CN105085649B - 使用包含cmp或酪蛋白种类的给料分离骨桥蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于从包含酪蛋白巨肽和/或游离β酪蛋白的乳源给料(例如，像基于乳血清或甜乳清的一种给料)中分离骨桥蛋白的方法。具体来说，本方法涉及使用该乳源给料的一个窄窗位的pH和比电导，这已经出乎意料地被证明实现了从化学上复杂的给料中非常有效地分离骨桥蛋白。
Description
本申请是申请号为“201280015495.4”，申请日为“2012年3月5日”，发明名称为“使用包含CMP或酪蛋白种类的给料来分离骨桥蛋白的方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用于从一种乳源给料(例如，基于乳血清(milk serum)或甜乳清的一种给料)中分离骨桥蛋白的方法。具体来说，本方法涉及使用该乳源给料的一个窄窗位的pH和比电导，这已经出乎意料地被证明实现了从化学上复杂的给料中非常有效地分离骨桥蛋白。
背景技术
骨桥蛋白是一种酸性的、高度磷酸化的、唾液酸丰富的、钙结合蛋白。骨桥蛋白含有约28摩尔结合磷酸盐/摩尔骨桥蛋白，并且结合约50摩尔钙/摩尔骨桥蛋白。
骨桥蛋白(OPN)是在许多生物过程中涉及的一种多功能生物活性蛋白，这些生物过程如骨重塑、异位钙化抑制、以及细胞粘附与迁移、还有若干免疫功能。骨桥蛋白具有细胞因子样特性并且是启动T辅助1型免疫应答的一个关键因素。骨桥蛋白存在于大多数组织和体液中，并且发现在乳中浓度最高。
为了支持在异位钙化中OPN的抑制功能，使用了OPN缺陷小鼠的体内模型在外源性添加这种蛋白质时显示出钙化减弱。此外，在泌尿道防御肾结石的形成中涉及OPN，因为OPN可以抑制一水草酸钙晶体的生长和聚集。
目前尚不清楚乳中OPN的生物学作用；然而，可以推测若干功能。已经报道在乳腺发育和分化中涉及骨桥蛋白，并且已经在泌乳早期在乳腺中观察到高水平的OPN表达。此外，该蛋白质的高阴离子性质可以使得OPN能够与钙离子形成可溶性络合物，并且从而抑制乳中无意的钙结晶和沉淀。
在科学文献中，骨桥蛋白典型地是从骨或乳中纯化出的，并且该蛋白质典型地以20mg/L的浓度存在于牛乳中。在乳中，骨桥蛋白是一种血清蛋白，但取决于Ca2+的水平还可能在一定程度上与酪蛋白胶束缔合。酸乳清是用于骨桥蛋白的工业生产的优选原材料。当酸乳清形成时，骨桥蛋白被认为在Ca2+泄漏进入血清相时离开酪蛋白胶束。此方面使酸乳清成为骨桥蛋白的一个直接来源。由于相同的原因，甜乳清具有稍低的骨桥蛋白质含量。此外，甜乳清含有来自κ-酪蛋白(kappa-casein)的酶裂解的酪蛋白巨肽(CMP)。CMP与骨桥蛋白在生化方面具有许多相似之处–都是小的、柔性的、酸性的、磷酸化的糖蛋白。由于此原因，CMP和骨桥蛋白被认为在其结合离子交换树脂方面相当类似，这将在从含CMP的原材料中纯化骨桥蛋白中造成问题。另一方面是由用于奶酪制作的蛋白水解酶所引起的骨桥蛋白的可能降解。无论是对于工业生产还是对于科学研究，这三个方面可能已导致避免使用这种原材料来纯化骨桥蛋白。
WO 02/28413A1描述了一种借助于低pH阴离子交换来从给料(如乳和酸乳清)中生产含骨桥蛋白的组合物的方法。在WO 02/28413A1中，强调了无论是工艺给料还是所得的产品都不可能含有cGMP，cGMP是已知结合阴离子交换剂并且将抑制骨桥蛋白的结合的一种类型的CMP。
WO 01/149741A2描述了一种方法，其中通过以下方式从一种乳材料中纯化出骨桥蛋白：将该乳材料与可溶性钙混合并调节该混合物的pH，以便选择性地沉淀乳清的其他蛋白质组分同时保留溶液中的骨桥蛋白。
发明内容
本发明人已经发现，出乎意料地并且与在现有技术中发现的偏见相反，可以通过阴离子交换从多种复杂的乳源给料中以高产量和高纯度分离出骨桥蛋白，尽管给料存在多种竞争蛋白。本发明人已经发现，给料的比电导对于骨桥蛋白的产量和纯度特别重要，并且已经确定了用于从乳源给料中分离骨桥蛋白的最佳比电导窗位。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
本发明可以例如涉及一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，
并且其中所述乳源给料进一步包含
-相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的酪蛋白巨肽，或
-游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
在一些实施方案中，该乳源给料还可包含具有小于5.0的等电点(pI)的额外蛋白质。优选地，该一种或多种额外蛋白质可包含选自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：α-乳清蛋白、酪蛋白巨肽、酪蛋白磷酸肽、蛋白胨-3、蛋白胨-5、蛋白胨-8以及它们的混合物。更优选地，该一种或多种额外蛋白质可包括酪蛋白巨肽(CMP)。
在一些实施方案中，该乳源给料可包含一种乳血清源给料、或甚至基本上由其组成。优选地，该乳源给料可包含甜乳清源给料、或甚至基本上由其组成。
在一些实施方案中，该乳源给料可包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的CMP。优选地，该乳源给料可包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1％至40％(w/w)的范围内的CMP。
在一些实施方案中，该乳源给料可包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为至少0.5％(w/w)的游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白。
在一些实施方案中，该乳源给料可具有在5.0-6.5范围内的pH，例如在pH 5.0-6.0的范围内。
在一些实施方案中，该乳源给料可具有在15℃-40℃范围内的温度，例如在20℃-38℃的范围内。
在一些实施方案中，所述方法中提供该乳源给料的步骤a)可涉及从一种将形成该乳源给料的酸化液体中去除沉淀。
在一些实施方案中，该乳源给料可包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的α-乳清蛋白。优选地，该乳源给料可包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1％至50％(w/w)的范围内的α-乳清蛋白。
在一些实施方案中，该乳源给料可包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的β-乳球蛋白。优选地，该乳源给料可包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1％至70％(w/w)的范围内的β-乳球蛋白。
在一些实施方案中，该乳源给料可包含总量在6-250g/L乳源给料的范围内的蛋白质。
