CN103492408A - 使用包含cmp或酪蛋白种类的给料来分离骨桥蛋白的方法 - Google Patents
使用包含cmp或酪蛋白种类的给料来分离骨桥蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103492408A CN103492408A CN201280015495.4A CN201280015495A CN103492408A CN 103492408 A CN103492408 A CN 103492408A CN 201280015495 A CN201280015495 A CN 201280015495A CN 103492408 A CN103492408 A CN 103492408A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- source feed
- protein
- breast
- scope
- breast source
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 title claims abstract description 147
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 title claims abstract description 147
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 105
- 239000005018 casein Substances 0.000 title description 29
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 29
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 title description 29
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 239000005862 Whey Substances 0.000 claims abstract description 38
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 196
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 149
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 149
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 149
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 73
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 claims description 23
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 15
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 claims description 13
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 12
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 11
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 claims description 8
- 150000001768 cations Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 8
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 5
- 229940071162 caseinate Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- 101000961187 Anacardium occidentale 11S globulin seed storage protein Ana o 2.0101 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001018382 Homo sapiens Cartilage matrix protein Proteins 0.000 claims description 3
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 abstract description 21
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 abstract description 21
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 abstract description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 abstract description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 abstract description 8
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 abstract description 6
- 108010067454 caseinomacropeptide Proteins 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 14
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 3
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 2
- -1 phosphoric acid salt Chemical class 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 2
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFYULHRIYLAUJM-UHFFFAOYSA-N 3,4-diiodobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(I)C(I)=C1 DFYULHRIYLAUJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100033668 Cartilage matrix protein Human genes 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical group COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000009911 Urinary Calculi Diseases 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004832 casein glue Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000023247 mammary gland development Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000697 sensory organ Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000020202 standardised milk Nutrition 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 235000008939 whole milk Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/20—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于从包含酪蛋白巨肽和/或游离β酪蛋白的乳源给料（例如，像基于乳血清或甜乳清的一种给料）中分离骨桥蛋白的方法。具体来说，本方法涉及使用该乳源给料的一个窄窗位的pH和比电导，这已经出乎意料地被证明实现了从化学上复杂的给料中非常有效地分离骨桥蛋白。
Description
发明领域
本发明涉及一种用于从一种乳源给料（例如，基于乳血清（milk serum）或甜乳清的一种给料）中分离骨桥蛋白的方法。具体来说，本方法涉及使用该乳源给料的一个窄窗位的pH和比电导，这已经出乎意料地被证明实现了从化学上复杂的给料中非常有效地分离骨桥蛋白。
发明背景
骨桥蛋白是一种酸性的、高度磷酸化的、唾液酸丰富的、钙结合蛋白。骨桥蛋白含有约28摩尔结合磷酸盐/摩尔骨桥蛋白，并且结合约50摩尔钙/摩尔骨桥蛋白。
骨桥蛋白（OPN）是在许多生物过程中涉及的一种多功能生物活性蛋白，这些生物过程如骨重塑、异位钙化抑制、以及细胞粘附与迁移、还有若干免疫功能。骨桥蛋白具有细胞因子样特性并且是启动T辅助1型免疫应答的一个关键因素。骨桥蛋白存在于大多数组织和体液中，并且发现在乳中浓度最高。
为了支持在异位钙化中OPN的抑制功能，使用了OPN缺陷小鼠的体内模型在外源性添加这种蛋白质时显示出钙化减弱。此外，在泌尿道防御肾结石的形成中涉及OPN，因为OPN可以抑制一水草酸钙晶体的生长和聚集。
