CN1500873A - 沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种沙蚕蛋白酶，同时提供了其分离提取纯化方法，此酶的英文名称：N－V proteinase：在Swissprot中的登录名为N－V proteinase，登录号为P83433。其分子量在27000－35000之间，等电点在5－7.5之间，最适温度为45℃，最适pH为7.8。该酶分子内部10个肽段的氨基酸残基的序列，其特征是(1)AVYLAGMK(2)NFPNYYINLY(3)VYLAANPTASS(4)QTFNSDTL(5)VYILDTGI沙蚕蛋白酶是一种蛋白水解酶，在体内体外都能强烈地水解纤维蛋白原和纤维蛋白，可做为溶栓药物和抗凝血药物，预防和治疗心肌梗塞、脑动脉血栓形成等疾病的应用。

Description

沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种溶血栓纤溶酶，特别是提供了一种沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用，涉及纤溶酶的分离提取纯化方法的生物化学技术领域。

背景技术：

血栓栓塞性是临床最常见的也是最严重的一种血液循环障碍疾病。治疗上述疾病，特别是在发病初期使用溶栓剂，降低纤维蛋白及纤维蛋白原含量、减少血小板凝集、溶解血栓、恢复血管再通，是最重要的治疗方法，能降低死亡率、减少后遗症。目前，国内外在临床上多用尿激酶和克栓酶、蛇毒降纤酶等溶栓性药物。这些药物价格都很昂贵，也有不同优缺点，如选择性差，半寿期长，抗原性强，毒性大，易引起继发出血性疾病。因此、发现研制新型溶栓类药物仍是制药工业非常有重要意义的科研项目，具有极大社会效益和经济效益。

发明内容：

本发明提供一种沙蚕蛋白酶，同时提供了该酶的分离提取纯化方法和应用，克服了常规溶栓剂药物价格昂贵，选择性差、半寿期短、抗原性强等缺点，并可以实现工业化生产。

沙蚕蛋白酶，英文名称：N-V proteinase(下文减称：N-V蛋白酶)：此酶在Swiss prot中的登录名为N-V proteinase，登录号为P83433。其分子量在27000-35000之间，等电点在5-7.5之间，最适温度为45℃，最适pH为8-9。

该酶分子内部5个肽段的氨基酸残基的序列，其特征是

(1)AVYLAGMK

(2)NFPNYYINLY

(3)VYLAANPTASS

(4)QTFNSDTL

(5)VYILDTGI

沙蚕蛋白酶是一种蛋白水解酶，在体内体外都能强烈地水解纤维蛋白原和纤维蛋白，可做为溶栓药物和抗凝血药物，预防和治疗心肌梗塞、脑动脉血栓形成等疾病的应用。

沙蚕蛋白酶系直接水解于纤维蛋白、不具有激酶性质的蛋白水解酶，是从环节动物门Phylum Annelida毛虫钢Class Chaetopoda，多毛目polychaeta，沙蚕科Nereidae，分离纯化获得。

本发明提供五种沙蚕蛋白酶的分离提纯方法：

(一)纯化工艺1，包括以下步骤：

1)取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；

2)取N-V蛋白酶粗提液，置冰浴中冷却至0-10℃，在搅拌条件下，加入-20～0℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达5～15％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10～10℃，3000～9000转/分离心15～60分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入预冷的无水乙醇，终浓度为25-45％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10～0℃，3000～9000转/分离心15～60分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。保存方法，将沉淀溶于适量pH4.0～9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液中，分装，-20℃保存，或将沉淀冷冻干燥，-20℃保存，取保存液用pH4.0～9.0，0.01～0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液稀释10-50倍，在截留值100000～10000之间超滤，获得超滤液；

3)分别用含5-10％乙醇的pH6.5-8.0、0.02～0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAESepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl，KCl等中性盐浓度从0～0.5mol/L)，收集活性峰并冻干；

4)分别用含10-15％乙醇的pH4.0-6.5、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡经上一步DEAE SepharoseFast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose FastFlow层析介质。平衡液上样，采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl，KCl等中性盐浓度浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，鉴定活性和纯度，进行蛋白定量，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。