在一些实施方案中，该乳源给料可具有在25℃下pH 3.8-5.5的范围内的pH。
在一些实施方案中，该乳源给料可具有在25℃下4.5-9.0mS/cm的范围内的比电导。
在一些实施方案中，该乳源给料可具有在25℃下4-7mS/cm的范围内的比电导。
在一些实施方案中，该乳源给料可具有在25℃下5-8mS/cm的范围内的比电导。
在一些实施方案中，该乳源给料可具有在25℃下7-10mS/cm的范围内的比电导。
在一些实施方案中，该阴离子交换介质可包含一种固相和一种或多种阳离子基团。
在一些实施方案中，该阴离子交换介质的该固相可包含选自下组的一种或多种组分，该组由以下各项组成：多个粒子、一种过滤器、以及一种膜。优选地，该固相可包含多糖、或甚至基本上由其组成。更优选地，该固相可包含交联多糖、或甚至基本上由其组成。最优选地，该固相可包含琼脂糖、或甚至基本上由其组成。
在一些实施方案中，所述阳离子基团可包括氨基、或甚至基本上由其组成。
在一些实施方案中，该回收的组合物还可经受选自下组的一个或多个处理步骤，该组由以下各项组成：浓缩、渗滤、蒸发溶剂、喷雾干燥、以及取代结合了蛋白质的阳离子。因此，在本发明的一些优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的酪蛋白巨肽，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
在本发明的其他优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
在本发明的另外的优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含
-相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的酪蛋白巨肽，以及
-游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
除了上面所提到的优点外，本方法允许更具成本效益地使用该阴离子交换介质，并且允许每kg阴离子交换介质骨桥蛋白的更高产量。
本方法的另一优点是如实例5中所展示的每个阴离子交换周期提高的骨桥蛋白产量。
水溶液的“比电导”(有时被称为“比电导率”)是该溶液导电能力的一个量度。该比电导可以(例如)通过测量该溶液在两个电极之间的AC电阻来确定，并且典型地以单位毫西门子每厘米(mS/cm)来给出结果。比电导的测量可以例如根据EPA(美国环境保护署)方法第120.1号进行测量。
本发明的又一方面涉及通过本方法获得的含骨桥蛋白的组合物。
本发明的再一方面因此涉及一种含骨桥蛋白的组合物。
附图说明
图1.在5.5mS/cm的比电导下甜乳清源给料的pH对骨桥蛋白的纯度和产量的影响，
图2.在pH 4.3下甜乳清源给料的比电导对骨桥蛋白的纯度和产量的影响，以及
图3.在pH 4.3下酸乳清源给料的比电导对OPN的纯度和产量的影响。
具体实施方式
如所提到的，本发明的一个方面涉及一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且
其中所述乳源给料进一步包含
-相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的酪蛋白巨肽，或
-游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
典型地按顺序执行该方法的这些步骤，例如,步骤a)、b)、c)、以及d)。然而，在本发明的一些实施例中，该方法的步骤c)被省略，并且在这种情况下，该方法包括步骤a)、b)、以及d)。
在本发明的背景中，术语“分离骨桥蛋白”涉及相对于在步骤d)过程中从阴离子交换介质中回收的蛋白质的总重量而言重量百分比为至少70％(w/w)、优选为至少80％(w/w)、并且甚至更优选为至少90％(w/w)的骨桥蛋白富集。分离骨桥蛋白可能例如涉及相对于在步骤d)过程中从阴离子交换介质中回收的蛋白质的总重量而言重量百分比为至少95％(w/w)，如至少97％(w/w)的骨桥蛋白富集。
该方法对于改进从包含等电点(pI)小于5.0的额外蛋白质的乳源给料(例如，含有CMP的乳源给料)中选择性富集骨桥蛋白特别有用。术语“选择性富集”应被理解为提高该乳源给料的骨桥蛋白与其他蛋白质的总量之间的摩尔比。
蛋白质的等电点优选通过在25℃下进行等电聚焦来确定。
在本发明的背景中，术语“乳源给料”涉及接触阴离子交换介质的液体给料。
该乳源给料是源于来自一种或多种哺乳动物源的乳，如来自人、牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、美洲驼、马和/或鹿的乳。在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料是源于牛乳。
在本发明的背景中，术语“乳源给料”、“甜乳清源给料”、“酸乳清源给料”、以及“乳血清源给料”涉及其中至少总蛋白质的50％(w/w)分别来源于乳、甜乳清、酸乳清或乳血清的给料。在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料的总蛋白质的至少90％(w/w)、并且优选地基本上全部来源于乳、甜乳清、酸乳清或乳血清。
在本发明的背景中，术语“乳”涉及从处于泌乳期间的哺乳动物的乳腺获得的液体。术语“乳”应被广义地解释，并且涵盖生乳(即，直接从乳腺获得的液体)和标准化乳制品(例如像脱脂乳或全脂乳)两者，其中乳脂肪的浓度相对于最初的生乳已被降低。
乳清是一个集体术语，是指在从乳制造奶酪或酪蛋白的过程中产生的水样副产物。
在本发明的背景中，术语“甜乳清”涉及在基于凝乳酶的乳凝结过程中获得的乳清，该凝结过程例如发生在黄奶酪的生产过程中。
在本发明的背景中，术语“酸乳清”涉及在乳的化学或生物酸化过程中获得的乳清，该酸化过程例如发生在农家奶酪或夸克奶酪(quark)的生产过程、或在酪蛋白/酪蛋白酸盐的生产过程中。
在本发明的背景中，术语“乳血清”也被称为“血清乳清”、“原生乳清”或“抗乳血清”，它涉及已除去乳脂肪和酪蛋白胶束的乳。然而，乳血清典型地含有一些游离酪蛋白种类，这些游离酪蛋白种类在胶束被除去之前已经从这些原生酪蛋白胶束中离解。乳血清可以例如通过将一种脱脂乳微滤通过具有约0.1微米的孔径的过滤器或膜，并且收集所得的渗透物作为乳血清来生产。根据Evans等人可以生产乳血清。
如将理解的，可能已经使该乳、甜乳清、酸乳清或乳血清经受若干处理步骤来制备乳源给料。
乳或乳相关的产品的处理典型地涉及一个或多个热处理过程，如巴氏灭菌(例如，72℃下持续15秒)或高巴氏灭菌(例如，85℃下持续20秒)。
可替代地、或另外地，该处理可以涉及一个或多个过滤步骤。微滤可以被用来除去微生物，或可替代地来浓缩酪蛋白。超滤或纳滤可以(例如)被用来浓缩乳清蛋白或乳血清蛋白。
可替代地，或另外地，该处理可以涉及一个或多个离心步骤，例如，用于从脱脂乳中分离脂肪和/或从乳中分离微生物。
可替代地，或另外地，该处理可以涉及一个或多个蒸发步骤以用于除去水并且从而浓缩干物质，如蛋白质和/或矿物质。