目前尚不清楚乳中OPN的生物学作用；然而，可以推测若干功能。已经报道在乳腺发育和分化中涉及骨桥蛋白，并且已经在泌乳早期在乳腺中观察到高水平的OPN表达。此外，该蛋白质的高阴离子性质可以使得OPN能够与钙离子形成可溶性络合物，并且从而抑制乳中无意的钙结晶和沉淀。
在科学文献中，骨桥蛋白典型地是从骨或乳中纯化出的，并且该蛋白质典型地以20mg/L的浓度存在于牛乳中。在乳中，骨桥蛋白是一种血清蛋白，但取决于Ca2+的水平还可能在一定程度上与酪蛋白胶束缔合。酸乳清是用于骨桥蛋白的工业生产的优选原材料。当酸乳清形成时，骨桥蛋白被认为在Ca2+泄漏进入血清相时离开酪蛋白胶束。此方面使酸乳清成为骨桥蛋白的一个直接来源。由于相同的原因，甜乳清具有稍低的骨桥蛋白质含量。此外，甜乳清含有来自κ-酪蛋白（kappa-casein）的酶裂解的酪蛋白巨肽（CMP）。CMP与骨桥蛋白在生化方面具有许多相似之处-都是小的、柔性的、酸性的、磷酸化的糖蛋白。由于此原因，CMP和骨桥蛋白被认为在其结合离子交换树脂方面相当类似，这将在从含CMP的原材料中纯化骨桥蛋白中造成问题。另一方面是由用于奶酪制作的蛋白水解酶所引起的骨桥蛋白的可能降解。无论是对于工业生产还是对于科学研究，这三个方面可能已导致避免使用这种原材料来纯化骨桥蛋白。
现有技术
WO02/28413A1描述了一种借助于低pH阴离子交换来从给料（如乳和酸乳清）中生产含骨桥蛋白的组合物的方法。在WO02/28413A1中，强调了无论是工艺给料还是所得的产品都不可能含有cGMP，cGMP是已知结合阴离子交换剂并且将抑制骨桥蛋白的结合的一种类型的CMP。
WO01/149741A2描述了一种方法，其中通过以下方式从一种乳材料中纯化出骨桥蛋白：将该乳材料与可溶性钙混合并调节该混合物的pH，以便选择性地沉淀乳清的其他蛋白质组分同时保留溶液中的骨桥蛋白。
发明简述
本发明人已经发现，出乎意料地并且与在现有技术中发现的偏见相反，可以通过阴离子交换从多种复杂的乳源给料中以高产量和高纯度分离出骨桥蛋白，尽管给料存在多种竞争蛋白。本发明人已经发现，给料的比电导对于骨桥蛋白的产量和纯度特别重要，并且已经确定了用于从乳源给料中分离骨桥蛋白的最佳比电导窗位。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
本发明可以例如涉及一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含
-相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的酪蛋白巨肽，或
-游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
因此，在本发明的一些优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的酪蛋白巨肽，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
在本发明的其他优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
在本发明的另外的优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含
-相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的酪蛋白巨肽，以及
-游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
除了上面所提到的优点外，本方法允许更具成本效益地使用该阴离子交换介质，并且允许每kg阴离子交换介质骨桥蛋白的更高产量。
本方法的另一优点是如实例5中所展示的每个阴离子交换周期提高的骨桥蛋白产量。
水溶液的“比电导”（有时被称为“比电导率”）是该溶液导电能力的一个量度。该比电导可以（例如）通过测量该溶液在两个电极之间的AC电阻来确定，并且典型地以单位毫西门子每厘米（mS/cm）来给出结果。比电导的测量可以例如根据EPA（美国环境保护署）方法第120.1号进行测量。
本发明的又一方面涉及通过本方法获得的含骨桥蛋白的组合物。
本发明的再一方面因此涉及一种含骨桥蛋白的组合物。
附图简述
图1.在5.5mS/cm的比电导下甜乳清源给料的pH对骨桥蛋白的纯度和产量的影响，
图2.在pH4.3下甜乳清源给料的比电导对骨桥蛋白的纯度和产量的影响，以及
图3.在pH4.3下酸乳清源给料的比电导对OPN的纯度和产量的影响。
发明详细说明
如所提到的，本发明的一个方面涉及一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且
其中所述乳源给料进一步包含
-相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的酪蛋白巨肽，或
-游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
典型地按顺序执行该方法的这些步骤，例如，步骤a)、b)、c)、以及d)。然而，在本发明的一些实施例中，该方法的步骤c)被省略，并且在这种情况下，该方法包括步骤a)、b)、以及d)。
在本发明的背景中，术语“分离骨桥蛋白”涉及相对于在步骤d)过程中从阴离子交换介质中回收的蛋白质的总重量而言重量百分比为至少70%（w/w）、优选为至少80%（w/w）、并且甚至更优选为至少90%（w/w）的骨桥蛋白富集。分离骨桥蛋白可能例如涉及相对于在步骤d)过程中从阴离子交换介质中回收的蛋白质的总重量而言重量百分比为至少95%（w/w），如至少97%（w/w）的骨桥蛋白富集。
该方法对于改进从包含等电点（pI）小于5.0的额外蛋白质的乳源给料（例如，含有CMP的乳源给料）中选择性富集骨桥蛋白特别有用。术语“选择性富集”应被理解为提高该乳源给料的骨桥蛋白与其他蛋白质的总量之间的摩尔比。
蛋白质的等电点优选通过在25℃下进行等电聚焦来确定。
在本发明的背景中，术语“乳源给料”涉及接触阴离子交换介质的液体给料。
该乳源给料是源于来自一种或多种哺乳动物源的乳，如来自人、牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、美洲驼、马和/或鹿的乳。在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料是源于牛乳。
在本发明的背景中，术语“乳源给料”、“甜乳清源给料”、“酸乳清源给料”、以及“乳血清源给料”涉及其中至少总蛋白质的50%（w/w）分别来源于乳、甜乳清、酸乳清或乳血清的给料。在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料的总蛋白质的至少90%（w/w）、并且优选地基本上全部来源于乳、甜乳清、酸乳清或乳血清。
在本发明的背景中，术语“乳”涉及从处于泌乳期间的哺乳动物的乳腺获得的液体。术语“乳”应被广义地解释，并且涵盖生乳（即，直接从乳腺获得的液体）和标准化乳制品（例如像脱脂乳或全脂乳）两者，其中乳脂肪的浓度相对于最初的生乳已被降低。
乳清是一个集体术语，是指在从乳制造奶酪或酪蛋白的过程中产生的水样副产物。
在本发明的背景中，术语“甜乳清”涉及在基于凝乳酶的乳凝结过程中获得的乳清，该凝结过程例如发生在黄奶酪的生产过程中。
在本发明的背景中，术语“酸乳清”涉及在乳的化学或生物酸化过程中获得的乳清，该酸化过程例如发生在农家奶酪或夸克奶酪（quark）的生产过程、或在酪蛋白/酪蛋白酸盐的生产过程中。
在本发明的背景中，术语“乳血清”也被称为“血清乳清”、“原生乳清”或“抗乳血清”，它涉及已除去乳脂肪和酪蛋白胶束的乳。然而，乳血清典型地含有一些游离酪蛋白种类，这些游离酪蛋白种类在胶束被除去之前已经从这些原生酪蛋白胶束中离解。乳血清可以例如通过将一种脱脂乳微滤通过具有约0.1微米的孔径的过滤器或膜，并且收集所得的渗透物作为乳血清来生产。根据Evans等人可以生产乳血清。
如将理解的，可能已经使该乳、甜乳清、酸乳清或乳血清经受若干处理步骤来制备乳源给料。
乳或乳相关的产品的处理典型地涉及一个或多个热处理过程，如巴氏灭菌（例如，72℃下持续15秒）或高巴氏灭菌（例如，85℃下持续20秒）。
可替代地、或另外地，该处理可以涉及一个或多个过滤步骤。微滤可以被用来除去微生物，或可替代地来浓缩酪蛋白。超滤或纳滤可以（例如）被用来浓缩乳清蛋白或乳血清蛋白。
可替代地，或另外地，该处理可以涉及一个或多个离心步骤，例如，用于从脱脂乳中分离脂肪和/或从乳中分离微生物。
可替代地，或另外地，该处理可以涉及一个或多个蒸发步骤以用于除去水并且从而浓缩干物质，如蛋白质和/或矿物质。
该处理还可以包括一个或多个pH调节。酸化可以（例如）被用来使酪蛋白凝结并且当该处理涉及离子交换色谱法时pH调节更为重要。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含来自其他乳蛋白部分（如过滤的、热处理的乳清或α-乳清蛋白和/或β-乳球蛋白-贫化乳清）的生产的一种或多种工艺物流。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料包含一种乳血清源给料，或甚至基本上由其组成。该乳源给料可以例如是一种乳血清、并且优选的是一种乳血清蛋白浓缩物，例如，处于通过超滤乳血清获得的渗余物的形式。
该乳源给料中的骨桥蛋白的含量取决于特定的给料类型。在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.01%至20%（w/w）的范围内的骨桥蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.05%至5%（w/w）的范围内的骨桥蛋白。该乳源给料可能（例如）包含量在0.1%至2%（w/w）的范围内的骨桥蛋白。
可替代地，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.1%至1%（w/w）的范围内的骨桥蛋白。
