CN105176953A - 一种胰激肽原酶纯化工艺 - Google Patents

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周翔
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Abstract

本发明公开了一种胰激肽原酶纯化工艺，该工艺包括提取、超滤、盐析、层析、超滤浓缩、及除菌冻干过程。与现有技术相比，本发明具有以下优点：（1）本发明所述胰激肽原酶纯化工艺能够适应工业化大规模的生产的需求，重现性好、保证不同生产批次的产品质量；（2）本发明所述胰激肽原酶纯化工艺缩短了整个生产工序的时间，自动化程度高；（3）本发明所述胰激肽原酶纯化工艺每批次可获得3.5亿单位的胰激肽原酶产品，且产品纯度达到90%以上，比活大于800？U/mg·pro，整个层析工艺花费的时间缩短至4小时以内。

Description

一种胰激肽原酶纯化工艺
技术领域
本发明涉及一种分离纯化方法，尤其涉及一种胰激肽原酶纯化工艺。
背景技术
胰激肽原酶是一种由18种氨基酸、4种糖组成的糖蛋白。它作用于蛋白质底物激肽原后释放出激素物质激肽。具有以下作用：扩张血管、改善微循环；激活纤溶酶、降低血粘度；激活磷脂酶A2，防止血小板聚集，防止血栓形成等；因此常被用作临床血管扩张药。此外，还可用来治疗微循环障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病、周围神经病、视网膜病、眼底病及缺血性脑血管病，也可用于原发性高血压的辅助治疗。
胰激肽原酶是从哺乳动物的胰脏中提取纯化而得，提取途径为从胰脏本身、胰酶粉或胰激肽原酶粗品中提取，并通过纯化而获得胰激肽原酶纯品。
现有技术中，胰激肽原酶的纯化工艺主要有离子交换层析，疏水层析，超滤等方法。中国专利CN00119540.9胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法，该专利利用胰激肽原酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶对酶抑制剂的亲和性的差别，使抑制剂与水不溶性载体结合。而将激肽原酶与其他酶分解，进而制得高纯度的胰激肽原酶产品。本发明具有以下优点：工艺简单、操作方便、适于工业化生产，且获得的胰激肽原酶单位效价较高，比活及收率较原有技术提升较大。但是上述方法在工业化纯化时规模较小，自动化程度较低，且工业化生产时上述方法的重现性较差。
发明内容
本发明的目的是：本发明通过提供一种胰激肽原酶纯化工艺解决现有技术中胰激肽原酶纯化技术规模较小、重现性较差、自动化程度低的问题，本发明采用亲和层析对胰激肽原酶进行纯化，从而获得单位效价高、比活高、收率高的胰激肽原酶。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种胰激肽原酶纯化工艺，包含以下步骤：
(1)提取：将粗胰激肽原酶和饮用水投入反应罐中，搅拌至完全溶解，用酸调节pH至3.0～6.0；
(2)超滤：将步骤(1)获得的混合液过滤或离心后取清液，将清液过超滤膜，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率低于2000μs/cm后收集超滤液；
(3)盐析：按超滤液与硫酸铵质量比1:0.1～0.5向超滤液中加入硫酸铵，静置后离心收集上清液；
(4)层析：将200～300升的亲和填料装入层析柱中，并与层析系统相连，系统流速设为600～800升/小时，用质量浓度为10～20％的硫酸铵平衡层析柱；将步骤(3)中获得的上清液流经层析柱，并用质量浓度为10～20％的硫酸铵洗涤，然后用质量浓度为10～20％的氯化钠洗脱，收集洗脱液，至紫外波长280nm处的吸收线降至基线后停止收集；
(5)超滤浓缩：将步骤(4)收集的洗脱液过超滤膜，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率低于1000μs/cm后收集超滤液；
(6)除菌冻干：向步骤(5)中获得的超滤液中加入辅料，超滤液与辅料的质量比为5～7:0.2～0.7，除菌过滤后在-40～-30℃条件下冻干得到胰激肽原酶冻干粉。
作为本发明的优选方案，步骤(1)中至粗胰激肽原酶完全溶解后，用酸调节pH至4.5。
作为本发明的优选方案，步骤(3)中按超滤液与硫酸铵质量比1:0.2向超滤液中加入硫酸铵，静置后离心收集上清液。
作为本发明的优选方案，步骤(4)层析过程中，温度不高于20℃。
作为本发明的优选方案，步骤(2)与步骤(5)中使用的超滤膜规格为分离分子量10000道尔顿的膜。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明所述胰激肽原酶纯化工艺能够适应工业化大规模的生产的需求，重现性好、保证不同生产批次的产品质量；
