CN113214378A - 一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法 - Google Patents

一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，主要包括以下步骤：步骤1、将酪蛋白溶解于pH值为5.0～6.86的水溶液中，然后加入加凝乳酶于水浴中酶解，得到第一物料。步骤2、将所述步骤1得到的第一物料与质量浓度为0.4％～0.6％的第一三氯乙酸溶液进行混合，离心，得上清液；步骤3、将所述步骤2得到的上清液与质量浓度高于8％的第二三氯乙酸溶液混合，离心，收集沉淀；步骤4、将步骤3得到的沉淀用丙酮进行洗涤，烘干，得到酪蛋白糖巨肽。本发明提供的提取分离方法操作简单，设备要求低，易于控制，便于推广，产品含杂质量少纯度高。

Description

一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法
技术领域
本发明涉及了分离提取糖巨肽的技术领域，特别涉及了一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法。
背景技术
牛乳中蛋白质主要由乳清蛋白和酪蛋白构成，其中酪蛋白由α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白组成，其中，κ-酪蛋白均存在糖基化结构，糖基化的κ-酪蛋白经过酶水解后生产糖巨肽，糖巨肽具有提升免疫力生理活性，糖巨肽在许多领域得到了应用。
目前，制备酪蛋白糖巨肽的方法主要是酶解法，例如中国专利CN101413019A中公开了一种酪蛋白糖巨肽的制备方法，首先将酪蛋白用胃蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解，离心取上清液，然后将上清液用膜超滤浓缩后得到酪蛋白糖巨肽。还有中国专利CN103382497中公开了牦牛乳糖巨肽及牦牛乳小分子肽的制备方法，具体步骤包括：脱脂、凝乳酶酶解、灭酶、离心和超滤膜超滤截留，得到牦牛乳糖巨肽。现有技术中，对酶解后物料的纯化方法经常采用超滤的方法进行纯化，但是该设备成本要求高，操作复杂，不好控制，不便于推广，而且超滤膜截留大于一定分子量的肽类，对于与糖巨肽相近分子量杂质，如糖类、其他蛋白质、酶解副产物也会被截留；或者出现因滤膜分子量范围选择不当导致部分聚合糖巨肽未被截留而造成损失。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术中用膜超滤截留分离糖巨肽的方法存在设备成本要求高，操作复杂，不好控制，不便于推广，还会截留一些相近分子量杂质以及滤膜分子量范围不易准确选择的问题，提供一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，该方法操作简单，设备要求低，易于控制，便于推广，产品含杂质量少纯度高。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，包括以下步骤：
步骤1、将酪蛋白溶解于pH为5.0～6.86的水溶液中，然后加入加凝乳酶于水浴中酶解，得到第一物料；
步骤2、将所述步骤1得到的第一物料与质量浓度为0.4％～0.6％的第一三氯乙酸溶液进行混合，离心，得上清液；
步骤3、将所述步骤2得到的上清液与质量浓度高于8％的第二三氯乙酸溶液混合，离心，收集沉淀；
步骤4、将步骤3得到的沉淀洗涤、烘干，得到酪蛋白糖巨肽。
本发明提供了一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，分离提取过程中，首先用凝乳酶对酪蛋白进行酶解反应，然后选择两种不同质量浓度范围的三氯乙酸溶液进行反应，可以将酪蛋白中的β酪蛋白、α酪蛋白及酶解副产物进行有效的分离，并将糖巨肽进行高效的提取。
