CN109924263A - 凝乳剂及制备干酪的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了凝乳剂、获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法以及制备干酪的方法。所述的凝乳剂含有：马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的至少之一。本发明的凝乳剂凝乳反应温度和pH值宽泛，凝乳效果较好，所得到的干酪质地、口感较佳。

Description

凝乳剂及制备干酪的方法

技术领域

本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及凝乳剂及制备干酪的方法。更具体地，本发明涉及凝乳剂、获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法以及制备干酪的方法。

背景技术

干酪是以乳、稀奶油、部分脱脂乳、酪乳或这些产品的混合物为原料，经凝乳酶或其他凝乳剂凝乳并分离乳清而制得的新鲜或发酵成熟的乳制品。干酪含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素及矿物质钙、磷等，又被称为“奶黄金”。

然而，目前凝乳剂的种类仍有待开发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种凝乳剂、获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法以及制备干酪的方法。本发明以马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的至少之一作为凝乳剂，凝乳反应温度和pH值宽泛，凝乳效果较好，所得到的干酪质地、口感较佳。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

干酪制作中通常使用的凝乳酶是小牛皱胃酶，但小牛皱胃凝乳酶的生产应用也受到多方面因素的限制，其中包括以下几个方面：一是由于干酪需求增加，导致宰杀小牛生产的小牛皱胃酶供不应求；二是由于宗教信仰(如犹太教、伊斯兰教等)和素食主义群体的饮食禁忌，一定程度上限制了动物凝乳酶在干酪生产中的使用。

有鉴于此，发明人发现，青羊参具有凝乳效果。进一步地，发明人分别提取青羊参根、茎、叶子中的蛋白酶，并分别测定其凝乳活力，得到凝乳活力的结果是：青羊参叶子提取液>青羊参茎提取液>青羊参根提取液。进而，发明人对青羊参叶子中的蛋白酶进行分离纯化，发明蛋白酶QA和QC具有凝乳作用，经鉴定，这两种蛋白酶分别为马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B。经深入研究发现，这两种蛋白酶的凝乳反应温度和pH值宽泛，凝乳效果较好，所得到的干酪质地、口感较佳。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种凝乳剂。根据本发明的实施例，所述凝乳剂含有：马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的至少之一。发明人意外地发现，马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B具有凝乳作用。进一步地，发明人深入研究发现，这两种蛋白酶的凝乳反应温度和pH值宽泛，且凝乳效果较好，所得到的干酪质地、口感较佳。

根据本发明的实施例，上述凝乳剂还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B来源于青羊参，优选青羊参叶。

根据本发明的实施例，所述凝乳剂进一步含有：含钙化合物和含铝化合物的至少之一。由此，以便进一步提高凝乳活力。

根据本发明的实施例，所述凝乳剂的作用温度为40～70℃，作用pH值为5.5～8.0。发明人发现，在此温度和pH值下，马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的凝乳效果最佳。

根据本发明的实施例，所述马利筋属的萝藦蛋白酶能够水解κ-酪蛋白上Ser132-Thr133的肽键。

根据本发明的实施例，所述牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B能够水解κ-酪蛋白上Asp14-Glu15和Ser132-Thr133的肽键。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将青羊参叶子浸泡于缓冲液中，收集提取液；以及将所述提取液进行纯化，以便获得所述马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B，其中，所述马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B是如前面所述凝乳剂所限定的。采用本发明的方法能够有效地提取出马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B，且纯度较高、操作简便。

根据本发明的实施例，上述获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法还可以进一步具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述缓冲液为柠檬酸-磷酸缓冲液。由此，以便使青羊参中的蛋白酶溶解于缓冲液中。

根据本发明的实施例，所述柠檬酸-磷酸缓冲液浓度为10mmol/L。由此，以便进一步使青羊参中的蛋白酶溶解于缓冲液中。

根据本发明的实施例，所述青羊参叶子与缓冲液的质量体积比为1：(10～30)，优选1:20。由此，以便进一步使青羊参中的蛋白酶溶解于缓冲液中。

根据本发明的实施例，所述浸泡是在4～25℃下进行30～50分钟，优选是在4℃下进行40分钟。由此，以便进一步使青羊参中的蛋白酶溶解于缓冲液中。

根据本发明的实施例，所述纯化包括：将所述提取液进行超滤浓缩，得到浓缩液；以及利用层析柱对所述浓缩液进行洗脱，以便得到所述青羊参蛋白酶，其中，所述洗脱包括：1)将所述浓缩液加入所述层析柱中，收集流出液，以便获得所述马利筋属的萝藦蛋白酶；2)向步骤1)所得到的层析柱中加入柠檬酸-磷酸盐缓冲液，释放流出液；以及3)向步骤2)所得到的层析柱中加入含有0.6mmol/L NaCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，收集流出液，以便获得所述牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B。由此，以便进一步分离纯化，得到马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B。