(2)本发明所述胰激肽原酶纯化工艺缩短了整个生产工序的时间，自动化程度高；
(3)本发明所述胰激肽原酶纯化工艺每批次可获得3.5亿单位的胰激肽原酶产品，且产品纯度达到90％以上，比活大于800U/mg·pro，整个层析工艺花费的时间缩短至4小时以内。
具体实施方式
实施例1：
一种胰激肽原酶纯化工艺，包含以下步骤：
(1)提取：向反应罐中加入800kg的粗胰激肽原酶和10.8吨饮用水，搅拌至完全溶解，制得粗提液，用草酸溶液调节pH至3.0，搅拌反应2小时后离心获得清夜；
(2)超滤：将步骤(1)获得的清液过超滤膜，超滤膜规格为分离分子量10000道尔顿，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率达到2000μs/cm后收集超滤液；
(3)盐析：按超滤液与硫酸铵质量比1:0.1向超滤液中加入硫酸铵，静置1小时后离心收集上清液；
(4)层析：将200升的亲和填料装入层析柱中，并与层析系统相连，系统流速设为600升/小时，用质量浓度为10％的硫酸铵平衡层析柱；将步骤(3)中获得的上清液流经层析柱，并用质量浓度为10％的硫酸铵洗涤，然后用质量浓度为10％的氯化钠洗脱，收集洗脱液，至紫外波长280nm处的吸收线降至基线后停止收集，该步骤反应温度控制在16℃；
(5)超滤浓缩：将步骤(4)收集的洗脱液过超滤膜，超滤膜规格为分离分子量10000道尔顿，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率为1000μs/cm后收集超滤液；
(6)除菌冻干：向步骤(5)中获得的超滤液中加入辅料，超滤液与辅料的质量比为5:0.2，除菌过滤后在-30℃条件下冻干得到胰激肽原酶冻干粉。
实施例2：
一种胰激肽原酶纯化工艺，包含以下步骤：
(1)提取：向反应罐中加入800kg的粗胰激肽原酶和10.8吨饮用水，搅拌至完全溶解，制得粗提液，用草酸溶液调节pH至4.5，搅拌反应2小时后离心获得清夜；
(2)超滤：将步骤(1)获得的清液过超滤膜，超滤膜规格为分离分子量10000道尔顿，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率达到1600μs/cm后收集超滤液；
(3)盐析：按超滤液与硫酸铵质量比1:0.2向超滤液中加入硫酸铵，静置1小时后离心收集上清液；
(4)层析：将300升的亲和填料装入层析柱中，并与层析系统相连，系统流速设为700升/小时，用质量浓度为12％的硫酸铵平衡层析柱；将步骤(3)中获得的上清液流经层析柱，并用质量浓度为12％的硫酸铵洗涤，然后用质量浓度为14％的氯化钠洗脱，收集洗脱液，至紫外波长280nm处的吸收线降至基线后停止收集，该步骤反应温度控制在16℃；
(5)超滤浓缩：将步骤(4)收集的洗脱液过超滤膜，超滤膜规格为分离分子量10000道尔顿，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率为800μs/cm后收集超滤液；
(6)除菌冻干：向步骤(5)中获得的超滤液中加入辅料，超滤液与辅料的质量比为6:0.5，除菌过滤后在-40℃条件下冻干得到胰激肽原酶冻干粉。
实施例3：
一种胰激肽原酶纯化工艺，包含以下步骤：
(1)提取：向反应罐中加入800kg的粗胰激肽原酶和10.8吨饮用水，搅拌至完全溶解，制得粗提液，用草酸溶液调节pH至6.0，搅拌反应2小时后离心获得清夜；
(2)超滤：将步骤(1)获得的清液过超滤膜，超滤膜规格为分离分子量10000道尔顿，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率达到1200μs/cm后收集超滤液；
(3)盐析：按超滤液与硫酸铵质量比1:0.5向超滤液中加入硫酸铵，静置1小时后离心收集上清液；
(4)层析：将260升的亲和填料装入层析柱中，并与层析系统相连，系统流速设为800升/小时，用质量浓度为20％的硫酸铵平衡层析柱；将步骤(3)中获得的上清液流经层析柱，并用质量浓度为20％的硫酸铵洗涤，然后用质量浓度为20％的氯化钠洗脱，收集洗脱液，至紫外波长280nm处的吸收线降至基线后停止收集，该步骤反应温度控制在16℃；
(5)超滤浓缩：将步骤(4)收集的洗脱液过超滤膜，超滤膜规格为分离分子量10000道尔顿，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率为800μs/cm后收集超滤液；
(6)除菌冻干：向步骤(5)中获得的超滤液中加入辅料，超滤液与辅料的质量比为7:0.7，除菌过滤后在-35℃条件下冻干得到胰激肽原酶冻干粉。
对实施例1～3所述方案纯化获得的产品进行检测，结果如下表所示：
实施例1 实施例2 实施例3
产量(亿单位) 3.4 3.8 3.6
产品收率(％) 93 94 93
比活(U/mg·pro) 800 900 860
单位效价(632U/mg) 600 632 615
工艺耗时(小时) 3.6 3.4 3.5

