CN104853612A - 生产含有酪蛋白巨肽的组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在高产率并具有非常低含量苯丙氨酸(Phe)的情况下生产含酪蛋白巨肽(CMP)的组合物的方法。更确切地说，该方法涉及使一种乳清来源的进料经受超滤和随后阳离子交换的组合。

Description

生产含有酪蛋白巨肽的组合物的方法
发明领域
本发明涉及一种在高产率并具有非常低水平苯丙氨酸(Phe)的情况下生产含酪蛋白巨肽(CMP)的组合物的方法。更确切地说，该方法涉及使一种乳清来源的进料经受超滤和随后阳离子交换色谱法的组合。
背景
CMP由于半乳糖胺、半乳糖和o-唾液酸的各种糖基化模式和不同糖基化程度而是一种高度异质的肽。出于这个原因，CMP不具有单电荷，但实际上存在一种电荷分布。
CMP是一种不含有Phe的独特的、天然存在的肽。CMP例如是在奶酪制备过程中当凝乳酶在105至106个氨基酸残基之间特异性裂解κ-酪蛋白时形成的。副κ-酪蛋白(残基1至105)凝结从而形成奶酪凝乳，而CMP(残基106至169)余留在乳清中。CMP是在甜乳清中继β-乳球蛋白(BLG)和α-乳白蛋白(ALA)之后的第3种最丰富的蛋白质。
Phe的缺乏使得CMP成为罹患苯丙酮尿症(PKU)的人们的一种感兴趣的蛋白质来源。
在现有技术中已经描述了从乳清中分离CMP的若干次尝试。
US 5,278,288披露了一种用于生产CMP的方法，其中在低pH下使一种奶酪乳清经受阳离子交换并且随后使未结合的级分经受超滤，因而单体CMP和其他杂质被分离在超滤渗透液中。最后将所得渗透液的pH调节到pH 7，这导致形成CMP低聚物，并且通过超滤对这些CMP低聚物进行浓缩。在US 5,278,288中未提到所得到的组合物的Phe含量。
WO 99/18808披露了另一种回收CMP的方法。更确切地说，WO99/18808描述了一种使奶酪乳清经受依次进行的具有相反极性的两个离子交换步骤的方法。在WO 99/18808的背景部分中讨论了以上提到的US5,278,288，并且在此提到US 5,278,288的该方法的CMP回收率是不经济地较低的。
WO 98/14071披露了一种生产CMP组合物的方法。这个方法涉及使奶酪乳清经受一个阴离子交换过程并且随后经受一个第二离子交换过程，该第二离子交换过程可以是一个阳离子或阴离子交换过程。据称所得到的CMP组合物相对于在通过盐酸进行蛋白质水解之后所测定的氨基酸总量具有至多0.5％(w/w)的Phe含量。
发明概述
与本领域中的一般理解相反(参见例如WO 99/18808，第2页)，诸位发明人已经发现超滤和阳离子交换的组合可以产生一种从乳清来源的进料中分离CMP的经济方法。然而，这要求在阳离子交换步骤之前进行超滤步骤，并且与披露了一个阳离子交换步骤然后是一个超滤步骤的US5,278,288中所描述的不一样。
通过使用本发明，可以在非常高产率并具有非常低的Phe含量这两者的情况下经济地分离CMP。
因此，本发明的一个方面涉及一种生产具有低含量苯丙氨酸的含酪蛋白巨肽的组合物的方法，该方法包括以下步骤
a)提供包含酪蛋白巨肽(CMP)和至少一种额外蛋白质的一种乳清来源的进料，所述乳清来源的进料具有至多4的pH，
b)使用允许单体CMP通过的一个超滤过滤器来使所述乳清来源的进料经受超滤(UF)，从而提供一种UF渗透液和UF渗余液，针对CMP富集该UF渗透液，
c)使来源于所述UF渗透液的一种第一组合物与一种阳离子交换材料接触，并且
d)收集未结合该阳离子交换材料的该第一组合物的级分，从而获得该含CMP的组合物。
在本发明的上下文中，术语“酪蛋白巨肽”或“CMP”涉及例如在奶酪制备过程中当暴露于凝乳酶时可以例如从κ-酪蛋白中释放的肽。术语CMP涵盖CMP的糖基化形式和非糖基化形式两者。在科学文献中，CMP有时又称为酪蛋白糖巨肽(cGMP)或糖巨肽(GMP)。
