CN1737134A - 高纯度胰激肽原酶的制备方法及其药物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备高纯度胰激肽原酶的方法，将抗原抗体反应与亲和层析技术结合，从含胰激肽原酶的胰脏中将胰激肽原酶分离纯化，制备得到纯度高的胰激肽原酶。本发明还涉及通过本发明方法制备的高纯度胰激肽原酶及其药物制剂，获得的产品比活高、纯度高，不含或仅含少量杂质，使用安全，能达到静脉给药的要求。

Description

高纯度胰激肽原酶的制备方法及其药物制剂

技术领域

本发明涉及高纯度胰激肽原酶的制备方法，具体地说涉及采用免疫亲和层析法制备的高纯度胰激肽原酶。

本发明还涉及采用本发明方法制备的高纯度胰激肽原酶及其制剂。

背景技术

胰激肽原酶(Pancreatic Kallidinogenase)又称为胰激肽释放酶(PancreaticKallikrein)是一类内切型蛋白水解酶，存在于哺乳动物体内的多种组织，尤以胰脏中含量最为丰富。在体内作用于激肽原，使其释放出激肽，从而发挥出一系列的药理作用：使微血管扩张，改善外周血液循环；促进前列腺素分泌，扩张小动脉，增加肾血管流量；激活纤溶酶系统，使纤维蛋白水解，降低血液粘度，防止血栓形成，溶解血栓。临床上主要用于微循环障碍引起的肾病变及眼底供血障碍、高血压症、脑动脉硬化和脑动脉血栓、冠心病及其它闭塞性周围血管性疾病的治疗。

国家卫生部药典会一九九八年编制的药品标准二部第六册(生化药品)第一分册中收载了胰激肽原酶原料药及其制剂，国家卫生部批准作为生化药品执行部颁药品标准。该标准规定胰激肽原酶系自猪胰中提取的蛋白酶，干品效价每lmg不得少于50单位，比活不得少于300单位/mg蛋白。由于纯度较低，只有肠溶片和冻干粉针剂两种剂型，供口服和肌内注射给药。肠溶片有20单位和60单位两种规格，一次120～240单位，一日360～720单位空腹服用；冻干粉针剂有10单位、20单位和40单位三种规格，一日10～40单位，一日1次或隔日1次肌内注射。已公布的上海惠海生化制药厂申请的专利(申请号00119540.9)，用胰蛋白酶抑制剂为配基与琼脂糖结合亲和层析纯化获得的胰激肽原酶单位效价为250～300单位/mg干品，比活800～1000单位/mg蛋白。日本申请的专利(申请号86104618)，将人尿浓缩后用聚氨基葡聚糖吸附的方法获得纯度为8.2单位/mg的胰激肽原酶粗品，再用抑肽酶—琼脂糖亲和层析获得828单位/mg蛋白的胰激肽原酶。但是这些产品对其组成未作介绍，也未见成功的产品上市。

针对上述胰激肽原酶制剂，由于纯度较低，安全上的限制只能用于口服和肌内注射，使其应用范围、适应症及其疗效受到很大限制。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种高纯度胰激肽原酶的制备方法，利用免疫亲和层析法制备得到了高纯度的胰激肽原酶。

本发明的另一目的在于提供使用本发明方法制备的高纯度胰激肽原酶。

本发明的再一目的在于提供含有本发明的高纯度胰激肽原酶的药物。

根据本发明的一方面，制备高纯度胰激肽原酶的方法，包括下述步骤：

1)含胰激肽原酶的猪胰或牛胰脏初步纯化、分离，获得主要成分为胰激肽原酶的活性组分1；

2)将所述活性组分1进一步纯化，获得活性组分2；

3)以所述活性组分2作为抗原，制备抗胰激肽原酶特异性抗体；

4)将所述制备得到的抗胰激肽原酶特异性抗体与亲和层析载体结合，制备抗体亲和层析柱；

5)以所述抗体亲和层析柱分离纯化步骤1)中的活性组分1，获得高纯度胰激肽原酶。

本发明的方法中，将抗原抗体反应与亲和层析技术结合，从含胰激肽原酶的猪胰或牛胰脏中将胰激肽原酶分离纯化，制备得到纯度高的胰激肽原酶。该方法中，首先需制备获得针对胰激肽原酶的特异性抗体，再将该特异性抗体与适宜的亲和层析载体结合，制备成抗体亲和层析柱，利用该抗体亲和层析柱可对原料进行纯化，制备高纯度的胰激肽原酶。