根据本发明的实施例，所述超滤浓缩是采用10.0kD的超滤管进行的。由此，以便进一步分离纯化，得到马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备干酪的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将干酪基料与前面所述凝乳剂进行混合处理以及静置处理，以便得到所述干酪。由此，根据本发明实施例的制备干酪的方法所得到的干酪质地、口感较佳。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：调节所述混合处理所得到的混合液的pH值至5.5～8.0。在此条件下，凝乳剂的凝乳效果较佳。

根据本发明的实施例，所述静置处理是在40～70℃下进行40分钟～1.5小时。在此条件下，凝乳剂充分发挥凝乳效果。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的获得蛋白酶QA和QC的方法的流程示意图；

图2显示了根据本发明另一个实施例的获得蛋白酶QA和QC的方法的流程示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的青羊参蛋白酶超滤浓缩液(A)和滤过液(B)电泳图，其中超滤浓缩液(A)泳道M：蛋白质分子量标准，泳道1：青羊参蛋白酶提取液，泳道2：超滤浓缩液；超滤滤过液(B)泳道M：蛋白质分子量标准，泳道1：青羊参蛋白酶提取液，泳道2：超滤滤过液；

图4显示了根据本发明一个实施例的青羊参蛋白酶纯化组分的SDS-PAGE电泳图，其中泳道M：蛋白质分子量标准；泳道1：青羊参蛋白酶超滤浓缩液；泳道2-5：蛋白组分QA,QB,QC,QD；

图5显示了根据本发明一个实施例的不同pH对青羊参蛋白酶QA(a)和QC(b)水解活力的影响；

图6显示了根据本发明一个实施例的不同温度对青羊参蛋白酶QA(a)和QC(b)水解活力的影响；

图7显示了根据本发明一个实施例的不同种类蛋白酶抑制剂对青羊参蛋白酶QA(a)和QC(b)水解活力的影响；

图8显示了根据本发明一个实施例的不同pH对青羊参蛋白酶QA(a)和QC(b)凝乳活力的影响；

图9显示了根据本发明一个实施例的不同温度对青羊参蛋白酶QA(a)和QC(b)凝乳活力的影响；以及

图10显示了根据本发明一个实施例的不同金属离子对青羊参蛋白酶QA(a)和QC(b)凝乳活力的影响。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了凝乳剂、获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法以及制备干酪的方法，下面将分别对其进行详细描述。

为了方便理解，下面简要阐述下凝乳酶作用机理：

凝乳剂参与的凝乳反应分为两步：在反应初期先水解κ-酪蛋白使其失去活性，κ-酪蛋白降解成不可溶解的副κ-酪蛋白和三氯乙酸可溶解的小肽也称糖巨肽；随后，副κ-酪蛋白在钙离子充足且温度高于20℃条件下会逐渐聚集成三维网状结构进而形成凝块。

凝乳剂

在本发明的一个方面，本发明提出了一种凝乳剂。根据本发明的实施例，凝乳剂含有：马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的至少之一。发明人意外地发现，马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B具有凝乳作用。进一步地，发明人深入研究发现，这两种蛋白酶的凝乳反应温度和pH值宽泛，且凝乳效果较好，所得到的干酪的质地、口感较佳。

根据本发明的实施例，马利筋属的萝藦蛋白酶(简称蛋白酶QA)和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B(简称蛋白酶QC)来源于青羊参，优选青羊参叶。发明人分别提取青羊参根、茎、叶子中的蛋白酶，并分别测定其凝乳活力，得到凝乳活力的结果是：青羊参叶子提取液>青羊参茎提取液>青羊参根提取液。进一步地，发明人对青羊参叶子中的蛋白酶进行分离纯化，发明蛋白酶QA和QC具有凝乳作用，经鉴定，这两种蛋白酶分别为马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B。

根据本发明的实施例，凝乳剂进一步含有：含钙化合物和含铝化合物的至少之一。发明人发现，钙离子和铝离子显著提高蛋白酶QA和QC的凝乳活力，从而使其凝乳效果较好，例如凝乳时间缩短，所得干酪质地软硬适中等。