在本发明的背景中，被陈述为“基本上由”一个或多个子组分或一个或多个活动“组成”的一种产品、组分、方法、或方法步骤由一个或多个所具体提到的子组分或一个或多个所具体提到的活动组成，但还可以包括实质上不影响本发明的一个或多个基本和新颖的特征的一个或多个额外的未命名的子组分或活动。
如上文所提到，本方法对于从复杂的给料，即含有干扰骨桥蛋白的分离的分子实体（如具有低于5.0的pI的蛋白质）的给料中分离骨桥蛋白特别有效。已经发现这类蛋白质与骨桥蛋白竞争阴离子交换介质的官能团。
具有小于5.0的pI的蛋白质的多个实例是α乳清蛋白、
蛋白胨-3、
蛋白胨-5、和
蛋白胨-8、以及酪蛋白衍生肽，如酪蛋白巨肽和/或酪蛋白磷酸肽。因此，该额外蛋白质可以包括来自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：α乳清蛋白、蛋白胨-3、
蛋白胨-5、和
蛋白胨-8、酪蛋白衍生肽、酪蛋白巨肽、酪蛋白磷酸肽、以及其组合。游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白是具有小于5.0的pI值的蛋白质的其他实例。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少0.1%（w/w）的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少0.5%（w/w）的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。
可替代地，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少2%（w/w）的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。如将理解的，具有小于5.0的pI的额外蛋白质不包括骨桥蛋白，但典型地包括具有特定范围内的pI的一种或多种其他蛋白质。
在本发明的其他实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.1%至50%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.5%至40%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在2%至25%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。
该乳源给料可能（例如）包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.1%至20%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.3%至15%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。可替代地，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.5%至10%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。
在本发明的进一步的实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在至少1%至50%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在10%至45%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。可替代地，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在15%至40%（w/w）的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，具有小于5.0的pI的额外蛋白质具有小于4.5的pI、并且优选小于4.0的pI。
在本发明的背景中，术语“蛋白质”涵盖多肽的大聚集体、单多肽链以及肽类，如二肽或三肽。在化学上，蛋白质是包含通过所谓的肽键连接的不同和/或相同的氨基酸的聚合物。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料进一步包含酪蛋白巨肽（CMP）。
在本发明的背景中，术语“CMP”或“酪蛋白巨肽”涉及当暴露于凝乳酶时从κ-酪蛋白中释放的一种小蛋白。CMP涵盖该蛋白质的糖基化变体和非糖基化变体两者。该蛋白质的糖基化变体有时被称为酪蛋白糖巨肽（cGMP）。
在本发明的其他优选实施例中，该乳源给料包含甜乳清源给料，或甚至基本上由其组成。该乳源给料可以例如是一种甜乳清、并且优选的是甜乳清蛋白浓缩物，例如，处于通过甜乳清的超滤获得的渗余物的形式。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料可以包含一种酸乳清源给料，或甚至基本上由其组成。该乳源给料可以例如是一种酸乳清、并且优选的是一种甜乳清蛋白浓缩物，例如，处于通过酸乳清的超滤获得的渗余物的形式。
在本发明的背景中，术语“乳血清蛋白浓缩物”、“甜乳清蛋白浓缩物”、或“酸性乳清蛋白浓缩物”涉及一种水性组合物，该水性组合物含有分别存在于原始乳血清、甜乳清、或酸乳清中的总蛋白质的至少80%（w/w），并且具有相对于该水性组合物的干重而言为至少25%（w/w）的总蛋白质含量。
然而，在本发明的其他实施例中，该乳源给料不是一种酸乳清源给料。
在本发明的优选实施例中，该乳源给料（例如，一种甜乳清源给料）包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的CMP。例如，该乳源给料（例如，一种甜乳清源给料）包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少5%（w/w）、优选为至少10%（w/w）、并且甚至更优选地相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至少15%（w/w）的CMP。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料（例如，一种甜乳清源给料）包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1%至40%（w/w）的范围内的CMP。例如，该乳源给料（例如，一种甜乳清源给料）可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在5%至35%（w/w）的范围内、优选地在10%至30%（w/w）的范围内、并且甚至更优选地在相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为15%至25%（w/w）的范围内的CMP。
本发明人已经观察到，出乎意料地，当给料是基于乳血清或其浓缩物时在本方法过程中形成了沉淀。这种沉淀在阴离子交换过程期间导致问题，并降低该阴离子交换过程的稳健性。
本发明人已经对该沉淀进行了研究并发现迹象表明该沉淀含有多个沉淀的酪蛋白种类，这些酪蛋白种类以溶解形式如游离β-酪蛋白或游离α-酪蛋白存在。
在本发明的背景中，术语“游离β-酪蛋白”或“游离α-酪蛋白”涉及未结合乳制品的原生酪蛋白胶束的β-酪蛋白分子或α-酪蛋白的分子。这类游离β-酪蛋白或游离α-酪蛋白包括β-酪蛋白或α-酪蛋白的溶解单分子或α-酪蛋白和/或β-酪蛋白的小聚集体。例如已知β-酪蛋白的单分子形成小的β-酪蛋白胶束，该胶束也是游离β-酪蛋白的一个实例。
因此，在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料进一步包含游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白典型地存在于乳血清源给料中。
本发明人已经发现，此沉淀问题可以通过在阴离子交换前从该乳源给料中除去该沉淀来解决。因此，在本发明的一些优选实施例中，该方法的步骤a)涉及从有待形成该乳源给料的酸化液体中除去沉淀。这种除去可能（例如）涉及对该酸化液体的离心或过滤。
该沉淀问题的另一种解决方案是使用该给料的其中沉淀被限制或甚至不存在，例如，在pH5.0-6.5的范围内的pH。
因此，该乳源给料可以具有在5.0-6.5的范围内、并且优选地在pH5.0-6.0的范围内的pH。
当在此pH范围内执行阴离子交换时，进一步建议使用高于15℃，如20℃至40℃的给料/过程温度。在此温度范围内，溶解的β-酪蛋白形成小的β-酪蛋白胶束，而不与乳的原生酪蛋白胶束混淆，并且这些β-酪蛋白胶束似乎比单一β-酪蛋白分子更少干扰阴离子交换过程。
因此，在步骤b)的过程中该乳源给料和阴离子交换材料的温度可以是在15℃至40℃的范围内、并且优选地在20℃至38℃的范围内。