在低pH下，CMP作为单个CMP分子存在，该单个CMP分子又称为“单体CMP”。在更高pH下，这些单个CMP分子开始聚集，从而形成CMP二聚体(两个单个CMP分子的一种复合物)或CMP低聚体(多于两个单个CMP分子的复合物)。
在本发明的上下文中，具有低含量苯丙氨酸(Phe)的一种组合物相对于该组合物的蛋白质总量含有至多0.5％(w/w)Phe。如在此所描述，甚至更低含量的Phe可以是优选的。根据ISO 13903:2005(动物饲料-氨基酸含量的测定(Animal feeding stuffs-Determination of amino acids content))测定一种组合物的Phe含量。
附图简要说明
图1是本发明的一个实施例的示意图，其中UF渗透液(3)用作该第一组合物。
图2是本发明的一个实施例的示意图，其中UF渗透液(3)用作该第一组合物，并且其中用水(5)稀释UF渗余液(2)并且将其作为该超滤系统的进料(5)再循环。
图3是本发明的一个实施例的示意图，其中依次安排三个UF单元，首先过滤乳清来源的进料(1)，然后是用水(5)稀释的来自该第一UF单元的UF渗余液(2)并且最后是也用水(5)稀释的来自该第二UF单元的UF渗余液(2’)。合并这三个UF单元的UF渗透液(3、3’和3”)并且将其用作该第一组合物。
发明详细说明
本发明的一个方面涉及一种生产具有低含量苯丙氨酸的含酪蛋白巨肽的组合物的方法，该方法包括以下步骤
a)提供包含酪蛋白巨肽(CMP)和至少一种额外蛋白质的一种乳清来源的进料，所述乳清来源的进料具有至多4的pH，
b)使用允许单体CMP通过的一个超滤过滤器来使所述乳清来源的进料经受超滤，从而提供一种UF渗透液和一种UF渗余液，针对CMP富集该渗余液，
c)使来源于所述UF渗透液的一种第一组合物与一种阳离子交换材料接触，并且
d)收集未结合该阳离子交换材料的该第一组合物的级分，从而获得该含CMP的组合物。
该乳清来源的进料是有待经受超滤的液体进料。该乳清来源的进料可以例如是在乳清加工过程中典型地获得的工艺流(process stream)中的一种。
在本发明的上下文中，术语“乳清”涉及当通过酶促裂解酪蛋白以及具体地是κ-酪蛋白来进行酪蛋白凝结时获得的液体级分，例如这在基于凝乳酶的奶酪生产过程中发生时。
在一种乳清来源的进料中，至少50％(w/w)的总蛋白质源自乳清。在本发明的一些优选实施例中，该乳清来源的进料的总蛋白质的至少90％(w/w)、以及优选地基本上所有源自乳清。
该乳清优选地是哺乳动物乳汁的乳清，例如像来自人、奶牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、美洲驼、马和/或鹿的乳汁。在本发明的一些优选实施例中，该乳清来源的进料是来源于牛乳。
在本发明的一些优选实施例中，该乳清来源的进料是来源于奶酪乳清或其一种浓缩物。该乳清来源的进料可以例如由奶酪乳清或其一种蛋白质浓缩物组成。
在本发明的上下文中，术语一种液体的“蛋白质浓缩物”涉及含有基本上所有该原始液体的蛋白质但具有较少水并且任选地还具有较少盐、碳水化合物以及其他小分子的一种液体组合物或粉末状组合物。蛋白质浓缩物可以例如是通过蒸发或通过使用一个低分子截留膜进行超滤来制备的。
在本发明的一些实施例中，该乳清来源的进料是来源于一种β-乳球蛋白还原的进料或其一种蛋白质浓缩物。
在本发明的其他优选实施例中，该乳清来源的进料来源于由凝乳酶凝结的酪蛋白或酪蛋白酸盐或其一种浓缩物获得的乳清。该乳清来源的进料可以例如由来自凝乳酶凝结的酪蛋白或酪蛋白酸盐或其一种浓缩物的乳清组成。此种乳清是例如在基于胶束酪蛋白分离物而不是乳汁进行的奶酪生产过程中获得的。
