CN101914511A - 一种制备高纯度胰激肽原酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，该方法包括以下工艺步骤：(1)原料磨碎、加热反应；(2)提取；(3)盐析；(4)亲和层析分离纯化；(5)超滤浓缩除菌；(6)真空冷冻干燥，即可得到成品。与现有技术相比，本发明已建立起一套规模化生产的生产工艺，体现出了亲和层析法制备胰激肽原酶的高效性、专一性，有利于生产工艺的稳定可控，减少了生产成本，大大提高了产品品质，其中比活达到800单位/毫克蛋白以上、纯度达到90％以上，从而极大地提高了产品的市场竞争力。

Description

一种制备高纯度胰激肽原酶的方法

技术领域

本发明涉及一种胰激肽原酶的制备方法，具体地说是涉及一种采用亲和层析法生产高纯度胰激肽原酶的制备方法；属于生物制药领域，涉及到药用蛋白酶的生化分离技术。

背景技术

胰激肽原酶是从猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶，它在药理和临床上的功用主要为：胰激肽原酶是一种具有扩张血管改善微循环作用的周围血管扩张药；它能够激活纤溶酶，抑制磷脂酶A2，具有降低血粘度，防止血小板聚集，防止血栓形成等作用。其主要用于微循环障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病、周围神经病、视网膜病、眼底病及缺血性脑血管病的治疗，也可用于高血压病的辅助治疗。

现有胰激肽原酶的纯化方法一种是使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离；或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡聚糖上，并分离之；另一种纯化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之。然而，利用上述多糖型非树脂物料进行吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备。而离子交换树脂法不能使产品在洗脱时除去不需要的杂质。因此，上述方法得到产品的纯度还有待于进一步提高。

胰激肽原酶最初收载于中国卫生部药品标准二部第六册(生化药品)(1998年)中，该标准中规定胰激肽原酶的比活按干燥品计算不得小于300单位/毫克蛋白，2006年国家药典委员会对该标准进行了修订，增加了纯度指标，规定供口服用胰激肽原酶的纯度不得低于65％。这一指标的制定从一定程度上提高了对胰激肽原酶的品质要求，但是由于目前国内生产胰激肽原酶工艺水平不高，产品纯度所能达到的程度不均衡，质量稳定性差，因此在制定纯度限度要求时，对纯度要求只有65％。最新发布的中国药典2010版中将胰激肽原酶作为新品种收录其中，对纯度要求做了修订，胰激肽原酶的纯度要求也仅提高到70％。

根据分析，胰激肽原酶工艺未获得重大突破的原因有三：一是生产厂家的工艺惯性，工艺一旦稳定不轻易变动；二是几年前胰激肽原酶在临床上的应用主要是用作口服制剂等，对产品的质量要求没有那么高；三是亲和层析技术本身的技术难度使得开发以亲和层析工艺来制备胰激肽原酶的技术不是那么容易。

可是近年来国际研究发现，胰激肽原酶静脉注射可舒张脑血管、增加脑血液中血红蛋白含量，降低脑梗塞面积的扩展，改善梗塞引起的脑组织葡萄糖和氧摄取降低，改善葡萄糖代谢，并可改善自发性皮层脑电图异常，用于治疗轻/中度急性血栓性脑梗死，这个应用使得国际市场上对本产品的需求不断扩大，而从质量要求上却更加严格，要求产品有更好的品质，传统工艺生产的胰激肽原酶显然已经不能满足这种需求。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺稳定、质量保证的制备高纯度胰激肽原酶的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)原料磨碎、加热反应：用研磨设备将新鲜冷冻猪胰直接磨成浆状，控制温度为40-60℃，加热搅拌反应4-5h，放置过夜，得到反应液；

(2)提取：将反应液泵入提取桶，将反应液、纯化水和丙酮按体积比1∶3∶1混合，搅拌3-4h，再经过固液分离装置得到清液；

(3)盐析：向步骤(2)得到的清液中加入硫酸铵至30％饱和度，在4℃冷库中放置过夜后过滤，得到提取液，在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，弃去上清液后用离心法收集底层沉淀，得到粗品；

(4)亲和层析分离纯化：将得到的粗品用纯化水溶解得到溶解液，将亲和层析介质装入分离柱，用缓冲液进行平衡后用溶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕后继续用缓冲液冲柱至流出液的OD₂₈₀值小于0.1；换用pH为7.0，浓度为0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)及0.5mol/L KCl的混合缓冲液继续洗脱，控制流速为50cm/h，收集洗脱峰；

(5)超滤浓缩除菌：对收集到的洗脱峰采用超滤膜进行浓缩，得到的浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌得到酶液；

