱。

c)调节上述洗脱收集液pH4.0±0.1，上SP琼脂糖凝胶FF柱(SpSepharose^TM Fast Flow，GE Healthcare公司)，冲洗至流出液OD280＜0.15，洗脱，收集OD280＞0.1的洗脱流出液。将洗脱收集液调pH7.0，用10000MWCO膜进行超滤浓缩，得到纯化的重组人胰激肽原酶蛋白。用酯酶法测定纯化蛋白的酶活性。

用上述方法进行大规模培养细胞并结合基于亲和层析技术制备的重组人胰激肽原酶具有下列特征：通过SDS-PAGE电泳方法测定，重组人胰激肽原酶的电泳带区域比现有人尿激肽原酶宽(重组人胰激肽原酶为38.0-43.0KDa，人尿激肽原酶分子量为40.0-43.0KDa)；说明重组人胰激肽原酶由于其糖基化程度的不同，比现有人尿激肽原酶具有更复杂的组成。通过酯酶法测定酶活性的结果表明重组人胰激肽原酶和现有人尿激肽原酶活性相近。

本发明由于采用了特定的大规模培养条件和发酵方法，从而使得到的重组人胰激肽原酶的糖基化程度与现有的人尿激肽原酶有所不同，在临床应用上副作用明显减小，尤其是对体内血压下降较为缓和。虽然导致重组人胰激肽原酶副作用小的机理并不很清楚，但我们推断可能是由于糖链结构有所不同，导致在体内的发挥了更优异的效能。

经静脉注射给药的重组人胰激肽原酶，一般是固体的灭菌形式，即冻干粉针剂。在使用时可以溶解于灭菌注射用水或各种其它注射用灭菌介质中。经静脉注射给药的重组人胰激肽原酶组合物也可以是水溶液形式，即注射液剂。

应用重组人胰激肽原酶在临床上使用的剂量根据病情的严重程度、治疗时间而定，一般静脉注射给药量是每天给药1-3次，每次0.005-2.5PNA单位。优选，药物的给药量是每天1次，每次0.1-0.2PNA单位。

PNA单位的定义为：在37℃、pH8.0条件下，1分钟水解底物Val-Leu-Arg-PNA释放1μmol游离PNA，即为1PNA单位。

附图说明

附图1：本发明的重组人胰激肽原酶和现有人尿激肽原酶的SDS-PAGE电泳图。1，重组人胰激肽原酶；2，人尿激肽原酶；3，蛋白标准分子量对照。

具体实施方式

实施例1：人胰激肽原酶基因(KLK1基因)的克隆

材料和方法：以人肾总RNA为模板，先通过反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)获得KLK的全长cDNA。然后以该cDNA为模板，首先分别扩增KLK的1-496bp(以ATG为1)和476-789bp两个片段，然后用5’和3’端引物通过重叠延伸PCR技术将两个片段拼接成完整的KLK基因。扩增KLK片段的PCR反应条件：94℃3min变性；94℃30s；62℃30s；72℃30s；扩增34个循环；

72℃延伸5min后结束反应。

扩增KLK的1-496所用引物为：

上游引物：5’GCCTCGCCCTGTCCCTGGGGGGGACTGGTGCTGCGCCCCCGATTCAGTCCCGGATTGTGG3’

下游引物：5’AATTCTCTGGTTCGATGCTGC 3’

PCR扩增476-789bp片段所用引物为：

上游引物：5’GCAGCATCGAACCAGAGAATTTCTCATTTCCAGATGATCTC3’

下游引物：5’GACACCATAGCGGAGAACTCCTGA3’

PCR拼接两个片段所用引物：

上游引物：5’GCCTCGCCCTGTCCCTGGGGGGGACTGGTGCTGCGCCCCCGATTCAGTCCCGGATTGTGG3’

下游引物：5’GACACCATAGCGGAGAACTCCTGA3’