在本发明方法中，针对胰激肽原酶的特异性抗体可以采用多种方法制备，在本发明的一个具体实施方案中，首先以胰激肽原酶为抗原免疫小鼠，获得含抗胰激肽原酶抗体的小鼠抗血清，同时将该胰激肽原酶与亲和层析载体结合，制备成抗原亲和层析柱，将小鼠抗血清上抗原亲和层析柱，利用结合于亲和层析载体上的抗原蛋白与血清中的抗体特异结合，获得纯化的特异性抗体。在本发明的另一个具体实施方案中，可以采用单克隆抗体技术来制备本发明的胰激肽原酶的特异性抗体，将经胰激肽原酶免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞，筛选分泌胰激肽原酶抗体的杂交瘤细胞建株，由此可获得稳定的胰激肽原酶的特异性抗体。

将制备获得的抗胰激肽原酶特异性抗体与适宜的亲和层析载体结合，制备成抗体亲和层析柱，使用该抗体亲和层析柱即可对原料进行分离纯化，制备高纯度的胰激肽原酶。

在本发明方法中，为了获得高纯度的胰激肽原酶，可以采用对原料进行分步纯化的方法，例如，在本发明的一个具体实施方案中，首先将原料胰脏进行透析截留一定分子量的成分，然后将获得的样品通过离子交换层析进行初步纯化，获得活性组分1，该活性组分1再经本发明的抗体亲和层析柱纯化，即可获得高纯度的胰激肽原酶。

用作抗原的胰激肽原酶最好使用纯度较高的胰激肽原酶，在本发明方法中，该用作抗原的胰激肽原酶可以通过将上述初步纯化的活性组分1进一步经过制备型高效液相色谱(HPLC)的分离而获得，这样获得的胰激肽原酶(活性组分2)可以用作免疫小鼠的抗原和制备抗原亲和层析柱的抗原使用。

本发明方法中用作亲和层析柱的载体的材料可以使用各种适宜的载体材料，优选的载体材料可以使用多糖基质，例如：Sepharose 4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶，在使用前可以先将载体活化，本发明的实施方案中，使用溴化氰作为活化剂，将制备得到的抗原或特异性抗体偶联到活化了的载体上，即可制备抗原亲和层析柱与抗体亲和层析柱。

根据本发明的一方面，提供通过本发明方法制备的高纯度胰激肽原酶，其具有以下特性：

比活性为每毫克蛋白800单位以上；

高效液相色谱法检测，为单一组分，主峰面积大于95％，保留时间为7.8±0.5min。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带，分子量为34～44千道尔顿；

氨基酸序列分析，N-末端15个氨基酸序列为：Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。

根据本发明的再一方面，提供含有本发明高纯度胰激肽原酶的药物制剂，以本发明的高纯度胰激肽原酶为药效成分，添加药学上可接受的药用辅料制备得到适于临床应用各种药物制剂，这些制剂的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、小容量注射剂、冻干粉针剂及专供静脉注射和静脉滴注用的大输液或冻干制剂。例如，注射用胰激肽原酶(冻干静脉注射用胰激肽原酶)、胰激肽原酶注射液(静脉注射用胰激肽原酶)、胰激肽原酶肠溶胶囊以及胰激肽原酶肠溶片等。

本发明采用免疫亲和层析技术，从胰脏中提取的激肽原酶纯度高，获得的产品比活高、纯度高，不含或仅含少量杂质，使用安全，能达到静脉给药的要求。与口服与肌注给药相比，静脉给药可使药品的有效成分全部直接进入血液，缩短吸收过程并减少损耗，因而药效迅速，疗程缩短，减少患者的痛苦并能节省医药费用；尤其适用于急性心脑血管栓塞性疾病的抢救，可以赢得宝贵的救治时间，提高治愈率减少病死率。本发明高纯度胰激肽原酶的开发扩大了该品的适应症与使用范围。