Claims (5)

1.一种胰激肽原酶纯化工艺，其特征在于，包含以下步骤：
（1）提取：将粗胰激肽原酶和饮用水投入反应罐中，搅拌至完全溶解，用酸调节pH至3.0~6.0；
（2）超滤：将步骤（1）获得的混合液过滤或离心后取清液，将清液过超滤膜，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率低于2000μs/cm后收集超滤液；
（3）盐析：按超滤液与硫酸铵质量比1:0.1~0.5向超滤液中加入硫酸铵，静置后离心收集上清液；
（4）层析：将200~300升的骨架为聚甲基丙烯酸树脂的亲和填料装入层析柱中，并与自动层析系统相连，系统流速设为600~800升/小时，用质量浓度为10~20%的硫酸铵平衡层析柱；将步骤（3）中获得的上清液流经层析柱，并用质量浓度为10~20%的硫酸铵洗涤，然后用质量浓度为10~20%的氯化钠洗脱，收集洗脱液，至紫外波长280nm处的吸收线降至基线后停止收集；
（5）超滤浓缩：将步骤（4）收集的洗脱液过超滤膜，期间分次加入纯化水，至超滤液电导率低于1000μs/cm后收集超滤液；
（6）除菌冻干：向步骤（5）中获得的超滤液中加入辅料，超滤液与辅料的质量比为5~7:0.2~0.7，除菌过滤后在-40~-30℃条件下冻干得到胰激肽原酶冻干粉。
2.根据权利要求1所述一种胰激肽原酶纯化工艺，其特征在于，步骤（1）中至粗胰激肽原酶完全溶解后，用酸调节pH至4.5。
3.根据权利要求1所述一种胰激肽原酶纯化工艺，其特征在于，步骤（3）中按超滤液与硫酸铵质量比1:0.2向超滤液中加入硫酸铵，静置后离心收集上清液。
4.根据权利要求1所述一种胰激肽原酶纯化工艺，其特征在于，步骤（4）层析过程中，温度不高于20℃。
5.根据权利要求1所述一种胰激肽原酶纯化工艺，其特征在于，步骤（2）与步骤（5）中使用的超滤膜规格为分离分子量10000道尔顿的膜。
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