该处理还可以包括一个或多个pH调节。酸化可以(例如)被用来使酪蛋白凝结并且当该处理涉及离子交换色谱法时pH调节更为重要。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含来自其他乳蛋白部分(如过滤的、热处理的乳清或α-乳清蛋白和/或β-乳球蛋白-贫化乳清)的生产的一种或多种工艺物流。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料包含一种乳血清源给料，或甚至基本上由其组成。该乳源给料可以例如是一种乳血清、并且优选的是一种乳血清蛋白浓缩物，例如，处于通过超滤乳血清获得的渗余物的形式。
该乳源给料中的骨桥蛋白的含量取决于特定的给料类型。在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.01％至20％(w/w)的范围内的骨桥蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.05％至5％(w/w)的范围内的骨桥蛋白。该乳源给料可能(例如)包含量在0.1％至2％(w/w)的范围内的骨桥蛋白。
可替代地，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.1％至1％(w/w)的范围内的骨桥蛋白。
在本发明的背景中，被陈述为“基本上由”一个或多个子组分或一个或多个活动“组成”的一种产品、组分、方法、或方法步骤由一个或多个所具体提到的子组分或一个或多个所具体提到的活动组成，但还可以包括实质上不影响本发明的一个或多个基本和新颖的特征的一个或多个额外的未命名的子组分或活动。
如上文所提到，本方法对于从复杂的给料，即含有干扰骨桥蛋白的分离的分子实体(如具有低于5.0的pI的蛋白质)的给料中分离骨桥蛋白特别有效。已经发现这类蛋白质与骨桥蛋白竞争阴离子交换介质的官能团。
具有小于5.0的pI的蛋白质的多个实例是α乳清蛋白、蛋白胨-3、蛋白胨-5、和蛋白胨-8、以及酪蛋白衍生肽，如酪蛋白巨肽和/或酪蛋白磷酸肽。因此，该额外蛋白质可以包括来自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：α乳清蛋白、蛋白胨-3、蛋白胨-5、和蛋白胨-8、酪蛋白衍生肽、酪蛋白巨肽、酪蛋白磷酸肽、以及其组合。游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白是具有小于5.0的pI值的蛋白质的其他实例。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少0.1％(w/w)的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少0.5％(w/w)的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。
可替代地，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少2％(w/w)的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。如将理解的，具有小于5.0的pI的额外蛋白质不包括骨桥蛋白，但典型地包括具有特定范围内的pI的一种或多种其他蛋白质。
在本发明的其他实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.1％至50％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.5％至40％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在2％至25％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。
该乳源给料可能(例如)包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.1％至20％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.3％至15％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。可替代地，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在0.5％至10％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。
在本发明的进一步的实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在至少1％至50％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在10％至45％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。可替代地，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在15％至40％(w/w)的范围内的具有小于5.0的pI的额外蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，具有小于5.0的pI的额外蛋白质具有小于4.5的pI、并且优选小于4.0的pI。
在本发明的背景中，术语“蛋白质”涵盖多肽的大聚集体、单多肽链以及肽类，如二肽或三肽。在化学上，蛋白质是包含通过所谓的肽键连接的不同和/或相同的氨基酸的聚合物。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料进一步包含酪蛋白巨肽(CMP)。
在本发明的背景中，术语“CMP”或“酪蛋白巨肽”涉及当暴露于凝乳酶时从κ-酪蛋白中释放的一种小蛋白。CMP涵盖该蛋白质的糖基化变体和非糖基化变体两者。该蛋白质的糖基化变体有时被称为酪蛋白糖巨肽(cGMP)。
在本发明的其他优选实施例中，该乳源给料包含甜乳清源给料，或甚至基本上由其组成。该乳源给料可以例如是一种甜乳清、并且优选的是甜乳清蛋白浓缩物，例如，处于通过甜乳清的超滤获得的渗余物的形式。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料可以包含一种酸乳清源给料，或甚至基本上由其组成。该乳源给料可以例如是一种酸乳清、并且优选的是一种甜乳清蛋白浓缩物，例如，处于通过酸乳清的超滤获得的渗余物的形式。
在本发明的背景中，术语“乳血清蛋白浓缩物”、“甜乳清蛋白浓缩物”、或“酸性乳清蛋白浓缩物”涉及一种水性组合物，该水性组合物含有分别存在于原始乳血清、甜乳清、或酸乳清中的总蛋白质的至少80％(w/w)，并且具有相对于该水性组合物的干重而言为至少25％(w/w)的总蛋白质含量。
然而，在本发明的其他实施例中，该乳源给料不是一种酸乳清源给料。