结果：

经过上述方法克隆到的KLK1基因全长序列见序列表中序列1，序列1中标有下划线的碱基为两个多态性位点，GenBank中相应位置分别是T和G。与GenBank发表的人KLK1基因对比，克隆的KLK1基因在第405和433位处存在两个突变，这两处突变是文献中已报道的多态性位点。

根据基因组序列设计对应的引物，用RT-PCR方法获得了KLK1的基因组DNA，见序列表中序列2，大写字母部分代表基因组DNA序列外显子部分，小写字母部分代表基因组DNA序列非编码区及内含子部分。

实施例2：含有重组KLK1基因表达质粒的构建

将全长KLK1基因插入含有CMV强启动子的载体pcDNA3.1/myc-His(-)A的Xho I和EcoR I位点，构建了pcDNA3.1-KLK1真核表达质粒。

构建pcDNA3.1-KLK1所用引物：

上游引物：5’GTGACTCGAGACCATGGGGTTCCTGGTTCTGTGC 3’(下划线为Xho I酶切位点)

下游引物：5’ATCTGAATTCTCAGGAGTTCTCCGCTATGGTGTC 3’(下划线为EcoR I酶切位点)。

另外，为了构建含有人胰激肽原酶和human IgG1 Fc片段以便表达在体内更为稳定的融合蛋白，在pcDNA3.1-KLK1的EcoR I和BamH I位点处插入了human IgG1 Fc片段，构建了pcDNA3.1-KLK1-Fc真核表达质粒。Fc片段位子KLK1基因的C端，通过EcoR I限制性酶切位点连接。

实施例3：重组人胰激肽原酶在真核细胞中的表达及其制备

方法：

1.KLK1基因在CHO细胞中的表达：

CHO细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，于5％CO₂、37℃孵育。用阳离子脂质体(LipofectAMINE 2000，Invitrogen公司)将上述实施例2制备的pcDNA3.1-KLK真核表达质粒转染CHO细胞，以G418筛选转染细胞；进而通过酶活性测定和Western Blot鉴定G418筛选后的单克隆稳定细胞株。

2.大规模培养表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞：

a)将含有表达重组蛋白的细胞株用含有5％胎牛血清的DMEM培养基(pH7.20)进行培养，在无血清培养基中采用常规的方法进行传代适应后，小规模悬浮批次培养，置温度37℃、5％CO2培养箱内孵育生长。接种于5L细胞培养罐(New Brunswick Scientific Co.USA)中进行细胞连续培养，接种密度为3.0×105/ml。培养温度37℃、pH7.2、转速90rpm/min，溶解氧50％空气饱和度和通气量0.1Lpm。

b)在无血清培养基中培养48小时后，将无血清灌注培养基以0.6V/V/day的灌注速率灌注进入生物反应器进行灌注培养。随着新鲜培养基的连续灌注，细胞数目逐渐增加，灌注速度需根据培养基中的残糖量进行调节。

当每天灌注≥5L时，保持残糖量在0.8-1.2g/L；抽取罐内少量培养液，检测和跟踪其体外活性。培养时间为28天，从第6天起开始收液，最高细胞密度可达1.1×107/ml。

c)收集含有表达重组人胰激肽原酶的培养基，过滤去除细胞碎片。上清液用于重组蛋白的纯化。

3.重组蛋白的纯化包括以下步骤：

a)收集10L含有重组人胰激肽原酶的无血清培养基，超滤浓缩后，上扩张床强阴离子交换(Streamline Q XL，GE Healthcare公司)离子交换柱，用含0.15M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲冲洗柱子至OD280＜0.2；用含0.3M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲洗脱柱子。

b)在上述20L洗脱收集液加入1800g(NH4)2SO4，用HCl调整pH 7.0±0.1，上苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl Sepharose 6Fast Flow，GEHealthcare公司)。用0.7M(NH4)2SO4缓冲液冲洗柱子。用0.4M(NH4)2SO4缓冲液进行洗脱柱子，洗脱液用10000膜超滤至3L。加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7.0±0.2，然后60℃恒温加热10小时。加热后将溶液调pH8.0±0.1，上苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶柱(Benzamidine Sepharose 6B，GE Healthcare公司)，用含0.1M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲进行冲洗，用含0.4M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲进行洗脱。