其中，首先选用低质量浓度为0.4％～0.6％的三氯乙酸溶液除去酪蛋白中的β酪蛋白、α酪蛋白、酶解副产物(副k-酪蛋白)，将糖巨肽保留在上清液中，再加8-10％高浓度三氯乙酸以沉淀糖巨肽。通过发明人大量的实验探索，针对性的选出了能同时除去不同杂蛋白，包括酶解副产物、剩余酶类的酸种类及质量浓度范围。本发明提供的提取分离方法操作简单，设备要求低，易于控制，便于推广，产品含杂质量少纯度高。
进一步的，所述步骤1中的酪蛋白由以下方法分离提取出来的：
步骤A、将脱脂牛乳升温至25-40℃，搅拌条件下，用盐酸调节pH值至4.6～4.8，收集沉淀，纯水洗涤沉淀后备用；
步骤B、将所述步骤A得到的沉淀置于水中，用氢氧化钠调节pH值至10～12，过滤，将沉淀物进行洗涤，得到酪蛋白。
液体生牛乳中本身k-酪蛋白含量低，提取难度较大，很多厂家都是通过直接购买酪蛋白进行直接提取，直接购买酪蛋白增加了加工成本，不利于生产。为此，本发明提供了一种从生牛乳中提取分离酪蛋白的方法，通过生成酪蛋白沉淀，然后把酪蛋白沉淀用丙酮反复清洗几遍，以去掉酪蛋白中残留液体中的乳清蛋白、糖类物质。通过多次提取后碱性条件复溶酪蛋白，增加液体牛奶中酪蛋白的提取量，进而提高酪蛋白的提取纯度和回收率，该方法操作简单，可大规模推广应用。
相比于目前其他研究较多的是直接利用乳清蛋白或酪蛋白提取CGMP，液体牛乳中本身k-酪蛋白含量低，提取难度更大。本方法通过先沉淀酪蛋白，多次提取后碱性条件复溶酪蛋白，增加液体牛乳中的提取量，可提高提取纯度和回收率。
进一步的，所述步骤A中，脱脂牛乳由以下步骤制备得到的：
取生牛乳适量，然后在6000～8000r/min、2-4℃下离心8-15min，去除脂肪，得到脱脂牛乳。
进一步的，所述步骤A中，盐酸的浓度为0.8～1.2mol/L。
进一步的，所述步骤B中，氢氧化钠的浓度为0.8～1.2mol/L。
进一步的，所述步骤1中，凝乳酶是用0.9～1.2mol/LNaCl水溶液溶解配制而成的，凝乳酶的质量浓度为1％～2％。
进一步的，所述步骤1中，水浴的温度为35℃～42℃。
进一步的，所述步骤1中，酶解的时间为45min～60min。
进一步的，所述步骤2中，所述第一三氯乙酸溶液的质量浓度为0.5％。经过发明人大量的实验研究发现，0.5％的三氯乙酸可同时沉淀去除不同杂蛋白，包括酶解副产物、剩余酶类物质，效果非常好。
本发明利用0.5％三氯乙酸沉淀出β酪蛋白、α酪蛋白、酶解副产物(副k-酪蛋白)。通过不同酸种类和浓度实验发现，0.5％三氯乙酸可同时沉淀去除不同杂蛋白，包括酶解副产物、剩余酶类物资。精确控制三氯乙酸的浓度，是实现阶段性沉淀，反复洗涤除去杂质成分，提高纯净度是本发明工艺方法的关键所在。
进一步的，所述步骤3中，所述第二三氯乙酸溶液的质量浓度为8％～12％。通过大量实验研究发现，糖巨肽在低浓度酸性条件下会溶解，研究发现，三氯乙酸溶液质量浓度在低于8％时，糖巨肽会有少量沉淀不完全，回收率较低。
进一步的，所述步骤4中，将步骤3得到的沉淀用丙酮进行2-5次洗涤。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，分离提取过程中，首先用凝乳酶对酪蛋白进行酶解反应，然后选择两种不同质量浓度范围的三氯乙酸溶液进行反应，可以将酪蛋白中的β酪蛋白、α酪蛋白及酶解副产物进行有效的分离，并将糖巨肽进行高效的提取，该方法操作简单，设备要求低，易于控制，便于推广，产品含杂质量少，纯度可达95％以上。
2、本发明提供了一种从生牛乳中提取分离酪蛋白的方法，通过先沉淀酪蛋白，多次提取后碱性条件复溶酪蛋白，增加液体牛奶中酪蛋白的提取量，进而提高酪蛋白的提取纯度和回收率，该方法操作简单，可大规模推广应用。
3、本方法相对于之前的酪蛋白分离简化了提取方法，核心目的是通过分离提取不同分子量、不同构型糖巨肽，结合后续鉴定方法，应用于研究不同构型肽的功能，同时根据其含量或活性差异对不同巴氏杀菌参数进行评估。
附图说明
图1是实施例1分离糖巨肽的液相色谱图。
图2是对比例1分离糖巨肽的液相色谱图。
图3是对比例2分离糖巨肽的液相色谱图。
图4是对比例3分离糖巨肽的液相色谱图。
图5是对比例4分离糖巨肽的液相色谱图。