在本发明的优选实施例中，该乳源给料(例如，一种甜乳清源给料)包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的CMP。例如，该乳源给料(例如，一种甜乳清源给料)包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少5％(w/w)、优选为至少10％(w/w)、并且甚至更优选地相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至少15％(w/w)的CMP。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料(例如，一种甜乳清源给料)包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1％至40％(w/w)的范围内的CMP。例如，该乳源给料(例如，一种甜乳清源给料)可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在5％至35％(w/w)的范围内、优选地在10％至30％(w/w)的范围内、并且甚至更优选地在相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为15％至25％(w/w)的范围内的CMP。
本发明人已经观察到，出乎意料地，当给料是基于乳血清或其浓缩物时在本方法过程中形成了沉淀。这种沉淀在阴离子交换过程期间导致问题，并降低该阴离子交换过程的稳健性。
本发明人已经对该沉淀进行了研究并发现迹象表明该沉淀含有多个沉淀的酪蛋白种类，这些酪蛋白种类以溶解形式如游离β-酪蛋白或游离α-酪蛋白存在。
在本发明的背景中，术语“游离β-酪蛋白”或“游离α-酪蛋白”涉及未结合乳制品的原生酪蛋白胶束的β-酪蛋白分子或α-酪蛋白的分子。这类游离β-酪蛋白或游离α-酪蛋白包括β-酪蛋白或α-酪蛋白的溶解单分子或α-酪蛋白和/或β-酪蛋白的小聚集体。例如已知β-酪蛋白的单分子形成小的β-酪蛋白胶束，该胶束也是游离β-酪蛋白的一个实例。
因此，在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料进一步包含游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白典型地存在于乳血清源给料中。
本发明人已经发现，此沉淀问题可以通过在阴离子交换前从该乳源给料中除去该沉淀来解决。因此，在本发明的一些优选实施例中，该方法的步骤a)涉及从有待形成该乳源给料的酸化液体中除去沉淀。这种除去可能(例如)涉及对该酸化液体的离心或过滤。
该沉淀问题的另一种解决方案是使用该给料的其中沉淀被限制或甚至不存在，例如，在pH 5.0-6.5的范围内的pH。
因此，该乳源给料可以具有在5.0-6.5的范围内、并且优选地在pH5.0-6.0的范围内的pH。
当在此pH范围内执行阴离子交换时，进一步建议使用高于15℃，如20℃至40℃的给料/过程温度。在此温度范围内，溶解的β-酪蛋白形成小的β-酪蛋白胶束，而不与乳的原生酪蛋白胶束混淆，并且这些β-酪蛋白胶束似乎比单一β-酪蛋白分子更少干扰阴离子交换过程。
因此，在步骤b)的过程中该乳源给料和阴离子交换材料的温度可以是在15℃至40℃的范围内、并且优选地在20℃至38℃的范围内。
该乳源给料可能(例如)包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为至少0.5％(w/w)的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为至少2％(w/w)的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。该乳源给料可能(例如)包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为至少10％(w/w)的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为在0.5％至40％(w/w)的范围内的量的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为在2％至20％(w/w)的范围内的量的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。该乳源给料可能(例如)包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言总量为在5％至15％(w/w)的范围内的量的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的α-乳清蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少10％(w/w)、优选为至少20％(w/w)、并且甚至更优选相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至少30％(w/w)的α-乳清蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1％至50％(w/w)的范围内的α-乳清蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在5％至40％(w/w)的范围内、优选地在10％至35％(w/w)的范围内、并且甚至更优选地在相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为12％至30％(w/w)的范围内的α-乳清蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的β-乳球蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少15％(w/w)、优选为至少30％(w/w)、并且甚至更优选相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至少40％(w/w)的β-乳球蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在1％至70％(w/w)的范围内的β-乳球蛋白。例如，该乳源给料可能包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言量在10％至65％(w/w)的范围内、优选地在20％至60％(w/w)的范围内、并且甚至更优选地在相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为35％至55％(w/w)的范围内的β-乳球蛋白。