该乳清来源的进料的CMP含量可以变化并且取决于所使用的具体乳清来源的进料。
在本发明的一些优选实施例中，该乳清来源的进料相对于蛋白质的总量含有至少1％(w/w)的量的CMP。例如，该乳清来源的进料可以相对于蛋白质的总量含有至少5％(w/w)的量的CMP。优选地，该乳清来源的进料相对于蛋白质的总量含有至少10％(w/w)的量的CMP。该乳清来源的进料可以例如相对于蛋白质的总量含有至少15％(w/w)的量的CMP。
该乳清来源的进料可以例如相对于蛋白质的总量含有1％-60％(w/w)范围内的量的CMP。例如，该乳清来源的进料可以相对于蛋白质的总量含有5％-50％(w/w)范围内的量的CMP。优选地，该乳清来源的进料相对于蛋白质的总量含有10％-40％(w/w)范围内的量的CMP。该乳清来源的进料可以例如相对于蛋白质的总量含有15％-30％(w/w)范围内的量的CMP。
一种组合物例如一种乳清来源的进料或一种相关产品的CMP的量和总蛋白质的量是优选地如在托马等人(托马C.(C.)、克劳斯I.(Krause,I.)和库洛兹克U.(Kulozik,U.)(2006)，酪蛋白巨肽的沉淀行为及其通过RP-HPLC用乳清蛋白进行的同时测定(Precipitationbehaviour of caseinomacropeptides and their simultaneous determination withwhey proteins by RP-HPLC)，国际乳品杂志(International Dairy Journal)，16，285-293)中所描述来测定的。
正如所述，该乳清来源的进料含有至少一种额外的蛋白质，并且典型地含有至少若干种额外的蛋白质。这些额外的蛋白质通常包括固有地存在于乳清中的蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，该至少一种额外的蛋白质包括选自下组的至少一种蛋白质，该组由以下各项组成：免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、牛血清白蛋白(BSA)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、β酪蛋白、酪蛋白来源的肽、乳脂肪球膜(MFGM)蛋白以及其一个组合。
应该注意在本发明的上下文中，术语“酪蛋白来源的肽”不涵盖CMP，即使CMP也是来源于酪蛋白。
例如，该至少一种额外的蛋白质可以包括选自下组的至少两种蛋白质，该组由以下各项组成：免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、牛血清白蛋白(BSA)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、β酪蛋白、酪蛋白来源的肽、乳脂肪球膜(MFGM)蛋白以及其一个组合。
该乳清来源的进料可以进一步含有通常存在于乳清中的其他组分，如盐、脂肪、乳糖以及其他碳水化合物。
通常，优选的是该乳清来源的进料仅含有少量的酪蛋白，并且优选地基本上根本不含有酪蛋白。
在本发明的一些实施例中，该乳清来源的进料相对于蛋白质的总量含有至多3％(w/w)的总量的酪蛋白。
例如，该乳清来源的进料可以相对于蛋白质的总量含有至多1％(w/w)的量的酪蛋白。优选地，该乳清来源的进料相对于蛋白质的总量含有至多0.1％(w/w)的量的酪蛋白。该乳清来源的进料可以例如相对于蛋白质的总量含有至多0.01％(w/w)的量的酪蛋白。
在本发明的一些优选实施例中，该乳清来源的进料相对于该乳清来源的进料的重量含有至少0.2％(w/w)的总量的蛋白质。例如，该乳清来源的进料可以相对于该乳清来源的进料的重量含有至少0.8％(w/w)的总量的蛋白质。优选地，该乳清来源的进料相对于该乳清来源的进料的重量含有至少2％(w/w)的总量的蛋白质。该乳清来源的进料可以例如相对于该乳清来源的进料的重量含有至少5％(w/w)的总量的蛋白质。
