KR20150091329A - 카세이노매크로펩티드를 함유하는 조성물을 생성하는 방법 - Google Patents

카세이노매크로펩티드를 함유하는 조성물을 생성하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 매우 낮은 함량의 페닐알라닌(Phe)을 갖는 카세이노매크로펩티드(CMP)-함유 조성물을 고수율로 생성하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 방법은 유장(whey) 유래 공급물에 한외여과 및 후속 양이온 교환의 조합을 거치게 하는 단계를 포함한다.

Description

카세이노매크로펩티드를 함유하는 조성물을 생성하는 방법{METHOD OF PRODUCING A COMPOSITION CONTAINING CASEINOMACROPEPTIDE}
본 발명은 매우 낮은 수준의 페닐알라닌(Phe)을 갖는 카세이노매크로펩티드(CMP)-함유 조성물을 고수율로 생성하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 방법은 유장(whey) 유래 공급물에 한외여과 및 후속 양이온 교환 크로마토그래피의 조합을 거치게 하는 단계를 포함한다.
CMP는 갈락토사민, 갈락토스 및 o-시알산에 의한 다양한 글리코실화 패턴 및 상이한 글리코실화 정도로 인해 매우 불균질한 펩티드이다. 이러한 이유로 CMP는 단일 차지(charge)를 갖지 않으나, 실제로는 차지들의 분포가 존재한다.
CMP는 Phe를 함유하지 않는 독특한 천연 발생 펩티드이다. CMP는, 예를 들어 치즈-제조 과정 동안, 키모신이 아미노산 잔기 105와 106 사이에서 κ-카세인을 특이적으로 절단할 때 형성된다. 파라-κ-카세인(잔기 1 내지 105)이 응고되어서 치즈 커드를 형성하며, 이와 동시에 CMP(잔기 106 내지 169)가 유장 중에 남아 있게 된다. CMP는 β-락토글로불린(BLG) 및 α-락트알부민(ALA)의 뒤를 이어, 감미 유장(sweet whey) 중에 존재하는 세 번째로 가장 풍부한 단백질이다.
Phe의 결여는 CMP를 페닐케톤뇨증(PKU)을 앓는 사람들에게 흥미로운 단백질 공급원이 되게 한다.
유장으로부터 CMP를 단리하기 위한 몇몇 시도가 종래 기술에서 기술되어 왔다.
US 5,278,288은 CMP를 생성하기 위한 방법을 개시하는데, 이 방법에서는 치즈 유장에 양이온 교환을 거치게 하고, 이어서 비-결합된 분획(fraction)에 낮은 pH에서 한외여과를 거치게 하여, 그럼으로써 단량체성 CMP 및 다른 불순물을 한외여과 투과물 중에 단리한다. 생성된 투과물의 pH는 최종적으로 pH 7로 조정하는데, 이는 CMP 올리고머의 형성으로 이어지고, CMP 올리고머를 한외여과에 의해 농축시킨다. 생성된 조성물의 Phe-함량은 US 5,278,288에 언급되어 있지 않다.
WO 99/18808은 CMP를 회수하는 또 다른 방법을 개시한다. 보다 구체적으로는, WO 99/18808은 치즈 유장에, 순차적으로 수행되는 반대 극성의 2개의 이온 교환 단계를 거치게 하는 공정을 기재한다. 상기 언급된 US 5,278,288은 WO 99/18808의 배경기술 섹션에 논의되어 있으며, 여기에는 US 5,278,288의 방법의 CMP 회수가 비경제적으로 낮다고 언급되어 있다.
WO 98/14071은 CMP-조성물을 생성하는 방법을 개시한다. 이 방법은 치즈 유장에 음이온 교환 공정 및 이어서 양이온 또는 음이온 교환 공정일 수 있는 제2 이온 교환 공정을 거치게 하는 단계를 포함한다. 생성된 CMP 조성물은 염산에 의한 단백질 가수분해 후에 결정된 아미노산의 총량에 대해 많아야 0.5% (w/w)의 Phe-함량을 갖는 것으로 되어 있다.
당업계에서의 일반적인 이해와는 대조적으로(예를 들어, WO 99/18808, 2면 참조), 본 발명자들은 한외여과와 양이온 교환의 조합이 유장-유래 공급물로부터 CMP를 분리하는 경제적인 공정으로 이어질 수 있음을 알아내었다. 그러나, 이는, 양이온 교환 단계에 이어 한외여과 단계를 개시하는 US 5,278,288에서와 달리, 한외여과 단계가 양이온 교환 단계 전에 수행될 것을 필요로 한다.
본 발명을 사용함으로써, 매우 높은 수율로 그리고 매우 낮은 함량의 Phe를 가지면서 CMP가 경제적으로 단리될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 낮은 함량의 페닐알라닌을 갖는 카세이노매크로펩티드-함유 조성물을 생성하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은
a) 카세이노매크로펩티드(CMP) 및 적어도 하나의 추가 단백질을 포함하고 많아야 4의 pH를 갖는 유장-유래 공급물을 제공하는 단계,
b) 단량체성 CMP의 통과를 가능하게 하는 한외여과(UF) 필터를 사용하여 상기 유장-유래 공급물에 한외여과를 거치게 함으로써, UF 투과물(permeate) 및 UF 잔류물(retentate)을 제공하며, 이때 UF 투과물은 CMP에 대해 부화(enrich)된 것인 단계,
c) 상기 UF 투과물로부터 유래된 제1 조성물을 양이온 교환 재료와 접촉시키는 단계, 및
d) 양이온 교환 재료에 결합되지 않은 제1 조성물의 분획을 수집함으로써 CMP-함유 조성물을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "카세이노매크로펩티드" 또는 "CMP"는, 예를 들면, 예를 들어 치즈 제조 과정 동안, 키모신에 노출시에 κ-카세인으로부터 방출될 수 있는 펩티드를 지칭한다. 용어 CMP는 CMP의 글리코실화 형태 및 비-글리코실화 형태 둘 모두를 포괄한다. 과학적 문헌에서, CMP는 또한 때때로 카세이노글리코매크로펩티드(cGMP) 또는 글리코매크로펩티드(GMP)로 지칭된다.
낮은 pH에서, CMP는 "단량체성 CMP"로도 지칭되는 단일 CMP 분자들로 존재한다. 더 높은 pH에서, 단일 CMP 분자들은 응집되기 시작하며, 이에 따라 CMP 이량체(2개의 단일 CMP 분자들의 복합체) 또는 CMP 올리고머(2개 초과의 단일 CMP 분자들의 복합체)를 형성한다.
본 발명과 관련하여, 낮은 함량의 페닐알라닌(Phe)을 갖는 조성물은 조성물의 단백질의 총량에 대해 많아야 0.5% (w/w)의 Phe를 함유한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 심지어 더 낮은 함량의 Phe가 바람직할 수 있다. 조성물의 Phe 함량은 규격[ISO 13903:2005(Animal feeding stuffs - Determination of amino acids content)]에 따라 결정된다.
도 1은 UF 투과물(3)이 제1 조성물로서 사용되는 본 발명의 일 구현예의 개략도이다.
도 2는 UF 투과물(3)이 제1 조성물로서 사용되고, UF 잔류물(2)이 물(5)로 희석되고 공급물(5)로서 한외여과 시스템으로 재순환되는 본 발명의 일 구현예의 개략도이다.
도 3은 3개의 UF 유닛이 순차적으로 배열되어서, 먼저 유장-유래 공급물(1)을 여과하고, 이어서 제1 UF 유닛으로부터의 UF 잔류물(2)을 물(5)로 희석시키고, 마지막으로 제2 UF 유닛으로부터의 UF 잔류물(2')을 또한 물(5)로 희석시키는 본 발명의 일 구현예의 개략도이다. 3개의 UF 유닛의 UF 투과물(3, 3', 3")을 합해서 제1 조성물로서 사용한다.
본 발명의 일 양태는 낮은 함량의 페닐알라닌을 갖는 카세이노매크로펩티드-함유 조성물을 생성하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은
a) 카세이노매크로펩티드(CMP) 및 적어도 하나의 추가 단백질을 포함하고 많아야 4의 pH를 갖는 유장-유래 공급물을 제공하는 단계,
b) 단량체성 CMP의 통과를 가능하게 하는 한외여과 필터를 사용하여 상기 유장-유래 공급물에 한외여과를 거치게 함으로써, UF 투과물 및 UF 잔류물을 제공하며, 이때 잔류물은 CMP에 대해 부화된 것인 단계,
c) 상기 UF 투과물로부터 유래된 제1 조성물을 양이온 교환 재료와 접촉시키는 단계, 및
d) 양이온 교환 재료에 결합되지 않은 제1 조성물의 분획을 수집함으로써 CMP-함유 조성물을 수득하는 단계를 포함한다.
유장-유래 공급물은 한외여과를 거치게 될 액체 공급물이다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어, 전형적으로 유장의 가공 동안 수득되는 공정 스트림들 중 하나일 수 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "유장"은 카세인, 특히 카파-카세인의 효소적 절단에 의해 카세인이 응고될 때 수득되는 액체 분획을 지칭하는데, 이는, 예를 들어 렌넷-기반 치즈 생성 동안 발생되는 바와 같다.
유장-유래 공급물에서, 총 단백질의 적어도 50% (w/w)는 유장으로부터 기원한다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장-유래 공급물의 총 단백질의 적어도 90% (w/w), 바람직하게는 실질적으로 전부는 유장으로부터 기원한다.
유장은 바람직하게는 포유류의 젖, 예컨대 이를테면 인간, 소, 양, 염소, 버팔로, 낙타, 라마, 말 및/또는 사슴으로부터의 젖의 유장이다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장-유래 공급물은 우유로부터 유래된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장-유래 공급물은 치즈 유장 또는 이의 농축물로부터 유래된다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 치즈 유장 또는 이의 단백질 농축물로 이루어질 수 있다.
본 발명과 관련하여, 액체의 "단백질 농축물"이라는 용어는 원래 액체의 단백질의 실질적으로 전부를 함유하지만 더 적은 물 및 선택적으로 또한 더 적은 염, 탄수화물, 및 다른 소분자를 함유하는 액체 조성물 또는 분말형 조성물을 지칭한다. 단백질 농축물은, 예를 들어 증발에 의해 제조되거나, 또는 저분자량 컷-오프 막을 사용하여 한외여과에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유장-유래 공급물은 베타-락토글로불린-감소된 공급물 또는 이의 단백질 농축물로부터 유래된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 유장-유래 공급물은 렌넷-응고된 카세인 또는 카세이네이트 또는 이의 농축물로부터 수득된 유장으로부터 유래된다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 렌넷-응고된 카세인 또는 카세이네이트 또는 이의 농축물로부터의 유장으로 이루어질 수 있다. 이러한 유장은, 예를 들어 우유 대신에 미셀 카세인 단리물(micellar casein isolate)을 기반으로 한 치즈 생성 동안 수득된다.
유장-유래 공급물의 CMP 함량은 다양할 수 있으며, 어느 특정 유장-유래 공급물이 사용되는지에 좌우된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장-유래 공급물은 단백질 총량에 대해 적어도 1% (w/w)의 CMP 양을 함유한다. 예를 들어, 유장-유래 공급물은 단백질 총량에 대해 적어도 5% (w/w)의 CMP 양을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 유장-유래 공급물은 단백질 총량에 대해 적어도 10% (w/w)의 CMP 양을 함유한다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 적어도 15% (w/w)의 CMP 양을 함유할 수 있다.
유장-유래 공급물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 1 내지 60% (w/w) 범위의 CMP 양을 함유할 수 있다. 예를 들어, 유장-유래 공급물은 단백질 총량에 대해 5 내지 50% (w/w) 범위의 CMP 양을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 유장-유래 공급물은 단백질 총량에 대해 10 내지 40% (w/w) 범위의 CMP 양을 함유한다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 15 내지 30% (w/w) 범위의 CMP 양을 함유할 수 있다.
조성물, 예를 들어 유장-유래 공급물 또는 관련 생성물의 CMP의 양 및 총 단백질의 양은 바람직하게는 문헌[Thoma et al (Thoma, C., Krause, I. and Kulozik, U. (2006). Precipitation behaviour of caseinomacropeptides and their simultaneous determination with whey proteins by RP-HPLC. International Dairy Journal, 16, 285-293)]에 기재된 바와 같이 결정된다.
언급된 바와 같이, 유장-유래 공급물은 적어도 하나의 추가 단백질, 전형적으로 적어도 수 개의 추가 단백질을 함유한다. 추가 단백질은 통상 유장 중에 고유하게 존재하는 단백질을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 추가 단백질은 면역글로불린 G, 면역글로불린 M, 소혈청 알부민(BSA), 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민, 베타 카세인, 카세인-유래 펩티드, 우유 지방구막(MFGM) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "카세인-유래 펩티드"는 비록 CMP가 또한 카세인으로부터 유래될지라도 CMP를 포함하지 않음을 유의해야 한다.
예를 들어, 적어도 하나의 추가 단백질은 면역글로불린 G, 면역글로불린 M, 소혈청 알부민(BSA), 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민, 베타 카세인, 카세인-유래 펩티드, 우유 지방구막(MFGM) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질을 포함할 수 있다.
유장-유래 공급물은 유장에서 통상 발견되는 다른 성분들, 예컨대 염, 지방, 락토스 및 다른 탄수화물을 추가로 함유할 수 있다.
일반적으로, 유장-유래 공급물은 단지 소량의 카세인을 함유하는 것, 바람직하게는 카세인을 실질적으로 전혀 함유하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유장-유래 공급물은 단백질 총량에 대해 많아야 3% (w/w)의 카세인 총량을 함유한다.
예를 들어, 유장-유래 공급물은 단백질 총량에 대해 많아야 1% (w/w)의 카세인 양을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 유장-유래 공급물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.1% (w/w)의 카세인 양을 함유한다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 많아야 0.01% (w/w)의 카세인 양을 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장-유래 공급물은 유장-유래 공급물의 중량에 대해 적어도 0.2% (w/w)의 단백질 총량을 함유한다. 예를 들어, 유장-유래 공급물은 유장-유래 공급물의 중량에 대해 적어도 0.8% (w/w)의 단백질 총량을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 유장-유래 공급물은 유장-유래 공급물의 중량에 대해 적어도 2% (w/w)의 단백질 총량을 함유한다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 유장-유래 공급물의 중량에 대해 적어도 5% (w/w)의 단백질 총량을 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유장-유래 공급물은 유장-유래 공급물의 중량에 대해 0.2 내지 20% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유한다. 예를 들어, 유장-유래 공급물은 유장-유래 공급물의 중량에 대해 0.8 내지 15% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 유장-유래 공급물은 유장-유래 공급물의 중량에 대해 2 내지 14% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유한다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 유장-유래 공급물의 중량에 대해 4 내지 10% (w/w) 범위, 예컨대 이를테면 4 내지 8% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유할 수 있다.
유장-유래 공급물은 올리고머성 CMP 복합체를 단량체성 CMP로 해리하는 것을 유리하게 하는 pH를 갖는 것이 바람직하다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 pH 1 내지 4 범위의 pH를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유장-유래 공급물은 1.5 내지 3.8 범위의 pH를 갖는다. 예를 들어, 유장-유래 공급물은 2.0 내지 3.6 범위의 pH를 가질 수 있다. 유장-유래 공급물은, 예를 들어 2.5 내지 3.5 범위, 예컨대 이를테면 2.8 내지 3.2 범위의 pH를 가질 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 pH 값은 12℃에서 측정된다.
언급된 바와 같이, 단계 b)는 단량체성 CMP의 통과를 가능하게 하는 한외여과 필터를 사용하여 유장-유래 공급물에 한외여과를 거치게 함으로써, CMP에 대해 부화된 UF 투과물, 및 UF 잔류물을 제공하는 단계를 포함한다.
UF 투과물은, UF 투과물 중의 단백질 총량에 대한 CMP의 중량 백분율이 유장-유래 공급물의 것보다 더 높다는 의미에서, CMP에 대해 부화된다. UF 투과물 중의 CMP의 절대 농도가 유장-유래 공급물 중의 CMP의 절대 농도보다 더 낮은 일이 일어날 수 있지만, 이는 한외여과 필터가 CMP의 백분율보다 다른 단백질들의 백분율을 더 크게 잔류시키는 한 문제가 안 된다.
한외여과 공정의 구현의 예는, 예를 들어 유럽 특허 EP 1 037 537 B1에서 찾을 수 있으며, 이는 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
단계 b)는 초기 UF 잔류물의 이른바 투석여과(diafiltration)를 추가로 포함할 수 있는데, 이는 잔류물 중에 남아 있는 더 많은 CMP를 유출해내기 위한 것이다. 투석여과는 단백질을 실질적으로 전혀 함유하지 않는 액체로 초기 UF 잔류물을 희석시키는 것을 포함한다. 이러한 액체의 유용한 예는 물, 유장 또는 우유의 나노여과 투과물, 또는 유장 또는 우유의 CMP-무함유 UF 투과물이다. 대안적으로, 희석에 사용된 액체는 역삼투 투과물일 수 있다. 역삼투 투과물은, 예를 들어 우유, 유장, 우유 UF 투과물, 또는 유장 UF 투과물의 역삼투로부터 수득될 수 있으며, 물 및 작은 1가 이온들을 주로 포함한다.
이어서, 희석된 액체는 동일하거나 유사한 UF 필터를 사용하여 초기 UF 단계에 필요한 것과 동일하거나 유사한 조건 하에서 한외여과를 거치게 된다. 필요하다면, 희석된 잔류물의 pH는 많아야 pH 4의 pH로 조정되어야 한다. 제1 UF-투석여과 단계는 제1 UF-투석여과 투과물 및 제1 UF-투석여과 잔류물의 형성을 가져온다.
이 공정은 1회 이상 반복될 수 있으며, 매번마다 이전의 잔류물을 희석시키고, 필요하다면 pH-조정을 행하고, 이어서 새로운 공급물에 한외여과를 거치게 하는데, 그 결과 추가의 CMP 부화된 UF-투석여과 투과물들 및 추가의 CMP-감소된 UF-투석여과 잔류물들의 형성을 가져온다.
제1 및 추가의 UF-투석여과 투과물은 바람직하게는 초기 UF 투과물과 배합하여 제1 조성물의 일부를 형성한다.
한외여과 필터는 필터의 공급측 상에 더 큰 분자를 잔류시킬 수 있고 더 작은 분자의 통과를 가능하게 하는 구성요소이다. 한외여과 필터는, 예를 들어 특정 세공 크기 분포를 갖는 세공들을 함유하는 박막(thin membrane)일 수 있다.
한외여과 필터는 바람직하게는, 작동 동안 필터를 통해 단량체성 CMP의 통과를 가능하게 할 수 있도록, 그리고 베타-락토글로불린 및 바람직하게는 또한 유사한 유장 단백질을 잔류시킬 수 있도록 선택된다. 당업자에게 알려지는 바와 같이, 한외여과 필터의 분리 특성은 이의 물리적 및 화학적 구조 둘 모두, 공급 물질의 특성, 및 한외여과가 수행되는 공정 파라미터에 좌우된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 한외여과 필터는 5 내지 300 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프(nominal molecular weight cut-off)를 갖는다. 예를 들어, 한외여과 필터는 10 내지 150 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프를 가질 수 있다. 바람직하게는, 한외여과 필터는 20 내지 100 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프를 가질 수 있다. 한외여과 필터는, 예를 들어 30 내지 80 kDa 범위, 예컨대 이를테면 35 내지 60 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프를 가질 수 있다.
예를 들어, 한외여과 필터는 5 내지 100 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프를 가질 수 있다. 바람직하게는, 한외여과 필터는 10 내지 70 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프를 가질 수 있다. 한외여과 필터는, 예를 들어 15 내지 50 kDa 범위, 예컨대 이를테면 20 내지 40 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프를 가질 수 있다. 대안적으로, 한외여과 필터는 10 내지 50 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프를 가질 수 있다.
한외여과 필터의 공칭 분자량 컷-오프는 전형적으로 필터 제조업체에 의해 제공된다. "공칭 분자량 컷-오프"는 최저 분자량 용질(단위: 달톤)로 정의되는데, 여기서는 용질의 90%가 필터에 의해 잔류된다. "공칭 분자량 컷-오프"는 ASTM 표준 E 1343-90에 따라 결정된다.
한외여과는, 예를 들어, 십자류 여과를 위해 배열된 필터를 포함한 한외여과 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 필터 장치의 비제한적인 예는 나선형-권취 한외여과 시스템, 중공 섬유 막 시스템, 및 관형 막 시스템이다.
일부 바람직한 구현예에서, 한외여과 필터는 한외여과막, 바람직하게는 중합체 막이다. 대안적으로, 막은 금속 막 또는 세라믹 막일 수 있다.
유용한 한외여과 필터에 대한 더 많은 예는 문헌["Membrane filtration and related molecular separation technologies", APV Systems, Nielsen W.K. (Ed.), Silkeborg Bogtrykkeri A/S (2003), ISBN 8788016757-9788788016758]에서 찾을 수 있다.
한외여과 동안의 유장-유래 공급물의 온도는 넓은 범위 내에서 다양할 수 있지만, 전형적으로 온도는 5 내지 60℃의 범위 내인 것이 바람직하다. 예를 들어, 한외여과 동안의 유장-유래 공급물의 온도는 6 내지 40℃의 범위, 바람직하게는 7 내지 30℃의 범위, 더욱 더 바람직하게는 8 내지 20℃의 범위일 수 있다.
현재는 상기 언급된 구간들의 하단에서 유장-유래 공급물의 온도를 유지하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 한외여과 동안의 유장-유래 공급물의 온도는 5 내지 20℃의 범위, 바람직하게는 7 내지 16℃의 범위, 더욱 더 바람직하게는 8 내지 12℃의 범위이다.
한외여과 동안 사용되는 압력은 사용되는 UF 필터의 특정 유형 및 설계에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로, 0.2 내지 10 bar의 트랜스필터 압력이 사용된다. 트랜스필터 압력은, 예를 들어 1 내지 8 bar의 범위일 수 있다. 대안적으로, 트랜스필터 압력은, 예를 들어 2 내지 6 bar의 범위일 수 있다. 예를 들어, 트랜스필터 압력은 3 내지 5 bar의 범위, 예컨대 이를테면 약 4 bar일 수 있다.
한외여과의 실제적인 구현 및 작동에 관한 더 상세한 내용은 문헌["Membrane filtration and related molecular separation technologies", APV Systems, Nielsen W.K. (Ed.), Silkeborg Bogtrykkeri A/S (2003), ISBN 8788016757-9788788016758]의 서적에서 찾을 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, UF 투과물은 단백질 총량에 대해 적어도 55% (w/w)의 CMP 총량을 함유한다. 예를 들어, UF 투과물은 단백질 총량에 대해 적어도 60% (w/w)의 CMP 총량을 함유할 수 있다. UF 투과물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 적어도 65% (w/w)의 CMP 총량을 함유할 수 있다.
UF 투과물은 바람직하게는 낮은 함량의 단백질 응집체를 갖는다. 단백질 응집체는 단일 단백질 분자보다 더 높은 분자량 및 이에 따라 더 낮은 확산 계수를 가지며, 따라서 비-CMP 단백질을 결합시키는 데 사용되는 후속 양이온 교환 단계에서 제거하기가 어렵다.
본 발명과 관련하여, 용어 "단백질 응집체"는 응집된 단백질 분자들의 입자를 지칭하는데, 이러한 입자는 전형적인 평균 유체역학 직경이 적어도 10 nm이다.
UF 투과물 중의 단백질 응집체의 함량은, 파장이 500 nm인 광에서 야기되는 단백질 응집체의 산란 수준을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 산란 수준은 표준 1 cm 큐벳(cuvette)을 포함하는 표준 흡광도 측정 셋업(normal absorbance measurement setup)을 사용하여 결정된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, UF 투과물은 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.1 AU(1 cm 경로 길이)이다. 예를 들어, UF 투과물은 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.05 AU일 수 있다. 바람직하게는, UF 투과물은 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.01 AU이다. 더욱 더 바람직하게는, UF 투과물은 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.001 AU이다.
이상적으로, UF 투과물은 500 nm에서 검출가능한 흡광도를 전혀 갖지 않는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, UF 투과물은 UF 투과물 중의 단백질 총량에 대해 많아야 1% (w/w)의 단백질 응집체를 함유한다. 예를 들어, UF 투과물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.1% (w/w)의 단백질 응집체를 함유할 수 있다. 바람직하게는, UF 투과물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.01% (w/w)의 단백질 응집체를 함유한다. 더욱 더 바람직하게는, UF 투과물은 UF 투과물의 단백질 총량에 대해 많아야 0.001% (w/w)의 단백질 응집체를 함유한다.
언급된 바와 같이, 단계 c)는 상기 UF 투과물로부터 유래된 제1 조성물을 양이온 교환 재료와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "제1 조성물"은 단계 c) 동안 양이온 교환을 거치게 되는 CMP-함유 공급물을 지칭한다. 제1 조성물은 바람직하게는 액체 수성 조성물이다. 제1 조성물의 CMP의 적어도 50% (w/w)가 UF 투과물로부터 기원한다는 의미에서, 제1 조성물은 UF 투과물로부터 유래된다. 단계 b)가 초기 UF 잔류물의 UF 투석여과를 추가로 포함하는 경우, 제1 조성물의 CMP의 적어도 50% (w/w)가 초기 UF 투과물 및 하나 이상의 후속 UF-투석여과 투과물들로부터 기원한다는 의미에서 제1 조성물은 UF 투과물로부터 유래된다.
예를 들어, 제1 조성물의 CMP의 적어도 75% (w/w)는 UF 투과물 및 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물들로부터 기원할 수 있다. 바람직하게는, 제1 조성물의 CMP의 적어도 90% (w/w)는 UF 투과물 및 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물들로부터 기원한다. 더욱 더 바람직하게는, 제1 조성물의 CMP의 적어도 90% (w/w), 예컨대 이를테면 모든 CMP는 UF 투과물 및 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물들로부터 기원한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 UF 투과물이다.
그러나, 본 발명의 다른 구현예에서, UF 투과물은 제1 조성물의 형성으로 이어지는 추가 공정 단계들을 거치게 될 수 있다. 이러한 추가 공정 단계들은, 예를 들어 온도 조정, 농축, pH 조정, 및/또는 추가의 분획화(fractionation)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 제1 조성물의 제공은 UF 투과물 및 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물의 pH 조정 및 농축을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 제1 조성물의 제공은, 예를 들어 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물들과 혼합된 UF 투과물을 농축시키는 것, 및 합한 투과물들을 pH 및 전도율에 대해 조정하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 적어도 55% (w/w)의 CMP 총량을 함유한다. 예를 들어, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 적어도 60% (w/w)의 CMP 총량을 함유할 수 있다. 제1 조성물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 적어도 65% (w/w)의 CMP 총량을 함유할 수 있다.
제1 조성물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 55 내지 95% (w/w) 범위의 CMP 총량을 함유할 수 있다. 예를 들어, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 60 내지 90% (w/w) 범위의 CMP 총량을 함유할 수 있다. 제1 조성물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 65 내지 80% (w/w) 범위의 CMP 총량을 함유할 수 있다.
언급된 바와 같이, 제1 조성물은 적어도 하나의 추가 단백질, 전형적으로 적어도 수 개의 추가 단백질을 함유한다. 추가 단백질은 통상 유장 중에 고유하게 존재하는 단백질을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 추가 단백질은 면역글로불린 G, 면역글로불린 M, 소혈청 알부민(BSA), 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민, 베타 카세인, 카세인-유래 펩티드, 우유 지방구막(MFGM) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함한다.
예를 들어, 적어도 하나의 추가 단백질은 면역글로불린 G, 면역글로불린 M, 소혈청 알부민(BSA), 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민, 베타 카세인, 카세인-유래 펩티드, 우유 지방구막(MFGM) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 제1 조성물의 추가 단백질의 총량의 적어도 50% (w/w)는 UF 투과물 및 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물들로부터 기원한다. 예를 들어, 제1 조성물의 추가 단백질의 적어도 75% (w/w)는 UF 투과물 및 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물들로부터 기원할 수 있다. 바람직하게는, 제1 조성물의 추가 단백질의 적어도 90% (w/w)는 UF 투과물 및 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물들로부터 기원한다. 더욱 더 바람직하게는, 제1 조성물의 추가 단백질의 적어도 90% (w/w), 예컨대 이를테면 모든 추가 단백질은 UF 투과물 및 임의의 추가의 UF-투석여과 투과물들로부터 기원한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 많아야 45% (w/w)의 추가 단백질 총량을 함유한다. 예를 들어, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 많아야 40% (w/w)의 추가 단백질 총량을 함유할 수 있다. 제1 조성물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 많아야 35% (w/w)의 추가 단백질 총량을 함유할 수 있다.
제1 조성물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 5 내지 45% (w/w) 범위의 추가 단백질 총량을 함유할 수 있다. 예를 들어, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 10 내지 40% (w/w) 범위의 추가 단백질 총량을 함유할 수 있다. 제1 조성물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 20 내지 35% (w/w) 범위의 추가 단백질 총량을 함유할 수 있다.
제1 조성물은 유장에서 통상 발견되는 다른 성분들, 예컨대 염, 지방, 락토스 및 다른 탄수화물을 추가로 함유할 수 있다.
일반적으로, 제1 조성물은 단지 소량의 카세인을 함유하는 것, 바람직하게는 카세인을 실질적으로 전혀 함유하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 구현예에서, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.5% (w/w)의 카세인 총량을 함유한다.
예를 들어, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.1% (w/w)의 카세인 양을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.01% (w/w)의 카세인 양을 함유한다. 제1 조성물은, 예를 들어 단백질 총량에 대해 많아야 0.001% (w/w)의 카세인 양을 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 제1 조성물의 중량에 대해 적어도 0.1% (w/w)의 단백질 총량을 함유한다. 예를 들어, 제1 조성물은 제1 조성물의 중량에 대해 적어도 0.2% (w/w)의 단백질 총량을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 제1 조성물은 제1 조성물의 중량에 대해 적어도 0.5% (w/w)의 단백질 총량을 함유한다. 제1 조성물은, 예를 들어 제1 조성물의 중량에 대해 적어도 1% (w/w)의 단백질 총량을 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 제1 조성물은 제1 조성물의 중량에 대해 0.1 내지 20% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유한다. 예를 들어, 제1 조성물은 제1 조성물의 중량에 대해 0.2 내지 15% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 제1 조성물은 제1 조성물의 중량에 대해 0.5 내지 10% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유한다. 제1 조성물은, 예를 들어 제1 조성물의 중량에 대해 1 내지 5% (w/w) 범위, 예컨대 이를테면 1 내지 2% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유할 수 있다.
UF 투과물과 유사하게, 제1 조성물은 바람직하게는 낮은 함량의 단백질 응집체를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.1 AU(1 cm 경로 길이)이다. 예를 들어, 제1 조성물은 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.05 AU일 수 있다. 바람직하게는, 제1 조성물은 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.01 AU이다. 더욱 더 바람직하게는, 제1 조성물은 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.001 AU이다.
이상적으로, 제1 조성물은 500 nm에서 검출가능한 흡광도를 전혀 갖지 않는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 제1 조성물 중의 단백질 총량에 대해 많아야 1% (w/w)의 단백질 응집체를 함유한다. 예를 들어, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.1% (w/w)의 단백질 응집체를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 제1 조성물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.01% (w/w)의 단백질 응집체를 함유한다. 더욱 더 바람직하게는, 제1 조성물은 제1 조성물의 단백질 총량에 대해 많아야 0.001% (w/w)의 단백질 응집체를 함유한다.
제1 조성물은 전형적으로 pH 2 내지 5 범위의 pH를 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 제1 조성물은 2.3 내지 4.6 범위의 pH를 갖는다. 예를 들어, 제1 조성물은 2.6 내지 4.2 범위의 pH를 가질 수 있다. 제1 조성물은, 예를 들어 2.8 내지 4.0 범위, 예컨대 이를테면 3.0 내지 3.7 범위의 pH를 가질 수 있다.
제1 조성물은, 예를 들어 2.5 내지 4.8 범위의 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 조성물은 3.0 내지 4.6 범위의 pH를 가질 수 있다. 제1 조성물은, 예를 들어 3.4 내지 4.4 범위, 예컨대 이를테면 3.6 내지 4.2 범위의 pH를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 12℃에서 1 내지 8 mS/cm 범위의 전도율을 갖는다.
수용액의 "전도율"(때때로 "비전도도(specific conductance)"라고도 지칭됨)은 그 용액이 전기를 전도하는 능력의 척도이다. 전도율은, 예를 들어 2개의 전극들 사이에서 용액의 AC 저항을 측정함으로써 결정될 수 있으며, 그 결과는 전형적으로 cm당 밀리지멘스(mS/cm)의 단위로 주어진다. 전도율은, 예를 들어 EPA(US Environmental Protection Agency, 미국 환경보호청) 방법 No. 120.1에 따라 측정될 수 있다.
예를 들어, 제1 조성물의 전도율은 12℃에서 1.5 내지 7 mS/cm의 범위일 수 있다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물의 전도율은 12℃에서 2 내지 5 mS/cm의 범위인 것이 더욱 더 바람직할 수 있다.
제1 조성물은, 예를 들어 12℃에서 0.5 내지 5 mS/cm 범위의 전도율을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 조성물은, 예를 들어 12℃에서 0.6 내지 4 mS/cm 범위의 전도율을 가질 수 있다. 대안적으로, 제1 조성물은, 예를 들어 12℃에서 0.8 내지 2 mS/cm 범위의 전도율을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 12℃에서 1 내지 8 mS/cm 범위의 전도율 및 12℃에서 pH 2 내지 5 범위의 pH를 갖는다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 12℃에서 1.5 내지 6 mS/cm 범위의 전도율 및 12℃에서 pH 2.5 내지 3.9 범위의 pH를 갖는다.
본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 12℃에서 2 내지 5 mS/cm 범위의 전도율 및 12℃에서 pH 3.0 내지 3.8 범위의 pH를 갖는다.
예를 들어, 제1 조성물은 12℃에서 0.5 내지 5 mS/cm 범위의 전도율 및 12℃에서 pH 3.0 내지 4.8 범위의 pH를 가질 수 있다.
대안적으로, 제1 조성물은 12℃에서 0.7 내지 3 mS/cm 범위의 전도율 및 12℃에서 pH 3.5 내지 4.5 범위의 pH를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 양이온 교환 재료는 제1 조성물과 접촉될 때 컬럼 내에 패킹되어 있다.
양이온 교환 재료는, 예를 들어 제1 조성물과 접촉될 때 자유 유동 입자로서 제1 조성물 중에 현탁되어 있을 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 양이온 교환 재료는 고상(solid phase), 및 양이온과 결합할 수 있는 하나 이상의 음이온성 기를 포함한다.
바람직하게는, 음이온성 기들 중 적어도 일부는 고상에 부착된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 양이온 교환 재료의 고상은 복수의 입자, 충전제, 및 막으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성요소들을 포함한다.
고상은, 예를 들어 다당을 포함하거나 또는 심지어는 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 가교결합된 다당이 특히 바람직하다. 유용한 다당의 예는 셀룰로스, 아가로스, 및/또는 덱스트란이다.
대안적으로, 고상은 비-탄수화물 중합체를 포함하거나 또는 심지어는 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 유용한 비-탄수화물 중합체의 예는 메타크릴레이트, 폴리스티렌, 및/또는 스티렌-디비닐벤젠이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 음이온성 기는, 예를 들어 강한 양이온 교환 기, 예컨대 이를테면 설폰산 기를 포함하거나 또는 심지어는 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 음이온성 기는, 예를 들어 약한 양이온 교환 기, 예컨대 이를테면 카르복실산 기를 포함하거나 또는 심지어는 이로 이루어질 수 있다.
사이클당 최적의 단백질 로드(load)는 양이온 교환 크로마토그래피 공정의 설계 및 양이온 교환 재료의 특성에 좌우된다.
압력 등을 포함한 양이온 교환 크로마토그래피 동안의 공정 조건은 실제의 공정 구현, 사용되는 장비 및 사용되는 양이온 교환 재료에 좌우된다.
단계 c) 동안의 제1 조성물의 온도는 전형적으로 미생물 성장을 최소화하기에 그리고 단백질 및 양이온 교환 재료의 열 손상을 피하기에 충분히 낮지만, 제1 조성물의 허용가능한 점도를 제공하기에 충분히 높다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단계 c) 동안의 제1 조성물의 온도는 2 내지 40℃의 범위이다. 바람직하게는, 단계 c) 동안의 제1 조성물의 온도는 4 내지 20℃의 범위, 더욱 더 바람직하게는 6 내지 15℃의 범위이다.
양이온 교환 크로마토그래피 및 이의 산업적 구현에 관한 더 상세한 내용은 문헌[Scopes]에서 찾을 수 있으며, 이는 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
단계 d)는 양이온 교환 재료에 결합되지 않은 제1 조성물의 분획을 수집함으로써 CMP-함유 조성물을 수득하는 단계를 포함한다.
수집된 분획은 그 자체로 CMP-함유 조성물로서 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로, 추가 공정 단계들을 거치게 될 수 있는데, 이러한 추가 공정 단계는, 예를 들어 조성물을 탈염(demineralising) 및 농축시키는 단계, 및 이어서 이를 분말로 변환시키는 단계이다.
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 수집된 분획은 열 처리, 농축, 탈염, 용매의 증발, 분무-건조, 및 단백질-결합된 양이온의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 공정 단계(들) 중 하나 이상을 추가로 거치게 된다.
예를 들어, 수집된 분획은 농축 단계를 거치게 될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 수집된 분획은, 예를 들어 단량체성 CMP를 잔류시키는 한외여과 필터를 사용하는 투석여과에 의해 탈염을 거치게 될 수 있다.
수집된 분획의 pH는 농축 또는 투석여과 전에 pH 4 초과의 pH, 예를 들어 적어도 pH 5의 pH로 조정될 수 있다. 상승된 pH는 단량체성 CMP의 올리고머로의 회합을 가져오며, 이는 더 큰 세공 크기를 갖는 막을 사용하는 농축 및/또는 투석여과를 가능하게 한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 수집된 분획은 증발 단계를 거치게 될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 수집된 분획은 건조-분무 단계를 거치게 될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 수집된 분획은 하기 단계들을 거치게 된다:
i) 농축(예를 들어, 한외여과, 나노여과, 또는 역삼투에 의함),
ii) 투석여과(예를 들어, 물에 대함),
iii) 선택적으로, 또 다른 농축 단계(예를 들어, 증발에 의함),
iv) 저온살균(pasteurisation), 및
v) 저온살균된 조성물을 분말로 변환시키기 위한 분무-건조.
본 방법은 배치(batch) 공정 또는 반배치 공정 둘 모두로 구현될 수 있다.
본 발명의 CMP-함유 조성물은 매우 높은 CMP 순도 및 매우 낮은 Phe 함량 둘 모두를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 방법은 조성물의 단백질 총량에 대해 적어도 92% (w/w)의 CMP 순도를 갖는 CMP-함유 조성물을 생성하기 위한 것이다. 예를 들어, 본 방법은 조성물의 단백질 총량에 대해 적어도 95% (w/w)의 CMP 순도를 갖는 CMP-함유 조성물을 생성하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 방법은 조성물의 단백질 총량에 대해 적어도 97% (w/w), 예컨대 이를테면 적어도 98% (w/w) 또는 심지어는 약 100% (w/w)의 CMP 순도를 갖는 CMP-함유 조성물을 생성하기 위한 것이다.
본 발명의 방법의 일 예시적인 구현예가 도 1에 개략적으로 예시되어 있다. 유장-유래 공급물(1)은 UF 유닛으로 유도되고, 이에 따라 한외여과를 거치게 된다. UF 단계는 UF 잔류물(2), 즉 UF 필터에 의해 잔류된 분획, 및 UF 투과물, 즉 UF 필터를 통해 투과된 분획의 형성으로 이어진다. 이 구현예에서, UF 투과물(3)은 제1 조성물로서 사용되며, 제1 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피를 거치게 된다. 제1 조성물의 비-CMP 단백질 불순물이 양이온 교환 재료(도시되지 않음)에 결합하고, 정제된 CMP-함유 조성물(4)이 수집된다.
본 발명의 방법의 또 다른 예시적인 구현예가 도 2에 개략적으로 도시되어 있다. 도 1의 공정과 유사하게, 유장-유래 공급물은 한외여과를 거치게 된다. 생성된 CMP-부화된 투과물(3)은 제1 조성물로서 사용되고, 양이온 교환 크로마토그래피를 거치게 된다. 양이온 교환 재료에 결합하지 않는 단백질 분획은 CMP-함유 조성물로서 수집된다. 그러나, 도 2의 방법에서는, 추가로 UF 잔류물이 물(5)로 희석되고 UF 공정으로 공급물로서 재순환되며, 그럼으로써 원래 유장-유래 공급물의 CMP의 더 많은 부분을 유출해내고 이를 UF 투과물 중에 회수한다.
본 발명의 또 다른 예시적인 구현예가 도 3에 개략적으로 예시되어 있다. 여기서는, 일련의 3개의 한외여과 유닛이 단계 b)에서 사용된다. 유장-유래 공급물(1)을 제1 UF 유닛에 공급하여, 그 결과 제1 UF 잔류물(2) 및 제1 UF 투과물(3)이 생성된다. 제1 UF 잔류물(2)을 물(5)과 혼합하고 제2 UF 유닛에 공급하여, 그 결과 제2 UF 잔류물(2') 및 제2 UF 투과물(3')이 생성된다. 제2 UF 잔류물(2')을 물(5)과 혼합하고 제3 UF 유닛에 공급하여, 그 결과 제3 UF 잔류물(2") 및 제3 UF 투과물(3")이 생성된다. 제1, 제2, 및 제3 투과물(3, 3', 3")을 합해서 제1 조성물로서 사용하며, 제1 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피를 거치게 된다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 수득가능한 CMP-함유 조성물에 관한 것이다.
CMP-함유 조성물은 바람직하게는 단백질 총량에 대해 많아야 0.5% (w/w)의 페닐알라닌을 함유한다. 예를 들어, CMP-함유 조성물은 단백질 총량에 대해 많아야 0.4% (w/w)의 페닐알라닌을 함유할 수 있다. 바람직하게는, CMP-함유 조성물은 바람직하게는 단백질 총량에 대해 많아야 0.3% (w/w)의 페닐알라닌을 함유한다. 더욱 더 바람직하게는, CMP-함유 조성물은 바람직하게는 단백질 총량에 대해 많아야 0.2% (w/w)의 페닐알라닌, 예컨대 단백질 총량에 대해 많아야 0.1% (w/w)의 페닐알라닌을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, CMP-함유 조성물은 조성물의 단백질 총량에 대해 적어도 92% (w/w)의 CMP 순도를 갖는다. 예를 들어, CMP-함유 조성물은 조성물의 단백질 총량에 대해 적어도 95% (w/w)의 CMP 순도를 가질 수 있다. 바람직하게는, CMP-함유 조성물은 조성물의 단백질 총량에 대해 적어도 97% (w/w), 예컨대 이를테면 적어도 98% (w/w) 또는 심지어는 약 100% (w/w)의 CMP 순도를 갖는다.
본 발명은 특정 구현예를 참고하여 전술되었다. 그러나, 전술된 것 이외의 다른 구현예가 본 발명의 범주 내에서 마찬가지로 가능하다. 본 발명의 다양한 구현예 및 양태의 상이한 특징 및 단계는 달리 언급되지 않는 한 본 명세서에 기재된 것과 다른 식으로 조합될 수 있다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 방법의 변형
한외여과 I - 분리:
30%의 건조 물질 및 24%의 단백질을 함유하는 12000 리터의 유장 단백질 농축물(WPC)을 탈염된 냉수로 희석시켜 건조 물질 함량 10% 및 단백질 함량 8%가 되게 하였다. pH가 2.8이 될 때까지 12M 염산을 첨가하였다. 이 용액을 31밀(mil) 스페이서 및 50,000 달톤의 공칭 컷-오프 값을 가진, 미국 캘리포니아주 바카빌 소재의 Synder Filtration사로부터의 유형 BN6338의 6" 나선형 권취 막들을 사용하여 여과하였다. 총 막 면적은 3072 m2였다. 하기 조건 하에서 여과를 수행하였다: 온도를 10℃로 유지하였으며, 평균 압력을 4.5 bar로 유지하였는데, 이때 공급 압력은 3.5 bar였다. 12M 염산을 사용함으로써 pH를 2.8로 유지하였으며, 투과물이 제거되는 유량과 동일한 유량으로 한외여과 II(하기 참조)로부터의 투과물을 첨가하였다. 이 루프에서의 재순환 유량은 180 m3/h였으며, 공급 탱크에 대한 재순환 유량은 대략 10 m3/h였다. 10시간 여과 후에, 한외여과 II로부터의 투과물의 첨가를 정지하였다. 평균 플럭스(flux)는 8 L/m2h인 것으로 측정되었다.
한외여과 II - 잔류물의 투석여과 및 투과물의 농축:
한외여과 I로부터의 투과물을 한외여과 II로의 공급 탱크 내에 수집하고, 연속해서, 6% 수산화나트륨을 사용함으로써 pH를 6.0으로 조정하였다. 한외여과 I과 동시에, 31밀 스페이서 및 5,000 달톤의 공칭 컷-오프 값을 가진, 미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Koch Membrane Systems사로부터의 유형 HFK-328 6338의 6" 나선형 권취 막들을 사용하여 한외여과 II를 수행하였다. 총 막 면적은 2304 m2였다. 하기 조건 하에서 여과를 수행하였다: 투과물이 한외여과 I로부터 제거되는 유량과 동일한 유량으로 투과물을 한외여과 I로 공급하기 위하여, 온도를 10℃로 유지하였으며 평균 압력을 1.0 내지 5.0 bar로 유지하였다. 10시간 여과 후에, 즉 한외여과 I의 정지 후에, 잔류물을 수집하였다. 이어서, 잔류물에 투석여과를 거치게 하였는데, 여기서는 여과액이 제거되는 유량과 동일한 유량으로 70,000 리터의 수돗물을 첨가하였다. 투석여과 후에, 잔류물 중의 단백질 함량이 12%가 될 때까지 잔류물을 농축시켰다. 잔류물의 최종 부피는 3450 리터였다. 여과 조건은 상기와 동일하였다. 잔류물 중의 CMP의 순도는 HPLC 분석에 기초하여 79%(단백질 100 g당 79 g의 CMP)인 것으로 결정되었다.
양이온 교환 크로마토그래피:
생성의 1일 동안, 한외여과 II로부터의 최종 잔류물 650 리터를 탈염된 냉수로 희석하여 단백질 함량이 1.24%(용액 100 g당 1.24 g의 단백질)가 되게 하였다. 42% w/w 시트르산을 사용하여 이 용액에서의 pH를 3.50으로 조정하였으며, 2M NaCl 및 2M KCl의 용액을 사용하여 전도율을 2.0 mS/cm로 조정하였다. 스웨덴 웁살라 소재의 GE Healthcare사로부터의 SP Sepharose 대형 비드 식품 등급(SP Sepharose Big Beads Food Grade) 116 리터로 패킹된 컬럼을 사용하여, 725 리터의 조정된 단백질 용액에 양이온 교환 크로마토그래피를 거치게 하였다.
양이온 교환 크로마토그래피의 각각의 사이클에 대해 하기 조건을 사용하였다:
290 리터의 탈염된 냉수로 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 상기로부터의 725 리터의 공급 용액(조정된 단백질 용액)을 1050 L/h의 유량으로 컬럼을 통해 펌핑하고, 관통 유동 물질(flow through)(비-결합 물질)을 생성물 탱크 내에 수집하였으며, 이는 또한 CMP 용액으로 표기하였다. 각각 232 리터 및 58 리터의 탈염수로 각각 1050 L/h 및 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 컬럼을 통해 580 리터의 0.5M 수산화나트륨을 943 L/h의 유량으로 펌핑함으로써 동시적인 용리 및 정위치 세정(Cleaning-in-Place) 단계를 수행하였다. 각각 290 리터 및 580 리터의 탈염수로 각각 943 L/h 및 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 양이온 교환 크로마토그래피의 1회 사이클에 대한 시간은 2.6시간이었다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 CMP의 상대 수율은 92%였다(공급물 중의 CMP 100 g당 관통 유동 물질 중 92 g의 CMP).
8회 사이클의 양이온 교환 크로마토그래피를 매일 수행하였으며, 이어서 생성물 탱크 내의 CMP 용액을 농축시키기 위해 표준 한외여과(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Koch Membrane Systems사로부터의 HFK-328 막들)를 수행하였다. 한외여과 전에, 수산화칼륨 및 수산화나트륨의 혼합 용액에 의해 생성물 탱크 내의 pH를 6.5로 조정하였다. 총 32회 사이클의 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였으며, 이후에 표준 한외여과(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Koch Membrane Systems사로부터의 HFK-328 막들)에 의해 CMP 용액을 추가로 농축시켰다. 농축된 CMP 용액을 표준 분무 건조기를 사용하여 분무 건조시켰으며, 196 kg의 분말을 수득하였다. 선택된 파라미터들과 함께 분말의 조성이 표 1에 제공되어 있다.
실시예 2 - 본 발명의 방법의 변형
실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 한외여과 I 및 II를 수행하였다. 최종 한외여과 II 잔류물에서의 CMP 순도는 HPLC 분석에 기초하여 80%(단백질 100 g당 80 g의 CMP)인 것으로 결정되었다.
하기 사항, 즉 희석된 용액의 pH를 3.37로 조정하고 총 47회 사이클의 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 CMP의 상대 수율은 90%였다(공급물 중의 CMP 100 g당 관통 유동 물질 중 90 g의 CMP). 농축된 CMP 용액을 표준 분무 건조기를 사용하여 분무 건조시켰으며, 357 kg의 분말을 수득하였다. 선택된 파라미터들과 함께 분말의 조성이 표 1에 제공되어 있다.
실시예 3 - 본 발명의 방법의 변형
실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 한외여과 I 및 II를 수행하였다. 최종 한외여과 II 잔류물에서의 CMP 순도는 HPLC 분석에 기초하여 83%(단백질 100 g당 83 g의 CMP)인 것으로 결정되었다.
양이온 교환 크로마토그래피:
생성의 1일 동안, 한외여과 II로부터의 최종 잔류물 450 리터를 탈염된 냉수로 희석하여 단백질 함량이 0.66%(용액 100 g당 0.66 g의 단백질)가 되게 하였다. 30% w/w 염산을 사용하여 이 용액에서의 pH를 3.25로 조정하였으며, 2M NaCl 및 2M KCl의 용액을 사용하여 전도율을 2.0 mS/cm로 조정하였다. 스웨덴 웁살라 소재의 GE Healthcare사로부터의 SP Sepharose 대형 비드 식품 등급 80 리터로 패킹된 컬럼을 사용하여, 1000 리터의 조정된 단백질 용액에 양이온 교환 크로마토그래피를 거치게 하였다.
양이온 교환 크로마토그래피의 1회 사이클에 대해 하기 조건을 사용하였다:
300 리터의 탈염된 냉수, 300 리터의 0.50% w/w 아세트산 및 200 리터의 탈염된 냉수로 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 상기로부터의 1000 리터의 공급 용액을 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 통해 펌핑하고, 관통 유동 물질(비-결합 물질)을 생성물 탱크 내에 수집하였으며, 이는 또한 CMP 용액으로 표기하였다.
200 리터의 탈염된 냉수로 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 컬럼을 통해 400 리터의 1.0M 수산화나트륨을 700 L/h의 유량으로 펌핑함으로써 동시적인 용리 및 정위치 세정 단계를 수행하였다. 각각 200 리터 및 400 리터의 탈염된 냉수로 각각 700 L/h 및 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 양이온 교환 크로마토그래피의 1회 사이클에 대한 시간은 2.7시간이었다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 CMP의 상대 수율은 77%였다(공급물 중의 CMP 100 g당 관통 유동 물질 중 77 g의 CMP). 8회 사이클의 양이온 교환 크로마토그래피를 매일 수행하였으며, 이어서 생성물 탱크 내의 CMP 용액을 농축시키기 위해 표준 한외여과(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Koch Membrane Systems사로부터의 HFK-328 막들)를 수행하였다. 한외여과 전에, 수산화칼륨 및 수산화나트륨의 혼합 용액을 사용하여 생성물 탱크 내의 pH를 6.5로 조정하였다. 총 20회 사이클의 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였으며, 이후에 표준 한외여과(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Koch Membrane Systems사로부터의 HFK-328 막들)에 의해 CMP 용액을 추가로 농축시켰다. 농축된 CMP 용액을 표준 분무 건조기를 사용하여 분무 건조시켰으며, 78 kg의 분말을 수득하였다. 선택된 파라미터들과 함께 분말의 조성이 표 1에 제공되어 있다.
실시예 4 - 본 발명의 방법의 변형
실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 한외여과 I 및 II를 수행하였다. 최종 한외여과 II 잔류물에서의 CMP 순도는 HPLC 분석에 기초하여 79%(단백질 100 g당 79 g의 CMP)인 것으로 결정되었다.
양이온 교환 크로마토그래피:
생성의 1일 동안, 한외여과 II로부터의 최종 잔류물 278 리터를 탈염된 냉수로 희석하여 단백질 함량이 0.68%(용액 100 g당 0.68 g의 단백질)가 되게 하였다. 30% w/w 염산을 사용하여 이 용액에서의 pH를 3.75로 조정하였으며, 5M NaCl의 용액을 사용하여 전도율을 4.0 mS/cm로 조정하였다. 스웨덴 웁살라 소재의 GE Healthcare사로부터의 SP Sepharose 대형 비드 식품 등급 80 리터로 패킹된 컬럼을 사용하여, 1000 리터의 조정된 단백질 용액에 양이온 교환 크로마토그래피를 거치게 하였다.
양이온 교환 크로마토그래피의 1회 사이클에 대해 하기 조건을 사용하였다:
300 리터의 1M NaCl, 300 리터의 탈염된 냉수, 300 리터의 0.25% w/w 아세트산 및 200 리터의 탈염된 냉수로 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 상기로부터의 1000 리터의 공급 용액(조정된 단백질 용액)을 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 통해 펌핑하고, 관통 유동 물질(비-결합 물질)을 생성물 탱크 내에 수집하였으며, 이는 또한 CMP 용액으로 표기하였다. 200 리터의 탈염된 냉수, 300 리터의 1M NaCl(용리) 및 200 리터의 탈염된 냉수로 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 컬럼을 통해 400 리터의 1.0M 수산화나트륨을 700 L/h의 유량으로 펌핑함으로써 정위치 세정 단계를 수행하였다. 각각 200 리터 및 400 리터의 탈염수로 각각 700 L/h 및 1300 L/h의 유량으로 컬럼을 플러싱하였다. 양이온 교환 크로마토그래피의 1회 사이클에 대한 시간은 3.3시간이었다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 CMP의 상대 수율은 90%였다(공급물 중의 CMP 100 g당 관통 유동 물질 중 90 g의 CMP). 5회 사이클의 양이온 교환 크로마토그래피를 매일 수행하였으며, 이어서 생성물 탱크 내의 CMP 용액을 농축시키기 위해 표준 한외여과(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Koch Membrane Systems사로부터의 HFK-328 막들)를 수행하였다. 한외여과 전에, 수산화칼륨 및 수산화나트륨의 혼합 용액에 의해 생성물 탱크 내의 pH를 6.5로 조정하였다. 총 10회 사이클의 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였으며, 이후에 표준 한외여과(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Koch Membrane Systems사로부터의 HFK-328 막들)에 의해 CMP 용액을 추가로 농축시켰다. 농축된 CMP 용액의 대략 절반을 표준 분무 건조기를 사용하여 분무 건조시켰으며, 24kg의 분말을 수득하였다. 선택된 파라미터들과 함께 분말의 조성이 표 1에 제공되어 있다.
실시예 5 - 본 발명의 방법의 변형
한외여과 I - 분리:
23%의 건조 물질, 20%의 단백질을 함유하고 대략 24%의 CMP 순도(단백질 100 g당 24 g의 CMP)를 갖는 베타-락토글로불린 감소된 WPC 농축물 600 리터를 탈염된 냉수로 희석시켜 건조 물질 함량 11% 및 단백질 함량 8.9%가 되게 하였다. pH가 2.2가 될 때까지 30% w/w 염산을 첨가하였다. 이 용액을 31밀 스페이서 및 50,000 달톤의 공칭 컷-오프 값을 가진, 미국 캘리포니아주 바카빌 소재의 Synder Filtration사로부터의 유형 BN6338의 6" 나선형 권취 막들을 사용하여 여과하였다. 총 막 면적은 64 m2였다. 하기 조건 하에서 여과를 수행하였다: 온도를 10℃로 유지하였으며, (2개의 필터 요소를 가로질러) 평균 압력을 2.0 bar로 유지하였는데, 이때 공급 압력은 3.0 bar였다. 30% w/w 염산을 사용함으로써 pH를 2.2로 유지하였으며, 투과물이 제거되는 유량과 동일한 유량으로 한외여과 II부터의 투과물을 첨가하였다. 이 루프에서의 재순환 유량은 30 m3/h였으며, 공급 탱크에 대한 재순환 유량은 대략 5 m3/h였다. 8.5시간 여과 후에, 한외여과 II로부터의 투과물의 첨가를 정지하였다. 평균 플럭스는 22 L/m2h인 것으로 측정되었다.
한외여과 II - 잔류물의 투석여과 및 투과물의 농축:
한외여과 I로부터의 투과물을 한외여과 II로의 공급 탱크 내에 수집하였다. 한외여과 I과 동시에, 31밀 스페이서 및 3,000 달톤의 공칭 컷-오프 값을 가진, 미국 캘리포니아주 바카빌 소재의 Synder Filtration사로부터의 유형 VT6338의 6" 나선형 권취 막들을 사용하여 한외여과 II를 수행하였다. 총 막 면적은 64 m2였다. 하기 조건 하에서 여과를 수행하였다: 온도를 10℃로 유지하였으며, (2개의 필터 요소를 가로질러) 평균 압력을 1.0 내지 1.5 bar로 유지하였는데, 이때 공급 압력은 0.5 내지 1.0 bar였다. 한외여과 I로부터의 투과물이 제거되는 유량과 동일한 유량으로 투과물을 생성하기 위하여 압력 조건을 조정하였다. 8.5시간 여과 후에, 즉 한외여과 I의 정지 후에, 상기에서와 동일한 조건을 사용하여 잔류물을 농축시켰으며, 600 리터의 잔류물을 수득하였다. 이어서, 4% 수산화나트륨을 사용하여 잔류물을 pH 6.3으로 조정하고, 투석여과를 거치게 하였는데, 여기서는 여과액이 제거되는 유량과 동일한 유량으로 3,300 리터의 수돗물을 첨가하였다. 여과 조건은 상기와 동일하였다. 건조 물질 함량이 3.4%이고 단백질 함량이 2.9%인 820 리터의 잔류물을 수득하였다. 잔류물 중의 CMP의 순도는 HPLC 분석에 기초하여 72%(단백질 100 g당 72 g의 CMP)인 것으로 결정되었다.
양이온 교환 크로마토그래피:
하기 사항, 즉 한외여과 II로부터의 최종 잔류물을 탈염된 냉수로 희석시켜 단백질 함량이 1.14%(용액 100 g당 1.14 g의 단백질)가 되게 하고, 희석된 용액에서의 pH를 3.47로 조정하고, 전도율을 2.3 mS/cm로 조정한 것을 제외하고는, 실시예 1에 제공된 설명과 유사하게 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 805 리터의 공급 용액을 각각의 사이클 동안 컬럼을 통해 펌핑하였으며, 총 2회 사이클의 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 CMP의 상대 수율은 80%였다(공급물 중의 CMP 100 g당 관통 유동 물질 중 80 g의 CMP). 농축된 CMP 용액의 대략 절반을 표준 분무 건조기를 사용하여 분무 건조시켰으며, 6 kg의 분말을 수득하였다. 선택된 파라미터들과 함께 분말의 조성이 표 1에 제공되어 있다.