(二)纯化工艺2，包括以下步骤：

1)超滤分离和浓缩：取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度；

2)CM-52纤维素柱层析：分别用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质；平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱；用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度；

3)QAE Sephadex A50柱层析：用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质；将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，PAGE鉴定纯度；

4)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析：将活性峰浓缩液用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡；用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液浓缩上样，采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5～0.05mol/L)；收集活性峰，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。

(三)纯化工艺3，包括以下步骤：

1)超滤分离和浓缩：取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度；

2)采用pH 7.0-8.0，0.02-0.04mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液，以常液洗脱方法，进行DEAE Sepharose Fast Flow层析，收集活性峰并超滤浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度；

3)采用pH梯度洗脱(pH 4.0-6.5，0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液)与盐梯度洗脱方法(pH5.5-6.5，0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液，NaCl浓度为0-0.5mol/L)组合，进行CMSepharose Fast Flow层析，超滤浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。

(四)纯化工艺4，包括以下步骤：

1)取沙蚕洗净后绞碎，加入1～5倍体积的pH6.0～8.0，0.1mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液制成匀浆；离心，取上清液即溶栓素粗提液；粗提液经15-60％(NH₄)₂SO₄盐析沉淀；

2)重新溶解沉淀，经Sephacryl S-100层析柱层析分离，收集活性峰；活性峰冻干浓缩；

3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析：用pH6.0～8.0，0.025mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄+1mol/L(NH₄)₂SO₄缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液上样，采用线性梯度洗脱法洗脱((NH₄)₂SO₄浓度从1-0.05mol/L)，收集活性峰，超滤浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度。

(五)制备性分离提取纯化方法，包括以下步骤：

用Epoxy-activated Sepharose 6B为介质，制成介质悬液；将纯化的兔抗沙蚕蛋白酶抗体溶解于偶联缓冲液中，与凝胶颗粒悬液混合，于摇床中作用过夜后装柱；用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体；用乙醇胺过夜处理凝胶，以封闭残余活性基团；用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱，用上样缓冲液洗脱亲和介质；收集洗脱液进行蛋白定量，计算偶联率；将制备好的亲和介质装柱，以沙蚕蛋白酶超滤液为上样样品，以阶段洗脱方法，收集活性峰并冻干。

本发明沙蚕蛋白酶在用于制备血栓性疾病的预防和治疗药物。

本发明的药物组合物优选重量比为0.1％～99.5％活性成分。

本发明药物优选含有1％～99％的沙蚕蛋白酶和99％～1％的赋形剂。

本发明药物优选含有10％～90％的沙蚕蛋白酶和90％～10％的药用赋形剂。

本发明药物优选含有30％～80％的沙蚕蛋白酶和70％～20％的药用赋形剂。

本发明药物最好含有60％～70％的沙蚕蛋白酶和40％～30％的赋形剂。

本发明的药物含有治疗有效量的提取物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明可以组合物的形式通过静脉、肌肉注射、口服、直肠等给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如：注射剂、片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂、口服液体剂型。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物混合，制成所需剂型。

上文的载体是指药学领域常规的药物载体，包括如：防腐剂、色素、稀释剂、赋形剂，填充剂，粘合剂，矫味剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体。

沙蚕蛋白酶的药物作用：

药效学实验：

1.体内血栓形成时间实验：

根据国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编，溶血栓药体内血栓溶解实验——颈动脉血栓形成法，以尿激酶为阳性对照药，以生理盐水为阴性对照，静脉给药后，用电刺激损伤大鼠颈动脉以形成血栓，观察血栓形成时间，同时测定凝血时间。

N-V蛋白酶的体内血栓实验研究表明：N-V蛋白酶和尿激酶在同等剂量的前提下，N-V蛋白酶的体内血栓形成时间长于尿激酶。

2.体外血栓形成

●体外血栓形成实验：根据国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编，以尿激酶为阳性对照药，以生理盐水为阴性对照，大鼠静脉给药后，腹腔主动脉取血，置于体外血栓形成仪中旋转，测定血栓长度、湿重、干重。结果表明：N-V蛋白酶的体内抗血栓形成效果优于尿激酶。