在本发明的一些实施例中，该乳清来源的进料相对于该乳清来源的进料的重量含有0.2％-20％(w/w)范围内的总量的蛋白质。例如，该乳清来源的进料可以相对于该乳清来源的进料的重量含有0.8％-15％(w/w)范围内的总量的蛋白质。优选地，该乳清来源的进料相对于该乳清来源的进料的重量含有2％-14％(w/w)范围内的总量的蛋白质。该乳清来源的进料可以例如相对于该乳清来源的进料的重量含有4％-10％(w/w)范围内的，例如像4％-8％(w/w)范围内的总量的蛋白质。
优选的是该乳清来源的进料具有有助于低聚CMP复合物解离成单体CMP的pH。该乳清来源的进料可以例如具有pH 1-4范围内的pH。
在本发明的一些实施例中，该乳清来源的进料具有1.5-3.8范围内的pH。例如，该乳清来源的进料可以具有2.0-3.6范围内的pH。该乳清来源的进料可以例如具有2.5-3.5范围内、例如像2.8-3.2范围内的pH。
除非另外说明，否则在此提到的这些pH值是在12℃下测量的。
正如所述，步骤b)涉及使用允许单体CMP通过的一个超滤过滤器来使该乳清来源的进料经受超滤，从而提供一种针对CMP富集的UF渗透液和一种UF渗余液。
针对CMP富集该UF渗透液，从某种意义上说相对于该UF渗透液中的蛋白质总量CMP的重量百分比是高于该乳清来源的进料的该CMP的重量百分比。可以发生的是该UF渗透液中的CMP绝对浓度是低于该乳清来源的进料中的CMP绝对浓度，但是只要该超滤过滤器保留比它保留CMP更大百分比的其他蛋白质，这就不是一个问题。
实施超滤过程的实例可以例如见于欧洲专利EP 1 037 537B1中，出于所有目的，该欧洲专利通过引用结合在此。
步骤b)可以另外涉及对该初始UF渗余液进行所谓的渗滤以洗涤掉更多余留在该渗余液中的CMP。该渗滤涉及用基本上不含有蛋白质的一种液体稀释该初始UF渗余液。这种液体的有用实例是例如水、乳清或乳汁的纳米过滤渗透液、或乳清或乳汁的不含CMP的UF渗透液。可替代地，用于稀释的该液体可以是一种反渗透渗透液。反渗透渗透液可以例如是由乳汁、乳清、乳汁UF渗透液或乳清UF渗透液的反渗透获得，并且主要包含水和小单价离子。
然后使用相同或一个相似UF过滤器在如对于初始UF步骤所要求的相同或相似条件下使该稀释的液体经受超滤。如果必要，应该将该稀释的渗余液的pH调节到至多pH 4的pH。第一UF-渗滤步骤引起一种第一UF渗滤渗透液和一种第一UF渗滤渗余液形成。
这个过程可以重复一次或多次，每次对先前的渗余液进行稀释，如果必要进行pH调节并且然后使新的进料经受超滤，这引起另外的CMP富集的UF渗滤渗透液和另外的CMP减少的UF渗滤渗余液形成。
优选地将该第一UF渗滤渗透液和另外的UF渗滤渗透液与该初始UF渗透液合并以形成该第一组合物的一部分。
该超滤过滤器是能够使更大的分子保留在该过滤器的进料侧上并且允许更小的分子通过的部件。该超滤过滤器可以例如是一种薄膜，该薄膜含有具有一个特定孔径分布(pore size distribution)的多个孔隙。
该超滤过滤器优选地被选择为使得在操作过程中它能够允许单体CMP通过该过滤器，并且使得它能够保留β-乳球蛋白并且优选地还保留类似的乳清蛋白。正如本领域技术人员将已知的，一个超滤过滤器的分离特征都取决于它的物理和化学结构、进料材料的特征以及进行该超滤的过程参数。
在本发明的一些优选实施例中，该超滤过滤器具有5-300kDa范围内的标称分子量截留。例如，该超滤过滤器可以具有10-150kDa范围内的标称分子量截留。优选地，该超滤过滤器可以具有20-100kDa范围内的标称分子量截留。该超滤过滤器可以例如具有30-80kDa范围内，例如像35-60kDa范围内的标称分子量截留。