附图简要说明

图1为本发明方法中制备活性组分1的阴离子交换柱层析紫外吸收图谱；

图2为本发明方法中抗胰激肽原酶特异性抗体纯化过程记录仪图谱；

图3为本发明方法中制备高纯度胰激肽原酶的亲和层析流程记录仪图谱；

图4为本发明制备的高纯度胰激肽原酶高效液相色谱图谱；

图5为本发明制备的另一批次的高纯度胰激肽原酶高效液相色谱图谱；

图6为本发明制备的又一批次的高纯度激肽原酶高效液相色谱图谱；

图7为胰激肽原酶SDS-聚丙烯酰胺凝较电泳图谱

图中：泳道1、2、4、5、6、7、9、10为胰激肽原酶样品；

泳道3、8为分子量标准蛋白质(分子量范围为14,000～97,400，其组成及分子量为：兔磷酸化酶B 97,400，牛血清白蛋白66,200，兔肌动蛋白43,000，牛碳酸酐酶31,000，胰蛋白酶抑制剂20,100，鸡蛋清溶菌酶14,400)

发明的具体实施方式

高纯度胰激肽原酶的制备

1、胰激肽原酶粗品的提取

新鲜或冷冻的猪胰或牛胰脏称重后，用水清洗干净，置消毒容器内。加1～3倍(W/V)生理盐水制成匀浆。3000～4000转/分钟离心20～40分钟取上清液。上清液经超滤浓缩，截留分子量10000～50000道尔顿(10～50KD)组分，冻干即为胰激肽原酶粗品。

2、离子交换层析初步纯化

胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液溶解，2500～3500转/分钟离心5～20分钟取上清，沉淀加少量缓冲液再次溶解，离心取上清。合并两次上清液，上阴离子交换层析柱(DEAE-Sepharose)，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl缓冲液平衡洗脱至基线，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，收集活性峰，得活性组份1。活性组分1的主要成分为胰激肽原酶，具胰激肽原酶活性，根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要带计算的分子量与胰激肽原酶吻合。此流程用280nm紫外检测仪检测，并用记录仪记录，如图1所示。

3、用作抗原的胰激肽原酶的制备

将离子交换层析收集的活性组分1浓缩，用制备型高效液相色谱分离，收集活性组分，并定性，得胰激肽原酶样品(活性组分2)。其具胰激肽原酶活性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为一条带，计算的分子量与胰激肽原酶标准品吻合；HPLC检测为单一组分，保留时间与胰激肽原酶标准品吻合。

4、免疫亲和层析制备胰激肽原酶特异性抗体

(1)亲和层析柱的制备

称2g活化的Sephose-4B，加300ml 1mol/L的HCL充分搅拌使之膨胀，另取30mg胰激肽原酶溶于0.1mol/L Na₂CO₃(含0.5mol/l NaCL)pH8.3缓冲液中。将上述Sephose-4B与胰激肽原酶溶液混合，在室温搅拌2h，用0.1mol/LpH8.3Na₂CO₃(含0.5mol/l NaCL)缓冲液充分洗涤后，再用0.1mol/L Tris-HCL缓冲液(pH8.30)再洗一次，加同一缓冲液，于室温搅拌过夜。备用。

(2)小鼠抗血清制备

用上述活性组分2(50～500μg/ml)与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠(中检所实验动物中心)皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫4～6次。在采血清前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫

(3)制备抗胰激肽原酶特异性抗体

取上述免疫小鼠血清，将血清样品上抗原亲和层析柱，用结合在凝胶上的抗原蛋白与样品中的抗体特异性结合，纯化得到特异性抗体。具体步骤为：用平衡液(0.02MTris-HCL缓冲液，pH＝7.2)平衡抗原亲和层析柱后，将血清样品上抗原亲和层析柱，用平衡液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，用洗脱液(0.02MTris-HCL缓冲液，pH＝7.2，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脱，收集活性组分，如图2所示。将收集到的活性组分用透析袋(截留分子量为10000，对聚乙二醇浓缩)浓缩后，冷冻干燥，即为抗胰激肽原酶特异性抗体。