该乳源给料可能（例如）包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为至少0.5%（w/w）的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为至少2%（w/w）的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。该乳源给料可能（例如）包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为至少10%（w/w）的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为在0.5%至40%（w/w）的范围内的量的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为在2%至20%（w/w）的范围内的量的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。该乳源给料可能（例如）包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为在5%至15%（w/w）的范围内的量的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的α-乳清蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少10%（w/w）、优选为至少20%（w/w）、并且甚至更优选相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至少30%（w/w）的α-乳清蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1%至50%（w/w）的范围内的α-乳清蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在5%至40%（w/w）的范围内、优选地在10%至35%（w/w）的范围内、并且甚至更优选地在相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为12%至30%（w/w）的范围内的α-乳清蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的β-乳球蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少15%（w/w）、优选为至少30%（w/w）、并且甚至更优选相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至少40%（w/w）的β-乳球蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1%至70%（w/w）的范围内的β-乳球蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在10%至65%（w/w）的范围内、优选地在20%至60%（w/w）的范围内、并且甚至更优选地在相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为35%至55%（w/w）的范围内的β-乳球蛋白。
已知酪蛋白在处于或低于约4.6的pH值下沉淀。因此，在本发明的一些实施例中，优选的是具有在约3.6-4.6的范围内的pH的乳源给料具有相对低浓度的酪蛋白，如相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至多1%（w/w）。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至多0.1%的酪蛋白（w/w）。甚至可能优选的是该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至多0.01%的酪蛋白（w/w）。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料包含总量在6-250g/L乳源给料的范围内的蛋白质。例如，该乳源给料可能包含总量在50-150g/L乳源给料的范围内的蛋白质。甚至可能优选的是该乳源给料包含总量在75-125g/L乳源给料的范围内的蛋白质。
可替代地，该乳源给料可能包含总量在50-250g/L乳源给料的范围内的蛋白质。例如，该乳源给料可能包含总量在50-150g/L乳源给料的范围内的蛋白质。甚至可能优选的是该乳源给料包含总量在75-150g/L乳源给料的范围内的蛋白质。
还可能优选的是该乳源给料可能包含总量在75-250g/L乳源给料的范围内的蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料包含总量为至少6g/L乳源给料的蛋白质。例如，该乳源给料可能包含总量为至少50g/L乳源给料的蛋白质。甚至可能优选的是该乳源给料包含总量为至少75g/L乳源给料的蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料具有在25℃下在pH3.8-6.0的范围内的pH。优选地，在25℃下的该乳源给料的pH在pH4.0-5.5的范围内。甚至更优选地，在25℃下该乳源给料的pH是在pH4.2-5.0的范围内，例如像pH4.3-4.5。
该乳源给料的所希望的比电导可以例如通过以下方式获得：
-通过部分除去水和/或添加盐来浓缩该乳源给料，这引起一个增大的比电导，或
-通过部分除去盐和/或添加水来使该乳源给料脱盐，这引起一个减小的比电导。
从水性液体中除去水和/或盐的技术是本领域中的技术人员所众所周知的。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料具有在25℃下4.5-9.0mS/cm的范围内的比电导。例如，该乳源给料的比电导可以是在25℃下5.0-8.0mS/cm的范围内。在本发明的一些优选实施例中，甚至可能更优选的是该乳源给料的比电导是在25℃下5.5-7.0mS/cm的范围内。
该乳源给料可能例如具有在25℃下4-7mS/cm的范围内的比电导。可替代地，该乳源给料可能具有在25℃下7-10mS/cm的范围内的比电导。可替代地，该乳源给料可能具有在25℃下5-8mS/cm的范围内的比电导。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料具有在25℃下4-7mS/cm的范围内的比电导以及在25℃下pH3.6-5.0的范围内的pH。
在本发明的其他优选实施例中，该乳源给料具有在25℃下7-10mS/cm的范围内的比电导以及在25℃下pH5.0-6.5的范围内的pH。
在本发明的进一步优选的实施例中，该乳源给料具有在25℃下5-8mS/cm的范围内的比电导以及在25℃下pH4.0-5.5的范围内的pH。
例如，该乳源给料可能具有在25℃下5-6mS/cm的范围内的比电导以及在25℃下pH4.2-5.0的范围内的pH。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料具有在3.6至6.5的范围内的pH，并且
-如果pH是在3.6-5.0的范围内，则比电导是
至少4mS/cm并且
至多比电导最大=1.38mS/cm*pH+1.03mS/cm，并且
-如果pH是在5-6.5的范围内，则比电导是
至少比电导最小=1.33mS/cm*pH-2.67mS/cm，并且
至多比电导最大=1.38mS/cm*pH+1.03mS/cm。
因此，如果这些实施例中的给料的pH是（例如）pH6.0，则比电导是
至少比电导最小=1.33mS/cm*6.0-2.67mS/cm=5.3mS/cm，并且
至多比电导最大=1.38mS/cm*6.0+1.03mS/cm=9.3mS/cm。
例如，该乳源给料可能具有在3.6至5.0的范围内的pH和以下比电导至少4mS/cm并且
至多比电导最大=1.38mS/cm*pH+1.03mS/cm。
可替代地，该乳源给料可能具有在5.0至6.5的范围内的pH和以下比电导
至少比电导最小=1.33mS/cm*pH-2.67mS/cm，并且
至多比电导最大=1.38mS/cm*pH+1.03mS/cm。
除非另有说明，否则比电导和pH值是在具有25℃的温度的给料中进行测量的。
在本发明的一些实施例中，阴离子交换介质包含一种固相和一种或多种阳离子基团。
优选地，该阳离子基团中的至少一些附接到该固相的表面上和/或附接到通过该固相的表面可接近的多个孔的表面上。
在本发明的一些实施例中，阴离子交换介质的固相包含选自下组的一种或多种组分，该组由以下各项组成：多个粒子、一种过滤器、以及一种膜。
该固相可以例如包含多糖，或甚至基本上由其组成。特别优选交联多糖。有用的多糖的实例是纤维素、琼脂糖，和/或葡聚糖。
可替代地，该固相可以包含一种非碳水化合物聚合物或甚至基本上由其组成。有用的非碳水化合物聚合物的实例是甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、和/或苯乙烯-二乙烯基苯。
在本发明的一些优选实施例中，这些阳离子基团包括氨基，或甚至基本上由其组成。叔氨基是特别优选的并且在适当的pH条件下生成季铵基。季铵基为阴离子交换介质提供了强阴离子交换特性。
可替代地，或另外地，这些阳离子基团可以包含一种或多种伯氨基或仲氨基。大量的伯氨基或仲氨基典型地为阴离子交换介质提供了弱阴离子交换特性。
每个周期的最佳蛋白加载取决于阴离子交换色谱法系统的设计和阴离子交换介质的特征。
在阴离子交换色谱法过程中的处理条件（包括压力、流速等）取决于实际的处理实施、所使用的设备以及所使用的阴离子交换介质。
在步骤b)过程中该乳源给料的温度典型地是低的足以避免微生物生长和蛋白质与阴离子交换介质的热损伤，但同时是高的足以提供一个可接受的粘度。
在本发明的一些实施例中，在步骤b)过程中该乳源给料的温度是在2℃至40℃的范围内。优选地，在步骤b)过程中该乳源给料的温度是在4℃至20℃的范围内，并且甚至更优选地在6℃至12℃的范围内。
有关阴离子交换色谱法及其工业实施的更多细节可以在斯科普斯（Scopes）中找到，其出于所有目的通过引用结合在此。
在本发明的一些优选实施例中，本发明的方法包括一个在使阴离子交换介质与乳源给料进行接触后用一种洗涤溶液洗涤该阴离子交换介质的步骤c)。有用的洗涤溶液是能够从该阴离子交换介质中除去松散结合的分子的典型地pH中性或弱酸性的水溶液。人们可以例如使用去矿物质的水或氯化钠的一种pH中性水溶液（例如，0.1M NaCl）作为洗涤液。
在本发明的其他优选实施例中，本发明的方法不包括步骤c)。
本发明的步骤d)涉及回收结合至阴离子交换介质的骨桥蛋白。该回收典型地通过使阴离子交换介质与一种洗脱剂进行接触并收集所得的洗脱液，即该洗脱剂加上从阴离子交换介质释放出的分子。
正常地，该洗脱剂是具有足以从阴离子交换介质释放结合的骨桥蛋白的离子强度和/或pH的一种水溶液。有用的洗脱液的实例是盐（如NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、或其组合）的pH中性的、1.0M的水溶液。
可以使回收的组合物经受另外的处理步骤（例如）以用于使该组合物去矿物质和浓缩，并随后将其转变成粉末。