图6是对比例5分离糖巨肽的液相色谱图。
图7是对比例6分离糖巨肽的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
酪蛋白糖巨肽的提取分离
步骤1、取生牛乳适量，在8000r/min、3℃下进行离心10min，去除脂肪，取脱脂乳备用。
步骤2、取脱脂乳升温至30℃，搅拌条件下，用1mol/L盐酸调节pH值至4.7，收集沉淀S1，纯水洗涤沉淀S1，备用。
步骤3、取沉淀S1置于纯水中，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至11，升温至45℃搅拌条件下溶解，低温3℃调节pH值至6.86。
步骤4、取上述pH值为6.86的水溶液，加凝乳酶(1mol/LNaCl溶解)于35℃水浴中酶解45min，再加入0.5％三氯乙酸，离心得上清液L1。
步骤5、取上清液L1再加入8％三氯乙酸，离心后，收集沉淀，用丙酮多次洗涤去掉残余三氯乙酸，烘干后得到糖巨肽。
测试：
用高效液相色谱法对上述提取的酪蛋白糖巨肽进行检测
1.1仪器：高效液相色谱仪(安捷伦1260)
1.2色谱柱：300SB-CB 250*4.6mm 5μm
1.3进样量：20μL
1.4柱温：40℃
1.5检测波长：241nm，辅助280nm
1.6流动相A：0.1wt％三氟乙酸水溶液
1.7流动相B：0.1wt％三氟乙酸乙腈溶液
1.8洗脱程序如表1所示。
表1实施例1洗脱程序
Figure BDA0003112377870000061
Figure BDA0003112377870000071
2.0标准品的前处理
称取糖巨肽标准品1mg至1.5mL离心管中，加入500μL试剂A(由6mol/L盐酸胍、0.1mol/LBis-Tris、5.37mol/L二水柠檬酸钠组成)，涡旋混匀，静置1h，然后加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β巯基乙醇，涡旋混匀，最后用0.22μm滤膜过滤，过滤后用于液相检测。
3.0样品检测过程
取实例1所得糖巨肽1mg至1.5mL离心管中，加入500μL试剂A(由6mol/L盐酸胍、0.1mol/LBis-Tris、5.37mol/L二水柠檬酸钠组成)，涡旋混匀，静置1h，然后加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β巯基乙醇，涡旋混匀，最后用0.22μm滤膜过滤，过滤后用于液相检测。
4.0结果
用高效液相色谱法对上述提取的酪蛋白糖巨肽进行检测，得到的谱图如图1所示，从图中可以看出得到的产品为酪蛋白糖巨肽，纯度较高，通过色谱数据采集软件积分处理后，根据峰面积比例测出目标物的纯度为97％。
对比例1
步骤1、取生牛乳适量，在8000r/min、3℃下进行离心10min，去除脂肪，取脱脂乳备用。
步骤2、取脱脂乳升温至30℃，搅拌条件下，用1mol/L盐酸调节pH值至4.7，收集沉淀S1，纯水洗涤沉淀S1，备用。
步骤3、取沉淀S1置于纯水中，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至11，升温至45℃搅拌条件下溶解，低温3℃调节pH值至6.86。
步骤4、取上述pH值为6.86的水溶液，加凝乳酶(1mol/LNaCl溶解)于35℃水浴中酶解45min。
步骤5、然后按中国专利CN101413019A实施例1中酶解后的步骤，酸沉，离心，超滤膜截留，得到酪蛋白糖巨肽。
然后按实施例1相同的方法和条件对对比例1制备的糖巨肽进行液相色谱分析，得到图2所示的图谱。
用超滤膜截留的方式得到糖巨肽，需要超滤设备，操作复杂，不好控制，超滤膜截留大于一定分子量的肽类，缺其余相近分子量杂质(如糖类、其他蛋白质、酶解副产物)也会截留。本法是通过多次实验确定，用两段式浓度的三氯乙酸沉淀，离心收集得到糖巨肽，方法简单，可重新性好，操作稳定。
对比例2
酪蛋白糖巨肽的提取分离
步骤1、取生牛乳适量，在8000r/min、3℃下进行离心10min，去除脂肪，取脱脂乳备用。