[표 1] 실시예 1 내지 실시예 5의 CMP-함유 생성물의 조성
하기의 생성물:
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
건조 물질(생성물의 % w/w) 96.0 95.5 95.8 93.5 95.3
단백질(생성물의 %) 76.8 76.9 77.5 75.5 82.2
단백질(건조 물질의 %) 80.0 80.6 80.9 80.7 86.3
CMP 순도(단백질의 %) 약 98 약 98 약 98 약 98 약 98
페닐알라닌(단백질의 %) 0.15 0.19 0.09 0.23 0.26
지방(생성물의 %) 0.11 0.23 < 0.1 0.22 < 0.1
락토스(생성물의 %) < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
재(ash)(단백질의 %) 7.4 7.3 6.9 6.8 6.5
실시예 6 - 종래 기술과의 비교
US 5,278,288A는 양이온 교환 크로마토그래피와 한외여과를 언급된 순서대로 조합하는 CMP 생성 방법을 개시한다. 예를 들어, 제1 양이온 교환 단계에서는, 치즈 유장을 양이온 교환 수지와 접촉시키고, 비-흡착된 물질을 수집한다. 이어서, 10,000 내지 50,000 달톤의 컷-오프 값을 갖는 막을 사용하여 pH 4 미만에서, 비-흡착된 물질에 한외여과를 거치게 하여, 여과액 중에 CMP를 수득한다. 마지막으로, 여과액의 pH를 조정하고, CMP 용액을 농축시키기 위하여 표준 한외여과를 수행한 후 분무 건조시킨다. 그러므로, 2개의 결정적인 분리 단계는 언급된 순서대로의 양이온 교환 크로마토그래피 및 pH < 4에서의 한외여과이다. 본 발명에서는, 이들 2개의 분리 단계의 순서가 반대이다. 본 명세서에서는, 많아야 4의 pH에서의 한외여과가 먼저 수행되고(실시예에서의 "한외여과 I"), 이어서 양이온 교환 크로마토그래피가 수행되는데, 여기서는 CMP가 비-흡착된 물질(또한 "관통 유동 물질" 또는 "비-결합 물질"로 표기됨) 중에 수득된다. 본 발명에서의 분리 단계들의 순서는 US 5,278,288A에서 제공된 분리 단계들의 순서와 비교할 때 몇몇 이점을 가진다.
본 발명의 첫 번째 이점은, 본 발명의 방법을 사용하는 경우 최종 생성물 중의 CMP의 순도(총 단백질의 %CMP)가 US 5,278,288A에서 얻어진 CMP 순도와 비교하여 훨씬 더 높다는 것이다. 80% 내지 88%의 순도 값이 US 5,278,288A에 제공되어 있다. 본 발명의 방법에 의하면, 대략 98% 또는 그 초과의 순도가 달성될 수 있다. 본 발명에 의해 수득된 CMP 생성물에서의 매우 높은 순도로 인해, 이러한 생성물은 페닐케톤뇨증을 앓는 환자들을 위한 영양 성분으로서 적합하며, 이는 또한 이 생성물 중에 존재하는 매우 낮은 수준의 페닐알라닌에 의해 나타난다. US 5,278,288A로부터의 방법에 의해 수득된 생성물에서와 같은 80% 내지 88%의 CMP 순도는 페닐알라닌의 함량과 상관하는데, 이 함량은 페닐케톤뇨증 환자들에게는 너무 높다.
본 발명의 두 번째 이점은 본 발명이 US 5,278,288A의 방법 및 비견되는 고순도의 CMP를 제공하는 종래 기술의 임의의 다른 방법보다 단리된 CMP 1 kg당 더 적은 이온 교환 재료를 사용한다는 것이다. 본 발명에 따르면, 제1 한외여과 단계는 비-CMP 유장 단백질의 대부분을 제거한다. 그럼으로써, 비-CMP 유장 단백질과 양이온 교환 크로마토그래피 단계로의 공급 용액 중의 CMP 사이의 중량비가 US 5,278,288A에서보다 훨씬 더 낮으며, 그러므로 모든 비-CMP 유장 단백질의 결합에 CMP의 질량 단위당 훨씬 더 낮은 부피의 양이온 교환 수지가 필요하다.
본 발명의 세 번째 이점은 본 발명의 방법을 사용하는 경우 CMP의 전체 수율(출발 물질 중의 CMP의 질량 대비 최종 생성물 중의 CMP의 %질량)이 US 5,278,288A에서 얻어진 CMP의 전체 수율과 비교하여 훨씬 더 높다는 것이다. US 5,278,288A에서의 실시예 2를 사용하고 고우다(Gouda) 유장 중의 단백질 함량이 6.2 g/L이고 총 단백질 함량에 대해 CMP 함량이 18%인 것으로 가정했을 때, 최종 생성물 중에 수득된 CMP가 81 mg인 것에 기초하여 전체 CMP 수율은 0.73%인 것으로 계산될 수 있다. 본 발명에 대한 실시예 2를 사용하고 출발 물질 중의 총 단백질 함량에 대해 CMP 함량이 18%인 것으로 가정했을 때, 전체 CMP 수율은 50%인 것으로 계산될 수 있는데, 이는 한외여과 단계로부터의 63%의 수율과 양이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 최종 분말 생성물에 걸친 80%의 수율을 합함으로써 얻어진 것이다.
본 발명의 네 번째 이점은 본 발명은 US 5,278,288A와 비교하여, 이온 교환 수지의 배치(batch)가 그것이 못쓰게 되기 전까지 견딜 수 있는 이온 교환 사이클 수를 증가시킨다는 것이다. 이온 교환 크로마토그래피는 비교적 고가인 단위 조작이며, 이온 교환 수지의 비용은 전체 가공 비용의 상당한 부분이 된다. 따라서, 이온 교환 재료의 수명 연장은 고순도 CMP-함유 생성물의 생성에 대한 전체 공정-경제성을 개선하기 위한 흥미로운 접근이다.

Claims (27)

  1. 낮은 함량의 페닐알라닌을 갖는 카세이노매크로펩티드-함유 조성물을 생성하는 방법으로서,
    a) 카세이노매크로펩티드(CMP) 및 적어도 하나의 추가 단백질을 포함하고 많아야 4의 pH를 갖는 유장(whey)-유래 공급물을 제공하는 단계,
    b) 단량체성 CMP의 통과를 가능하게 하는 한외여과 필터를 사용하여 상기 유장-유래 공급물에 한외여과를 거치게 함으로써, UF 투과물(permeate) 및 UF 잔류물(retentate)을 제공하며, 이때 UF 투과물은 CMP에 대해 부화(enrich)된 것인 단계,
    c) 상기 UF 투과물로부터 유래된 제1 조성물을 양이온 교환 재료와 접촉시키는 단계, 및
    d) 양이온 교환 재료에 결합되지 않은 제1 조성물의 분획을 수집함으로써 CMP-함유 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    유장-유래 공급물이 치즈 유장 또는 이의 농축물로부터 유래되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    유장-유래 공급물이 렌넷(rennet) 응고된 카세인 또는 카세이네이트 또는 이의 농축물로부터 수득된 유장으로부터 유래되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    유장-유래 공급물이 단백질 총량에 대해 적어도 1% (w/w)의 CMP 총량을 함유하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    유장-유래 공급물이 단백질 총량에 대해 1 내지 60% (w/w) 범위의 CMP 총량을 함유하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 단백질이 면역글로불린 G, 면역글로불린 M, 소혈청 알부민(BSA), 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민, 베타 카세인, 카세인 유래 펩티드, 우유 지방구막(MFGM) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 단백질이 면역글로불린 G, 면역글로불린 M, 소혈청 알부민(BSA), 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민, 베타 카세인, 카세인 유래 펩티드, 우유 지방구막(MFGM) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질을 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    유장-유래 공급물이 단백질 총량에 대해 많아야 3% (w/w)의 카세인 총량을 함유하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    유장-유래 공급물이 유장-유래 공급물의 중량에 대해 적어도 0.2% (w/w)의 단백질 총량을 함유하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    유장-유래 공급물이 유장-유래 공급물의 중량에 대해 0.2 내지 20% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    유장-유래 공급물이 pH 1 내지 4 범위의 pH를 갖는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    한외여과 필터가 5 내지 300 kDa 범위의 공칭 분자량 컷-오프(nominal molecular weight cut-off)를 갖는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    UF 투과물이 단백질 총량에 대해 적어도 55% (w/w)의 CMP 총량을 함유하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    UF 투과물의 500 nm에서의 흡광도가 많아야 0.1 AU인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 조성물이 단백질 총량에 대해 적어도 55% (w/w)의 CMP 총량을 함유하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 조성물이 단백질 총량에 대해 55 내지 95% (w/w) 범위의 CMP 총량을 함유하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 조성물이 제1 조성물의 중량에 대해 많아야 0.5% (w/w)의 카세인 총량을 함유하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 조성물이 적어도 0.1% (w/w)의 단백질 총량을 함유하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 조성물이 0.1 내지 20% (w/w) 범위의 단백질 총량을 함유하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 조성물이 pH 2 내지 5 범위의 pH를 갖는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 조성물이 1 내지 8 mS/cm 범위의 전도율을 갖는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    양이온 교환 재료가 제1 조성물과 접촉될 때 컬럼 내에 패킹되어 있는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    양이온 교환 재료가 제1 조성물과 접촉될 때 자유 유동 입자로서 제1 조성물 중에 현탁되어 있는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    수집된 분획을 농축시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    수집된 분획을 분무-건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 의해 수득가능한 CMP-함유 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    단백질 총량에 대해 많아야 0.5% (w/w)의 페닐알라닌을 함유하는 CMP-함유 조성물.
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