5.单克隆抗体技术制备胰激肽原酶特异性抗体

(1)免疫

用上述活性组分2(50～500μg/ml)与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫4～6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。

(2)细胞融合

取经免疫的BALA/c小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠sp2/10骨髓瘤细胞按(5～10)∶1的比例混合，加入分子量40000～60000的50％聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多块96孔细胞培养板孔内。

(3)特异杂交瘤细胞筛选

将接种细胞混合液的细胞培养板置于5％ CO₂培养箱内培养。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基培养。收集细胞分泌液，用酶联免疫法对单克隆抗体进行筛选及效价测定，将分泌特异性胰激肽原酶抗体的细胞挑选出来传代培养，建立细胞系，由此可获得稳定的抗体。

6、抗体亲和层析柱的制备

选择琼脂糖4B、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶作为亲和层析的载体，用溴化氰活化该载体；取上述由免疫亲和层析或单克隆抗体技术制备的抗体100mg溶于20ml硼酸缓冲液中，过滤，滤液加至活化的琼脂糖4B中，在10℃下搅拌反应18小时，次日装柱，用10倍柱体积的pH10.2硼酸缓冲液以5～6ml/min流速洗涤柱体，收集流出液，然后再依次用5倍柱体积的pH10.00.1mol/L的乙醇胺溶液及0.1mol/L的硼酸缓冲液(pH8.0)充分洗涤，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡，即得到抗体亲和层析柱。该柱可重复使用200次以上，用20％的乙醇可长期保存。

7、胰激肽原酶的制备

将上述离子交换层析得到的活性组分1用亲和层析平衡缓冲液(0.02MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)溶解，上抗体亲和层析柱，用该缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱(0.02MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)。收集各洗脱峰，如图3所示，鉴定胰激肽原酶活性峰并测定效价，冷冻干燥后即为胰激肽原酶原料药。满足高纯度胰激肽原酶的性能评定标准。

下面，通过对具体实施例的详细描述，详细说明本发明：

【实施例1】免疫抗体亲和层析柱的制备

用高效液相色谱纯化并经定性的胰激肽原酶(活性组分2)50μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在采集血清前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。

用溴化氰活化4B-Sepharose琼脂糖凝胶，把得到的胰激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成免疫抗体亲和层析柱。

【实施例2】免疫抗体亲和层析柱的制备

用高效液相色谱纯化并经定性的胰激肽原酶(活性组分2)250μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。

用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝胶，把得到的胰激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成免疫抗体亲和层析柱。

【实施例3】免疫抗体亲和层析柱的制备

用高效液相色谱纯化并经定性的胰激肽原酶(活性组分2)500μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。

用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝胶，把得到的胰激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成免疫亲和层析柱。

【实施例4】单克隆抗体亲和层析柱的制作方法

用高效液相色谱纯化并经定性的胰激肽原酶(活性组分2)500μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。

取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠sp2/10骨髓瘤细胞按5∶1的比例混合，加入分子量40000的50％聚乙二醇作用后，将细胞悬液分别接种在多块96孔细胞培养板孔内。

将接种细胞悬液的细胞培养板置于CO₂培养箱内培养。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基培养。收集细胞分泌液，用酶联免疫法对单克隆抗体进行筛选及效价测定，将分泌特异性胰激肽原酶抗体的细胞挑选出来传代培养，建立细胞系，由此获得稳定的抗体。

用溴化氰活化4B-Sepharose琼脂糖凝胶，把得到的胰激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成单克隆抗体亲和层析柱。

【实施例5】单克隆抗体亲和层析柱的制作方法

用高效液相色谱纯化并经定性的胰激肽原酶(活性组分2)250μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。

取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠sp2/10骨髓瘤细胞按7∶1的比例混合，加入分子量50000的50％聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多块96孔细胞培养板孔内。