已知酪蛋白在处于或低于约4.6的pH值下沉淀。因此，在本发明的一些实施例中，优选的是具有在约3.6-4.6的范围内的pH的乳源给料具有相对低浓度的酪蛋白，如相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至多1％(w/w)。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至多0.1％的酪蛋白(w/w)。甚至可能优选的是该乳源给料包含相对于该乳源给料的蛋白质的总量而言为至多0.01％的酪蛋白(w/w)。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料包含总量在6-250g/L乳源给料的范围内的蛋白质。例如，该乳源给料可能包含总量在50-150g/L乳源给料的范围内的蛋白质。甚至可能优选的是该乳源给料包含总量在75-125g/L乳源给料的范围内的蛋白质。
可替代地，该乳源给料可能包含总量在50-250g/L乳源给料的范围内的蛋白质。例如，该乳源给料可能包含总量在50-150g/L乳源给料的范围内的蛋白质。甚至可能优选的是该乳源给料包含总量在75-150g/L乳源给料的范围内的蛋白质。
还可能优选的是该乳源给料可能包含总量在75-250g/L乳源给料的范围内的蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料包含总量为至少6g/L乳源给料的蛋白质。例如，该乳源给料可能包含总量为至少50g/L乳源给料的蛋白质。甚至可能优选的是该乳源给料包含总量为至少75g/L乳源给料的蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料具有在25℃下在pH3.8-6.0的范围内的pH。优选地，在25℃下的该乳源给料的pH在pH4.0-5.5的范围内。甚至更优选地，在25℃下该乳源给料的pH是在pH4.2-5.0的范围内，例如像pH 4.3-4.5。
该乳源给料的所希望的比电导可以例如通过以下方式获得：
-通过部分除去水和/或添加盐来浓缩该乳源给料，这引起一个增大的比电导，或
-通过部分除去盐和/或添加水来使该乳源给料脱盐，这引起一个减小的比电导。
从水性液体中除去水和/或盐的技术是本领域中的技术人员所众所周知的。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料具有在25℃下4.5-9.0mS/cm的范围内的比电导。例如，该乳源给料的比电导可以是在25℃下5.0-8.0mS/cm的范围内。在本发明的一些优选实施例中，甚至可能更优选的是该乳源给料的比电导是在25℃下5.5-7.0mS/cm的范围内。
该乳源给料可能例如具有在25℃下4-7mS/cm的范围内的比电导。可替代地，该乳源给料可能具有在25℃下7-10mS/cm的范围内的比电导。可替代地，该乳源给料可能具有在25℃下5-8mS/cm的范围内的比电导。
在本发明的一些优选实施例中，该乳源给料具有在25℃下4-7mS/cm的范围内的比电导以及在25℃下pH 3.6-5.0的范围内的pH。
在本发明的其他优选实施例中，该乳源给料具有在25℃下7-10mS/cm的范围内的比电导以及在25℃下pH 5.0-6.5的范围内的pH。
在本发明的进一步优选的实施例中，该乳源给料具有在25℃下5-8mS/cm的范围内的比电导以及在25℃下pH 4.0-5.5的范围内的pH。
例如，该乳源给料可能具有在25℃下5-6mS/cm的范围内的比电导以及在25℃下pH4.2-5.0的范围内的pH。
在本发明的一些实施例中，该乳源给料具有在3.6至6.5的范围内的pH，并且
-如果pH是在3.6-5.0的范围内，则比电导是至少4mS/cm并且至多比电导最大＝1.38mS/cm*pH+1.03mS/cm，并且
-如果pH是在5-6.5的范围内，则比电导是至少比电导最小＝1.33mS/cm*pH-2.67mS/cm，并且至多比电导最大＝1.38mS/cm*pH+1.03mS/cm。
因此，如果这些实施例中的给料的pH是(例如)pH 6.0，则比电导是至少比电导最小＝1.33mS/cm*6.0-2.67mS/cm＝5.3mS/cm，并且至多比电导最大＝1.38mS/cm*6.0+1.03mS/cm＝9.3mS/cm。
例如，该乳源给料可能具有在3.6至5.0的范围内的pH和以下比电导至少4mS/cm并且至多比电导最大＝1.38mS/cm*pH+1.03mS/cm。
可替代地，该乳源给料可能具有在5.0至6.5的范围内的pH和以下比电导至少比电导最小＝1.33mS/cm*pH–2.67mS/cm，并且至多比电导最大＝1.38mS/cm*pH+1.03mS/cm。
除非另有说明，否则比电导和pH值是在具有25℃的温度的给料中进行测量的。
在本发明的一些实施例中，阴离子交换介质包含一种固相和一种或多种阳离子基团。
优选地，该阳离子基团中的至少一些附接到该固相的表面上和/或附接到通过该固相的表面可接近的多个孔的表面上。
在本发明的一些实施例中，阴离子交换介质的固相包含选自下组的一种或多种组分，该组由以下各项组成：多个粒子、一种过滤器、以及一种膜。
该固相可以例如包含多糖，或甚至基本上由其组成。特别优选交联多糖。有用的多糖的实例是纤维素、琼脂糖，和/或葡聚糖。
可替代地，该固相可以包含一种非碳水化合物聚合物或甚至基本上由其组成。有用的非碳水化合物聚合物的实例是甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、和/或苯乙烯-二乙烯基苯。
在本发明的一些优选实施例中，这些阳离子基团包括氨基，或甚至基本上由其组成。叔氨基是特别优选的并且在适当的pH条件下生成季铵基。季铵基为阴离子交换介质提供了强阴离子交换特性。
可替代地，或另外地，这些阳离子基团可以包含一种或多种伯氨基或仲氨基。大量的伯氨基或仲氨基典型地为阴离子交换介质提供了弱阴离子交换特性。
每个周期的最佳蛋白加载取决于阴离子交换色谱法系统的设计和阴离子交换介质的特征。
在阴离子交换色谱法过程中的处理条件(包括压力、流速等)取决于实际的处理实施、所使用的设备以及所使用的阴离子交换介质。
在步骤b)过程中该乳源给料的温度典型地是低的足以避免微生物生长和蛋白质与阴离子交换介质的热损伤，但同时是高的足以提供一个可接受的粘度。
在本发明的一些实施例中，在步骤b)过程中该乳源给料的温度是在2℃至40℃的范围内。优选地，在步骤b)过程中该乳源给料的温度是在4℃至20℃的范围内，并且甚至更优选地在6℃至12℃的范围内。
有关阴离子交换色谱法及其工业实施的更多细节可以在斯科普斯(Scopes)中找到，其出于所有目的通过引用结合在此。
在本发明的一些优选实施例中，本发明的方法包括一个在使阴离子交换介质与乳源给料进行接触后用一种洗涤溶液洗涤该阴离子交换介质的步骤c)。有用的洗涤溶液是能够从该阴离子交换介质中除去松散结合的分子的典型地pH中性或弱酸性的水溶液。人们可以例如使用去矿物质的水或氯化钠的一种pH中性水溶液(例如，0.1M NaCl)作为洗涤液。
在本发明的其他优选实施例中，本发明的方法不包括步骤c)。
本发明的步骤d)涉及回收结合至阴离子交换介质的骨桥蛋白。该回收典型地通过使阴离子交换介质与一种洗脱剂进行接触并收集所得的洗脱液，即该洗脱剂加上从阴离子交换介质释放出的分子。