因此，在本发明的一些优选实施例中，使该回收的组合物进一步经受选自下组的一个或多个处理步骤，该组由以下各项组成：浓缩、渗滤、蒸发溶剂、喷雾干燥、以及取代结合了蛋白质的阳离子。
例如，可以使该回收的组合物经受一个浓缩步骤。
可替代地，或另外地，可以使该回收的组合物经受一个渗滤步骤。
可替代地，或另外地，可以使该回收的组合物经受一个蒸发步骤。
可替代地，或另外地，可以使该回收的组合物经受一个喷雾干燥步骤。
在本发明的一个优选实施例中，可以使该回收的组合物经受以下步骤：
i)浓缩，例如，通过超滤，
ii)渗滤，例如，通过水，
iii)可任选地，另一浓缩步骤，例如，通过蒸发，
iv)阳离子置换，通过使步骤ii)或iii)的水性组合物与一种水溶性钙盐（例如，CaCl2）进行接触，
v)巴氏灭菌，并且
vi)喷雾干燥，以将该巴氏杀菌的组合物转化成粉末。
本方法可以作为分批方法亦或半分批方法来实施。该半分批方法可以例如通过以下方式来实施：操作一个第一阴离子交换柱和一个第二阴离子交换柱，并且在该第一阴离子交换柱上执行步骤b)，同时在该第二阴离子交换柱上执行步骤c)和/或d），并且反之亦然。
因此，在本发明的一些优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料是一种甜乳清蛋白浓缩物，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，
并且其中所述乳源给料进一步包含相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的酪蛋白巨肽，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
在本发明的其他优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳给料是一种乳血清蛋白浓缩物，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
本发明的又一方面涉及可通过在此描述的方法获得的一种含骨桥蛋白的组合物。
上文已经参考多个具体实施例对本发明进行了描述。然而，除上文描述的以外的其他实施例同样有可能在本发明的范围之内。除非另有说明，否则本发明的各种实施例和方面的不同特征和步骤可以按照除在此描述的这些以外的其他方式进行结合。
实例
实例1.从受控电导甜乳清浓缩物中富集骨桥蛋白
试验方案
下面的纯化实验是在装备有装在一个13.3mL（170mm×10mm）柱中的强阴离子交换树脂Q-琼脂糖大珠的快速蛋白液相色谱（FPLC）设备上进行的。在所有实验的整个加载、洗涤、以及洗脱过程中，将流量保持在3.33ml/min。原材料是一种甜乳清蛋白分离物，并且在每个实验过程中将70克的总蛋白质加载到该柱上。对原材料中的CMP的含量进行分析。将原材料的样品稀释到最终蛋白质浓度为10%w/v，此后通过分别添加HCl和NaCl对pH（pH3.0-5.7，在4.7mS/cm下）和比电导（2.3-10.3mS/cm，在pH4.3下）进行调节。通过3个床体积的100mM NaCl、pH5.0的溶液将未结合的蛋白质从柱中洗出。随后，通过使1M NaCl、pH5.0的溶液流动通过该柱来洗脱结合的蛋白质，直到洗脱液中检测不到蛋白质为止。
对于各洗脱液样品，使用以下技术对骨桥蛋白（OPN）、CMP、以及总蛋白质的含量进行分析。
总蛋白质的测定
通过如在科恩（Cohen）中所描述的标准凯式氮分解法（standardKjeldahl digestion）对洗脱液的总蛋白质含量进行测定。
通过HPLC方法对OPN进行定量
分析原理：
将样品通过0.22μm的过滤器过滤，并且使其经受HPLC，其中柱为MonoQHR5/5（1ml）（法玛西亚公司（Pharmacia））并且在280nm下进行检测。通过外标法（与已知OPN含量的标准品的峰面积进行比较）来计算样品的浓度。由于该方法的低特异性，因此对于此分析程序，一个先决条件是这些样品包含相对纯的OPN，例如，如通过SDS-PAGE（Laemmli，1970）所测定的。
试剂：OPN标准品、密理博（Milli Q）水（HPLC级）、NaCl（默克公司（Merck））、Tris HCl（西格玛公司（Sigma））
缓冲液A：10mM NaCl，20mM Tris HCL，pH8.0
缓冲液B：0.8M NaCl，20mM Tris HCl，pH8.0
标准的校准曲线是从缓冲液A中的OPN标准品的在1-10mg/ml的浓度范围内的5个标准品制成的。在加载到柱上之前，所有的标准品都通过0.22μm的过滤器进行过滤。
采样和预处理：
如果用于分析的样品在该标准曲线的范围之外的话，则用密理博水（HPLC级）将这些样品进行稀释。在一些情况下，如果存在太多的来自洗脱剂的NaCl，为了使得OPN能够结合至阴离子交换树脂，稀释也是必要的。注入相当于25μL的量的1-10mg/mL的OPN以用于分析。在注入至HPLC之前，将样品通过0.22μm的过滤器过滤。
HPLC条件：流量1ml/min，注入体积25μL，梯度：0-3min0%B，3-17min0-60%B，17-30min60%-100%B，30-33min100%B，33-34min100%-0%B，34-40min0%B。
结果的计算和表达：
每个样品中的OPN的浓度是通过参考标准曲线并通过观察所采用的稀释来计算的。
通过OPN与总蛋白质之间的比率，使用OPN特定琼斯系数7.17来计算纯度，这是因为在当前背景中通过凯氏氮分解法测定的大部分或全部蛋白是OPN。
通过HPLC对主要乳清蛋白进行定量
通过凝胶渗透色谱法对主要乳清蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、以及CMP（酪蛋白糖巨肽）进行分离和定量。
该凝胶渗透色谱法使用2个与附接的预柱PWxl（6mm×4cm）（Tosohass，日本）串联连接的TSKgel3000PWxl（7.8mm×30cm）柱来进行。
用于该系统的校准的标准溶液由以下项组成：溶解在500.0ml0.02M磷酸盐缓冲液7.5中的225mg CMP、225mgα-乳清蛋白以及50mgβ-乳球蛋白。
样品的预处理：将粉末样品以1mg/ml溶解于磷酸盐缓冲液中并且放置过夜以用于溶液化。可替代地，将液体样品用磷酸盐缓冲液进行稀释，以便获得约0.1%的蛋白质含量。如果蛋白质含量低于0.1%，则在未稀释的情况下测定该样品。在注入至柱之前，使所有的样品都通过0.22μm的过滤器过滤。
结果的计算和表达：
根据A×0.1×F来计算样品中单独蛋白质的百分比，其中
B
A=样品中所测得的面积
0.1=用于0.1%溶液的换算系数
F=稀释系数（100,000/样品重量（单位mg））
B=0.1%标准溶液中单独蛋白质的计算出的面积
结果
CMP的含量
该甜乳清原材料中的CMP的含量是20.1%，但出乎意料地在实例1的富集的OPN组合物中不能检测到CMP。
给料pH对骨桥蛋白的纯度和产量的影响：
图1中示出的伴随着改变所采用的给料的pH值的第一系列实验表明，OPN的产量（来自给料中的70g总蛋白质的mg OPN）随pH从pH3增大至约pH4.3而增加。当pH增加到超过pH4.3时高产量得到保持。所获得的OPN制剂中的OPN的纯度在低pH值下是非常高的，但当pH增大超过约pH4.5时，纯度缓慢下降但仍然是可接受的，直到达到约pH6.5。然而，高纯度OPN的最佳产量是在pH窗位pH3.8-5.5中，并且特别是在pH4.3-4.5的范围内获得的。
给料比电导对骨桥蛋白的纯度和产量的影响：
图2中示出了伴随着改变比电导的一系列实验的结果。在低比电导下，产量高而纯度低。随着比电导增大，纯度增大并且在约5.5mS/cm下达到100%。当比电导进一步增大时，纯度仍然很高，而当比电导超过约10mS/cm时，OPN的产量开始下降。然而，高纯度OPN的最佳产量似乎是在比电导范围4.5-9.0mS/cm内，并且特别是在5-8mS/cm的范围内获得的。
讨论/结论
pH的影响：
从图1可见，在低于约pH3.6的pH值下，OPN逐渐减少其电荷并且因此逐渐减少其与树脂的阳离子基团的结合。在高于约pH4.5的pH值下，由于给料的其他蛋白质变得带负电荷并且开始结合树脂，所以OPN的纯度开始降低。因此，我们已经确认了在pH3.6-6.5范围中的一个最佳pH值窗位以用于分离高纯度且高产量的OPN，即使给料含有大量的CMP。在得到的OPN制剂中，CMP是不能检测出的。
比电导的影响：
从图2可见，在低于约4mS/cm的比电导下，由于其他蛋白质可以结合树脂，所以OPN的纯度逐渐下降。在高于约6mS/cm的比电导下，OPN与树脂的结合变弱，并且产量缓慢下降但是可以接受，直到达到约10mS/cm的比电导。因此，我们已经确认了最佳用于OPN生产的从约4-10mS/cm的一个窄范围。在此窄范围内，OPN可以甚至从含有约20%的CMP的原材料中以高产量和高纯度进行分离。
已经进行了若干探索基于甜乳清的给料中所要求的pH/比电导窗位的另外的实验，并且这些另外的实验证实了上述结论。
实例2从受控电导酸乳清浓缩物中富集骨桥蛋白
以下的纯化实验是在与实例1类似的FPLC设备上进行的。然而，原材料是具有10%（w/w）的总蛋白质含量的酸乳清浓缩物，并且将约70g总蛋白质加载到柱上。
将浓缩的酸乳清稀释至不同程度，这产生了在从2.5至10mS/cm的范围内的比电导。通过实例1中所描述的方法对在给料和洗脱液中的OPN和总蛋白质进行测量。
通过添加HCl将pH调节至4.3，并且将原材料施加到阴离子交换柱上。通过3个床体积的0.1M NaCl将未结合的蛋白质从柱中洗出，并且随后通过使1M NaCl溶液流动通过该柱将结合的蛋白质进行洗脱，直到洗脱液中检测不到蛋白质为止。
在从浓缩的酸乳清中富集OPN的过程中比电导对OPN纯度和产量的影响示出于图3中。
图3中的数据示出了通过所描述的程序从酸乳清中富集OPN。与其中使用甜乳清作为原材料的实例1一样，再次观察到，给料中的低比电导增加了产品产量而牺牲了产品纯度。然而，由于酸乳清源给料不含有大量的CMP，因此对于OPN的富集的影响不如在给料是源于甜乳清的情况下那样有害。酸乳清源给料确实含有多种微量组分，这些微量组分的结合可以通过如为避免CMP的结合而采用的相同的参数设定来最小化。因此，可以观察到，在实例1中确认的OPN分离的窄最佳范围同样适用于从酸乳清中分离OPN。