c)调节上述洗脱收集液pH4.0±0.1，上SP琼脂糖凝胶FF柱(SpSepharoseTM Fast Flow，GE Healthcare公司)，用0.1M NaAc-HAc缓冲液进行冲洗至流出液OD280＜0.15，用含0.1MNaCl及0.1MNaAc-HAc缓冲溶液进行洗脱，收集OD280＞0.1的洗脱流出液。将洗脱收集液调pH7.0，用1万超滤膜进行超滤浓缩。

4.活性测定方法：

分别配置含有等量活性的人尿激肽原酶和重组人胰激肽原酶的样品溶液，在样品溶液中加入底物S-2266(H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl)，置37±0.5℃水浴中准确反应15分钟，在405nm波长处测定测定各样品的吸收值A，A值控制在0.1～0.2之间。将A值代入下式计算活性单位：

PNA单位/ml＝173.6×A×T/1000

注：式中173.6为反应常数；T为稀释倍数；1000为单位/L与单位/ml的单位换算值

活性单位定义为：在37℃pH8.0的条件下，1分钟水解1μmolVal-Leu-Arg-PNA的酶量称为1PNA单位。

结果：

在CMV强启动子调控下将KLK1基因转染到CHO细胞，通过酶活性测定和Western Blot分析筛选酶活性高的单克隆稳定细胞株，通过生物反应器灌注法进行大规模细胞培养，收集含有重组人胰激肽原酶的无血清培养基，进行纯化，获得纯化的重组人胰激肽原酶。通过酯酶法测定酶活性的结果表明重组人胰激肽原酶和人尿激肽原酶活性相近，分别为7.1和6.8PNA/mg蛋白。

灌注培养一方面连续向反应器中注入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。优化培养条件后细胞密度达到10⁷/ml，高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞以足够的营养以及除去有素毒的代谢物。灌注培养时用新鲜的培养液进行灌注，可以确保上述目的的实现。通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。采用灌注培养的优越性在于大大提高了细胞生长密度，同时有助于产物的表达和纯化。

已有报导表明蛋白质糖基化的程度受多种因素的影响，如大规模培养条件和发酵方法等。纯化的重组人胰激肽原酶和现有的人尿激肽原酶分子量通过SDS-PAGE电泳测定，结果如附图1所示。从附图1中可以看出，现有的人尿激肽原酶分子量为39.0-43.0KDa，本发明的重组人胰激肽原酶为35.0-44.0KDa，重组人胰激肽原酶的电泳带区域比人尿激肽原酶宽，说明重组人胰激肽原酶由于其糖基化程度的不同，尤其是唾液酸化程度的不同，即重组人胰激肽原酶比人尿激肽原酶具有更复杂的糖基化组成。

实施例4重组人胰激肽原酶对新西兰兔血压的影响

动物和分组：

新西兰兔18只，体重2.0-3.0kg，雌雄各半。在光照充足、通风和空调设备良好动物室饲养，室温控制在20-25℃，湿度为40-65％。将动物随机分为3组，每组6只：

①对照组：氯化钠注射液

②重组人胰激肽原酶组

③人尿激肽原酶组

检测指标和方法：用20％乌拉坦(5ml/kg)静脉注射麻醉后，切开气管，插入气管套管。一侧颈动脉插管并与压力换能器相连，经AP-601G放大器测量股动脉血压。在血压指标稳定后记录初始动脉压作为对照值，然后静脉注射给药(2ml/Kg)，在20min内定时匀速注完，对照组给予等体积氯化钠注射液。分别记录给药后在5、15、30、45、60min时间点的平均动脉压。一次注射重组人胰激肽原酶和人尿激肽原酶剂量为0.005PNA/Kg，用氯化钠注射液进行稀释。