(6)真空冷冻干燥：将步骤(5)中得到的酶液置于冻干盘中，通过真空冷冻干燥对酶液进行冷冻干燥，即得到产品。

所述的步骤(2)中固液分离装置为机电一体化箱式板框过滤设备。

所述的步骤(4)中亲和层析介质是以市售的GE Health凝胶作为基础，以三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶氮基-苯甲脒作为配基，在酸性条件下于冰浴中搅拌24小时制备而得，凝胶与配基的重量比为1∶(0.1-0.2)。

所述的步骤(4)中的缓冲液为浓度为0.1mol/Lol/L，pH为7.0的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液。

所述的步骤(5)中超滤膜为截流分子量为5000的超滤膜。

所述的步骤(6)中真空冷冻干燥的冷冻温度为-40～-50℃。

与现有技术相比，本发明体现出了亲和层析法生产胰激肽原酶的优越性，有利于工艺的稳定和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，以较高的收率得到纯度很高的产品，胰激肽原酶的比活由层析前的约150单位/毫克蛋白提高到约900单位/毫克蛋白，比活提高600％以上，纯度由层析前的40％左右提高到90％，大大提高了产品的市场竞争力。

附图说明

图1为纯度测定中对照品的色谱图；

图2为实施例1亲和层析前色谱图；

图3为实施例1亲和层析后色谱图；

图4为实施例2亲和层析前色谱图；

图5为实施例2亲和层析后色谱图；

图6为实施例3亲和层析前色谱图；

图7为实施例3亲和层析后色谱图。

具体实施方式

本发明将通过以下具体实施例来说明本技术的实施过程。

实施例1

取新鲜冷冻猪胰200公斤，用研磨机将原料直接磨成浆状，50℃加热搅拌反应5h，放置过夜。次日将反应液泵入提取桶，加入600L纯化水、200L冷丙酮，搅拌4h，用板框过滤设备过滤得清液，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理。清液超滤浓缩，加入硫酸铵至30％饱和度，在4℃冷库中放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液，在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到粗品2.2公斤。粗品用22L纯化水溶解，将20L自制的亲和层析介质装柱，亲和层析介质以市售的GE Health凝胶介质为基础，以CAD(三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶氮基-苯甲脒)作为配基，在酸性条件下于冰浴中搅拌24小时制备而得，凝胶与配基的重量比为1∶0.1。用60L 0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，pH为7.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用溶解液上样，控制流速在30cm/h；上样完毕，继续用60L缓冲液进行平衡冲柱至流出液的光密度OD₂₈₀值小于0.1。换用0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L KCl，pH为7.0混合缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰40L。用截流量5000的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至5L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-40℃，即可得到成品。成品取样，参照中国药典2005年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典2010版二部的要求，检测结果如表1所示。纯度测定中对照品的色谱图如图1所示，亲和层析前的色谱图如图2所示，亲和层析后的色谱图如图3所示；亲和层析前后比活和纯度的变化如表2所示。

高纯度胰激肽原酶的主要性能评定

为检验按本发明中所提供的工艺制备的高纯度胰激肽原酶的质量是否达到预期要求，对按本发明进行的工业化规模制备的高纯度胰激肽原酶进行检验，检验项目为：比活、纯度、蛋白酶、炽灼残渣、脂肪。检测方法参照中国药典2010版二部胰激肽原酶项下规定。具体检测方法叙述如下：

1、比活

效价测定

标准品溶液的制备：取胰激肽原酶标准品适量，加上述磷酸盐缓冲液(pH为7.0)制成每1ml中含10单位的溶液。

供试品溶液的制备：取本品适量，加上述磷酸盐缓冲液(pH为7.0)制成每1ml中约含10单位的溶液。

底物溶液的制备：取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐17.7mg，加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(称取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800ml溶解，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0，加水稀释至1000ml)至100ml，4℃保存。

测定法：量取25±0.5℃水浴中预热的底物溶液2.5ml，置于1cm比色池中，精密加入供试品溶液或标准品溶液0.1mol/L1，混匀，立即计时，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IV A)，在25±0.5℃，于253nm波长处，以底物溶液为空白，准确读取1min的吸收度A0和3min的吸收度A，标准品溶液和供试品溶液需平行测定3次，分别求得标准品溶液和供试品溶液的ΔA值(ΔA＝A-A0)的平均值代入下式计算：