将接种细胞混合液的细胞培养板置于CO₂培养箱内培养。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基培养。收集细胞分泌液，用酶联免疫法对单克隆抗体进行筛选及效价测定，将分泌特异性胰激肽原酶抗体的细胞挑选出来传代培养，建立细胞系，由此获得稳定的抗体。

用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝胶，把得到的胰激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成单克隆抗体亲和层析柱。

【实施例6】单克隆抗体亲和层析柱的制作方法

用高效液相色谱纯化并经定性的胰激肽原酶(活性组分2)50μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。

取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠sp2/10骨髓瘤细胞按10∶1的比例混合，加入分子量60000的50％聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多块96孔细胞培养板孔内。

将接种细胞混合液的细胞培养板置于CO₂培养箱内培养。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基培养。收集细胞分泌液，用酶联免疫法对单克隆抗体进行筛选及效价测定，将分泌特异性胰激肽原酶抗体的细胞挑选出来传代培养，建立细胞系，由此获得稳定的抗体。

用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝胶，把得到的胰激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成单克隆抗体亲和层析柱。

【实施例7】胰激肽原酶原料药制备

取新鲜猪胰10kg，用水清洗干净，置消毒容器内。加1～3倍(W/V)生理盐水制成匀浆。3000～4000转/分钟离心20～40分钟取上清液。离心上清液经超滤浓缩，截留分子量10000～50000道尔顿(10～50KD)组分，冻干即为胰激肽原酶粗品。胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液500ml溶解，2500～3500转/分钟离心5～20分钟取上清，沉淀加少量缓冲液再次溶解，离心取上清。合并两次上清液，上阴离子交换层析柱，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl缓冲液平衡洗脱至基线，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，收集活性峰(活性组分1)。将上述离子交换层析得到的活性组分1用亲和层析平衡缓冲液(0.02M Tris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)200ml溶解，上亲和层析柱，用该缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，用含有洗脱剂(0.02M Tris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)的亲和层析洗脱液洗脱。收集各洗脱峰，鉴定胰激肽原酶活性峰并测定效价，冷冻干燥后即为胰激肽原酶原料药。

【实施例8】胰激肽原酶原料药制备

取新鲜牛胰10kg，用水清洗干净，置消毒容器内。加3倍(W/V)生理盐水制成匀浆。3000～4000转/分钟离心20～40分钟取上清液。离心上清液经超滤浓缩，截留分子量10000～50000道尔顿(10～50KD)组分，冻干即为胰激肽原酶粗品。胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液500ml溶解，2500～3500转/分钟离心5～20分钟取上清，沉淀加少量缓冲液再次溶解，离心取上清。合并两次上清液，上阴离子交换层析柱，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl缓冲液平衡洗脱至基线，用含0.01～0.5mol/LNaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，收集活性峰。将上述离子交换层析得到的活性组分1用亲和层析平衡缓冲液200ml(0.02M Tris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)溶解，上亲和层析柱，用该缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液(0.02M Tris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脱。收集各洗脱峰，鉴定胰激肽原酶活性峰并测定效价，冷冻干燥后即为胰激肽原酶原料药。

高纯度胰激肽原酶的性能评定

1、高纯度胰激肽原酶对N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐底物水解速率的测定

溶液的配制

(1)磷酸盐缓冲液(pH7.0)称取磷酸氢二钠10.9g，磷酸二氢钠2.3g，加水约700ml使溶解，调pH值至7.0，加水稀释至1000ml，混匀即得。

(2)0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)称取三羟甲基氨基甲烷12.114g，加水约800ml溶解，用6mol/L盐酸溶液调pH值至8.0，加水至1000ml，混匀即得。

(3)胰蛋白酶抑制剂溶液称取大豆胰蛋白酶抑制剂(Amresco)5mg，加入磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解并稀释至10ml，混匀即得。

(4)供试品溶液取供试品(依前述实施例7～8制备的高纯度胰激肽原酶，批号为040218、040220和040223，下同)适量，加入磷酸盐缓冲液(pH7.0)使溶解，制成每1ml含10单位的溶液。量取4.0ml，置10ml量瓶中，加胰蛋白酶抑制剂溶液1ml，再用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释至刻度。