结果：

各组新西兰兔不同时间点平均动脉压值的检测结果如下见表1：

表：各组新西兰兔不同时间点平均动脉压(KPa)的变化

注：其中①组为氯化钠注射液对照组，②组为重组人胰激肽原酶组，③组为人尿激肽原酶组。另外，*和**分别表示各组内不同时间点压力与初始压力比较，P＜0.05和P＜0.01。

从表1可以看出，对照组和重组人胰激肽原酶组从注射开始到注射结束的整个观察时间内，平均动脉压较稳定，未出现明显波动，而人尿激肽原酶组则在给药5min即出现血压明显下降，静脉给药结束后40min恢复注射前的平均动脉压。

实验结果表明，重组人胰激肽原酶和人尿激肽原酶对家兔血压的影响有明显差异，重组人胰激肽原酶在上述给药条件下对血压没有明显影响，而人尿激肽原酶则表现出短期的对血压的下降作用。

序列表

序列1：克隆到的KLK1基因全长序列

ATGTGGTTCCTGGTTCTGTGCCTCGCCCTGTCCCTGGGGGGGACTGGTGCTGCGCCCCCGATTCAGTCCCGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGTGAGCAGCATTCCCAGCCCTGGCAGGCGGCTCTGTACCATTTCAGCACTTTCCAGTGTGGGGGCATCCTGGTGCACCGCCAGTGGGTGCTCACAGCTGCTCATTGCATCAGCGACAATTACCAGCTCTGGCTGGGTCGCCACAACTTGTTTGACGACGAAAACACAGCCCAGTTTGTTCATGTCAGTGAGAGCTTCCCACACCCTGGCTTCAACATGAGCCTCCTGGAGAACCACACCCGCCAAGCAGACGAGGACTACAGCCACGACCTCATGCTGCTCCGCCTGACAGAGCCTGCTGATACCATCACAGACGCTGTGAAGGTCGTGGAGTTGCCCACCCAGGAACCCGAAGTGGGGAGCACCTGTTTGGCTTCCGGCTGGGGCAGCATCGAACCAGAGAATTTCTCATTTCCAGATGATCTCCAGTGTGTGGACCTCAAAATCCTGCCTAATGATGAGTGCAAAAAAGCCCACGTCCAGAAGGTGACAGACTTCATGCTGTGTGTCGGACACCTGGAAGGTGGCAAAGACACCTGTGTGGGTGATTCAGGGGGCCCGCTGATGTGTGATGGTGTGCTCCAAGGTGTCACATCATGGGGCTACGTCCCTTGTGGCACCCCCAATAAGCCTTCTGTCGCCGTCAGAGTGCTGTCTTATGTGAAGTGGATCGAGGACACCATAGCGGAGAACTCCTGA

 