3.凝血相关生化检验

参考N-V蛋白酶半数致死量，选择大、中、小三个剂量组静脉给药，时间、方法同步骤2。

●纤维蛋白原mg/dL对照组266，小剂量207，中剂量142，大剂量132，尿激酶153，差异显著；

●PT 对照组19.6，小剂量19.2，中剂量18.1，大剂量20.1，尿激酶19.3，差异不显著；

●APTT 对照组20.7，小剂量16.8，中剂量16.8，大剂量19.0，尿激酶19.9，差异不显著；

4.凝血时间实验：小鼠尾静脉注射N-V蛋白酶后摘出眼球，取血。

●玻片法 单位秒：对照组131，小剂量194，中剂量233，大剂量183秒；

●毛细管法单位秒：对照组124，小剂量180，中剂量329，大剂量211秒；

5.体内溶血实验：

●大鼠法：体内注射小、中、大三个剂量的N-V蛋白酶，不同时间后取腹主动脉血，柠檬酸钠抗凝，在试管中，离心3000转/秒，5分钟，血液分上下两层，上为清亮血浆，无溶血；

●家兔法：无溶血

制剂的热源实验

用鲎试剂检测无热源。

定性鉴定实验

N-V蛋白酶为抗原免疫家兔，分离抗血清。在琼脂板上做抗原抗体反应。N-V蛋白酶产生免疫沉淀线，其他蛋白质均无反应。

N-V蛋白酶的体外活性测定方法——纤维蛋白平板

1.材料

人血纤维蛋白原                            (中国生物制品检定所)

人血凝血酶                                (中国生物制品检定所)

人尿激酶                                  (中国生物制品检定所)

其它药品均为国产分析纯

2.方法：

(1)制备0.5％的纤维蛋白原溶液：100mg纤维蛋白原粉末溶于0.1MpH7.4 Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。

(2)制备20U/ml的凝血酶溶液：按标定单位，将凝血酶溶于0.1MpH7.4Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。

(3)制备纤维蛋白平板：在用水平仪校正过的平面上放置直径9cm的平皿，加入9ml的0.5％的纤维蛋白原溶液和1.0ml 20u/ml的凝血酶溶液，混匀后静置15分钟。

(4)测定活性：取阴性对照药(生理盐水)、阳性对照药(尿激酶)和N-V蛋白酶各10ul，在纤维蛋白平板上点样，37℃下放置15分钟。

用卡尺测量溶斑的长短径，计算溶斑面积。

结果：

根据溶斑面积的大小，判断N-V蛋白酶活性的高低。溶斑面积越大，N-V蛋白酶的活性越高。

N-V蛋白酶的蛋白定量方法

1.方法：

(1)标准试剂的配制：

精称100mg的考马斯亮蓝G-250，溶于95％的乙醇中，再与100mlw/v的磷酸混合，0.01M pH7.0的磷酸盐缓冲液定容于1000ml的容量瓶中。

(2)分析方法：

常规分析法：取5ml标准试剂，加入0.1ml 0.01M pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解的蛋白样品液中，充分混合，放置5分钟后，在595nm处测定吸光度。

微量分析法：取0.2ml标准试剂，加入0.8ml 0.01M pH7.0的磷酸盐溶解的蛋白样品液中，充分混合，放置5分钟后，在595nm处测定吸光度。

(3)备注：

常规分析法的蛋白含量线性范围：0.2～1.4mg/ml

微量分析法的蛋白含量线性范围：5～100ug/ml

(4)标准定量曲线

在常规分析法和微量分析法蛋白含量线性范围内均匀取浓度点，以蛋白浓度为横坐标、595nm处的吸光度为纵坐标，分别绘制常规和微量标准定量曲线，并做直线相关检验。

2结果：

在规定蛋白浓度范围内蛋白浓度与A595呈直线正相关(P＜0.001)。

N-V蛋白酶温度影响实验

1.将2mgN-V蛋白酶电泳纯纯品溶解于1ml生理盐水。

2.分别放置在20、30、37、45、50、60、70℃水浴箱中保温1小时。

3.纤维蛋白平板测定活性(37℃，15分钟)。

激酶活性分析与纤溶酶原激活分析

(一)激酶活性分析

1.以10000截留值的超滤离心管，用10mM Tris pH7.4，150mM NaCl，10mM MgCl₂缓冲液充分洗涤N-V蛋白酶的电泳纯纯品，洗涤三次。