正常地，该洗脱剂是具有足以从阴离子交换介质释放结合的骨桥蛋白的离子强度和/或pH的一种水溶液。有用的洗脱液的实例是盐(如NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、或其组合)的pH中性的、1.0M的水溶液。
可以使回收的组合物经受另外的处理步骤(例如)以用于使该组合物去矿物质和浓缩，并随后将其转变成粉末。
因此，在本发明的一些优选实施例中，使该回收的组合物进一步经受选自下组的一个或多个处理步骤，该组由以下各项组成：浓缩、渗滤、蒸发溶剂、喷雾干燥、以及取代结合了蛋白质的阳离子。
例如，可以使该回收的组合物经受一个浓缩步骤。
可替代地，或另外地，可以使该回收的组合物经受一个渗滤步骤。
可替代地，或另外地，可以使该回收的组合物经受一个蒸发步骤。
可替代地，或另外地，可以使该回收的组合物经受一个喷雾干燥步骤。
在本发明的一个优选实施例中，可以使该回收的组合物经受以下步骤：
i)浓缩，例如，通过超滤，
ii)渗滤，例如，通过水，
iii)可任选地，另一浓缩步骤，例如，通过蒸发，
iv)阳离子置换，通过使步骤ii)或iii)的水性组合物与一种水溶性钙盐(例如，CaCl2)进行接触，
v)巴氏灭菌，并且
vi)喷雾干燥，以将该巴氏杀菌的组合物转化成粉末。
本方法可以作为分批方法亦或半分批方法来实施。该半分批方法可以例如通过以下方式来实施：操作一个第一阴离子交换柱和一个第二阴离子交换柱，并且在该第一阴离子交换柱上执行步骤b)，同时在该第二阴离子交换柱上执行步骤c)和/或d)，并且反之亦然。
因此，在本发明的一些优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳源给料是一种甜乳清蛋白浓缩物，所述乳源给料具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，
并且其中所述乳源给料进一步包含相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％(w/w)的酪蛋白巨肽，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
在本发明的其他优选实施例中，用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料，所述乳给料是一种乳血清蛋白浓缩物，所述乳源给料具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，并且其中所述乳源给料进一步包含游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白，
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触，
c)可任选地，洗涤该阴离子交换介质，并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
本发明的又一方面涉及可通过在此描述的方法获得的一种含骨桥蛋白的组合物。
上文已经参考多个具体实施例对本发明进行了描述。然而，除上文描述的以外的其他实施例同样有可能在本发明的范围之内。除非另有说明，否则本发明的各种实施例和方面的不同特征和步骤可以按照除在此描述的这些以外的其他方式进行结合。
实例
实例1.从受控电导甜乳清浓缩物中富集骨桥蛋白
试验方案
下面的纯化实验是在装备有装在一个13.3mL(170mm×10mm)柱中的强阴离子交换树脂Q-琼脂糖大珠的快速蛋白液相色谱(FPLC)设备上进行的。在所有实验的整个加载、洗涤、以及洗脱过程中，将流量保持在3.33ml/min。原材料是一种甜乳清蛋白分离物，并且在每个实验过程中将70克的总蛋白质加载到该柱上。对原材料中的CMP的含量进行分析。将原材料的样品稀释到最终蛋白质浓度为10％w/v，此后通过分别添加HCl和NaCl对pH(pH 3.0-5.7，在4.7mS/cm下)和比电导(2.3-10.3mS/cm，在pH 4.3下)进行调节。通过3个床体积的100mM NaCl、pH 5.0的溶液将未结合的蛋白质从柱中洗出。随后，通过使1M NaCl、pH 5.0的溶液流动通过该柱来洗脱结合的蛋白质，直到洗脱液中检测不到蛋白质为止。
对于各洗脱液样品，使用以下技术对骨桥蛋白(OPN)、CMP、以及总蛋白质的含量进行分析。
总蛋白质的测定
通过如在科恩(Cohen)中所描述的标准凯式氮分解法(standard Kjeldahldigestion)对洗脱液的总蛋白质含量进行测定。
通过HPLC方法对OPN进行定量
分析原理：
将样品通过0.22μm的过滤器过滤，并且使其经受HPLC，其中柱为MonoQ HR 5/5(1ml)(法玛西亚公司(Pharmacia))并且在280nm下进行检测。通过外标法(与已知OPN含量的标准品的峰面积进行比较)来计算样品的浓度。由于该方法的低特异性，因此对于此分析程序，一个先决条件是这些样品包含相对纯的OPN，例如，如通过SDS-PAGE(Laemmli，1970)所测定的。
试剂：OPN标准品、密理博(Milli Q)水(HPLC级)、NaCl(默克公司(Merck))、TrisHCl(西格玛公司(Sigma))
缓冲液A：10mM NaCl，20mM Tris HCL，pH 8.0
缓冲液B：0.8M NaCl，20mM Tris HCl，pH 8.0
标准的校准曲线是从缓冲液A中的OPN标准品的在1-10mg/ml的浓度范围内的5个标准品制成的。在加载到柱上之前，所有的标准品都通过0.22μm的过滤器进行过滤。
采样和预处理：
如果用于分析的样品在该标准曲线的范围之外的话，则用密理博水(HPLC级)将这些样品进行稀释。在一些情况下，如果存在太多的来自洗脱剂的NaCl，为了使得OPN能够结合至阴离子交换树脂，稀释也是必要的。注入相当于25μL的量的1-10mg/mL的OPN以用于分析。在注入至HPLC之前，将样品通过0.22μm的过滤器过滤。
HPLC条件：流量1ml/min，注入体积25μL，梯度：0-3min 0％B，3-17min 0-60％B，17-30min 60％-100％B，30-33min 100％B，33-34min100％-0％B，34-40min 0％B。
结果的计算和表达：
每个样品中的OPN的浓度是通过参考标准曲线并通过观察所采用的稀释来计算的。
通过OPN与总蛋白质之间的比率，使用OPN特定琼斯系数7.17来计算纯度，这是因为在当前背景中通过凯氏氮分解法测定的大部分或全部蛋白是OPN。
通过HPLC对主要乳清蛋白进行定量
通过凝胶渗透色谱法对主要乳清蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、以及CMP(酪蛋白糖巨肽)进行分离和定量。
该凝胶渗透色谱法使用2个与附接的预柱PWxl(6mm×4cm)(Tosohass，日本)串联连接的TSKgel3000PWxl(7.8mm×30cm)柱来进行。