根据本发明的实施例，凝乳剂的作用温度为40～70℃，作用pH值为5.5～8.0。发明人发现，在此温度和pH值下，蛋白酶QA和QC的凝乳效果较佳。

根据本发明的实施例，马利筋属的萝藦蛋白酶能够水解κ-酪蛋白上Ser132-Thr133的肽键；牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B能够水解κ-酪蛋白上Asp14-Glu15和Ser132-Thr133的肽键。马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B对α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白均有水解作用。小牛皱胃酶酶切位点是κ-酪蛋白Phe105-Met106上肽键，发明人意外地发现，本发明的两种蛋白酶的作用位点并不同于小牛皱胃酶。

获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法

在本发明的另一方面，本发明提出了一种获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地提取出马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B，且纯度较高、操作简便。

根据本发明的实施例，参考图1，该方法包括：

S100浸泡

在该步骤中，将青羊参叶子浸泡于缓冲液中，收集提取液。

根据本发明的实施例，缓冲液为柠檬酸-磷酸缓冲液。发明人在众多缓冲盐中发现，蛋白酶QA和QC在柠檬酸-磷酸缓冲液中的溶解率较高。进而，将青羊参叶子浸泡于柠檬酸-磷酸缓冲液中，以便充分提取出蛋白酶QA和QC。根据本发明的优选实施例，柠檬酸-磷酸缓冲液浓度为10mmol/L。由此，以便进一步充分提取出蛋白酶QA和QC。

根据本发明的实施例，青羊参叶子与缓冲液的质量体积比为1：(10～30)，优选1:20。发明人发现，在此较佳质量体积比的条件下，能够充分提取出青羊参叶子中的蛋白酶QA和QC，且提取液中蛋白酶QA和QC含量较高。

需要说明的是，本发明的“质量体积比”是指青羊参叶子的质量与缓冲液的体积的比例。

根据本发明的实施例，浸泡是在4～25℃下进行30～50分钟。由此，以便充分提取出青羊参叶子中的蛋白酶QA和QC。根据本发明的优选实施例，浸泡是在4℃下进行40分钟。

S200纯化

在该步骤中，将提取液进行纯化，以便获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B。

根据本发明的实施例，参见图2，纯化包括：

S210超滤浓缩

在该步骤中，将提取液进行超滤浓缩，得到浓缩液。

根据本发明的实施例，超滤浓缩是采用10.0kD的超滤管进行的。发明人发现，提取液经10.0kD超滤管浓缩分离后得到的超滤浓缩液蛋白浓度显著增加，经SDS-PAGE凝胶电泳得到三条主要的条带，分子量在6.5kD至27.0kD之间，而超滤滤过液中几乎不含蛋白质。由此，说明青羊参提取液中所含蛋白酶的分子量基本大于10.0kD，因此选用10.0kD超滤管做为初步纯化手段可以有效分离青羊参提取液中蛋白酶和小分子杂质。

S220洗脱

在该步骤中，利用层析柱对浓缩液进行洗脱，以便得到青羊参蛋白酶。

根据本发明的实施例，洗脱包括：

1)将浓缩液加入层析柱中，收集流出液，以便获得马利筋属的萝藦蛋白酶；

2)向步骤1)所得到的层析柱中加入柠檬酸-磷酸盐缓冲液，释放流出液；以及

3)向步骤2)所得到的层析柱中加入含有0.6mmol/L NaCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，收集流出液，以便获得牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B。

发明人发现，将浓缩液加入层析柱中，蛋白酶QA不会吸附于层析柱上，直接流出，收集该部分流出液即可获得蛋白酶QA。接着，采用不含NaCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗脱层析柱，可以洗脱出另一种青羊参蛋白酶。然后，再采用0.6mmol/L NaCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗脱层析柱，蛋白酶QC解吸附，随着缓冲液流出，收集该部分流出液即可获得蛋白酶QC。

根据本发明的实施例，马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B是如前面所描述的凝乳剂所限定的。本领域技术人员能够理解的是，前面针对凝乳剂所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。

制备干酪的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备干酪的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将干酪基料与前面所述凝乳剂进行混合处理以及静置处理，以便得到干酪。如前所述，本发明的凝乳剂凝乳反应温度和pH值宽泛，且凝乳效果较好，所得到的干酪的质地、口感较佳。

本领域技术人员能够理解的是，本发明所使用的术语“干酪基料”主要是指待进行凝乳处理的物料。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：调节混合处理所得到的混合液的pH值至5.5～8.0。通过将干酪基料与凝乳剂混合所得到的混合液的pH值调至最适凝乳反应pH值(5.5～8.0)，以便凝乳酶发挥凝乳作用，得到质地、口感较佳的干酪。

根据本发明的实施例，静置处理是在40～70℃下进行40分钟～1.5小时。将混合后的混合液在此条件下静置，以便凝乳剂发挥凝乳作用，得到质地、口感较佳的干酪。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对凝乳剂所描述的特征和优点，同样适用于该制备干酪的方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一般方法