例如，该超滤过滤器可以具有5-100kDa范围内的标称分子量截留。优选地，该超滤过滤器可以具有10-70kDa范围内的标称分子量截留。该超滤过滤器可以例如具有15-50kDa范围内，例如像20-40kDa范围内的标称分子量截留。可替代地，该超滤过滤器可以具有10-50kDa范围内的标称分子量截留。
一个超滤过滤器的该标称分子量截留典型地是通过该过滤器制造商来提供。该“标称分子量截留”被定义为其中90％的溶质通过该过滤器保留的最低分子量溶质(以道尔顿计)。该“标称分子量截留”是根据ASTM标准E 1343-90来确定的。
该超滤可以例如是使用一个超滤系统来进行的，该超滤系统包括被安排用于错流过滤的一个过滤器。有用的过滤器安排的非限制性实例是螺旋卷式超滤系统、中空纤维膜系统、以及管式膜系统。
在一些优选实施例中，该超滤过滤器是一种超滤膜，并且优选地是一种聚合物膜。可替代地，该膜可以是一种金属膜或陶瓷膜。
关于有用的超滤过滤器的更多实例可以见于“膜过滤和相关分子分离技术(Membrane filtration and related molecular separation technologies)”，APV系统，尼尔森W.K.(Nielsen W.K.)(编著)，Silkeborg Bogtrykkeri A/S(2003)，ISBN 8788016757-9788788016758中。
在该超滤过程中该乳清来源的进料的温度可以在一个广泛范围内变化，但典型地优选的是该温度在5℃-60℃范围内。例如，在该超滤过程中该乳清来源的进料的温度可以是在6℃-40℃范围内，优选地在7℃-30℃范围内、甚至更优选的在8℃-20℃范围内。
目前优选的是使该乳清来源的进料的温度保持在以上提到的区间的下端上。因此，在本发明的一些优选实施例中，在该超滤过程中该乳清来源的进料的温度是在5℃-20℃范围内，优选地在7℃-16℃范围内，甚至更优选地在8℃-12℃范围内。
在该超滤过程中使用的压力可以根据所使用的该UF过滤器的具体类型和设计而变化。典型地，使用0.2-10巴的跨过滤器压力。该跨过滤器压力可以例如是在1-8巴范围内。可替代地，该跨过滤器压力可以例如是在2-6巴范围内。例如，该跨过滤器压力可以是在3-5巴范围内，例如像约4巴。
关于超滤的实际实施和操作的更多细节可以见于书本“膜过滤和相关分子分离技术”，APV系统，尼尔森W.K.(编著)，Silkeborg Bogtrykkeri A/S(2003)，ISBN 8788016757-9788788016758中。
在本发明的一些优选实施例中，该UF渗透液相对于蛋白质的总量含有至少55％(w/w)的总量的CMP。例如，该UF渗透液可以相对于蛋白质的总量含有至少60％(w/w)的总量的CMP。该UF渗透液可以例如相对于蛋白质的总量含有至少65％(w/w)的总量的CMP。
该UF渗透液优选地具有低含量蛋白质聚集体。蛋白质聚集体具有比单个蛋白质分子更高的分子量并且因而具有更低的扩散系数，并且因此难以在随后用于结合非CMP蛋白的阳离子交换步骤中去除。
在本发明的上下文中，术语“蛋白质聚集体”涉及聚集的蛋白质分子的颗粒，这些颗粒具有至少10nm的典型平均水动力直径。
该UF渗透液中的蛋白质聚集体含量可以是通过测量这些蛋白质聚集体在具有500nm波长的光中引起散射的水平来定量的。使用包括一个标准1cm吸收池的一个正规吸光度测量装置来测定散射的水平。
在本发明的一些优选实施例中，该UF渗透液在500nm处具有至多0.1AU(1cm路径长度)的吸光度。例如，该UF渗透液可以在500nm处具有至多0.05AU的吸光度。优选地，该UF渗透液在500nm处具有至多0.01AU的吸光度。甚至更优选地，该UF渗透液在500nm处具有至多0.001AU的吸光度。