2.吸取上清，在37℃条件下，加入ATP、[³²P]ATP、以及偶氮酪蛋白、纤维蛋白原等底物，共同孵育15分钟。

3.加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样液，煮沸终止反应，离心取上清。

4.进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以0.25％Coomassie blue(45％甲醇，10％乙酸配制)固定，于X光片曝光，检查磷酸化的底物带。结果表明，N-V蛋白酶无激酶活性。

纤溶酶原激活分析方法

1.以生理盐水配制纤溶酶原溶液、以pH7.4，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液配制N-V蛋白酶溶液。以5μl、1U/mL纤溶酶原溶液与5μlN-V蛋白酶溶液(①液)，以5μl生理盐水与5μl N-V蛋白酶溶液(②液)，以5μl、10U/mL纤溶酶原溶液与5μl N-V蛋白酶溶液(③液)，分别混合配制，并分为三份。

2.所有配液同(二)、1，但是在①液与③液加入ATP溶液，②液中不加。分别混合配制，并分为三份。

3.将上述两种方法制备的各三份配液，第一份在混合后直接在纤维蛋白平板上点样，第二份混合后于37℃下放置10分钟，在纤维蛋白平板上点样，第三份混合后于37℃下放置20分钟在纤维蛋白平板上点样。点样完成后，于37℃下放置15分钟，后测定活性。结果显示：

N-V蛋白酶无纤溶酶原激活作用。

N-V蛋白酶血块溶解实验

a)取Wister大鼠，麻醉后腹主动脉取血，放置于平皿，室温形成血栓，切割并称量血块，装入试管中。

b)将尿激酶和N-V蛋白酶加入血块试管中，37℃恒温，于不同时间观测溶解情况。结果表明：10小时内完全溶解，而磷酸盐缓冲液对照组无溶解。

具体实施方式：

实施例1

取200g沙蚕，洗净后绞碎，加入4.5倍体积的pH7.0，0.01mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，缓冲液制成匀浆；4℃，9000转/分离心30分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml，置冰浴中冷却至0℃，在搅拌条件下，加入-20℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达5％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10℃，9000转/分离心30分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇，终浓度为30％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10℃，9000转/分离心30分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8，0.01mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中，分装。用前以pH8.0，0.02mol/L Tris-HCl缓冲液稀释5倍，在截留值100000-10000之间超滤，获得超滤液。分别用含5％乙醇的pH8.0、0.02mol/L Tris-HCl缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。分别用含15％乙醇的pH4.0、0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L)，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.23‰。

实施例2

取200g沙蚕，洗净后绞碎，加入8倍体积的pH8.0，0.08mol/LTris缓冲液制成匀浆；4℃，6000转/分离心60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml，置冰浴中冷却至0℃，在搅拌条件下，加入-20℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达10％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10℃，6000转/分离心60分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇，终浓度为25％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10℃，8000转/分离心30分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8，0.01mol/L HAC-NaAC缓冲液中，分装。用前以pH7.8，0.04mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液稀释5倍，在截留值100000-10000之间超滤，获得超滤液。分别用含5％乙醇的pH7.8，0.04mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。分别用含25％乙醇的pH6.0、0.02mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(KCl浓度从0-0.5mol/L)，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.21‰。

实施例3

取200g沙蚕，洗净后绞碎，加入8倍体积的pH5.0，0.04mol/LHAC-NaAC，缓冲液制成匀浆；4℃，4000转/分离心60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml，置冰浴中冷却至0℃，在搅拌条件下，加入-20℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达10％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10℃，4000转/分离心60分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇，终浓度为25％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10℃，6000转/分离心45分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8，0.01mol/LHAC-NaAC缓冲液中，分装。用前以pH7.8，0.04mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液稀释5倍，在截留值100000-10000之间超滤，获得超滤液。分别用含20％乙醇的pH6.0，0.03mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。分别用含25％乙醇的pH 4.0、0.02mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(KCl浓度从0-0.5mol/L)，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.26‰。