1、蛋白酶液中蛋白含量测定根据考马斯亮蓝法(Bradford,1976)，使用牛血清白蛋白作为蛋白标准品。

2、凝乳活性鉴定

参照Crisina等(Onopordum acanthium L.(Asteraceae)flowers ascoagulating agent for cheesemaking)的方法并略做修改。具体地，1mL 12％(w/v)脱脂还原乳(含10mmol/L CaCl₂)加入0.1mL酶液混匀后放置于37℃，观察并记录凝乳时间，凝乳形成之后拍照记录。一个凝乳活力单位定义为每mg酶在40min内凝结牛乳的量，用索氏单位(U)表示。计算公式为：

凝乳活力＝2400×V/(ν×t)

式中，V表示加入底物的体积(mL)；ν表示加入蛋白溶液的体积(mL)；t表示凝乳时间(s)。

3、酪蛋白水解活力

测定参照Mohanty等(2012)的方法并略作修改(Isolation,purification andcharacterization of chymosin from riverine buffalo(Bubalos bubalis))。具体地，以1％(w/v)全乳酪蛋白溶液作为底物，1.1mL底物中加入0.1mL酶液混合均匀于37℃反应30min后，加入1.8mL 5％(w/v)TCA溶液终止反应。空白对照组是将1.8mL 5％(w/v)TCA溶液加入0.1mL酶液混匀后，再加入1.1mL底物。反应结束后5000g 20min离心吸取上清液于280nm处测定吸光值。一个酶水解活力单位定义为每min使吸光值增加0.1所需要的酶量，用单位SU表示。

实施例1

在该实施例中，研究不同提取条件的影响：

基本提取方法：

青羊参干叶子用剪刀剪碎，分别以一定料液比加入提取液，混匀后浸提，然后用四层纱布过滤，滤液于4℃8000g离心40min除杂，上清液用0.22μm滤膜过滤，微滤液通过10.0kD超滤管浓缩分离，取上层截留液获得青羊参蛋白酶浓缩液。采用考马斯亮蓝法(Bradford,1976)测定浓缩液蛋白含量，并用12％(w/v)脱脂还原乳观察凝乳时间。

1、不同浸提条件

研究三种浸提条件，分别为55℃加热40min、25℃放置40min、4℃放置40min。观察浓缩液凝乳时间，得到不同条件对青羊参叶子凝乳效果的影响如表1所示。青羊参叶子在55℃处理40min后，其所需要的凝乳时间是4℃放置40min的青羊参叶子凝乳时间的7倍，结果表明55℃处理40min会使青羊参叶子凝乳作用显著减弱。由此，选择浸提条件为4℃放置40min。

表1不同浸提条件对青羊参叶子提取效果的影响

不同温度处理	凝乳时间(min)
		55℃处理40min	110min
25℃处理40min	40min
		4℃处理40min	15min

2、不同料液比

研究三个料液比，分别为1:10、1:20、1:30。料液比是蛋白酶提取条件中非常重要的一个因素，一方面料液比升高会增加蛋白酶的溶出效率，另一方面随着料液比的升高，蛋白酶的浓度会降低，从而影响酶的稳定性和活性。综合考虑选取了1:10、1:20和1:30三个料液比来探究对青羊参叶子蛋白酶提取效果的影响，得到如表2所示结果。结果表明，当料液比为1:20时，青羊参蛋白酶浓缩液的凝乳活力最大。由此确定青羊参蛋白酶提取的料液比为1:20。

表2不同料液比对青羊参叶子提取效果的影响

料液比	凝乳活力(U/mg)
		1:10	147.7
1:20	213.6
		1:30	204.2

3、不同提取液

研究超纯水、pH6.5 10mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液(含150mmol/L NaCl、1mmol/LCys和EDTA)。发明人发现，在低浓度的盐存在的条件下，其溶解度会增加，所以采用盐溶液进行酶的提取。不同提取溶液对青羊参蛋白酶的提取结果如表3所示，相比于超纯水浸提提取，pH6.5 10mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液提取得到的蛋白酶溶液凝乳活力相近，但是蛋白含量高出一倍，这是由于蛋白酶在低盐溶液中的溶解度高于超纯水。由此确定青羊参蛋白酶的提取溶液为柠檬酸-磷酸缓冲液。

表3不同提取溶液对提取效果的影响

不同提取溶液	蛋白含量(mg/mL)	凝乳活力(U/mg)
			超纯水	0.136	198.1
pH6.5 10mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液	0.305	201.5