我们已经进行了若干探索基于酸乳清的给料中所要求的pH/比电导窗位的另外的实验，并且这些另外的实验证实了上述发现。
实例3从受控电导乳血清浓缩物中富集骨桥蛋白
根据前面的实例，可以使用乳血清作为用于通过所披露的方法生产OPN的原材料。通过在24度下对脱脂乳进行微滤（过滤器孔径为约0.1微米）以便除去胶束酪蛋白来生产乳血清。其后，通过HCl将乳血清的样品调节至pH4.3或pH4.7，并且将乳血清的样品渗滤来获得在4-10mS/cm的范围内的比电导和约5%或10%（w/w）的总蛋白质含量。随后，如实例1所描述，在约5℃下通过阴离子交换从修饰的乳血清样品中富集OPN。
结果和观察
所进行的这些试验表明，源于乳血清的给料也可以用于本方法中。
出乎意料地，在该方法过程中观察到未确认的沉淀，该沉淀导致在一些阴离子交换周期后阴离子交换材料的堵塞或污染。该沉淀问题通过在阴离子交换前使酸化的乳血清通过滤纸过滤而得到解决。我们已经看到多个迹象表明该沉淀与溶解的酪蛋白种类，如在原生酪蛋白胶束被除去时留在乳血清中的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白有关。
讨论/结论
乳血清通过对脱脂乳进行微滤以便除去酪蛋白来生产，而甜乳清和酸乳清分别在凝乳酶或酸的作用下通过酪蛋白的沉淀而将酪蛋白耗尽。因此，所有三类乳源给料基本上没有胶束的酪蛋白，这些胶束的酪蛋白由于酪蛋白的沉淀和絮凝而将干扰阴离子交换色谱法程序。
我们已经看到多个迹象表明溶解的酪蛋白在阴离子交换过程中引起问题。这个问题可以通过在阴离子交换前使用（例如）微过滤器来过滤这些乳源给料而得以解决。
可替代地，阴离子交换步骤可以在其中沉淀被限制或甚至不存在的pH下进行，例如，在pH5.0-6.5的范围内进行。当在此pH范围内执行阴离子交换时，进一步建议使用高于15℃，如20℃至40℃的给料/过程温度。在此温度范围内，溶解的β-酪蛋白形成小的β-酪蛋白胶束，而不与原生酪蛋白胶束混淆，并且这些β-酪蛋白胶束比单一β-酪蛋白分子更少干扰阴离子交换过程。
实例4在无受控电导下从甜乳清浓缩物中富集骨桥蛋白
以下的纯化实验是在与实例1类似的FPLC设备上进行的。原材料是甜乳清分离物并且约1g的总蛋白质被加载到柱上。在加载到柱上之前，将该甜乳清通过超滤进行浓缩、在添加等体积的水后进行透滤、并且最后再次通过等体积的水进行稀释。得到的比电导为2.1mS/cm。CMP和总蛋白质通过实例1中所描述的方法在给料和洗脱液中进行测量。由于给料和洗脱液两者中的干扰蛋白质，不能测定OPN的量。表1中的OPN数据是根据实例1的实验中的已知产量估计而来的。
通过添加HCl将pH调节至4.3，并且将原材料施加到阴离子交换柱上。多种未结合的蛋白质通过3个床体积的水从柱中洗出，并且结合的蛋白质其后通过使1M NaCl溶液流动通过该柱而被洗脱，直到洗脱液中检测不到蛋白质为止。
表1.低电导甜乳清的阴离子交换的结果
| 原材料 | 洗脱液 | |
| 总蛋白质，mg | 979 | 192 |
| OPN，mg | 2.9 | 2.8 |
| OPN的纯度，% | 0.3 | 1.5 |
| GMP，mg | 193 | 186 |
| GMP纯度，% | 19.7 | 97 |
讨论/结论：
表1中的数据示出了通过所描述的程序进行的酸性乳清蛋白的富集。然而，OPN仅在较小程度上被富集，因为它构成给料中的酸性乳清蛋白的一小部分。由于（例如）CMP也结合树脂并以高浓度存在于给料中，这种蛋白质占用了树脂的大量的结合容量。因此，此程序对于OPN生产不是令人满意的。
实例5比较和结论（比较实例1与实例4）
在以下表2中对实例1和实例4中的方法的一些特性进行了比较。
表2.实例1和实例4的多个特性
| 实例1 | 实例4 | |
| pH | 4.3 | 4.3 |
| 比电导，mS/cm | 6.0 | 2.1 |
| 每ml树脂的蛋白加载，g/ml | 5.26 | 0.074 |
| 原材料中的蛋白质的估计OPN，% | 0.3 | 0.3 |
| OPN的成倍富集 | 333 | 5 |
| 洗脱液中OPN的纯度，% | 100 | 1.5 |
结论
如表2中所概述，相比实例4的方法，实例1的方法对富集OPN更具特异性。因此，使用实例1的方法，可以在每个周期中将多得多的蛋白质加载到柱上，并且每个周期的OPN产量要高得多。这种方法得到几乎纯的OPN，而在实例4的产品中CMP占主导。
参考文献
科恩（Cohen）朱利叶斯B·科恩，《实用有机化学》，1910（Julius B.Cohen，Practical Organic Chemistry，1910）
埃文斯（Evans）等人埃文斯（Evans）等人，“百分之三十四的乳清蛋白与乳血清蛋白浓缩物的组成、感官以及挥发性组分的比较”，《乳品科学杂志》.92:4773-4791，2009（“Comparison of composition，sensory，andvolatile components of thirty-four percent whey protein and milk serumprotein concentrates”，J.Dairy Sci.92:4773-4791，2009）
斯科普斯（Scopes）《蛋白质纯化：原理与实践》；罗伯特K·斯科普斯；第三版，纽约施普林格出版社，ISBN0-387-94072-3（Protein Purification:Principles and Practice;Robert K.Scopes;3rd edition，Springer Verlag NewYork，Inc.，ISBN0-387-94072-3）
WO02/28413A1
WO01/149741A2
WO99/33415A1
Claims (30)
1.一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含
-相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的酪蛋白巨肽，或
-游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该乳源给料进一步包含具有小于5.0的等电点（pI）的额外蛋白质。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该一种或多种额外蛋白质包含选自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：α-乳清蛋白、酪蛋白巨肽、酪蛋白磷酸肽、
蛋白胨-3、
蛋白胨-5、
蛋白胨-8、以及它们的混合物。
4.根据权利要求3或4所述的方法，其中该一种或多种额外蛋白质包括酪蛋白巨肽（CMP）。
5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含一种乳血清源给料、或甚至基本上由其组成。
6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含甜乳清源给料、或甚至基本上由其组成。
7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的CMP。
8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1%至40%（w/w）的范围内的CMP。
9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为至少0.5%（w/w）的游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该乳源给料具有在5.0-6.5范围内的pH，例如在pH5.0-6.0的范围内。
11.根据权利要求9所述的方法，其中该乳源给料具有在15℃-40℃范围内的温度，例如在20℃-38℃的范围内。
12.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中提供该乳源给料的步骤a)涉及从一种将形成该乳源给料的酸化液体中去除沉淀。
13.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的α-乳清蛋白。
14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1%至50%（w/w）的范围内的α-乳清蛋白。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%（w/w）的β-乳球蛋白。
16.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1%至70%（w/w）的范围内的β-乳球蛋白。
17.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料包含总量在6-250g/L乳源给料的范围内的蛋白质。
18.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料具有在25℃下pH3.8-5.5的范围内的pH。
19.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料具有在25℃下4.5-9.0mS/cm的范围内的比电导。
20.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料具有在25℃下4-7mS/cm的范围内的比电导。
21.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料具有在25℃下5-8mS/cm的范围内的比电导。
22.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳源给料具有在25℃下7-10mS/cm的范围内的比电导。
23.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该阴离子交换介质包含一种固相和一种或多种阳离子基团。