实施例4

取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入2倍体积的pH7.0，0.025mol/L磷酸盐缓冲液制成匀浆；4℃，9000转/分离心15分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。分别用pH4.6 0.01mol/L柠檬酸-柠檬酸钠+0.01mol/L NaCl缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱，超滤浓缩。用pH4.6 0.01mol/L柠檬酸-柠檬酸钠+0.01mol/L NaCl缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.0 0.025mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+1.5mol/LNaCl缓冲液充分平衡。用pH7.0 0.025mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+1.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5～0.05mol/L)，收集活性峰，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，超滤浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.3‰。

实施例5

取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入5倍体积的pH5.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液制成匀浆；4℃，6000转/分离心30分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。分别用pH5.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱，超滤浓缩。用pH5.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.5 0.025mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+1mol/LNaCl缓冲液充分平衡。用pH7.5 0.025mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+1mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1～0.05mol/L)，收集活性峰，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，超滤浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.35％。

实施例6

取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入10倍体积的pH6.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液制成匀浆；4℃，4000转/分离心60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。分别用pH6.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱，超滤浓缩。用pH6.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.5 0.01mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+0.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡。用pH7.5 0.01mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄+0.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0.5～0.05mol/L)，收集活性峰，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，超滤浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.33‰。

实施例7

1)抗原的获得：采用制备型电泳获得目标蛋白—沙蚕蛋白酶。连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为10％。电泳结束后剥胶，切下一窄条胶块，放入染色液中染色10分钟，即可观察到活性带；剩余的凝胶块用保鲜膜包好，保存在4℃条件下。将染色的胶块与未染色的胶块在玻璃板上对齐，切下未染色的大胶块上与活性蛋白带相对应的胶条，切下的胶条封入透析袋中，内装少量缓冲液A，放入水平电泳槽电泳，80mA，电泳4小时。收集袋内液体，用蒸馏水透析除盐，离心，过微孔滤膜除菌，然后冻干，即获得电泳纯抗原。

2)免疫动物

2.1)卡介苗致敏：给每只家兔两后足皮内注射活卡介苗，每只1mg。

2.2)基础免疫：两星期后进行基础免疫。在高压灭菌的研钵中加入弗氏不完全佐剂，再滴加灭活的卡介苗，边滴加边研磨，制成弗氏完全佐剂(2mg卡介苗/ml弗氏完全佐剂)；将冻干的抗原溶于适量的高压灭菌的缓冲液A中，滴加入完全佐剂中，边滴加边研磨，再加入青霉素钠溶液、硫酸链霉素溶液少许，研磨均匀，制成油包水乳剂，抗原浓度为100μg/ml乳剂。给每只兔子背部皮下多点注射，每只2ml。

2.3)加强免疫：每3周加强免疫一次，方法基本与基础免疫相同，不同的是用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，加强注射的剂量可适当降低。每次加强免疫后7～10天，耳缘静脉取血，用双向琼脂扩散试验^[31]测定抗血清效价，当效价≥8时，从耳缘静脉放血20～30ml/只。放血后继续饲养，继续免疫。效价稳定后，可每间隔1周从耳缘静脉放血20～30ml/只，直至血清效价下降，最后从兔主动脉取全血。

2.4)在用电泳纯溶栓素免疫四只兔子的同时，用沙蚕匀浆上清液免疫另外两只兔子，作为对照。

2.5)取抗血清

每次获得的血样收集于灭菌的离心管中(不加抗凝剂)，于室温放置使之凝固。用一玻棒沿管壁旋松凝块，再室温放置数小时，使抗血清完全析出；5000转/分离心15分钟，上清即为抗血清。分装，-20℃贮存。

3)IgG的提纯

3.1)取适量抗血清冻融，加入等体积的预冷的缓冲液B混匀。冰浴条件下滴加饱和(NH₄)₂SO₄溶液，边加边搅拌，使溶液的(NH₄)₂SO₄饱和度达到50％，4℃静置2小时，4000转/分离心20分钟，弃上清。