蛋白含量：取本品约10mg，精密称定，照氮测定法(中国药典2010年版二部附录VII D第二法)测定，将结果乘以6.25即得。

比活力：由测得的酶活力和蛋白含量计算每1mg蛋白中含胰激肽原酶的单位数。

2、纯度

取本品适量，用流动相A制成每1ml中约含200单位的溶液，作供试品溶液。另取胰激肽原酶对照品(纯度应大于95％)适量，同法制成每1ml中约含200单位的溶液，作对照品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)试验。

用憎水性凝胶为填充剂(如TSKgel Phenyl-5PW，7.5mm×75mm，10μm)；以含1.7mol/L硫酸铵的磷酸盐缓冲液(pH为7.0)(取磷酸氢二钠10.9g，磷酸二氢钠2.3g，加水约700ml使溶解，调pH值至7.0，再加水稀释至1000ml)为流动相A，以上述磷酸盐缓冲液(pH为7.0)为流动相B；柱温为25℃；流速为每min 0.5ml，梯度洗脱；检测波长为280nm。理论板数按胰激肽原酶峰计算应不低于1500，胰激肽原酶主峰与相邻杂质峰的分离度不得低于0.8。

分别取流动相A、供试品溶液及对照品溶液各20μl注入高效液相色谱仪，以流动相A洗脱10min，然后梯度洗脱，10～20min，流动相B的比例从0％增加至100％，维持15min，记录色谱图。分析结束后应以流动相A平衡至少20min。将供试品溶液和对照品溶液的色谱图扣除流动相A色谱图(作为空白基线)，进行基线校正。在供试品溶液色谱图中，取空白基线拐点(约16min)后所有色谱峰，按面积归一化法计算与对照品溶液主峰保留时间一致的主峰面积，对照品的色谱图如图1所示。

3、蛋白酶

供试品溶液的制备：取本品适量，加上述磷酸盐缓冲液(pH为7.0)制成每1ml中含1单位的溶液。

测定方法：精密量取供试品溶液1ml置试管中，在35±0.5℃水浴中保温5min，精密加入已预热至35±0.5℃的酪蛋白溶液(酪蛋白0.6g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液80ml，65℃加热溶解，放冷，调节pH值至8.0，加水至100ml，临用前配制)5ml，混匀，于35±0.5℃水浴中准确反应20min，再精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，混匀，滤过，取续滤液作供试品溶液；另精密量取供试品溶液1ml，置试管中，精密加5％三氯醋酸溶液5ml，混匀，于35±0.5℃水浴中准确反应20min，再精密加入上述酪蛋白溶液5ml，混匀，滤过，取续滤液作空白溶液，在2h以内照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IV A)，在280nm的波长处测定吸收度，不得过0.2。

4、炽灼残渣

取本品0.5g，依法检查(中国药典2010年版二部附录VIII N)遗留残渣不得超过3.0％。

5脂肪

取本品1.0g，置具塞锥形瓶中，加入乙醚20ml，密塞，时时旋动，放置约30min后，将乙醚液倾至用乙醚润湿的滤纸上，滤过，再用乙醚10ml洗涤残渣，合并滤液及洗液至恒重的蒸发皿中，除去乙醚，在105℃干燥2h，精密称定，遗留脂肪不得过1mg。

实施例2

取新鲜冷冻猪胰600公斤，用研磨机将原料直接磨成浆状，50℃加热搅拌反应4.5h，放置过夜。次日将反应液泵入提取桶，加入1800L纯化水、600L冷丙酮，搅拌4h，用板框过滤设备过滤得清液，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理。清液超滤浓缩，加入硫酸铵至30％饱和度，在4℃冷库中放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液，在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到粗品6.5公斤。粗品用65L纯化水溶解，将50L自制的亲和层析介质装柱，亲和层析介质以市售的GE Health凝胶介质为基础，以CAD(三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶氮基-苯甲脒)作为配基，在酸性条件下于冰浴中搅拌24小时制备而得，凝胶与配基的重量比为1∶0.2。用150L 0.1mol/L Tris-HCl，pH为7.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用溶解液上样，控制流速在30cm/h；上样完毕，继续用150L缓冲液平衡冲柱，至流出液的OD₂₈₀值小于0.1。换用0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L KCl，pH为7.0的混合缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰110L。用截流量5000的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至16L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-50℃，即可得到成品。成品取样，参照中国药典20010年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，检测结果如表1所示。亲和层析前的色谱图如图4所示，亲和层析后的色谱图如图5所示；亲和层析前后比活和纯度的变化如表2所示。