4、分离纯化

超滤是借助超滤膜将不同大小的物质分离的技术，通常小于膜孔径的物质会透过膜孔流出，反之则截留，因此超滤不仅能提高提取溶液中蛋白酶浓度，同时也可以除去提取溶液中的某些小分子杂质，如酚类物质和色素。超滤浓缩液和滤过液经SDS-PAGE凝胶电泳得到如图3所示结果，结果表明，青羊参蛋白酶提取液经10.0kD超滤管浓缩分离后得到的超滤浓缩液蛋白浓度显著增加，并且得到三条主要的条带，分子量在6.5kD至27.0kD之间，而超滤滤过液中几乎不含蛋白质。这一结果说明青羊参提取液中所含蛋白酶的分子量基本大于10.0kD，因此选用10.0kD超滤管做为初步纯化手段可以有效分离青羊参提取液中蛋白酶和小分子杂质。

超滤浓缩得到的青羊参蛋白酶浓缩液仍然含有大量的杂蛋白，需要进一步纯化将目标蛋白进行有效分离。因此可利用不同蛋白质对弱阴离子交换树脂结合能力不同来对青羊参蛋白酶进行纯化，最终使目标蛋白和杂蛋白有效分离。发明人采用不同浓度的NaCl溶液(0mmol/L,0.6mmol/L,1mmol/L)洗脱吸附在弱阴离子交换树脂上的蛋白质，可将青羊参蛋白酶浓缩液分成四组分，按照洗脱顺序分别称之为QA(直接流出)、QB(0mmol/L)、QC(0.6mmol/L)、QD(1mmol/L)，各组分在280nm下吸光值、蛋白含量及凝乳活性鉴定结果如表4所示。在280nm下吸光值和蛋白含量测定结果表明，青羊参蛋白酶超滤浓缩液经弱阴离子交换树脂纯化后，蛋白质主要集中在QA和QC中，随后用各组分进行凝乳活性鉴定，仅观察到QA和QC具有凝乳活性。

表4青羊参蛋白酶纯化组分的鉴定

组分	A280	蛋白含量(mg/ml)	凝乳时间
				QA	0.382	0.189	35min凝乳
QB	0.106	0.031	4h内未凝乳
				QC	0.425	0.155	50min凝乳
QD	0.129	0.072	4h内未凝乳

经弱阴离子交换树脂吸附洗脱后收集的QA,QB,QC,QD各组分通过SDS-PAGE电泳分析得到如图4所示结果，结果表明，青羊参蛋白酶大部分集中在QA和QC两组分中，这一结果和考马斯亮蓝法测定各组分蛋白含量得到的结果一致。另外从SDS-PAGE电泳图还可得出，QA中的蛋白酶分子量集中在14.3kD左右，经分析得到其分子量为14.1kD；QC中的蛋白酶分子量集中在27.0kD左右，经分析得到其分子量为26.9kD。这一结果说明弱阴离子交换柱能有效分离纯化青羊参蛋白酶得到两种分子量不同且均具有凝乳活性的的蛋白酶。

实施例2蛋白酶QA和QC的基本性质

凝乳活力和水解活力是凝乳酶应用中非常重要的特性，目前已研究的许多植物蛋白酶表现的凝乳活力都被认为可做为凝乳酶的替代品用于干酪生产制作。但是植物凝乳酶通常表现出较高的水解活力，对酪蛋白水解过度，这也是导致干酪成熟过程中产生苦味的原因。因此，发明人分析比较了青羊参蛋白酶QA、QC、小牛皱胃酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶的凝乳活力与水解活力，结果如表5所示。从表中可得出，虽然青羊参蛋白酶QA、QC的水解活力均显著高于菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶(p<0.05)，但是QA、QC的凝乳活力也均显著高于菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶(p<0.05)。由表5可计算出，青羊参蛋白酶QA凝乳活力与水解活力的比值为37.37，青羊参蛋白酶QC凝乳活力与水解活力的比值为36.14。

表5青羊参蛋白酶及其他蛋白酶的凝乳活力与水解活力

注：同列不同行中不同上标字母表示具有显著性差异(p<0.05)。

通常采用凝乳活力与水解活力的比值是来评价凝乳酶是否可以适合应用于干酪生产制作，一般情况下凝乳活力与水解活力的比值越高表征该酶越适合用于制作干酪。虽然青羊参蛋白酶QA和QC的水解活力显著高于菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解活力(p<0.05)，但是青羊参蛋白酶QA和QC的凝乳活力与水解活力的比值与其他植物凝乳酶的凝乳活力与水解活力的比值相比具有明显优势，其结果如表6所示。从表中可得出，从大翅蓟、刺菜蓟、钉头果、凤梨科属等植物中获得的凝乳酶的凝乳活力/水解活力的值均小于10.0，其中马利筋属钉头果凝乳酶的凝乳活力与水解活力的比值仅为0.68，这都远远低于青羊参蛋白酶QA和QC的凝乳活力与水解活力的比值(分别为37.37和36.14)。由此，表明青羊参蛋白酶QA和QC更加适合用于制作干酪。