步骤2、取脱脂乳升温至30℃，搅拌条件下，用1mol/L盐酸调节pH值至4.7，收集沉淀S1，纯水洗涤沉淀S1，备用。
步骤3、取沉淀S1置于纯水中，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至11，升温至45℃搅拌条件下溶解，低温3℃调节pH值至6.86。
步骤4、取上述pH值为6.86的水溶液，加凝乳酶(1mol/LNaCl溶解)于35℃水浴中酶解45min，再加入0.5％盐酸溶液，离心得上清液L1。
步骤5、取上清液L1再加入8％三氯乙酸，离心后，收集沉淀，用丙酮多次洗涤去掉残余三氯乙酸，烘干后得到糖巨肽。
按实施例1相同的方法和条件对对比例2制备的糖巨肽进行液相色谱分析，得到图3所示的图谱。
从图3的图谱中可以显示，使用0.5％的盐酸沉淀效果较差，有较多杂质峰，且只能提取到极少量的糖巨肽样品。
对比例3
酪蛋白糖巨肽的提取分离
步骤1、取生牛乳适量，在8000r/min、3℃下进行离心10min，去除脂肪，取脱脂乳备用。
步骤2、取脱脂乳升温至30℃，搅拌条件下，用1mol/L盐酸调节pH值至4.7，收集沉淀S1，纯水洗涤沉淀S1，备用。
步骤3、取沉淀S1置于纯水中，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至11，升温至45℃搅拌条件下溶解，低温3℃调节pH值至6.86。
步骤4、取上述pH值为6.86的水溶液，加凝乳酶(1mol/LNaCl溶解)于35℃水浴中酶解45min，再加入0.5％硫酸溶液，离心得上清液L1。
步骤5、取上清液L1再加入8％三氯乙酸，离心后，收集沉淀，用丙酮多次洗涤去掉残余三氯乙酸，烘干后得到糖巨肽。
按实施例1相同的方法和条件对对比例3制备的糖巨肽进行液相色谱分析，得到图4所示的图谱。
从图4的图谱中可以显示，使用0.5％的硫酸沉淀效果较差，有较多杂质峰，且只能提取到极少量的糖巨肽样品，糖巨肽的峰面积比例均低于50％。
对比例4
酪蛋白糖巨肽的提取分离
步骤1、取生牛乳适量，在8000r/min、3℃下进行离心10min，去除脂肪，取脱脂乳备用。
步骤2、取脱脂乳升温至30℃，搅拌条件下，用1mol/L盐酸调节pH值至4.7，收集沉淀S1，纯水洗涤沉淀S1，备用。
步骤3、取沉淀S1置于纯水中，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至11，升温至45℃搅拌条件下溶解，低温3℃调节pH值至6.86。
步骤4、取上述pH值为6.86的水溶液，加凝乳酶(1mol/LNaCl溶解)于35℃水浴中酶解45min，再加入0.3％三氯乙酸，离心得上清液L1。
步骤5、取上清液L1再加入8％三氯乙酸，离心后，收集沉淀，用丙酮多次洗涤去掉残余三氯乙酸，烘干后得到糖巨肽。
按实施例1相同的方法和条件对对比例4制备的糖巨肽进行液相色谱分析，得到图5所示的图谱。
从图5的图谱中可以显示，使用0.3％三氯乙酸沉淀效果较差，有较多杂质峰，糖巨肽的峰面积比例均低于10％。
对比例5
酪蛋白糖巨肽的提取分离
步骤1、取生牛乳适量，在8000r/min、3℃下进行离心10min，去除脂肪，取脱脂乳备用。
步骤2、取脱脂乳升温至30℃，搅拌条件下，用1mol/L盐酸调节pH值至4.7，收集沉淀S1，纯水洗涤沉淀S1，备用。
步骤3、取沉淀S1置于纯水中，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至11，升温至45℃搅拌条件下溶解，低温3℃调节pH值至6.86。
步骤4、取上述pH值为6.86的水溶液，加凝乳酶(1mol/LNaCl溶解)于35℃水浴中酶解45min，再加入0.8％三氯乙酸，离心得上清液L1。
步骤5、取上清液L1再加入8％三氯乙酸，离心后，收集沉淀，用丙酮多次洗涤去掉残余三氯乙酸，烘干后得到糖巨肽。
按实施例1相同的方法和条件对对比例5制备的糖巨肽进行液相色谱分析，得到图6所示的图谱。