序列2：KLK1基因组序列

agatctctgggactttggaggacaggacgttgagcacccataactgggagcaagaagtgggaggctcattgagaccccagcattgtttgggagggacactggattttgtaatgctaaagaacttaccctgggagacccctgaaacttcacattcctggatctggaggcactaggaatgtggtgatgtgtaccccaaaattttattatgaaaggaacagtagctttggggacctaggtcctgggtctgggagtgcaagaaccagggcattctgaaggccaaggcttatatttcagggggaactggcagctgagatgctagtatcttggctccgagtggtgcagggaatcagagccctaactgctggtgtttgagggcaccaggtctgggggtgcagggccttaattgagactgaggtatatggggctttgtaccaggggtcactgattcctccgtcttcctgtttctgcttcccctcagtccccccttgcctcactggctgctccccagagcaaagccccagagccacaggccctgccccacctggcttcaaccccaggaatgcgtccagcgtgatccagggcctgcagaacaggtgctggttctccctccccgtctacagctctggggatcggaggcgggggggcaattgtccagcccccaggcaacaggggaagggccttggcaacatctgggtgccagcagggcaggggtggggctctgaggggataagggcttttaaaagcctccccagggaggttccccAGTTCCTCCACCTGCTGGCCCCTGGACACCTCTGTCACCATGTGGTTCCTGGTTCTGTGCCTCGCCCTGTCCCTGGGGGGGACTGgtgagacagtggggggatgtgggagggggaacgggccctgattctcttgctggcctcacatccccccccgataagaccttcccctccaacaccccaccctcatccctctggcccacagtctatcctagtccggggtgccccggctcttatctatcttgcgcggccccaccctaaacttccacccccgctcctccatgttgtcatagtgctcactcccacaccagattcctgctcctcccaggaagcctcagtactttctcctcttccctagccaacgccctgtcccaccgctttaccaaaggggcagattctgggccatctctgtctctctctggaggaccccaaccctcccatgggcttcccccaccccacaggactctgatcatcccctcctgccccctagttccctgcggccacctatttggctcctgagtctacaaatcccaccacactccagtgactttttccatccagctgtccgctctcaactgtgtcctccagaccctgacatctggtctccccagtccttccagggtcccccaaatttcaccagaaaaccctgcttcccaaactggcatgtgggatcccccatctggtatgggggggggtctgcaaatgtcccttcccacccagcacccccagctctcccaggaaaaacaccacaccctcccaccacatgctcctttccttggggaagttccatcccgccccaggccccagcccttctctgcctgaattgttcctacacagctctggttttctggaaccccacgccaaggatcctgaatgccttctcagccagcgcttctgccctggctcccccaagtcagtatgtgattctacaacctcacatcaagtgggtcctgcattgcattcccacagctgcttggcgcctgttctcaccacttctccaatcctcttcctaggattgcctccaagaggaccccatatccttccagtaccctcagaccatgaaccccatccccatgagaaacgaagatcccatccttcaccctgtccgagaaggactgccactcacgcctccctcctcctgagccccgtcccagtcctgaccgcaactgtgttctcagggccccaacctcccctcatattgccattcctggttcacaggaaggaccccaaaacctctcggaagcccacctctagccttaaccatagccctttcttttaccctttaaccaggaagccctgaaatctaactgtccagccaagctggccccttccaaccccaatgtagggaccccaagtcacccccaaactcttcagtcgagatgctcttctttacctctcagacctggttccctaaagctgcatcctttcctgaacctcaaaagcccaacccaggtcctgtttccctagcctaggagccccttagccctccagattcttcctcagtgagcctctgatcctgtcccacccttggcgccttgatccctggtttccagaatccctttccactcccctaacccaccacctcccatcccccagccccagaccccaaatgacctgacgcccagatgcagtgtctgctccagacactgtctcctgtctcctaccctgatccctggaggctgctctactgtcagagcacaaaatctccccaccaggtccagccaccactccaaaagcccagggaacagtccagagtcccaccccttcccaacaccccttgcccatgtccccaacctccagccctggtcctctacccgcaatgtcccttcagacccacagcccagctccctctcctagccttgtccctggcctctcctgccaaccctgcccttcctgacccagcaccgcctctgcagGTGCTGCGCCCCCGATTCAGTCCCGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGTGAGCAGCATTCCCAGCCCTGGCAGGCGGCTCTGTACCATTTCAGCACTTTCCAGTGTGGGGGCATCCTGGTGCACCGCCAGTGGGTGCTCACAGCTGCTCATTGCATCAGCGAgtgagtaggggcctggggtctgggaggagggcatctatgctgccacaggattgacaggccagtggcattccccttggataacctcaggcaagactggggggctgagccagagaggaaggctctggcgcaggtcgcctggcagggcagagctgggctggacacccctctccaaggctgcctgggtctcttgggatctggttctgcttgtgtctctgtgtgactgtgttctggtctctgtcttcctctctctcctctgtctccttgtctctgcatctcccctgtctctgtctgtctctgagtctctctgcggcatctctgtcactgtgtctcaccctccatctctctacccatctctctctctctgggtctctacctcaccgctccctcatccctactaaacacacacccagatggacctaagggaggccccagagtaaaggaagggctttatccccaacttgtgtgcctgggagggggcgcctctccctctgtccagctccccgccccacaggatatccctccactctggagagacacagggaagggctggtttcagcgggagctgggtggggcaactgagggaggaggaaggaggaggcggggcgagaaacgcgcgggagggtgctgggaaccgaagggggcctcgaccttggacttcaggccaggccacctgcccctggggagcccgcaccacagccccagctgcagctgagccgctctcaggcctcccctcctccctacctgcccccaccctccccacctgcccccaccctcccccagggcctccctcccttttctctcccacactcggtcactcctgcttcctctctgcctctgtttctagttctcactctgacgtcccgcgtcctttttcatttgtctgcttctcgctcccttccgtgttctgttccctcttcctccctcttccctggggcctgtttctcgctgtccctgtcttttatccttctcatctgcctcttttttgctcaccctgtttctcactgccctcccctccgcctttctcacccctctgtccttttgagctcttttttgctctgtctcttcatttgccttttgcactctcaaactctttcatcttcccattcgctgtctgtatttctccataactatatctttcttcctctgtctccgcccacccacatttttctctttccctttctctctttggggaccctcccccatgctcccctgccccatccccttttccccttcccgtcttctcatccctccattcccatctttccccagCAATTACCAGCTCTGGCTGGGTCGCCACAACTTGTTTGACGACGAAAACACAGCCCAGTTTGTTCATGTCAGTGAGAGCTTCCCACACCCTGGCTTCAACATGAGCCTCCTGGAGAACCACACCCGCCAAGCAGACGAGGACTACAGCCACGACCTCATGCTGCTCCGCCTGACAGAGCCTGCTGATACCATCACAGACGCTGTGAAGGTCGTGGAGTTGCCCACCCAGGAACCCGAAGTGGGGAGCACCTGTTTGGCTTCCGGCTGGGGCAGCATCGAACCAGAGAATTgtatgtgggggcagactgtgtagcccaaggcggggatggggactcctgcgtccaagggagaaagggccagggaagcaggtgaggtcgggctgcagccctttttctcccgggttcgtagTCTCATTTCCAGATGATCTCCAGTGTGTGGACCTCAAAATC CTGCCTAATGATGAGTGCAAAAAAGCCCACGTCCAGAAGGTGACAGACTTCATGCTGTGTGTCGGACACCTGGAAGGTGGCAAAGACACCTGTGTGgtgaggcagccctgcccccagggtctggaagggctgagggaggggactcagcctctgaactggcttctgagagctaaccaggcatctgcttcactgcttcccagctagctgtagccactcgccccatcagtgccccagctccccctccttccccgcccatccagggacaactgcatctcaccccccacaccagagttcaccgttcctcgtggtaatgtgttgttaccgtcgagtcagagagtagtcctggagaggtggcctctgcgatgtgcccgcaggggcagcgtcctgcagatggtcctgcccctcctccccctaacctgtctgcaggcactgtccacctggaccctgccccatgtgcaggagctggaccctgaggtcccttcccccttggccaggactggagaccctgtcccctctgtgggaatccctgcccaccttcctctgggagtgggcactggaggccctgtctgcgagctggggctccccaggcagaacttgggccccgtagacctttctcactctcccctcccaccttgtgctcccagGGTGATTCAGGGGGCCCGCTGATGTGTGATGGTGTGCTCCAAGGTGTCACATCATGGGGCTACGTC CCTTGTGGCACC CCCAATAAGCCTTCTGTCGCCGTCAGAGTGCTGTCTTATGTGAAGTGGATCGAGGACACCATAGCGGAGAACTCCTGAACGCCCAGCCCTGTCCCCTACCCCCAGTAAAATCAAATGTGCATCCaatgtgtgtcacgttctgccatcacctatctttccagatgtggtgcacctggacccactcggctgaggctggggccaccccagctgtgtcaatctcatgcctggaagtctgaggtcaccagcaggtggggaaaggaaggggctgtgacaggtgcagacaaacaggcagggaaaggctcagatcccaaagggcgagtcagggacgccagaacagttcactcacactaggatggaccctgccctggtggggaggtggggggcaatggaaggtctgaggctgagaggt