表6其他植物凝乳酶的凝乳活力与水解活力

植物凝乳酶种类	凝乳活力(U/mL)	水解活力(SU/mL)	凝乳活力/水解活力
				Onopordum acanthium	0.546±0.004	0.019±0.002	9.58
Cynara cardunculus	103.6±4.1	16.4±1.3	5.34
				Asclepias fruticosa	0.7±0.02	1.03±0.06	0.68
Bromelia balansae	6.85±0.3	1.32±0.03	5.19
				Bromelia hieronymi	10.0±0.005	2.39±0.04	4.18
Philibertia gilliesii	16.0±0.003	3.32±0.03	4.82

对分离纯化后的青羊参蛋白酶进行胶条鉴定，NCBI和Uniprot两个数据库得到的结果一致，如表7所示。目前尚未有报道研究青羊参蛋白酶，因此对其进行蛋白质鉴定有助于对其酶学性质的初步了解。从表7中可知蛋白质得分显著高于可接受得分阈值(65分)，因此可得出青羊参蛋白酶QA被鉴定为马利筋属的萝藦蛋白酶，青羊参蛋白酶QC被鉴定为牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B。

表7青羊参蛋白酶QA和QC的质谱鉴定结果

注：^aNCBI数据库中的登录号；^b从NCBI数据库中获得的蛋白质名字；^c从NCBI数据库中获得的蛋白的物种来源；^d蛋白质的分子量搜索得分；^e被鉴定蛋白质的序列覆盖率；^f从Uniprot中得到的理论分子量。

实施例3酶学性质—水解活力的影响

1、pH值

体系中pH值的变化会影响酶活性中心可解离基团的解离，进而影响酶活。青羊参蛋白酶QA和QC的酪蛋白水解活力随pH的变化曲线具有一定相似性，但水解活力达到最大值时QA和QC所对应的pH不一样，分别为7.0和6.5(图5)。

由图5a可得出，当pH小于7.0时，QA对酪蛋白的水解活力逐渐增强；当pH大于7.0时，QA对酪蛋白的水解活力逐渐减弱；在整个pH变化过程中，QA的酪蛋白水解活力始终高于最大水解活力的40％，这一结果在弱酸性、中性、弱碱性条件下QA都有酪蛋白水解活力。

由图5b可得出，当pH小于6.5时，QC对酪蛋白的水解活力逐渐增强；当pH大于6.5时，QC对酪蛋白的水解活力逐渐减弱；在整个pH变化过程中，QC的酪蛋白水解活力始终高于最大水解活力的80％，这一结果说明在弱酸性、中性、弱碱性条件下QC都有水解活力。结果表明，青羊参蛋白酶QA和QC水解作用pH宽泛。

2、温度

温度对青羊参蛋白酶QA和QC酪蛋白水解活力的影响分别如图6a和6b所示。青羊参蛋白酶QA和QC分别在65℃和60℃达到最佳水解活力，但是在温度由40℃升至70℃过程中，青羊参蛋白酶QA和QC均表现出较高的酪蛋白水解活力，这一现象说明青羊参蛋白酶QA和QC作用温度比较宽泛并且青羊参蛋白酶具有较高的耐热性。但是当温度过高(高于70℃)时，青羊参蛋白酶QA和QC的酪蛋白水解活力仍然会快速下降，这可能是因为温度过高会导致青羊参蛋白酶发生热变性进而导致酶失活。

3、蛋白酶抑制剂

不同种类蛋白酶抑制剂对青羊参蛋白酶QA和QC酪蛋白水解活力的影响分别如图7a和7b所示，青羊参蛋白酶QA和QC呈现相似的结果。与对照组相比，EDTA和胃酶抑素A的存在并不会显著影响青羊参蛋白酶QA和QC对酪蛋白的水解活力(p>0.05)，这一结果说明青羊参蛋白酶QA和QC不属于金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。同时，观察到与对照组相比，加入苯甲基磺酰氟后青羊参蛋白酶QA和QC对酪蛋白的水解活力均显著减弱，损失15％左右(p<0.05)，这一结果说明青羊参蛋白酶中含有丝氨酸蛋白酶活性中心。与此同时还观察到，加入E-64后的青羊参蛋白酶QA和QC对酪蛋白的水解活力仅为对照组的20％，E-64是典型的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，因此说明青羊参蛋白酶QA和QC水解活力显著受半胱氨酸蛋白酶抑制剂影响(p<0.05)。综合不同种类蛋白酶抑制剂对青羊参蛋白酶水解活力的影响可知，青羊参蛋白酶同时存在丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性中心。