3.2)沉淀用同体积的缓冲液B溶解，冰浴条件下逐滴加入饱和(NH₄)₂SO₄溶液，边加边搅拌，使溶液的(NH₄)₂SO₄饱和度达33％，4℃静置2小时，4000转/分离心20分钟，弃上清；重复4.2操作两次。

3.3)将沉淀溶于少量缓冲液B中，装入透析袋，4℃对缓冲液C透析除盐平衡，离心，上清为较纯的IgG溶液。

3.4)上步得到较纯的IgG过DEAE Sepharose Fast Flow柱层析，平衡缓冲液是缓冲液C，洗脱液是缓冲液D，常液洗脱，收集第一峰，用PEG20000浓缩。杂蛋白用缓冲液E洗脱。提纯的IgG用SDS-PAGE鉴定。

4)亲和层析介质的制备与亲和层析：用Epoxy-activated Sepharose6B为介质，制成介质悬液；将纯化的兔抗溶栓素抗体溶解于偶联缓冲液中，与凝胶颗粒悬液混合，于37℃摇床中作用16小时后装柱；用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体；用1M乙醇胺，37℃过夜处理凝胶，以封闭残余活性基团；用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱，用上样缓冲液洗脱亲和介质；收集洗脱液进行蛋白定量，计算偶联率。将制备好的亲和介质装柱，以溶栓素超滤液为上样样品，以阶段洗脱方法，收集活性峰并冻干。

实施例8

取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入2倍体积的pH8.0，0.03mol/L Tris缓冲液制成匀浆；4℃，6000转/分离心30分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。以pH8.0，0.03mol/L Tris缓冲液充分平衡浓缩液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，并进行常液洗脱，收集活性峰并超滤浓缩。以乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM Sepharose Fast Flow层析介质，以0.02mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.5-pH6.5)进行pH梯度洗脱，以pH6.5 0.02mol/L乙酸盐缓冲液(NaCl 0-0.5mol/L)进行盐梯度洗脱，超滤浓缩。采用pH7.0，0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行Sephadex G-50层析，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度。获得N-V蛋白酶产率为0.32‰。

实施例9

取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入2倍体积的含10％乙醇的pH8.0，0.03mol/L Tris缓冲液制成匀浆；4℃，6000转/分离心60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。以pH7.5，0.025mol/LTris缓冲液充分平衡浓缩液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，并进行常液洗脱，收集活性峰并超滤浓缩。以柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM Sepharose Fast Flow层析介质，以0.04mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.5-pH6.5)进行pH梯度洗脱，以pH6.5 0.04mol/L柠檬酸盐缓冲液(NaCl 0-0.5mol/L)进行盐梯度洗脱，超滤浓缩。采用pH7.0，0.04mol/L磷酸盐缓冲液进行Sephadex G-75层析，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度。获得N-V蛋白酶产率为0.39‰。

实施例10

1)取500g沙蚕，洗净后绞碎，加入4.5倍体积的pH7.0，0.1mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液制成匀浆；4℃，9000转/分离心30分钟，取上清液即溶栓素粗提液；粗提液经15-60％(NH₄)₂SO₄盐析沉淀；

2)重新溶解沉淀，经Sephacryl S-100层析柱层析分离，收集活性峰；活性峰冻干浓缩；

3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析：用pH7.0、0.025mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄+1mol/L(NH₄)₂SO₄缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液上样，采用线性梯度洗脱法洗脱((NH₄)₂SO₄浓度从1-0.05mol/L)，收集活性峰，超滤浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度。

实施例11

N-V蛋白酶制剂工艺

制剂种类和每瓶装量：冻干制剂，N-V蛋白酶1-3mg/瓶；

赋型剂种类和用量：甘露醇10-40mg，右旋糖苷10-40mg，L赖氨酸5-15mg，人血白蛋白2-10mg，各组成成分以上述用量任意配比，以单方或复方形式，冻干赋型。

冻干操作：一级冻干：-30～-20℃冻干16-48小时；二级冻干：0-10℃冻干16-24小时。

Claims (10)