实施例3

取新鲜冷冻猪胰400公斤，用研磨机将原料直接磨成浆状，60℃加热搅拌反应4h，放置过夜。次日将反应液泵入提取桶，加入1200L纯化水、400L冷丙酮，搅拌3.5h，用板框过滤设备过滤得清液，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理。清液超滤浓缩，加入硫酸铵至30％饱和度，在4℃冷库中放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液，在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到粗品4.5公斤。粗品用45L纯化水溶解，将30L自制的亲和层析介质装柱，亲和层析介质以市售的GE Health凝胶介质为基础，以CAD(三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶氮基-苯甲脒)作为配基，在酸性条件下于冰浴中搅拌24小时制备而得，凝胶与配基的重量比为1∶0.15。用100L 0.1mol/L Tris-HCl，pH为7.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用溶解液上样，控制流速在30cm/h；上样完毕，用100L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1。换用0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L KCl，pH为7.0缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰100L。用截流量5000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至12L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-50℃，即可得到成品。成品取样，参照中国药典20010年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，检测结果如表1所示。亲和层析前的色谱图如图6所示，亲和层析后的色谱图如图7所示；亲和层析前后比活和纯度的变化如表2所示。

实施例4

取新鲜冷冻猪胰800公斤，用研磨机将原料直接磨成浆状，45℃加热搅拌反应5h，放置过夜。次日将反应液泵入提取桶，加入2400L纯化水、800L冷丙酮，搅拌4h，用板框过滤设备过滤得清液，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理。清液超滤浓缩，加入硫酸铵至30％饱和度，在4℃冷库中放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液，在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到粗品8.8公斤。粗品用88L纯化水溶解，将75L自制的亲和层析介质装柱，亲和层析介质以市售的GE Health凝胶介质为基础，以CAD(三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶氮基-苯甲脒)作为配基，在酸性条件下于冰浴中搅拌24小时制备而得，凝胶与配基的重量比为1∶0.15。用180L 0.1mol/L Tris-HCl，pH为7.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用溶解液上样，控制流速在30cm/h；上样完毕，用180L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1。换用0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L KCl，pH为7.0的混合缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰150L。用截流量5000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至18L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-50℃，即可得到成品。成品取样，参照中国药典20010年版第二部的要求，进行全项测定。

表1 检测结果

表2 亲和层析前后比活和纯度的变化

由以上检定结果可以得出结论：运用本发明中以CAD(三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶氮基-苯甲脒)为配基的亲和层析技术生产的高纯度胰激肽原酶比活可达到800单位/毫克蛋白以上，纯度均超过90％，远高于中国药典2010版中药用胰激肽原酶的规定，且主要杂质指标均符合本发明制定的更严格于中国药典2010版中要求的标准，表明本品纯度高，杂质少，安全性高，符合药用标准。

Claims (6)

1.一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)原料磨碎、加热反应：用研磨设备将新鲜冷冻猪胰直接磨成浆状，控制温度为40-60℃，加热搅拌反应4-5h，放置过夜，得到反应液；

(2)提取：将反应液泵入提取桶，将反应液、纯化水和丙酮按体积比1∶3∶1混合，搅拌3-4h，再经过固液分离装置得到清液；

(3)盐析：向步骤(2)得到的清液中加入硫酸铵至30％饱和度，在4℃冷库中放置过夜后过滤，得到提取液，在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，弃去上清液后用离心法收集底层沉淀，得到粗品；

(4)亲和层析分离纯化：将得到的粗品用纯化水溶解得到溶解液，将亲和层析介质装入分离柱，用缓冲液进行平衡后用溶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕后继续用缓冲液冲柱至流出液的光密度OD₂₈₀值小于0.1；换用pH为7.0，浓度为0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)及0.5mol/L KCl的混合缓冲液继续洗脱，控制流速为50cm/h，收集洗脱峰；

(5)超滤浓缩除菌：对收集到的洗脱峰采用超滤膜进行浓缩，得到的浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌得到酶液；

(6)真空冷冻干燥：将步骤(5)中得到的酶液置于冻干盘中，通过真空冷冻干燥对酶液进行冷冻干燥，即得到产品。

2.根据权利要求1所述的一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中固液分离装置为机电一体化箱式板框过滤设备。

3.根据权利要求1所述的一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中亲和层析介质是以市售的GE Health凝胶作为基础，以三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶氮基-苯甲脒作为配基，在酸性条件下于冰浴中搅拌24小时制备而得，凝胶与配基的重量比为1∶(0.1-0.2)。

4.根据权利要求1所述的一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的缓冲液为浓度为0.1mol/Lol/L，pH为7.0的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1所述的亲和层析法生产高纯度胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中超滤膜为截流分子量为5000的超滤膜。

6.根据权利要求1所述的一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，其特征在于，所述的步骤(6)中真空冷冻干燥的冷冻温度为-40～-50℃。

Images