从图6的图谱中可以显示，使用0.8％三氯乙酸沉淀效果较差，有较多杂质峰，糖巨肽的峰面积比例均低于10％。
对比例6
酪蛋白糖巨肽的提取分离
步骤1、取生牛乳适量，在8000r/min、3℃下进行离心10min，去除脂肪，取脱脂乳备用。
步骤2、取脱脂乳升温至30℃，搅拌条件下，用1mol/L盐酸调节pH值至4.7，收集沉淀S1，纯水洗涤沉淀S1，备用。
步骤3、取沉淀S1置于纯水中，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至11，升温至45℃搅拌条件下溶解，低温3℃调节pH值至6.86。
步骤4、取上述pH值为6.86的水溶液，加凝乳酶(1mol/LNaCl溶解)于35℃水浴中酶解45min，再加入0.5％三氯乙酸，离心得上清液L1。
步骤5、取上清液L1再加入2％三氯乙酸，离心后，收集沉淀，用丙酮多次洗涤去掉残余三氯乙酸，烘干后得到糖巨肽。
按实施例1相同的方法和条件对对比例6制备的糖巨肽进行液相色谱分析，得到图7所示的图谱。
从图7的图谱中可以显示，取上清液L1再加入2％三氯乙酸，离心后，收集沉淀，沉淀效果较差，有较多杂质峰，糖巨肽的峰面积比例均低于10％。
本发明提供了一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，分离提取过程中，首先用凝乳酶对酪蛋白进行酶解反应，然后选择两种不同质量浓度范围的三氯乙酸溶液进行反应，可以将酪蛋白中的β酪蛋白、α酪蛋白及酶解副产物进行有效的分离，并将糖巨肽进行高效的提取，该方法操作简单，设备要求低，易于控制，便于推广，产品含杂质量少，纯度可达95％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将酪蛋白溶解于pH为5.0～6.86的水溶液中，然后加入加凝乳酶于水浴中酶解，得到第一物料；
步骤2、将所述步骤1得到的第一物料与质量浓度为0.4％～0.6％的第一三氯乙酸溶液进行混合，离心，得上清液；
步骤3、将所述步骤2得到的上清液与质量浓度高于8％的第二三氯乙酸溶液混合，离心，收集沉淀；
步骤4、将步骤3得到的沉淀洗涤、烘干，得到酪蛋白糖巨肽。
2.根据权利要求1所述的分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述步骤1中的酪蛋白由以下方法分离提取出来的：
步骤A、将脱脂牛乳升温至25-40℃，搅拌条件下，用盐酸调节pH值至4.6～4.8，收集沉淀，纯水洗涤沉淀后备用；
步骤B、将所述步骤A得到的沉淀置于水中，用氢氧化钠调节pH值至10～12，过滤，将沉淀物进行洗涤，得到酪蛋白。
3.根据权利要求2所述的分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述步骤A中，脱脂牛乳由以下步骤制备得到的：取生牛乳适量，然后在6000～8000r/min、2-4℃下离心8-15min，去除脂肪，得到脱脂牛乳。
4.根据权利要求1所述的分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述步骤1中，水浴的温度为35℃～42℃。
5.根据权利要求1所述的分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述步骤1中，酶解的时间为45min～60min。
6.根据权利要求1所述的分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述步骤2中，所述第一三氯乙酸溶液的质量浓度为0.5％。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的分离提取酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述步骤3中，所述第二三氯乙酸溶液的质量浓度为8％～12％。
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