1、一种沙蚕蛋白酶，直接水解于纤维蛋白、不具有激酶性质的蛋白水解酶，其分子量在27000-35000之间，等电点在5-7.5之间，最适温度为40-50℃，最适pH为8-9，N-V蛋白酶最适pH8-9，pH4-12均有活性，加热70℃10分钟，活性丧失，酶分子内部5个肽段的氨基酸残基的序列如下：

(1)AVYLAGMK

(2)NFPNYYINLY

(3)VYLAANPTASS

(4)QTFNSDTL

(5)VYILDTGI

2、沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法，包括以下步骤：

1)取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；

2)取N-V蛋白酶粗提液，置冰浴中冷却至0-10℃，在搅拌条件下，加入-70-0℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达5-15％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10-0℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入预冷的无水乙醇，终浓度为25-45％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10-0℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。保存方法，将沉淀溶于适量pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液中，分装，-20℃保存，或将沉淀冷冻干燥，-20℃保存取保存液用pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液稀释10-50倍，在截留值100000-10000之间超滤，获得超滤液；

3)分别用含5-10％乙醇的pH6.5-8.0、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAESepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl，KCl等中性盐浓度从0~0.5mol/L)，收集活性峰并冻干；

4)分别用含10-15％乙醇的pH4.0-6.5、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡经上一步DEAE SepharoseFast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose FastFlow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl，KCl等中性盐浓度浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，鉴定活性和纯度，进行蛋白定量，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。

3、沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法，包括以下步骤：

1)超滤分离和浓缩：取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度；

2)CM-52纤维素柱层析：分别用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质；平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱；用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度；

3)QAE Sephadex A50柱层析：用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质；将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，PAGE鉴定纯度；

4)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析：将活性峰浓缩液用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡；用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液浓缩上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5~0.05mol/L)；收集活性峰，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。

4、沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法，包括以下步骤：

1)超滤分离和浓缩：取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度；

2)采用pH7.0-8.0，0.02-0.04mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液，以常液洗脱方法，进行DEAE Sepharose Fast Flow层析，收集活性峰并超滤浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₆₀值，PAGE鉴定纯度；

3)采用pH梯度洗脱(pH 4.0-6.5，0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液)与盐梯度洗脱方法(pH 5.5-6.5，0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液，NaCl浓度从0-0.5mol/L)组合，进行CMSepharose Fast Flow层析，超滤浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。

5、沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法，包括以下步骤：

1)取沙蚕洗净后绞碎，加入1～5倍体积的pH6.0～8.0，0.1mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液制成匀浆；离心，取上清液即溶栓素粗提液；粗提液经15-60％(NH₄)₂SO₄盐析沉淀；

2)重新溶解沉淀，经Sephacryl S-100层析柱层析分离，收集活性峰；活性峰冻干浓缩；

3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析：用pH6.0～8.0，0.025mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄+1mol/L(NH₄)₂SO₄缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液上样，采用线性梯度洗脱法洗脱((NH₄)₂SO₄浓度从1-0.05mol/L)，收集活性峰，超滤浓缩，分别测定A₂₆₀和A₂₈₀值，PAGE鉴定纯度。

6、沙蚕蛋白酶的制备性分离提取纯化方法，包括以下步骤：

用Epoxy-activated Sepharose 6B为介质，制成介质悬液；将纯化的兔抗沙蚕蛋白酶抗体溶解于偶联缓冲液中，与凝胶颗粒悬液混合，于摇床中作用过夜后装柱；用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体；用乙醇胺过夜处理凝胶，以封闭残余活性基团；用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱，用上样缓冲液洗脱亲和介质；收集洗脱液进行蛋白定量，计算偶联率；将制备好的亲和介质装柱，以沙蚕蛋白酶超滤液为上样样品，以阶段洗脱方法，收集活性峰并冻干。

7、沙蚕蛋白酶在制备血栓性疾病的预防和治疗药物。

8、沙蚕蛋白酶作为治疗有效量的活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

9、根据权利要求5、6所述的药物组合物，优选重量比为0.1％～99.5％活性成分。

10、根据权利要求5、6所述的药物，其特征在于：所说的药物是任何一种药剂学上所说的剂型。