Claims (8)

1.一种重组人胰激肽原酶，其中所述重组人胰激肽原酶是由238个氨基酸残基组成一条单链，N-末端和C-末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，通过SDS-PAGE电泳测定，其分子量为35.0-44.0KDa，其一级结构为：

2.根据权利要求1所述的重组人胰激肽原酶，该分子中含有5对S-S键，分别为Cys7-Cys150，Cys26-Cys42，Cys29-Cys196，Cys161-Cys175以及Cys186-Cys211，等电点约为4.0，分子中含有14.4％的糖，结合位点分别位于Asn78、Asn84及Asn141。

3.制备根据权利要求1所述的重组人胰激肽原酶的方法，其步骤为：

1)根据KLK1的DNA序列设计引物，采用RT-PCR方法从人胰腺扩增KLK1 DNA序列；

2)将KLK1 DNA克隆到表达载体，构建含有KLK1 DNA的表达质粒；

3)将含有KLK1 DNA表达质粒转入宿主细胞；

4)用发酵方法或大规模细胞培养方法大量生产表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞，其步骤如下：

a)将含有表达重组蛋白的细胞株用含有5-10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养，然后在无血清培养基中采用常规的方法进行传代适应后，小规模悬浮批次培养，置温度37℃、5％CO₂培养箱内孵育生长，接种于细胞培养罐中进行细胞连续培养，接种密度为1.0×10⁵/ml-5.0×10⁵/ml，培养温度37℃、pH7.2、转速50-120rpm/min，溶解氧50％空气饱和度和通气量0.1Lpm；

b)在无血清培养基中培养24-72小时后，将无血清培养基灌注进入生物反应器进行灌注培养，保持残糖量在0.8-1.2g/L；

c)收集含有表达重组人胰激肽原酶的培养基，过滤去除细胞碎片，上清液用于重组蛋白的纯化；

5)从大量培养的表达重组人胰激肽原酶的细胞中纯化重组蛋白，该蛋白的纯化包括以下步骤：

a)将含有重组人胰激肽原酶的培养基超滤浓缩后，上扩张床强阴离子交换柱，冲洗柱子至OD₂₈₀＜0.2；用缓冲液洗脱柱子；

b)在上述洗脱收集液加入(NH₄)₂SO₄，用HCl调整pH 7.0±0.1上苯基交联琼脂糖快速流凝胶，洗脱液用10000MWCO膜超滤至3L，加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7.0±0.2，然后60℃恒温加热10小时，加热后将溶液调pH8.0±0.1，上苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶柱，冲洗，洗脱。

c)调节上述洗脱收集液pH4.0±0.1，上SP琼脂糖凝胶FF柱，冲洗至流出液OD280＜0.15，洗脱，收集OD280＞0.1的洗脱流出液，将洗脱收集液调pH7.0，用10000MWCO膜进行超滤浓缩，得到纯化的重组人胰激肽原酶蛋白。

4.根据权利要求3所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤1)中的KLK1DNA序列包括cDNA、基因组DNA和人工合成的DNA。

5.根据权利要求4所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤2)中的表达载体包括原核表达载体、酵母表达载体或真核表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤3)中的宿主细胞包括原核细胞、酵母或哺乳细胞。

7.根据权利要求6所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤4)的a)中，所述的接种密度为3.0×10⁵/ml，转速为90rpm/min。

8.权利要求1-2所述的重组人胰激肽原酶在制备治疗脑梗塞的药物中的用途。

Images