(5)底物溶液取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐17.7mg，精密称定，加0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)至100ml，充分混匀，4℃保存。

水解速率测定  量取在30±0.5℃预热5分钟的底物溶液2.9ml置1cm比色池中，加供试品溶液0.1ml，混匀，立即计时，在30±0.5℃下，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)在253nm波长处测定4分钟的吸光度(A₄)和6分钟的吸光度(A₆)。另取胰蛋白酶抑制剂1.0ml，加入磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释至10ml，量取0.1ml置1cm比色池中，加入30±0.5℃预热5分钟的底物溶液2.9ml，混匀为空白，求得A值[(A₆-A₄)/2]，按下式计算R值(水解速率)。

R值(水解速率)应为0.12～0.17

$R=\frac{A}{0.0383\×a\×b}$

式中：a为供试品溶液每1ml中的mg数；

      b为供试品每1mg的效价单位数。

 2、纯度检查(主要用于检查原料)

(1)照高效液相色谱法(中国药典2000版附录VI H)测定，应为单一组分。

色谱条件与系统适用性试验：

仪器型号SHIMADZU(岛津)液相色谱仪；SPD-10A vp检测器；SCL-10A vp控制器；LC-AT vp输液泵；FCV-10AL vp溶剂切换器；PGU-14A脱气机；Class-vp6.10色谱工作站；

色谱柱为TSK-2000凝胶色谱柱300×7.5mm，5μm；流动相0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)；检测波长280nm；流速1.0ml/min；检测温度25℃；理论板数按胰激肽原酶峰计算应不小于3000。

测定法取供试品用流动相制成每1ml含10单位的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，主峰面积应大于95％，保留时间应为7.8±0.5min，结果见图4～6。

(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上应显示一条带(详见分子量测定)。

3、分子量测定照电泳法(中国药典2000年版二部附录V F第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)测定。

供试品缓冲液取水4.8ml，浓缩胶缓冲液1.2ml，甘油1.0ml，10％十二烷基硫酸钠2.0ml，0.5％溴酚蓝溶液0.5ml，β-巯基乙醇0.5ml，混匀。

标准蛋白溶液的制备  取分子量测定用标准蛋白(分子量范围1～10万)适量，加供试品缓冲液制成每1ml中含1μg蛋白的溶液。临用前置沸水浴中5min，冷却。

供试品溶液的制备取供试品适量(按蛋白含量计算)，加供试品缓冲液制成每1μl中含2μg蛋白的溶液，临用前置沸水浴中5min，冷却。

测定法照上述电泳法试验，采用垂直板电泳，每孔加5～10μl供试品溶液或标准蛋白溶液，考马斯亮蓝染色。以标准蛋白分子量的对数为纵坐标，以迁移率为横坐标进行直线回归，由回归方程计算供试品的分子量。

测定结果应为一条带，分子量应为39000±5000道尔顿，见图7。

4、序列测定

将前述实施例7～8制备的高纯度胰激肽原酶经北京大学生命科学院氨基酸序列分析，N-末端15个氨基酸序列为：Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。

5、效价及比活力测定

标准溶液的配制取胰激肽原酶标准品(中国药品生物制品检定所)适量，精密称重，加上述磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解并制成每1ml中含10单位的溶液。

供试品溶液的制备取供试品适量，精密称重，加磷酸盐缓冲液(pH7.0)制成每1ml中约含10单位的溶液。

底物溶液的制备取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐17.7mg，精密称定，加0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)至100ml，4℃保存。

测定法量取25±0.5℃水浴中预热的底物溶液2.5ml置1cm比色池中，精密加入供试品溶液或标准品溶液0.1ml，混匀，立即计时。照紫外分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在25±0.5℃于253nm波长处测定，以底物溶液为空白，准确读取1分钟的吸光度A₁和3分钟的吸光度A₃。标准品和供试品平行测定3次取平均值，计算标准品和供试品的A值(A＝A₃-A₁)，按下式计算每1mg供试品的效价：