24.根据权利要求23所述的方法，其中该阴离子交换介质的该固相包含选自下组的一种或多种组分，该组由以下各项组成：多个粒子、一种过滤器、以及一种膜。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中该固相包含多糖、或甚至基本上由其组成。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中该固相包含交联多糖、或甚至基本上由其组成。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中该固相包含琼脂糖、或甚至基本上由其组成。
28.根据以上权利要求23-27中任一项所述的方法，其中这些阳离子基团包括氨基、或甚至基本上由其组成。
29.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该回收的组合物进一步经受选自下组的一个或多个处理步骤，该组由以下各项组成：浓缩、渗滤、蒸发溶剂、喷雾干燥、以及取代结合了蛋白质的阳离子。
30.通过以上权利要求中任一项所述的方法可获得的包含骨桥蛋白的组合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510434329.3A CN105085649B (zh) | 2011-03-03 | 2012-03-05 | 使用包含cmp或酪蛋白种类的给料分离骨桥蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161448775P | 2011-03-03 | 2011-03-03 | |
| EP11156826 | 2011-03-03 | ||
| EP11156826.7 | 2011-03-03 | ||
| US61/448,775 | 2011-03-03 | ||
| PCT/EP2012/053748 WO2012117119A1 (en) | 2011-03-03 | 2012-03-05 | Method for isolating osteopontin using feeds containing cmp or casein species |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510434329.3A Division CN105085649B (zh) | 2011-03-03 | 2012-03-05 | 使用包含cmp或酪蛋白种类的给料分离骨桥蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103492408A true CN103492408A (zh) | 2014-01-01 |
| CN103492408B CN103492408B (zh) | 2015-07-29 |
Family
ID=44202290
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510434329.3A Active CN105085649B (zh) | 2011-03-03 | 2012-03-05 | 使用包含cmp或酪蛋白种类的给料分离骨桥蛋白的方法 |
| CN201280015375.4A Active CN103476787B (zh) | 2011-03-03 | 2012-03-05 | 用于使用浓缩给料分离骨桥蛋白的方法 |
| CN201280015495.4A Active CN103492408B (zh) | 2011-03-03 | 2012-03-05 | 使用包含cmp或酪蛋白种类的给料来分离骨桥蛋白的方法 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510434329.3A Active CN105085649B (zh) | 2011-03-03 | 2012-03-05 | 使用包含cmp或酪蛋白种类的给料分离骨桥蛋白的方法 |
| CN201280015375.4A Active CN103476787B (zh) | 2011-03-03 | 2012-03-05 | 用于使用浓缩给料分离骨桥蛋白的方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9181325B2 (zh) |
| EP (2) | EP2681231B1 (zh) |
| JP (2) | JP5967665B2 (zh) |
| KR (2) | KR101940830B1 (zh) |
| CN (3) | CN105085649B (zh) |
| AR (2) | AR085620A1 (zh) |
| AU (2) | AU2012222313B2 (zh) |
| BR (2) | BR112013022251B1 (zh) |
| CA (2) | CA2828669C (zh) |
| DK (2) | DK2681231T3 (zh) |
| EA (2) | EA023367B1 (zh) |
| ES (2) | ES2565380T3 (zh) |
| HK (1) | HK1217961A1 (zh) |
| MX (2) | MX2013010019A (zh) |
| PL (2) | PL2681231T3 (zh) |
| WO (2) | WO2012117119A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113567573A (zh) * | 2021-07-09 | 2021-10-29 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 骨桥蛋白的分离方法和分析方法 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2702666A4 (en) * | 2011-04-28 | 2014-10-29 | Zoll Circulation Inc | VIRAL DISTRIBUTION OF BATTERY MANAGEMENT PARAMETERS |
| EP2830647A1 (en) | 2012-03-28 | 2015-02-04 | Arla Foods amba | Nanoparticle aggregates containing osteopontin and calcium- and/or strontium-containing particles |
| MX369925B (es) * | 2013-07-05 | 2019-11-25 | Arla Foods Amba | Osteopontina lactea de mamifero para mejorar la capacidad de respuesta inmunitaria. |
| US9661868B2 (en) * | 2013-07-16 | 2017-05-30 | Mead Johnson Nutrition Company | Expanded bed adsorption methods for isolation of basic milk proteins including lactoferrin |
| KR200482960Y1 (ko) | 2016-04-07 | 2017-03-21 | 오숙희 | 고주파 얼굴 축소 시술기 |
| KR20230037067A (ko) | 2016-07-06 | 2023-03-15 | 빌딩 블록 뉴트리셔널즈, 엘엘씨 | 영양 조제식 |
| US12109284B2 (en) | 2016-11-08 | 2024-10-08 | Dentherapy Ltd | Compositions comprising fluoride and calcium and method for preparing them |
| WO2019122363A1 (en) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Extracts and their use |
| CN109613140B (zh) * | 2019-01-07 | 2021-10-08 | 雅士利国际集团有限公司 | 食品中酪蛋白磷酸肽的检测方法 |
| IL299098A (en) | 2020-06-15 | 2023-02-01 | Building Block Nutritionals Llc | Nutritional formula |
| GB202010987D0 (en) | 2020-07-16 | 2020-09-02 | Dentherapy Ltd | Oral care compositions and methods |
| CN117377391A (zh) * | 2021-04-19 | 2024-01-09 | 雀巢产品有限公司 | 乳蛋白质级分作为骨桥蛋白源的用途 |
| GB202110114D0 (en) | 2021-07-14 | 2021-08-25 | Dentherapy Ltd | Oral care compositions for use in treaatment |
| WO2024056840A1 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | Univerza V Ljubljani | Isolation of osteopontin and glycomacropeptide from whey |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001049741A2 (en) * | 2000-01-07 | 2001-07-12 | Arla Foods Amba | A process for isolation of osteopontin from milk |
