JPH04198198A - ｋ―カゼイングリコマクロペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、種々の生理活性をもつκ−カゼイングリコマ
クロペプチドを簡便に製造する方法に関する。

（従来の技術） に−カゼイングリコマクロペプチドは、牛乳のに一カゼ
インにレンネット又はペプシンを作用させた時に生成す
るシアル酸結合ペプチドであって、チーズホエー中に含
まれることが、従来から知られている。

従来、に−カゼイングリコマクロペプチドの製造法とし
ては、実験室的には、牛乳から単離したに一カゼインを
脱イオン水に溶解したものにペプシンを作用させた後、
トリクロル酢酸を加えてバラ−に一カゼイン画分を沈澱
させ、次いで得られた上滑を脱イオン水に対して透析し
て脱塩した後、凍結乾燥することより調製する方法（ス
タン等「プルティン　オブ　エクスペリメンタル　バイ
オロジー　アンド　メディシンＪ　　（Ｂｕｌｌｕｔｉ
ｎ　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　９６　８８９（１９８３
））　、または、上記に一カゼインを脱イオン水に溶解
し、該溶液のｐＨを６．７に調整した後、レンネットを
作用させ、次いで更にｐＨを４．６に調整してパラ−に
一カゼインを沈澱させて除去し、得られた上滑を透析に
付して脱塩した後、凍結乾燥して調製する方法（アカデ
ミツクブレス社発行「ミルクプロティンＪ　　（Ｍｉｌ
ｋ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）　ｐｐ２００）等が行われていた
。

しかし、これらの方法は、実験室的のものであるから、
当然大量生産には適さない。

一方、に−カゼイングリコマクロペプチドの産業上の利
用性が従来知られていなかったため、その大量生産のた
めの方法についても検討されていなかった。

ところが、最近になってκ−カゼイングリコマクロペプ
チドが犬の食欲を低下させる作用を有すること（スタン
等、「プルティン　オブ　エクスペリメンタル　バイオ
ロジー　アンド　メディシンＪ　　（Ｂｕｌｌｕｔｉｎ
　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
ａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ）　９６．８８９　（１９８３
））が報告されたことから、肥満防止用食品素材として
利用され得ることが判った。

更に、その後、に−カゼイングリコマクロペプチドには
大腸菌の腸管細胞への付着を阻止したり、インフルエン
ザウィルスの感染を防御する効果（特開昭６３−２８４
１３３号）や抗歯垢効果（特開昭６３−２３３９１１号
）のあることが判明したことから、その工業的規模での
生産が強く望まれるようになった。

（発明が解決しようとする課題） かかる状況にあって、レンネットカゼインカードのホエ
ーからκ−カゼイングリコマクロペプチドを調製する方
法が開発されたく特開昭６３−２８４１９９号）。この
方法は、従来用いてきたトリクロル酢酸を使わなくても
良いことから食品素材として充分利用可能であり、また
、大量生産も可能である。しかし、レンネットカゼイン
カードホエーを得る際に副生じてくるレンネットカゼイ
ンカードの上手な利用法を開発しない限り、カードの処
理にコストがかかり、ひいては、に−カゼイングリコマ
クロペプチドの製造コストを引き上げることになり、実
際的ではない。

ところで、本発明者らは、に−カゼイングリコマクロペ
プチドの分子量がｐＨ４を境にしてシャープに変化する
性質を見出し、この性質を利用して簡便で、安価にκ−
カゼイングリコマクロペプチドを製造する方法を見い出
した（特開平２−２７６５４２号）。

この発明は、に−カゼイングリコマクロペプチドを含有
する乳質原料物質、例えばチーズホエー、ホエー蛋白質
濃縮物、除蛋白質チーズホエー等を、まずｐＨ４未満に
調整した後、分画分子量１０，０００〜ｓｏ　、　ｏｏ
ｏの膜を用い、限外濾過処理をして透過液を得、好まし
くは再度、該透過液をｐＨ４以上に調整した後、分画分
子量ｓｏ　、　ｏｏｏ以下の膜を用いて脱塩し濃縮する
ことを特徴とするκ−カゼイングリコマクロペプチドの
製造法である。

この発明によればチーズホエー、ホエー蛋白質濃縮物、
除蛋白質チーズホエー等のｐＨを制御するだけで、に−
カゼイングリコマクロペプチドを簡便に、大量にかつ安
価に製造し得る。しかもその純度も高い。