理想地，该UF渗透液在500nm处根本不具有可检测的吸光度。
在本发明的一些优选实施例中，该UF渗透液相对于该UF渗透液中的蛋白质总量含有至多1％(w/w)蛋白质聚集体。例如，该UF渗透液可以相对于蛋白质总量含有至多0.1％(w/w)蛋白质聚集体。优选地，该UF渗透液相对于蛋白质总量含有至多0.01％(w/w)蛋白质聚集体。甚至更优选地，该UF渗透液相对于该UF渗透液的蛋白质总量含有至多0.001％(w/w)蛋白质聚集体。
正如所述，步骤c)涉及使来源于所述UF渗透液的一种第一组合物与一种阳离子交换材料接触。
在本发明的上下文中，术语“第一组合物”涉及在步骤c)过程中经受该阳离子交换的含CMP的进料。该第一组合物优选地是一种液体含水组合物。该第一组合物是来源于该UF渗透液，从某种意义上说该第一组合物的至少50％(w/w)的该CMP源自该UF渗透液。如果步骤b)另外涉及对该初始UF渗余液进行UF渗滤，该第一组合物是来源于该UF渗透液，从某种意义上说该第一组合物的至少50％(w/w)的该CMP源自该初始UF渗透液和一种或多种随后的UF-渗滤渗透液。
例如，该第一组合物的至少75％(w/w)的该CMP可以源自该UF渗透液和任何额外的UF-渗滤渗透液。优选地，该第一组合物的至少90％(w/w)的该CMP源自该UF渗透液和任何额外的UF-渗滤渗透液。甚至更优选地，该第一组合物的至少90％(w/w)的该CMP源自该UF渗透液和任何额外的UF-渗滤渗透液，例如像所有CMP。
在本发明的一些优选实施例中，该第一组合物是该UF渗透液。
然而，在本发明的其他实施例中，可以使该UF渗透液经受引起该第一组合物形成的额外过程步骤。此类额外过程步骤可以例如涉及温度调节、浓缩、pH调节和/或进一步分馏。
在本发明的一些实施例中，提供该第一组合物涉及对该UF渗透液和任何额外的UF-渗滤渗透液进行pH调节和浓缩。
在本发明的其他实施例中，提供该第一组合物涉及对例如与任何额外的UF-渗滤渗透液相混合的该UF渗透液进行浓缩并且针对pH和电导率对合并的渗透液进行调节。
在本发明的一些优选实施例中，该第一组合物相对于蛋白质的总量含有至少55％(w/w)的总量的CMP。例如，该第一组合物可以相对于蛋白质的总量含有至少60％(w/w)的总量的CMP。该第一组合物可以例如相对于蛋白质的总量含有至少65％(w/w)的总量的CMP。
该第一组合物可以例如相对于蛋白质的总量含有55％-95％(w/w)范围内的总量的CMP。例如，该第一组合物可以相对于蛋白质的总量含有60％-90％(w/w)范围内的总量的CMP。该第一组合物可以例如相对于蛋白质的总量含有65％-80％(w/w)范围内的总量的CMP。
正如所述，该第一组合物含有至少一种额外的蛋白质，并且典型地含有至少若干种额外的蛋白质。这些额外的蛋白质通常包括固有地存在于乳清中的蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，该至少一种额外的蛋白质包括选自下组的至少一种蛋白质，该组由以下各项组成：免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、牛血清白蛋白(BSA)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、β酪蛋白、酪蛋白来源的肽、乳脂肪球膜(MFGM)蛋白以及其一个组合。
例如，该至少一种额外的蛋白质可以包括选自下组的至少两种蛋白质，该组由以下各项组成：免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、牛血清白蛋白(BSA)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、β酪蛋白、酪蛋白来源的肽、乳脂肪球膜(MFGM)蛋白以及其一个组合。