用于该系统的校准的标准溶液由以下项组成：溶解在500.0ml 0.02MpH为7.5的磷酸盐缓冲液中的225mg CMP、225mgα-乳清蛋白以及50mgβ-乳球蛋白。
样品的预处理：将粉末样品以1mg/ml溶解于磷酸盐缓冲液中并且放置过夜以用于溶液化。可替代地，将液体样品用磷酸盐缓冲液进行稀释，以便获得约0.1％的蛋白质含量。如果蛋白质含量低于0.1％，则在未稀释的情况下测定该样品。在注入至柱之前，使所有的样品都通过0.22μm的过滤器过滤。
结果的计算和表达：
根据A×0.1×F来计算样品中单独蛋白质的百分比，其中
B
A＝样品中所测得的面积
0.1＝用于0.1％溶液的换算系数
F＝稀释系数(100,000/样品重量(单位mg))
B＝0.1％标准溶液中单独蛋白质的计算出的面积
结果
CMP的含量
该甜乳清原材料中的CMP的含量是20.1％，但出乎意料地在实例1的富集的OPN组合物中不能检测到CMP。
给料pH对骨桥蛋白的纯度和产量的影响：
图1中示出的伴随着改变所采用的给料的pH值的第一系列实验表明，OPN的产量(来自给料中的70g总蛋白质的mg OPN)随pH从pH 3增大至约pH 4.3而增加。当pH增加到超过pH 4.3时高产量得到保持。所获得的OPN制剂中的OPN的纯度在低pH值下是非常高的，但当pH增大超过约pH 4.5时，纯度缓慢下降但仍然是可接受的，直到达到约pH 6.5。然而，高纯度OPN的最佳产量是在pH窗位pH 3.8-5.5中，并且特别是在pH 4.3-4.5的范围内获得的。
给料比电导对骨桥蛋白的纯度和产量的影响：
图2中示出了伴随着改变比电导的一系列实验的结果。在低比电导下，产量高而纯度低。随着比电导增大，纯度增大并且在约5.5mS/cm下达到100％。当比电导进一步增大时，纯度仍然很高，而当比电导超过约10mS/cm时，OPN的产量开始下降。然而，高纯度OPN的最佳产量似乎是在比电导范围4.5-9.0mS/cm内，并且特别是在5-8mS/cm的范围内获得的。
讨论/结论
pH的影响：
从图1可见，在低于约pH 3.6的pH值下，OPN逐渐减少其电荷并且因此逐渐减少其与树脂的阳离子基团的结合。在高于约pH 4.5的pH值下，由于给料的其他蛋白质变得带负电荷并且开始结合树脂，所以OPN的纯度开始降低。因此，我们已经确认了在pH 3.6-6.5范围中的一个最佳pH值窗位以用于分离高纯度且高产量的OPN，即使给料含有大量的CMP。在得到的OPN制剂中，CMP是不能检测出的。
比电导的影响：
从图2可见，在低于约4mS/cm的比电导下，由于其他蛋白质可以结合树脂，所以OPN的纯度逐渐下降。在高于约6mS/cm的比电导下，OPN与树脂的结合变弱，并且产量缓慢下降但是可以接受，直到达到约10mS/cm的比电导。因此，我们已经确认了最佳用于OPN生产的从约4-10mS/cm的一个窄范围。在此窄范围内，OPN可以甚至从含有约20％的CMP的原材料中以高产量和高纯度进行分离。
已经进行了若干探索基于甜乳清的给料中所要求的pH/比电导窗位的另外的实验，并且这些另外的实验证实了上述结论。
实例2 从受控电导酸乳清浓缩物中富集骨桥蛋白
以下的纯化实验是在与实例1类似的FPLC设备上进行的。然而，原材料是具有10％(w/w)的总蛋白质含量的酸乳清浓缩物，并且将约70g总蛋白质加载到柱上。
将浓缩的酸乳清稀释至不同程度，这产生了在从2.5至10mS/cm的范围内的比电导。通过实例1中所描述的方法对在给料和洗脱液中的OPN和总蛋白质进行测量。
通过添加HCl将pH调节至4.3，并且将原材料施加到阴离子交换柱上。通过3个床体积的0.1M NaCl将未结合的蛋白质从柱中洗出，并且随后通过使1M NaCl溶液流动通过该柱将结合的蛋白质进行洗脱，直到洗脱液中检测不到蛋白质为止。
在从浓缩的酸乳清中富集OPN的过程中比电导对OPN纯度和产量的影响示出于图3中。
图3中的数据示出了通过所描述的程序从酸乳清中富集OPN。与其中使用甜乳清作为原材料的实例1一样，再次观察到，给料中的低比电导增加了产品产量而牺牲了产品纯度。然而，由于酸乳清源给料不含有大量的CMP，因此对于OPN的富集的影响不如在给料是源于甜乳清的情况下那样有害。酸乳清源给料确实含有多种微量组分，这些微量组分的结合可以通过如为避免CMP的结合而采用的相同的参数设定来最小化。因此，可以观察到，在实例1中确认的OPN分离的窄最佳范围同样适用于从酸乳清中分离OPN。
我们已经进行了若干探索基于酸乳清的给料中所要求的pH/比电导窗位的另外的实验，并且这些另外的实验证实了上述发现。
实例3 从受控电导乳血清浓缩物中富集骨桥蛋白
根据前面的实例，可以使用乳血清作为用于通过所披露的方法生产OPN的原材料。通过在24度下对脱脂乳进行微滤(过滤器孔径为约0.1微米)以便除去胶束酪蛋白来生产乳血清。其后，通过HCl将乳血清的样品调节至pH 4.3或pH 4.7，并且将乳血清的样品渗滤来获得在4-10mS/cm的范围内的比电导和约5％或10％(w/w)的总蛋白质含量。随后，如实例1所描述，在约5℃下通过阴离子交换从修饰的乳血清样品中富集OPN。
结果和观察
所进行的这些试验表明，源于乳血清的给料也可以用于本方法中。
出乎意料地，在该方法过程中观察到未确认的沉淀，该沉淀导致在一些阴离子交换周期后阴离子交换材料的堵塞或污染。该沉淀问题通过在阴离子交换前使酸化的乳血清通过滤纸过滤而得到解决。我们已经看到多个迹象表明该沉淀与溶解的酪蛋白种类，如在原生酪蛋白胶束被除去时留在乳血清中的游离α-酪蛋白和游离β-酪蛋白有关。
讨论/结论
乳血清通过对脱脂乳进行微滤以便除去酪蛋白来生产，而甜乳清和酸乳清分别在凝乳酶或酸的作用下通过酪蛋白的沉淀而将酪蛋白耗尽。因此，所有三类乳源给料基本上没有胶束的酪蛋白，这些胶束的酪蛋白由于酪蛋白的沉淀和絮凝而将干扰阴离子交换色谱法程序。
我们已经看到多个迹象表明溶解的酪蛋白在阴离子交换过程中引起问题。这个问题可以通过在阴离子交换前使用(例如)微过滤器来过滤这些乳源给料而得以解决。
可替代地，阴离子交换步骤可以在其中沉淀被限制或甚至不存在的pH下进行，例如，在pH 5.0-6.5的范围内进行。当在此pH范围内执行阴离子交换时，进一步建议使用高于15℃，如20℃至40℃的给料/过程温度。在此温度范围内，溶解的β-酪蛋白形成小的β-酪蛋白胶束，而不与原生酪蛋白胶束混淆，并且这些β-酪蛋白胶束比单一β-酪蛋白分子更少干扰阴离子交换过程。
实例4 在无受控电导下从甜乳清浓缩物中富集骨桥蛋白
以下的纯化实验是在与实例1类似的FPLC设备上进行的。原材料是甜乳清分离物并且约1g的总蛋白质被加载到柱上。在加载到柱上之前，将该甜乳清通过超滤进行浓缩、在添加等体积的水后进行透滤、并且最后再次通过等体积的水进行稀释。得到的比电导为2.1mS/cm。CMP和总蛋白质通过实例1中所描述的方法在给料和洗脱液中进行测量。由于给料和洗脱液两者中的干扰蛋白质，不能测定OPN的量。表1中的OPN数据是根据实例1的实验中的已知产量估计而来的。
通过添加HCl将pH调节至4.3，并且将原材料施加到阴离子交换柱上。多种未结合的蛋白质通过3个床体积的水从柱中洗出，并且结合的蛋白质其后通过使1M NaCl溶液流动通过该柱而被洗脱，直到洗脱液中检测不到蛋白质为止。
表1.低电导甜乳清的阴离子交换的结果
| 原材料 | 洗脱液 | |
| 总蛋白质，mg | 979 | 192 |
| OPN，mg | 2.9 | 2.8 |
| OPN的纯度，％ | 0.3 | 1.5 |
| GMP，mg | 193 | 186 |
| GMP纯度，％ | 19.7 | 97 |
讨论/结论：
表1中的数据示出了通过所描述的程序进行的酸性乳清蛋白的富集。然而，OPN仅在较小程度上被富集，因为它构成给料中的酸性乳清蛋白的一小部分。由于(例如)CMP也结合树脂并以高浓度存在于给料中，这种蛋白质占用了树脂的大量的结合容量。因此，此程序对于OPN生产不是令人满意的。
实例5 比较和结论(比较实例1与实例4)
在以下表2中对实例1和实例4中的方法的一些特性进行了比较。
表2.实例1和实例4的多个特性
| 实例1 | 实例4 | |
| pH | 4.3 | 4.3 |
| 比电导，mS/cm | 6.0 | 2.1 |
| 每ml树脂的蛋白加载，g/ml | 5.26 | 0.074 |
| 原材料中的蛋白质的估计OPN，％ | 0.3 | 0.3 |
| OPN的成倍富集 | 333 | 5 |
| 洗脱液中OPN的纯度，％ | 100 | 1.5 |
结论
如表2中所概述，相比实例4的方法，实例1的方法对富集OPN更具特异性。因此，使用实例1的方法，可以在每个周期中将多得多的蛋白质加载到柱上，并且每个周期的OPN产量要高得多。这种方法得到几乎纯的OPN，而在实例4的产品中CMP占主导。
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Claims (26)
1.一种用于从一种乳血清源给料中分离骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳血清源给料，所述乳血清源给料包含在50-150g/L乳血清源给料范围内的蛋白质总量并且具有在25℃下pH 3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导，
b)使所述乳血清源给料经受阴离子交换色谱法，包括使该乳血清源给料与一种阴离子交换介质进行接触，并且
c)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质，从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物，
并且其中所述方法还包括当该乳血清源给料的pH在3.6-5.0范围内时在阴离子交换之前从该乳血清源给料去除沉淀物的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法在步骤b)和步骤c)之间还包含洗涤该阴离子交换介质的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料是乳血清。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料是乳血清蛋白浓缩物。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料具有在25℃下pH 3.6-4.6范围内的pH。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中去除沉淀物包括离心或过滤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中该乳血清源给料具有5.0-6.5范围内的pH。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述给料/过程温度高于15℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该乳血清源给料进一步包含具有小于5.0的等电点(pI)的额外蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该额外蛋白质包含选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质：α-乳清蛋白、酪蛋白磷酸肽、蛋白胨-3、蛋白胨-5、蛋白胨-8以及它们的混合物。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料包含相对于该乳血清源给料的蛋白质的总量而言总量为至少0.5％w/w的游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料包含相对于该乳血清源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％w/w的α-乳清蛋白。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料包含相对于该乳血清源给料的蛋白质的总量而言量在1％至50％w/w的范围内的α-乳清蛋白。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料包含相对于该乳血清源给料的蛋白质的总量而言量为至少1％w/w的β-乳球蛋白。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料包含相对于该乳血清源给料的蛋白质的总量而言量在1％至70％w/w的范围内的β-乳球蛋白。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料具有在25℃下4.5-9.0mS/cm的范围内的比电导。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料具有在25℃下4-7mS/cm的范围内的比电导。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳血清源给料具有在25℃下5-8mS/cm的范围内的比电导。
19.根据权利要求1所述的方法，其中该乳血清源给料具有在25℃下7-10mS/cm的范围内的比电导。
20.根据权利要求1所述的方法，其中该阴离子交换介质包含一种固相和一种或多种阳离子基团。
21.根据权利要求20所述的方法，其中该阴离子交换介质的该固相包含选自由以下组成的组的一种或多种组分：多个粒子、一种过滤器、以及一种膜。
22.根据权利要求20所述的方法，其中该固相包含多糖。
23.根据权利要求20所述的方法，其中该固相包含交联多糖。
24.根据权利要求20所述的方法，其中该固相包含琼脂糖。
25.根据权利要求20所述的方法，其中这些阳离子基团包括氨基。
26.根据权利要求1或2所述的方法，其中该回收的组合物进一步经受选自由以下组成的组的一个或多个处理步骤：浓缩、渗滤、蒸发溶剂、喷雾干燥、以及取代结合了蛋白质的阳离子。
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