更にホエー蛋白質濃縮物を通常製造している工場におい
ては新たに設備投資しなくても、既存の限外濾過装置や
逆浸透濾過装置を用いてκ−カゼイングリコマクロペプ
チドを製造することが可能であり、に−カゼイングリコ
マクロペプチド以外の蛋白質画分は、ホエー蛋白質濃縮
物として利用することが可能である。

しかし、この方法ではκ−カゼイングリコマクロペプチ
ドの製造コストを引き下げるため、実際には製造時に副
生ずるホエー蛋白質を中和してから脱塩、乾燥し、ホエ
ー蛋白濃縮物とせねばならなかった。又、ホエーを限外
濾過にて濃縮し、に−カゼイングリコマクロペプチドを
回収する際、タンパク質のファウリングにより透過流束
が低下するため、運転に長時間を要する等の問題も残さ
れていた。

また、このほかにに−カゼイングリコマクロペプチドを
大量生産する技術として特願平２−９５６８６号の方法
も知られている。この方法はホエー蛋白含有溶液を加熱
した後、凍結し、さらにこの凍結物を解凍した時に得ら
れる上滑液を濃縮、脱塩することによってκ−カゼイン
グリコマクロペプチドを得る方法で、コスト、作業時間
の点で優れているが、純度の高いものが得られないとい
う欠点があった。

本発明は、に−カゼイングリコマクロペプチドの大量調
製法に関して、純度、コスト、作業時間、労力ともに有
利な方法を提供することを目的とする。さらに、ホエー
タンパク単離物質をイオン交換樹脂にて調製する際、主
要なホエー蛋白質は樹脂に吸着するが、イオン交換体に
吸着しない画分中に、に−カゼイングリコマクロペプチ
ドが豊富に含有されていることを見い出し、この画分か
らκ−カゼイングリコマクロペプチドを調製する方法を
提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は、に−カゼイングリコマクロペプチドを含有す
る乳質原料物質をイオン交換体と接触させ、イオン交換
体に吸着しなかった百分を集め、これを濃縮脱塩するこ
とを特徴とするκ−カゼイングリコマクロペプチドの製
造法である。

好ましくは、濃縮脱塩に際し、イオン交換体に吸着しな
かった両分のｐＨを４未満に調整した後、分画分子量１
０，０００〜ｓｏ、ｏｏｏの膜を用い、限外濾過処理を
行い透過液を得て、この透過液に分画分子量５０．００
０以下の膜を用いる。

さらに、好ましくは限外濾過処理により得られた透過液
を再度ｐＨ４以上に調整する。

また、透過液に分画分子量１０，０００以下の膜を用い
ることが好ましい。

ホエータンパク単離物質をイオン交換樹脂にて調製する
際、主要なホエー蛋白質は樹脂に吸着するが、イオン交
換体に吸着しない画分からκ−カゼイングリコマクロペ
プチドを得る際、そのまま濃縮、脱塩、乾燥しても良い
が、さらに高純度のものを得ようという場合においては
、（特願平１−９７５８３号）に示す方法を用いること
ができる。すなわち−旦、この画分のｐＨを４以下に調
整し、分画分子量１０，０００〜ｓｏ、　ｏｏｏの限外
濾過膜にて処理を行い、得られた透過液を再びｐＨ４以
上として濃縮、脱塩、乾燥を行い、に−カゼイングリコ
マクロペプチドを得る。

本発明による方法を用いれば、限外濾過処理時ホエー蛋
白質のファウリングが起こりに＜＜、大きな透過液流束
が得られるため、短い作業時間でしかも高純度のに〜カ
ゼイングリコマクロペプチドを得ることができる。

以下に、本発明によるχ−カゼイングリコマクロペプチ
ドの調製法の詳細を記載し、説明する。

イオン交換体にホエータンパク質を吸着させる技術につ
いては、すでに公知であり、例えばウィト（Ｊ、Ｎ、ｄ
ｅ　Ｗｉｔ）らの方法（Ｎｅｔｈ、　Ｍｉｌｋ　Ｄａｉ
ｒｙ　Ｊ、＋４０、４１〜５６　（１９８６））、エイ
ヤース（Ｊ、Ｓ、Ａｙｅｒｓ）　らの方法（Ｎｅｗ　Ｚ
ｅａｌａｎｄ　Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、　ａｎｄ　
Ｔｅｃｈ、＋針、２１〜３５　（１９８６））、特開昭
５２−１５１２００号、特開平２−１０４２４６号など
が例示される。

使用する原料としては、に−カゼイングリコマクロペプ
チドを含有する乳質原料物質であれば何でも良く、例え
ばチーズホエー、チーズホエーを限外濾過して製造した
ホエー蛋白質濃縮物、又は、加熱等の方法でホエー蛋白
質を沈澱除去したチーズホエーや乳糖母液を用いること
ができる。