实施例4酶学性质—凝乳活力

1、pH

从图8可得出，青羊参蛋白酶QA和QC凝乳作用的pH较宽泛，在pH5.5至8.5变化过程中均能观察到青羊参蛋白酶QA和QC使脱脂还原乳形成凝块。从图8a可以看出，青羊参蛋白酶QA的凝乳活力在pH 5.5至7.5时无显著变化；当pH大于7.5时，凝乳活力显著下降，当pH为8.5时青羊参蛋白酶QA的凝乳活力仅为最大凝乳活力的30％，说明碱性条件能显著降低青羊参蛋白酶QA的凝乳活力(p<0.05)。从图8b可以看出，青羊参蛋白酶QC随pH变化曲线与青羊参蛋白酶QA随pH变化曲线一致，也表现出在碱性条件下凝乳活力显著下降，当pH为8.5时凝乳活力仅为最大凝乳活力的30％。乳pH的增加会导致凝乳活力逐渐下降，观察到在碱性条件下凝乳时间增加，这是由于pH对凝乳反应的酶解和聚集阶段均有影响，但是主要影响的是酪蛋白聚集阶段，pH过高破坏酪蛋白聚集形成凝乳。这也是青羊参蛋白酶QA和QC在碱性条件下凝乳活力显著下降的原因。

2、温度

如图9所示，温度对青羊参蛋白酶QA和QC的凝乳活力具有显著影响。从图9a中可以得出，当温度低于70℃时青羊参蛋白酶QA的凝乳活力逐渐增加，在70℃时达到凝乳活力最大值，温度为75℃和80℃时，仍具有较高的凝乳活力(为最大凝乳活力的80％左右)。但是当温度达到85℃时，实验过程中未观察到脱脂还原乳形成凝块，这一结果说明温度高于80℃时青羊参蛋白酶QA完全丧失凝乳活力。从图9b中可以得出，当温度低于65℃时青羊参蛋白酶QC的凝乳活力逐渐增加，在65℃时达到凝乳活力最大值，但与青羊参蛋白酶QA不同的是当温度高于65℃时青羊参蛋白酶QC的凝乳活力快速下降，仅为最大凝乳活力的20％，这一结果说明青羊参蛋白酶QC的耐热性较青羊参蛋白酶QA差。温度过高可能会引起酪蛋白胶束酸化、磷酸钙沉淀、胶束解聚或亚胶束之间形成凝胶，会使β-乳球蛋白变性并与κ-酪蛋白结合，可能形成酪蛋白-乳清蛋白凝胶，可与酶作用的底物浓度减少，因此可能导致凝乳时间增加。

3、金属离子

在酶反应过程中，部分金属离子可作为辅助因子参与反应影响酶活性。另外，向乳中添加盐使其离子强度增加，破坏酪蛋白胶束的稳定性，进而影响凝乳的发生。pH6.5 12％(w/v)脱脂还原乳(含10mmol/L CaCl₂)中分别添加10mmol/L的不同金属离子后测得的青羊参蛋白酶QA和QC的凝乳活力如图10所示，可得出添加不同金属离子对青羊参蛋白酶QA和QC凝乳活力的影响是一致的。从图10可得出，往脱脂还原乳中添加锂离子、钠离子、钾离子、镁离子和钡离子对青羊参蛋白酶QA和QC的凝乳活力无显著影响(p>0.05)；添加铜离子和锌离子则能显著抑制青羊参蛋白酶QA和QC的凝乳活力(p<0.05)；但是与铜离子和锌离子作用相反的是，添加钙离子和铝离子能显著增强青羊参蛋白酶QA和QC的凝乳活力(p<0.05)。钙离子能促进凝乳酶而减少凝乳时间的原因是在凝乳反应的第二阶段即酪蛋白发生聚集过程中，钙离子能与暴露的α-酪蛋白、β-酪蛋白结合从而促进凝乳发生。另外还有研究表明钙离子对酶具有保护作用尤其是耐热性差的酶类，能稳定酶的结构，因此在干酪生产中常常添加一定量的CaCl₂来保护酶结构，从而增加酶活性加快凝乳速度。

实施例5

用pH6.5 10mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液配制浓度为5mg/mL的κ-酪蛋白溶液，随后按照体积比1:10分别加入青羊参蛋白酶QA和QC，混匀于60℃反应1h，然后加入上样缓冲液终止反应，漩涡混匀后在沸水浴中处理5min，冷却离心后用于Urea SDS-PAGE凝胶电泳分离，染色后得到的目标条带切下用胰蛋白酶酶解，得到的酶解液冷冻干燥后用于Orbitrap分析。获得主要肽段序列信息如表8所示。