在本发明的一些实施例中，该第一组合物的这些额外蛋白质的总量的至少50％(w/w)源自该UF渗透液和任何额外的UF-渗滤渗透液。例如，该第一组合物的至少75％(w/w)的这些额外蛋白质可以源自该UF渗透液和任何额外的UF-渗滤渗透液。优选地，该第一组合物的至少90％(w/w)的这些额外蛋白质源自该UF渗透液和任何额外的UF-渗滤渗透液。甚至更优选地，该第一组合物的至少90％(w/w)的这些额外蛋白质源自该UF渗透液和任何额外的UF-渗滤渗透液，例如像所有这些额外蛋白质。
在本发明的一些优选实施例中，该第一组合物相对于蛋白质的总量含有至多45％(w/w)的总量的额外蛋白质。例如，该第一组合物可以相对于蛋白质的总量含有至多40％(w/w)的总量的额外蛋白质。该第一组合物可以例如相对于蛋白质的总量含有至多35％(w/w)的总量的额外蛋白质。
该第一组合物可以例如相对于蛋白质的总量含有5％-45％(w/w)范围内的总量的额外蛋白质。例如，该第一组合物可以相对于蛋白质的总量含有10％-40％(w/w)范围内的总量的额外蛋白质。该第一组合物可以例如相对于蛋白质的总量含有20％-35％(w/w)范围内的总量的额外蛋白质。
该第一组合物可以进一步含有通常存在于乳清中的其他组分，如盐、脂肪、乳糖以及其他碳水化合物。
通常，优选的是该第一组合物仅含有少量酪蛋白，并且优选地基本上根本不含有酪蛋白。
在本发明的一些实施例中，该第一组合物相对于蛋白质的总量含有至多0.5％(w/w)的总量的酪蛋白。
例如，该第一组合物可以相对于蛋白质的总量含有至多0.1％(w/w)的量的酪蛋白。优选地，该第一组合物相对于蛋白质的总量含有至多0.01％(w/w)的量的酪蛋白。该第一组合物可以例如相对于蛋白质的总量含有至多0.001％(w/w)的量的酪蛋白。
在本发明的一些优选实施例中，该第一组合物相对于该第一组合物的重量含有至少0.1％(w/w)的总量的蛋白质。例如，该第一组合物可以相对于该第一组合物的重量含有至少0.2％(w/w)的总量的蛋白质。优选地，该第一组合物相对于该第一组合物的重量含有至少0.5％(w/w)的总量的蛋白质。该第一组合物可以例如相对于该第一组合物的重量含有至少1％(w/w)的总量的蛋白质。
在本发明的一些实施例中，该第一组合物相对于该第一组合物的重量含有0.1％-20％(w/w)范围内的总量的蛋白质。例如，该第一组合物可以相对于该第一组合物的重量含有0.2％-15％(w/w)范围内的总量的蛋白质。优选地，该第一组合物相对于该第一组合物的重量含有0.5％-10％(w/w)范围内的总量的蛋白质。该第一组合物可以例如相对于该第一组合物的重量含有1％-5％(w/w)范围内的总量的蛋白质，例如像1％-2％(w/w)范围内。
类似于该UF渗透液，该第一组合物优选地具有低含量蛋白质聚集体。
在本发明的一些优选实施例中，该第一组合物在500nm处具有至多0.1AU(1cm路径长度)的吸光度。例如，该第一组合物可以在500nm处具有至多0.05AU的吸光度。优选地，该第一组合物在500nm处具有至多0.01AU的吸光度。甚至更优选地，该第一组合物在500nm处具有至多0.001AU的吸光度。
理想地，该第一组合物在500nm处根本不具有可检测的吸光度。
在本发明的一些优选实施例中，该第一组合物相对于该第一组合物中的蛋白质总量含有至多1％(w/w)蛋白质聚集体。例如，该第一组合物可以相对于蛋白质的总量含有至多0.1％(w/w)蛋白质聚集体。优选地，该第一组合物相对于蛋白质的总量含有至多0.01％(w/w)蛋白质聚集体。甚至更优选地，该第一组合物相对于该第一组合物的蛋白质总量含有至多0.001％(w/w)蛋白质聚集体。