蛋白含量取供试品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含0.15mg蛋白的溶液，精密量取供试品1.0ml。照福林酚测定法(见注)测定，计算每1mg供试中的蛋白毫克数。

比活力按下式计算：

注：福林酚测定法

试剂：碱性铜试液取氢氧化钠10g，硫酸钠50g，加水400ml使其溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使其溶解，另取硫酸铜0.25g加水30ml使其溶解，将两液混合作为乙液。

临用前，合并甲、乙两液，并加水至500ml。

对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。

供试品溶液的制备取供试品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含0.15mg蛋白的溶液。

标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml。再分别加碱性铜试液1.0ml，摇匀；各加入福林试液(中国药典2000年版二部附录XV B，取福林试液贮备液，按1∶15用水稀释)4.0ml，盖塞，立即混匀。置55℃水浴中准确反应5min，置冷水浴中10min，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV B)以0号管为空白，在650nm波长处测定吸光度。以对照品溶液浓度与其相对应的吸收度A_对照进行直线回归，求出回归方程。

测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起操作，测得其样品的吸光度A_样品，从回归方程计算蛋白的含量，并乘以稀释倍数，即得。

6、过敏试验取供试品适量，加0.9％氯化钠注射液制成每1ml含100单位的溶液作为供试品致敏液与攻击液。

取体重250-350g豚鼠6只，间日腹腔注射供试品致敏液0.5ml，连续3次使致敏。然后将动物分成两组，每组3只，分别在第一次注射后第14日及第21日静脉注射供试品攻击液1.0ml进行攻击。仔细观察注射后15min内豚鼠的反应，均不得出现过敏性反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者；或啰音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者，应判为阳性。

7、异常毒性取本品，加0.9％氯化钠注射液制成每1ml含10单位的溶液，依法检查(中国药典2000版二部附录XI C)，按静脉法给药，符合规定。三个批次样品的检定结果列表如下：

由检定结果可以得出结论：运用免疫亲和层析技术，提取的胰激肽原酶纯度高，获得的产品比活高，达到每毫克蛋白800单位以上，经HPLC检查为单一组分，在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带，分子量测定为34～44KD不含杂质，使用安全，能达到静脉给药的要求。

含高纯度胰激肽原酶的药物制剂

【实施例9】注射用胰激肽原酶(冻干静脉注射用胰激肽原酶)制剂生产工艺。

首先，在局部百级洁净区内按配制处方将胰激肽原酶原料药((按照本发明前述实施例制备，并经各项检测合格，下同))与磷酸盐、氯化钠、右旋糖酐等辅料准确称量在配液容器内；加注射用水充分溶解或稀释，搅拌混匀后，使磷酸盐的浓度为0.03mol/L，氯化钠浓度为0.9％，右旋糖苷浓度为3％，得到制剂中间体；除菌过滤，其中过滤前后应对除菌过滤系统进行完整性测试。然后，将过滤后的中间体按装量装入抗生素瓶，在分装过程中应进行至少4次装量检查，保证每一只瓶内装入的药量准确。最后，将装入药品的抗生素瓶码在冻干箱各层的隔板上，按照品种冻干曲线进行速冻至零下20～30℃，维持8小时；然后抽真空，在真空状态下缓慢升温至35～40℃，保持一定时间，再降至室温后取出。压塞、轧盖得成品。经过成品质量检验合格后，进行包装，入成品库存放。

【实施例10】胰激肽原酶注射液(静脉注射用胰激肽原酶制剂)生产工艺。

首先，在局部百级洁净区内按配制处方将胰激肽原酶原料药、磷酸盐、氯化钠等辅料准确称量在配液容器内；加注射用水充分溶解或稀释，搅拌混匀后，使磷酸盐的浓度为0.03mol/L，氯化钠浓度为0.9％，得到制剂中间体；除菌过滤，其中过滤前后应对除菌过滤系统进行完整性测试。然后，将过滤后的中间体按装量装入抗生素瓶同时压塞、轧盖即得成品，在分装过程中应进行至少4次装量检查，保证每一只瓶内装入的药量准确。最后，经过成品质量检验合格后，进行包装，入成品库存放。