ホエー蛋白質濃縮物を用いる場合は、水で還元したもの
を出発原料とするが、この時の濃度については特に限定
するものではない。チーズホエーはどんなものでもよい
が、カゼインのカードや脂肪が少量残存していることが
多いので、遠心分離、クリームセパレーター、或いはタ
ラリファイヤー等でこれらを除去しておく。加熱して蛋
白を除いたチーズホエー中には乳糖が主成分となってお
り乳糖が沈澱してくることがある。この場合には沈澱し
た乳糖を遠心分離、タラリファイヤー或いはデカンタ−
等で除去しておくとよい。

これら原料について、用いるイオン交換体に応じてｐＨ
を調整する。例えば、カルボキシメチル基を交換基とす
るイオン交換体ではｐＨ３〜４．５、ジエチルアミノエ
チル基を交換基とするイオン交換体ではｐＨ６〜７とす
る。この時、ｐＨ調整に用いる物質は何でも良いが、例
えば酸であれば塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸等が
例示でき、アルカリであれば、苛性ソーダ、重炭酸ソー
ダ、アンモニア等が例示される。また、イオン交換体も
これらの他にスルホン基を交換基とするもの、４級アミ
ンを交換基とするものなどが例示される。原料中のホエ
ー蛋白質をイオン交換体に吸着させる方法については前
述の公知の方法に従って行い、その後、イオン交換体に
吸着した画分と非吸着の画分に分ける。

また、樹脂と原料を接触させる際、効率を上げ、かつ大
量に処理するために、特開平２−１３８２９５号に開示
された回転型カラムを用いることが、さらに望ましい。

こうして得られた非吸着画分をそのまま濃縮脱塩しても
良いが、に−カゼイングリコマクロペプチドはｐＨ４を
境として、それ以下では、モノマー（分子量９，０００
）、それを超えるとポリマー（分子量４０，０００〜５
０，０００）として存在するので、限外濾過にて濃縮脱
塩を行う時、溶液のｐ）Ｉが４以下の場合は、分画分子
量１０，０００以下の膜を用いなければならない。

また、さらに高純度のκ−カゼイングリコマクロペプチ
ドを得ようとする場合は、この非吸着画分のｐＨを４未
満、好ましくは３±０．５に調整する。

ｐＨが４以上になるとκ−カゼイングリコマクロペプチ
ドは互いに会合するために分子量が高くなり膜を通過し
にくくなる。ｐＨの下限は特に制限はないが、ｐＨ２，
５以下になるとκ−カゼイングリコマクロペプチドに結
合しているシアル酸が不安定となり、生理効果が減少す
ることがある。但し、脱シアル酸κ−カゼイングリコマ
クロペプチドを得ようとする場合には、ＰＨ２，５以下
であっても構わない。ｐＨの調整は酸であれば、塩酸、
硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸等、アルカリであれば、苛
性ソーダ、重炭酸ソーダ、アンモニア等を例示し得る。

ｐＨ調整後、限外濾過を行うが、用いる膜の分画分子量
は１０，０００〜５０，０００である。分画分子量１０
．０００未満の膜を用いるとκ−カゼイングリコマクロ
ペプチドが透過しにくくなり、ｓｏ　、　ｏｏｏを超え
る膜ではκ−カゼイングリコマクロペプチドは透過する
ものの共存するホエー蛋白質の一部も透過し、に−カゼ
イングリコマクロペプチドの純度が低くなる。通常、ホ
エー蛋白質濃縮物の製造工程では分画分子量２０，００
０程度の膜を装着したモジュールで限外濾過することが
一般的であり、これと同じ膜を用いることができる。

限外濾過は、可能な限り濃縮し透過液を得ることが歩留
を向上させる上で好ましい。濃縮液に加水し、再度限外
濾過したり、これを繰り返すことは更に好ましい。又、
この際、透過流束を上げるために５０℃位に加温しても
良い。しかし、６０℃を超えるとホエー蛋白質が沈澱、
或いはゲル化してくるために６０℃以下で行うことが望
ましい。濃縮液はｐＨを中性に戻した後に乾燥し、ホエ
ー蛋白質濃縮物粉末とすることができる。

このようにして得られた透過液にはκ−カゼイングリコ
マクロペプチドの他に、乳糖やミネラルが含まれ、又、
に−カゼイングリコマクロペプチドの濃度も低いので脱
塩、濃縮を行うが、これには２通りの方法がある。

まず第１の方法は、透過液のｐＨを４以上に戻した後に
分画分子量５０，０００以下の膜で限外濾過、ダイアフ
ィルトレージョン、又は逆浸透濾過を行う。

ｐＨの調整はアルカリ剤なら何でも良く、例えば水酸化
ナトリウム、重炭酸ナトリウム、アンモニア水等を用い
ることができる。に−カゼイングリコマクロペプチドは
ｐＨ４を境として、それ以下ではモノマー（分子量９，
０００）、それを超えるとポリマー（分子量４５．００
０）になることから目的に応じてｐＨ５以上とすること
が好ましい。又、用いる膜は分画分子量５０，０００以
下なら何でも良いが、５０，０００を超える膜ではκ−
カゼイングリコマクロペプチドが透過してしまう。一般
のホエー蛋白質濃縮物製造工程中で用いられている分画
分子量２０，０００程度の膜を用いるのが最も簡便であ
る。

透過液のｐＨを４以上に戻さなかった場合には、に−カ
ゼイングリコマクロペプチドはモノマーで存在するので
第２の方法を用いる。すなわち、分子量分画１０，００
０以下の膜、好ましくは８．０００以下の膜で限外濾過
、ダイアフィルトレージョン、或いは逆浸透濾過を行い
濃縮液を得る。

いずれの方法においても、電気透析やイオン交換樹脂に
よる脱塩工程を組み合わせることには全く問題がない。

こうして得られた濃縮液には本質的にκ−カゼイングリ
コマクロペプチドしか含まれていないので、噴霧乾燥又
は凍結乾燥等の手段によって乾燥する。尚、に−カゼイ
ングリコマクロペプチドは熱に対して安定なために乾燥
工程の前に殺菌工程を入れることは更に望ましい。

（発明の効果） このように本発明によれば、ホエープロティン単離物質
製造時に副生ずるイオン交換体に非吸着の両分を利用し
て、に−カゼイングリコマクロペプチドを簡便に製造す
ることができる。この場合、原料は副生物であるため、
に−カゼイングリコマクロペプチドのコストを引き下げ
ることができ、主要なホエー蛋白質を除いであるため、
限外濾過処理時、従来法より蛋白質のファウリングによ
る透過流束の減少も起こしに＜＜、作業時間も短縮され
る。また、トリクロル酢酸等の添加物を一切使用してい
ないので、食品素材や医薬品素材としてκ−カゼイング
リコマクロペプチドを応用することが可能であり、産業
界にとって極めて有益である。

（実施例） 以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。

実施例１ ゴーダチーズホエー１０ｋｇを塩酸にてｐ）Ｉ４．ｏに
調整した。ＣＭ−セファデックスＣ−５０（ファルマシ
ア社製、商品名）２５ｇを４０℃の水にて膨潤させてお
き、上記のチーズホエーと混合し、２０時間ゆっくり攪
拌し、濾過用金網フィルターにて、非吸着画分とイオン
交換体を分離した。得られた非吸着画分９．９ｋｇをプ
ールし、これを５０℃にて分画分子量２０．０００の限
外濾過膜（ＤＤＳ社製、商品名ＧＲ６１ｐｐ）にて限外
濾過し、濃縮液をダイアフィルトレージョンにて脱塩し
、さらに、凍結乾燥することによってκ−カゼイングリ
コマクロペプチド粉末１６０ｍｇを得た。ウレア−５Ｏ
５電気泳動で分析したところ純度５５％であった。

実施例２ 実施例１と同様にしてゴーダチーズホエー１０ｋｇから
、ＣＭ−セファデックスＣ−５０に吸着しない画分９．
８ｋｇを得た。これを塩酸にてｐＨ３，０とし、分画分
子量２０，０００の限外濾過膜を用い、５０℃にて限外
濾過し、透過液８．９ｋｇを得た。この透過液に２５％
苛性ソーダを加え、ｐ）１７．０とし、分画分子量２０
．０００の限外濾過膜にて濃縮し、続いてダイアフィル
トレージョンにて脱塩、さらに凍結乾燥し、に−カゼイ
ングリコマクロペプチド８１１ｍｇを得た。

ウレア−５ＤＳｉｉ気泳動で分析したところ純度８８％
であった。

実施例３ 実施例１と同様にしてゴーダチーズホエー１０ｋｇから
、ＣＭ−セファデックスＣ−５０に吸着しない画分９．
８ｋｇを得た。これを塩酸にてｐＨ３，５とし、分画分
子量２０，０００の限外濾過膜を用い、５０℃にて限外
濾過し、透過液８．９ｋｇを得た。この透過液を分画分
子量８，０００の限外濾過膜（ＤＤＳ社製、ＧＲ８１ｐ
ｐ）にて濃縮し、続いてダイアフィルトレージョンにて
脱塩、さらに凍結乾燥し、に−カゼイングリコマクロペ
プチド９０ｍｇを得た。ウレア−３ＤＳｔ気泳動で分析
したところ純度８０％であった。

実施例４ ゴーダチーズホエー１０ｋｇ、　ｐＨ６，４を、４０℃
の水で膨潤させたＤＦＡＥセファデックスＡ−５０（フ
ァルマシア社製）２５ｇを充填した充填層型カラムに、
毎時０．５１！の流速で通した。その後、水でカラムを
洗浄し、合計１２ｋｇの非吸着ホエーを得た。

この非吸着画分について実施例２と同様の処理を行い、
に−カゼイングリコマクロペプチド粉末５５Ｐｓｇを得
た。ウレア−３ＤＳｉ４気泳動で分析したところ純度８
０％であった。

実施例５ 塩酸にてｐＨ３，０に調整したゴーダチーズホエー１０
ｋｇを５０℃の水で膨潤させたインジオン（Ｉｎｄｉａ
ｎ）Ｓ２　（フェニノクスケミカル社製）　４００ｇを
充填した内容積２．３１の回転カラムに毎時１００Ｉ！
の流速で１時間通液した。次いで、水を同じ流速で１０
分間通液し、樹脂を洗った。循環通液したホエーおよび
洗液、合計約２６ｋｇについて実施例２と同様の処理を
行い、に−カゼイングリコマクロペプチド粉末５９ｍｇ
を得た。ウレア−３ＤＳ電気泳動による分析の結果、純
度８２％であった。

実施例６ 塩酸にてｐＨ３，３に調整したゴーダチーズホエー２０
０ｋｇを５０℃の水で膨潤させたビスチク（Ｖｉｓｔｅ
ｃ）ＣＭ　（ビスコースグループ社製）５１を充填した
内容積１４βの回転カラムに毎時１０００７！の流速で
４時間通液した。さらに、水で同じ流速で３分間洗浄し
、非吸着ホエーおよび洗液、合計約２３０ｋｇを得た。

次いで回転型カラムに流速毎時１０００　Ａにて５分間
０．２モルＮａＪＰＯ４を含む１モルＮａＣｌ　（ｐＨ
８，４）を通液し、吸着ホエー蛋白質を回収した。回収
蛋白質は、分画分子量２０，０００の膜を備えた限外濾
過装置（ＤＤＳ社製、ＧＲ６１ｐｐ）で限外濾過し、濃
縮液は、さらにダイアフィルトレージョンを行った。

次いで濃縮後、噴霧乾燥し、ホエー蛋白質ｊｌＬＭ物質
約２ｋｇを得た。

一方、非吸着画分は、ｐ）Ｉを塩酸で２．０に調整した
後、実施例２と同様に限外濾過および脱塩を行い、約２
０１を得た。これをさらにロータリーエバポレーターで
１２０ｍ１まで濃縮し、パルビスミニスプレーＧＡ−３
１（ヤマト社）を用い、入口温度１５０℃、出口温度８
５℃にて噴霧乾燥し、に−カゼイングリコマクロペプチ
ド１７ｇの粉末を得た。ウレア−３Ｏ５電気泳動で分析
した結果、純度７９％であった。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）κ−カゼイングリコマクロペプチドを含有する乳
   質原料物質をイオン交換体と接触させ、イオン交換体に
   吸着しなかった画分を集め、これを濃縮脱塩することを
   特徴とするκ−カゼイングリコマクロペプチドの製造法
   。
2. （２）濃縮脱塩に際し、イオン交換体に吸着しなかった
   画分のｐＨを４未満に調整した後、分画分子量１０，０
   ００〜５０，０００の膜を用い、限外濾過処理を行い透
   過液を得て、この透過液に分画分子量５０，０００以下
   の膜を用いることを特徴とする請求項１記載のκ−カゼ
   イングリコマクロペプチドの製造法。
3. （３）限外濾過処理により得られた透過液を再度ｐＨ４
   以上に調整する請求項２記載のκ−カゼイングリコマク
   ロペプチドの製造法。
4. （４）透過液を処理するに際し、分画分子量１０，００
   ０以下の膜を用いる請求項２記載のκ−カゼイングリコ
   マクロペプチドの製造法。