| WO2002028413A1 (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-11 | New Zealand Dairy Board | Bone health compositions derived from milk |
| US6555659B1 (en) * | 1996-10-01 | 2003-04-29 | John Stephen Ayers | Process for isolating glycomacropeptide from dairy products with a phenylalanine impurity of 0.5% w/w |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999033415A1 (en) | 1997-12-31 | 1999-07-08 | Depuy Orthopaedics, Inc. | Osteopontin-based compositions for enhancing bone repair |
| WO1999057134A1 (en) | 1998-05-06 | 1999-11-11 | Genentech, Inc. | Protein purification by ion exchange chromatography |
| AU777698B2 (en) * | 1999-12-08 | 2004-10-28 | Massey University | Process for separation of whey proteins using a novel anion exchanger |
-
2012
- 2012-03-05 EA EA201391203A patent/EA023367B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-03-05 DK DK12707103.3T patent/DK2681231T3/en active
- 2012-03-05 JP JP2013555900A patent/JP5967665B2/ja active Active
- 2012-03-05 MX MX2013010019A patent/MX2013010019A/es active IP Right Grant
- 2012-03-05 CA CA2828669A patent/CA2828669C/en active Active
- 2012-03-05 ES ES12707103.3T patent/ES2565380T3/es active Active
- 2012-03-05 BR BR112013022251-4A patent/BR112013022251B1/pt active IP Right Grant
- 2012-03-05 US US14/002,614 patent/US9181325B2/en active Active
- 2012-03-05 AU AU2012222313A patent/AU2012222313B2/en active Active
- 2012-03-05 CN CN201510434329.3A patent/CN105085649B/zh active Active
- 2012-03-05 KR KR1020137026175A patent/KR101940830B1/ko active IP Right Grant
- 2012-03-05 KR KR1020137026174A patent/KR101940829B1/ko active IP Right Grant
- 2012-03-05 BR BR112013022252-2A patent/BR112013022252B1/pt active IP Right Grant
- 2012-03-05 WO PCT/EP2012/053748 patent/WO2012117119A1/en active Application Filing
- 2012-03-05 CN CN201280015375.4A patent/CN103476787B/zh active Active
- 2012-03-05 PL PL12707103T patent/PL2681231T3/pl unknown
- 2012-03-05 WO PCT/EP2012/053749 patent/WO2012117120A1/en active Application Filing
- 2012-03-05 PL PL12706623T patent/PL2681230T3/pl unknown
- 2012-03-05 EP EP12707103.3A patent/EP2681231B1/en active Active
- 2012-03-05 MX MX2013010017A patent/MX2013010017A/es active IP Right Grant
- 2012-03-05 ES ES12706623.1T patent/ES2565379T3/es active Active
- 2012-03-05 CN CN201280015495.4A patent/CN103492408B/zh active Active
- 2012-03-05 DK DK12706623.1T patent/DK2681230T3/en active
- 2012-03-05 CA CA2828746A patent/CA2828746C/en active Active
- 2012-03-05 EA EA201391204A patent/EA023615B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-03-05 US US14/002,578 patent/US9181316B2/en active Active
- 2012-03-05 EP EP12706623.1A patent/EP2681230B1/en active Active
- 2012-03-05 JP JP2013555901A patent/JP6012053B2/ja active Active
- 2012-03-05 AU AU2012222312A patent/AU2012222312B2/en active Active
- 2012-03-06 AR ARP120100713A patent/AR085620A1/es active IP Right Grant
- 2012-03-06 AR ARP120100714A patent/AR088719A1/es active IP Right Grant
-
2016
- 2016-05-25 HK HK16105999.2A patent/HK1217961A1/zh unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6555659B1 (en) * | 1996-10-01 | 2003-04-29 | John Stephen Ayers | Process for isolating glycomacropeptide from dairy products with a phenylalanine impurity of 0.5% w/w |
| WO2001049741A2 (en) * | 2000-01-07 | 2001-07-12 | Arla Foods Amba | A process for isolation of osteopontin from milk |
| WO2002028413A1 (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-11 | New Zealand Dairy Board | Bone health compositions derived from milk |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 丛涛等: "酪蛋白源生物活性肽――酪蛋白巨肽研究进展", 《食品科技》, no. 02, 20 February 2008 (2008-02-20) * |
| 张智武等: "酪蛋白巨肽的特性及应用前景", 《中国乳品工业》, no. 02, 25 April 1997 (1997-04-25) * |
| 李海平等: "乳源糖巨肽的生物活性", 《中国乳品工业》, no. 05, 25 October 2002 (2002-10-25) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113567573A (zh) * | 2021-07-09 | 2021-10-29 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 骨桥蛋白的分离方法和分析方法 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103492408B (zh) | 使用包含cmp或酪蛋白种类的给料来分离骨桥蛋白的方法 | |
| AU2003218623B2 (en) | A process of isolating lactoferrin | |
| NZ614874B2 (en) | Method for isolating osteopontin using concentrated feeds | |
| NZ614872B2 (en) | Method for isolating osteopontin using feeds containing cmp or casein species |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |