CN110257460A - 一种降血压的牡丹蛋白肽的制备方法 - Google Patents

一种降血压的牡丹蛋白肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降血压的牡丹蛋白肽的制备方法，具体制备方法如下，以带种皮的牡丹籽粕为原料，制备牡丹籽蛋白，向牡丹籽蛋白液中加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶，蛋白酶K，胰凝乳蛋白酶，酶解得到牡丹蛋白肽，牡丹蛋白肽用环糊精包埋去除辛辣味，所述复合蛋白酶在最适酶解条件下，得到特定分子量800Da‑1200Da之间的牡丹蛋白肽，得率在95％以上，在复合酶的作用下，所得牡丹蛋白肽上有作用于血管紧张素转化酶ACE的位点暴露，能够抑制ACE的活性，动物实验证明，牡丹蛋白肽具有降血压的效果，本方法可直接获得特定分子量的牡丹蛋白肽，无需超滤分级，提高制备效率，降低生产成本。

Description

一种降血压的牡丹蛋白肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种降血压的牡丹蛋白肽及其制备方法与应用，属于食品加工技术领域。
背景技术
高血压是一种常见的心血管疾病，近年来，高血压的患病率呈现逐年上升的趋势，据统 计，我国目前有高血压病人1.6亿，并且以每年新发病例360万的速度递增，高血压病人长 期得不到有效控制，还将会引起更严重的心脑血管疾病，高血压的病因很多，与年龄、遗传 因素、职业和环境、体重等都有关系，目前治疗高血压的药物有很多，而且需要长期服用， 开发出无毒副作用的高血压药物对高血压病人非常有益。
近年来牡丹籽作为生产牡丹皮的副产物，产量丰富，含油量高，有文献报告牡丹籽油中 不饱和脂肪酸含量高达87.60％，其中亚油酸的含量占22.19％，亚麻酸占35.70％，油酸占 27.14％，亚油酸和亚麻酸是人体必需脂肪酸，具有降血脂，降胆固醇和促进脂肪代谢，增强 免疫，预防冠心病等生理活性，因此近年来牡丹籽的使用越来越多，产生的牡丹籽粕也越来 越多，对牡丹籽粕产物牡丹蛋白的研究也正在成为热门的研究课题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题，研究出可得到特定分子量牡丹蛋白肽的方法，该方法 制备安全，工艺简便，不用利用超滤分级，提高了制备效率，降低了生产成本。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种牡丹蛋白肽的制备方法，所述方法步骤为，
S1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界CO2萃取脱脂，过筛，按料液比1:20～30与水混合，加 入NaOH调节pH9～10，50～60℃条件下磁力搅拌60～70min，离心(3500～4000r/min，13～18min)， 取上清液，加入HCl，调节pH3.0～4.0，离心(3500～4000r/min，13～18min)，沉淀用少量去 离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
S2：取步骤S1所得蛋白2份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括菠萝蛋白 酶1～2份，蛋白酶K 3～4份，胰凝乳蛋白酶6～7份，酶活力100～120u/mL，酶解反应pH为 6.0～7.0，反应温度45～55℃，反应时间3～4h，酶解后，高温灭活，加入10％～15％的HCl，调 节pH至4.0～4.5，在80～100r/min条件下搅拌，使未酶解的牡丹蛋白呈凝乳状析出，过滤分 离，提纯后冷冻干燥得牡丹蛋白肽，SDS-PAGE电泳测定蛋白肽分子量为800Da-1200Da之间， 用凯氏定氮法计算其得率在95％以上。
蛋白酶K具有降解天然蛋白质的能力，菠萝蛋白酶能够水解多肽，胰凝乳蛋白酶对蛋白 质有多个酶切位点，控制酶解条件结合蛋白酶K和菠萝蛋白酶，有助于牡丹蛋白肽上的作用ACE的位点暴露，使水解得到的牡丹蛋白肽有降血压作用。
优选的，采用带种皮的牡丹籽粕为原料，种皮中部分可溶性成分溶解在蛋白肽中，使蛋 白肽活性较高。
优选的，步骤S1牡丹籽粉碎过110～130目筛。
优选的，步骤S2的冷冻干燥温度为-40℃，干燥10h，冷冻干燥处理能够保持牡丹蛋白肽 的ACE抑制活性。
优选的，所述酶解反应pH值为6.5，反应温度为45℃，反应时间为3.5h。
优选的，所述酶解液高温灭活温度为85～95℃,15-20min。
优选的，所述牡丹肽用环糊精进行包埋处理，去除辛辣味。
本发明的另一目的是提供一种由上述任一项方法制备得到的牡丹蛋白肽。
本发明的又一目的是提供一种牡丹蛋白肽的用途，所述牡丹蛋白肽用于降血压，所述牡 丹蛋白在所述复合酶作用下，使牡丹肽上作用ACE的位点暴露，能够抑制血管紧张素转化酶 ACE的活性，从而具有降血压的效果。
与现有技术相比本发明具有以下技术效果：
以带种皮的牡丹籽粕为原料，先制备牡丹蛋白，将牡丹蛋白溶解，向牡丹蛋白液中加入 复合蛋白酶，复合蛋白酶包括菠萝蛋白酶1～2份，蛋白酶K 3～4份，胰凝乳蛋白酶6～7份， 酶活力100～120u/mL，酶解反应pH为6.0～7.0，反应温度45～55℃，反应时间3～4h，酶解液 高温灭活后，酸沉，再过滤分离取滤液，提纯后，冷冻干燥得牡丹蛋白肽，SDS-PAGE电泳 测定蛋白肽分子量为800Da-1200Da之间，用凯氏定氮法计算其得率在95％以上，在复合酶 的作用下所得牡丹蛋白肽作用ACE的位点暴露，能够抑制血管紧张素转化酶ACE的活性， 动物实验证明，牡丹蛋白肽具有降血压的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制 本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照 制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替 换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1
一种牡丹蛋白肽的制备方法，所述方法步骤为，
S1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界CO2萃取脱脂，过筛，按料液比1:27与水混合，加入NaOH调节pH9.35，57.6℃条件下磁力搅拌63.4min，离心(3700r/min，17min)，取上清液， 加入HCl，调节pH3.6，离心(3700r/min，17min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻 干燥，得牡丹籽蛋白；
S2：取步骤S2所得蛋白2份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括菠萝蛋白 酶1份，蛋白酶K 3份，胰凝乳蛋白酶6份，酶活力113u/mL，酶解反应pH为6.0，反应温度45℃，反应时间3.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的HCl，调节pH至4.3，在90r/min 条件下搅拌，过滤分离，提纯后冷冻干燥得牡丹蛋白肽，得率为95.8％。
实施例2
一种牡丹蛋白肽的制备方法，所述方法步骤为，
S1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界CO2萃取脱脂，过筛，按料液比1:27与水混合，加入NaOH调节pH9.35，57.6℃条件下磁力搅拌63.4min，离心(3700r/min，17min)，取上清液， 加入HCl，调节pH3.6，离心(3700r/min，17min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻 干燥，得牡丹籽蛋白；
S2：取步骤S2所得蛋白2份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括菠萝蛋白 酶1.5份，蛋白酶K 3.5份，胰凝乳蛋白酶6.5份，酶活力109u/mL，酶解反应pH为6.5，反应温度50℃，反应时间3.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的HCl，调节pH至4.3，在90r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后冷冻干燥得牡丹蛋白肽，得率为96.3％。
实施例3
一种牡丹蛋白肽的制备方法，所述方法步骤为，
S1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界CO2萃取脱脂，过筛，按料液比1:27与水混合，加入NaOH调节pH9.35，57.6℃条件下磁力搅拌63.4min，离心(3700r/min，17min)，取上清液， 加入HCl，调节pH3.6，离心(3700r/min，17min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻 干燥，得牡丹籽蛋白；
S2：取步骤S2所得蛋白2份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括菠萝蛋白 酶2份，蛋白酶K 4份，胰凝乳蛋白酶7份，酶活力98u/mL，酶解反应pH为7.0，反应温度55℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的HCl，调节pH至4.3，在90r/min条 件下搅拌，过滤分离，提纯后冷冻干燥得牡丹蛋白肽，得率为96.4％。
对比例1
一种牡丹蛋白肽的制备方法，所述方法步骤为，
S1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界CO2萃取脱脂，过筛，按料液比1:27与水混合，加入NaOH调节pH9.35，57.6℃条件下磁力搅拌63.4min，离心(3700r/min，17min)，取上清液， 加入HCl，调节pH3.6，离心(3700r/min，17min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻 干燥，得牡丹籽蛋白；
S2：取步骤S2所得蛋白2份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括菠萝蛋白 酶1份，蛋白酶K 2份，胰凝乳蛋白酶3份，酶活力47u/mL，酶解反应pH为7.0，反应温度45℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的HCl，调节pH至4.3，在90r/min条 件下搅拌，过滤分离，提纯后冷冻干燥得牡丹蛋白肽，得率为56.3％
对比例2
一种牡丹蛋白肽的制备方法，所述方法步骤为，
S1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界CO2萃取脱脂，过筛，按料液比1:27与水混合，加入NaOH调节pH9.35，57.6℃条件下磁力搅拌63.4min，离心(3700r/min，17min)，取上清液， 加入HCl，调节pH3.6，离心(3700r/min，17min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻 干燥，得牡丹籽蛋白；
S2：取步骤S2所得蛋白2份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括菠萝蛋白 酶2份，蛋白酶K 2份，胰凝乳蛋白酶2份，酶活力51u/mL，酶解反应pH为6.5，反应温度45℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的HCl，调节pH至4.3，在90r/min条 件下搅拌，过滤分离，提纯后冷冻干燥得牡丹蛋白肽，得率为49.8％。
对比例3
一种牡丹蛋白肽的制备方法，所述方法步骤为，
S1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界CO2萃取脱脂，过筛，按料液比1:27与水混合，加入NaOH调节pH9.35，57.6℃条件下磁力搅拌63.4min，离心(3700r/min，17min)，取上清液， 加入HCl，调节pH3.6，离心(3700r/min，17min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻 干燥，得牡丹籽蛋白；
S2：取步骤S2所得蛋白2份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括菠萝蛋白 酶3份，蛋白酶K 5份，胰凝乳蛋白酶5份，酶活力43u/mL，酶解反应pH为6.0，反应温度45℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的HCl，调节pH至4.3，在90r/min条 件下搅拌，过滤分离，提纯后冷冻干燥得牡丹蛋白肽，得率为48.4％。
表1为菠萝蛋白酶、蛋白酶K和胰凝乳蛋白酶不同含量比和不同实验反应条件下，牡丹 蛋白肽的得率差别。
表1牡丹蛋白肽2份和不同复合酶含量条件下牡丹蛋白肽的制备
实验例1
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
(一)仪器、原料和试剂
仪器：垂直版型电泳槽；直流稳压电源；50uL枪头，玻璃板、水浴锅、染色槽、烧杯、吸量管、滴管。
原料：0.5mg/mL样品溶液
试剂：Tris-HCl缓冲液pH8.9，Tris-HCl缓冲液pH6.7,30％分离胶储液，10％浓缩胶储液， 10％SDS溶液，染色液，脱色液。
(二)实验步骤
1、安装电泳槽
2、配胶
3、制备凝胶板
4、样品处理及加样
将0.5mg/mL样品溶液和标准蛋白液用沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用，将15uL样 品小心加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，开始电泳。
5、电泳
将电泳仪打开，将电流调到10mA。待样品分离时，电流调至25mA，当蓝色染料迁移至 底部，电流调为零，关闭电源，拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去， 在胶板一端做标记，染色。
6、染色及脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白 区带清晰，用直尺量取各条带与凝胶顶端的距离。
7、计算
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移 率，从标准曲线上可找出其分子量。
相对迁移率mR＝样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)
实验例2
血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性测定实验来验证牡丹蛋白肽的降血压药学功效。
(一)试液配制
牡丹蛋白肽样品溶液：取实施例1中制备的牡丹蛋白肽样品适量，用0.1mol/L硼酸缓冲 液(pH 8.3，含0.3mol/L NaCl)配成适当浓度的牡丹蛋白肽样品溶液。
ACE溶液：取0.1U ACE溶于1ml0.1mol/L硼酸缓冲液(pH 8.3，含0.3mol/L NaCl)。
HHL溶液：取适量HHL，用0.1mol/L硼酸缓冲液(pH 8.3，含0.3mol/L NaCl)配成6.5mmol/LHHL溶液。
马尿酸标准液：取适量马尿酸标准品，配置1mg/mL的马尿酸标准液。
(二)反应液的配制
分别向样品管(A)和空白管(B)加入ACE溶液5uL，样品管加入10uL牡丹蛋白肽样品溶液，空白管加入10uL硼酸缓冲液，37℃恒温5min后加入50uL HHL溶液，在37℃条件 下，反应30min后，加入85mL 1.0mol/LHCl终止反应，得到反应液。0.45um滤膜过滤后用 于HPLC分析。
(三)HPLC色谱分析
流动相和色谱条件：乙腈：超纯水＝25:75(含0.05％(v/v)TFA，0.1％(v/v)三乙胺)， 流速：0.5mL/min，检测波长：228nm；柱温：30℃；进样量：20uL。
(四)实验结果计算
计算公式为：R＝(B-A)/B*100％
R:样品对ACE的抑制率(％)；A：样品组中马尿酸的峰面积；B：空白组中马尿酸的峰面积。
ACE抑制率实验及HPLC分析结果显示，牡丹籽蛋白肽样品溶液浓度与ACE抑制率呈线性关系，即随着牡丹籽蛋白肽浓度的增高，其ACE抑制率也升高，牡丹籽蛋白肽的ACE 抑制的IC50为6.21mg/mL。
实验例3
牡丹蛋白肽的降血压实验
采用实施例1制备的牡丹籽蛋白肽对家兔进行动物实验，通过对照试验考察本发明的牡 丹籽蛋白肽对试验家兔的治疗作用。
具体试验过程如下：
(一)器材与药品
D-95微机系统、测压装置1套、兔手术台、手术灯、手术器械1套、动脉夹、磅秤、注射器、纱布、丝线。
20％乌拉坦、0.5％肝素、生理盐水、牡丹蛋白肽
(二)实验动物
家兔。
(三)实验步骤
家兔称重，麻醉(20％乌拉坦5ml/kg耳源静脉注射)，进药要慢，先慢后更慢，进入麻 醉状态后，2-5min将乌拉坦推完，固定家兔，分离左右颈总动脉，穿线备用，开机调零，耳源静脉注射肝素0.5ml，左侧颈总动脉插管，记录正常血压；提右颈总动脉15s，2min后重复一次，记录升压幅度；快速静脉注射0.01％去甲肾上腺素0.05ml/kg，记录升压幅度；静脉注射高、中、低三种不同剂量的牡丹蛋白肽(高剂量组为1.0mg/ml，中剂量组为0.1mg/ml，低剂量组为0.01mg/ml)，记录降压幅度；对比例1-3所述制备的牡丹籽蛋白肽，按照高剂量静脉注射；空白组注射等量生理盐水。
采用SPSS16.0统计软件进行数据处理，实验数据以均数标准差表示，采用t检验，检验 水准a＝0.05。结果见表2：
表2：牡丹籽蛋白肽对家兔血压的影响
本公开中涉及的诸如“包括”、“包含”、“具有”等等的词语是开放性词汇，指“包括但不限 于”，且可与其互换使用。这里所使用的词汇“或”和“和”指词汇“和/或”，且可与其互换使用， 除非上下文明确指示不是如此。这里所使用的词汇“诸如”指词组“诸如但不限于”，且可与其 互换使用。
另外，如在此使用的，在以“至少一个”开始的项的列举中使用的“或”指示分离的列举， 例如“A、B或C的至少一个”的列举意味着A或B或C，或AB或AC或BC，或ABC(即A 和B和C)。此外，措辞“示例的”不意味着描述的例子是优选的或者比其他例子更好。
提供所公开的方面的以上描述以使本领域的任何技术人员能够做出或者使用本公开。对 这些方面的各种修改对于本领域技术人员而言是非常显而易见的，并且在此定义的一般原理 可以应用于其他方面而不脱离本公开的范围。因此，本公开不意图被限制到在此示出的方面， 而是按照与在此公开的原理和新颖的特征一致的最宽范围。
为了示例和描述的目的已经给出了以上描述。此外，此描述不意图将本公开的实施例限 制到在此公开的形式。尽管以上已经讨论了多个示例方面和实施例，但是本领域技术人员将 认识到其某些变型、修改、改变、添加和子组合。

Claims (9)

1.一种牡丹蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界CO2萃取脱脂，过筛，按料液比1:20～30与水混合，加入NaOH调节pH9～10，50～60℃条件下磁力搅拌60～70min，离心(3500～4000r/min，13～18min)，取上清液，加入HCl，调节pH3.0～4.0，离心(3500～4000r/min，13～18min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
S2：取步骤S1所得蛋白2份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括菠萝蛋白酶1～2份，蛋白酶K3～4份，胰凝乳蛋白酶6～7份，酶解反应pH为6.0～7.0，酶活力100～120u/mL，反应温度45～55℃，反应时间3～4h，酶解后，高温灭活，加入10％～15％的HCl，调节pH至4.0～4.5，在80～100r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后冷冻干燥得牡丹蛋白肽。
2.根据权利要求1所述牡丹蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S1中采用带种皮的牡丹籽粕为原料。
3.根据权利要求1所述牡丹蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S1牡丹籽粉碎过110～130目筛。
4.根据权利要求1所述牡丹蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的冷冻干燥温度为-40℃，干燥10h。
5.根据权利要求1所述牡丹蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述酶解反应pH值为6.5，反应温度为45℃，反应时间为3.5h。
6.根据权利要求1所述牡丹蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述酶解液高温灭活温度为85～95℃,15～20min。
7.根据权利要求1所述牡丹蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述牡丹蛋白肽用环糊精进行包埋处理。
8.权利要求1～7任一项所述方法制备得到的牡丹蛋白肽。
9.权利要求8所述牡丹蛋白肽在制备用于降血压产品中的应用。
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