【实施例11】胰激肽原酶肠溶胶囊制剂生产工艺。

首先，在十万级洁净区内将胰激肽酶原料药与淀粉、乳糖等辅料准确称量，辅料配比为淀粉：乳糖为1∶1，充分混合均匀，得到制剂中间体。然后，取外观、长度、厚度、臭味、水分、脆碎度、融化时限、炽灼残渣及微生物学检查均符合规定的胶囊壳，填充中间体药粉，得到半成品。最后盖上胶囊上节、压平打光，制得成品。经过成品质量检验合格后，用玻璃瓶或塑料瓶密闭包装，入成品库，放置在阴凉干燥处，温度不得超过25℃，相对湿度不得超过45％。

【实施例12】为胰激肽原酶肠溶片生产工艺。

首先，在十万级洁净区内将胰激肽原酶原料药与淀粉、羧丙基纤维素钠等辅料准确称量(淀粉∶羧丙基纤维素钠＝1∶1)，充分混合均匀，得到制剂中间体。然后，进行制粒与压片，在压片过程中随时注意片剂的外观，定时抽查药片的重量差异、硬度和崩解时限。最后，包肠溶衣得到成品。经过成品质量检验合格后，进行包装，入成品库，贮存在阴凉、通风、干燥处，注意防止受潮、发霉、变质。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

Claims (10)

1、制备高纯度胰激肽原酶的方法，包括下述步骤：

1)将含胰激肽原酶的猪胰或牛胰脏初步纯化、分离，获得主要成分为胰激肽原酶的活性组分1；

2)将所述活性组分1进一步纯化，获得活性组分2；

3)以所述活性组分2作为抗原，制备抗胰激肽原酶特异性抗体；

4)将所述制备得到的抗胰激肽原酶特异性抗体与亲和层析载体结合，制备抗体亲和层析柱；

5)用所述抗体亲和层析柱分离纯化步骤1)中的活性组分1，获得高纯度胰激肽原酶。

2、权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述制备抗胰激肽原酶特异性抗体包括下述步骤：

3a)以所述活性组分2作为抗原，免疫小鼠，制备抗血清；

3b)将所述活性组分2与亲和层析载体结合，制备抗原亲和层析柱；

3c)将所述抗血清上抗原亲和层析柱，分离得到抗胰激肽原酶特异性抗体。

3、权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述制备抗胰激肽原酶特异性抗体包括下述步骤：

3i)以所述活性组分2作为抗原，免疫小鼠，制备免疫小鼠脾细胞；

3ii)将所述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备融合的杂交瘤细胞；

3iii)筛选表达抗胰激肽原酶抗体的杂交瘤细胞，建立细胞株；

3iv)培养所述细胞株获得所述抗胰激肽原酶特异性抗体。

4、权利要求1、2或3所述方法，其特征在于步骤1)所述猪胰或牛胰脏原料初步纯化、分离包括下述步骤：

1a)将胰脏原料经透析，截留分子量10000～50000道尔顿部分；

1b)将上述截留部分经DEAE-Sepharose离子交换柱吸附，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl缓冲液平衡洗脱至基线，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，收集活性峰，制备活性组分1。

5、权利要求1、2或3所述方法，其特征在于所述亲和层析载体为Sepharose4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶。

6、权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述步骤2)中进一步纯化活性组分1的方法为将活性组分1经制备型高效液相色谱分离，制备胰激肽原酶，即为活性组分2。

7、权利要求1方法制备的高纯度胰激肽原酶。

8、权利要求7所述的高纯度胰激肽原酶，其特征在于所述高纯度胰激肽原酶具有以下特性：

比活性为每毫克蛋白800单位以上；

高效液相色谱法检测，单组分图谱，主峰面积大于95％，保留时间为7.8±0.5min；

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带，分子量为34～44千道尔顿；

氨基酸序列分析，N-末端15个氨基酸序列为：

Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。

9、一种药物制剂，含有权利要求7所述高纯度胰激肽原酶以及药学上可接受的药用辅料。

10、权利要求9所述的药物制剂，其特征在于所述药物制剂为静脉给药剂型。

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