胰蛋白酶胶内酶切得到的产物经Orbitrap/MS分析其肽段氨基酸序列，得出青羊参蛋白酶QA水解产物与κ-酪蛋白氨基酸序列相匹配的肽段有八个，序列覆盖率为73.68％，肽段分子量搜索得分为729.38；青羊参蛋白酶QC水解产物与κ-酪蛋白氨基酸序列相匹配的肽段有七个，序列覆盖率为66.84％，肽段分子量搜索得分为988.79。覆盖率和肽段分子量搜索得分结果说明青羊参蛋白酶水解产物与κ-酪蛋白的匹配程度显著(p<0.05)，表明这些水解产物都是κ-酪蛋白N-端的肽段。由表8的肽段氨基酸序列可得出，青羊参蛋白酶QA和QC水解κ-酪蛋白主要生成一条分子量较大的肽段。

具体结果为：青羊参蛋白酶QA将κ-酪蛋白水解成两个肽段：κ-酪蛋白(1-132)，分子量为15139.72Da；κ-酪蛋白(133-169)，分子量为3840.89Da。青羊参蛋白酶QC将κ-酪蛋白水解成三个肽段：κ-酪蛋白(1-14)，分子量为1743.78Da；κ-酪蛋白(15-132)，分子量为13413.94Da；κ-酪蛋白(133-169)，分子量为3840.89Da。因此，根据肽段重叠以及排除胰酶酶切位点可得出：青羊参蛋白酶QA可水解κ-酪蛋白上Ser132-Thr133的肽键，青羊参蛋白酶QC可水解κ-酪蛋白上Asp14-Glu15和Ser132-Thr133的肽键。

表8κ-酪蛋白水解产物的胶内酶解肽段氨基酸序列鉴定

gi|162811κ-casein precursor(Bos Taurus)；Mass:21255.89Da.

¹[M+H]⁺代表分子离子的质量和所带电荷数

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种凝乳剂，其特征在于，含有：马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的至少之一。

2.根据权利要求1所述的凝乳剂，其特征在于，所述马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B来源于青羊参，优选青羊参叶。

3.根据权利要求1所述的凝乳剂，其特征在于，进一步含有：含钙化合物和含铝化合物的至少之一。

4.根据权利要求1所述的凝乳剂，其特征在于，所述凝乳剂的作用温度为40～70℃，作用pH值为5.5～8.0。

5.根据权利要求1所述的凝乳剂，其特征在于，所述马利筋属的萝藦蛋白酶能够水解κ-酪蛋白上Ser132-Thr133的肽键，

任选地，所述牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B能够水解κ-酪蛋白上Asp14-Glu15和Ser132-Thr133的肽键。

6.一种获得马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B的方法，其特征在于，包括：

将青羊参叶子浸泡于缓冲液中，收集提取液；以及

将所述提取液进行纯化，以便获得所述马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B，

其中，所述马利筋属的萝藦蛋白酶和牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B是如权利要求1～5任一项所述凝乳剂所限定的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为柠檬酸-磷酸缓冲液；

任选地，所述柠檬酸-磷酸缓冲液浓度为10mmol/L；

任选地，所述青羊参叶子与缓冲液的质量体积比为1：(10～30)，优选1:20；

任选地，所述浸泡是在4～25℃下进行30～50分钟，优选是在4℃下进行40分钟。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纯化包括：

将所述提取液进行超滤浓缩，得到浓缩液；以及

利用层析柱对所述浓缩液进行洗脱，以便得到所述青羊参蛋白酶，

其中，所述洗脱包括：

1)将所述浓缩液加入所述层析柱中，收集流出液，以便获得所述马利筋属的萝藦蛋白酶；

2)向步骤1)所得到的层析柱中加入柠檬酸-磷酸盐缓冲液，释放流出液；以及

3)向步骤2)所得到的层析柱中加入含有0.6mmol/L NaCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，收集流出液，以便获得所述牛角瓜属的半胱氨酸蛋白酶B，

任选地，所述超滤浓缩是采用10.0kD的超滤管进行的。

9.一种制备干酪的方法，其特征在于，包括：

将干酪基料与权利要求1～5任一项所述凝乳剂进行混合处理以及静置处理，以便得到所述干酪。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步包括：

调节所述混合处理所得到的混合液的pH值至5.5～8.0；

所述静置处理是在40～70℃下进行40分钟～1.5小时。