该第一组合物典型地具有pH 2-5范围内的pH。
在本发明的一些实施例中，该第一组合物具有2.3-4.6范围内的pH。例如，该第一组合物可以具有2.6-4.2范围内的pH。该第一组合物可以例如具有2.8-4.0范围内，例如像3.0-3.7范围内的pH。
该第一组合物可以例如具有2.5-4.8范围内的pH。例如，该第一组合物可以具有3.0-4.6范围内的pH。该第一组合物可以例如具有3.4-4.4范围内，例如像3.6-4.2范围内的pH。
在本发明的一些优选实施例中，该第一组合物在12℃下具有1-8mS/cm范围内的电导率。
一种水溶液的“电导率”(有时称为“比电导”)是该溶液导电能力的一个量度。该电导率可以例如是通过测量该溶液在两个电极之间的AC电阻来确定的，并且结果典型地是以单位毫西门子/厘米(mS/cm)给出。该电导率可以例如是根据EPA(美国环境保护局(US Environmental ProtectionAgency))方法第120.1号来测量的。
例如，该第一组合物的电导率在12℃下可以是在1.5-7mS/cm范围内。在本发明的一些优选实施例中，可以甚至更优选的是该第一组合物的电导率在12℃下是在2-5mS/cm范围内。
该第一组合物可以例如在12℃下具有0.5-5mS/cm范围内的电导率。例如，该第一组合物可以例如在12℃下具有0.6-4mS/cm范围内的电导率。可替代地，该第一组合物可以例如在12℃下具有0.8-2mS/cm范围内的电导率。
在本发明的一些优选实施例中，该第一组合物在12℃下具有1-8mS/cm范围内的电导率并且在12℃下具有pH 2-5范围内的pH。
在本发明的其他优选实施例中，该第一组合物在12℃下具有1.5-6mS/cm范围内的电导率并且在12℃下具有pH 2.5-3.9范围内的pH。
在本发明的另外的优选实施例中，该第一组合物在12℃下具有2-5mS/cm范围内的电导率并且在12℃下具有pH 3.0-3.8范围内的pH。
例如，该第一组合物可以在12℃下具有0.5-5mS/cm范围内的电导率并且在12℃下具有pH 3.0-4.8范围内的pH。
或者，该第一组合物可以在12℃下具有0.7-3mS/cm范围内的电导率并且在12℃下具有pH 3.5-4.5范围内的pH。
在本发明的一些实施例中，当与该第一组合物接触时该阳离子交换材料被填充在一个柱中。
当与该第一组合物接触时，该阳离子交换材料可以例如作为自由流动颗粒悬浮于该第一组合物中。
在本发明的一些实施例中，该阳离子交换材料包含一个固相和能够结合阳离子的一个或多个阴离子基团。
优选地，这些阴离子基团中的至少一些被附接到该固相上。
在本发明的一些实施例中，该阳离子交换材料的该固相包含选自下组的一种或多种组分，该组由以下各项组成：多个颗粒、一个过滤器以及一个膜。
该固相可以例如包含多糖或甚至基本上由其组成。交联多糖是特别优选的。有用的多糖的实例是纤维素、琼脂糖和/或葡聚糖。
或者，该固相可以包含一种非碳水化合物聚合物或甚至基本上由其组成。有用的非碳水化合物聚合物的实例是甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯和/或苯乙烯-二乙烯基苯。
在本发明的一些优选实施例中，这些阴离子基团可以例如包括强阳离子交换基团例如像磺酸基或甚至由其组成。可替代地或另外地，这些阴离子基团可以例如包括弱阳离子交换基团例如像羧酸基或甚至由其组成。
每个循环的最佳蛋白负载取决于阳离子交换色谱法过程的设计和该阳离子交换材料的特征。
在该阳离子交换色谱法过程中的过程条件(包括压力等)取决于实际的过程实施、所使用的设备以及所使用的该阳离子交换材料。
在步骤c)过程中的该第一组合物的温度典型地是足够低的以使微生物生长最小化并且避免热损害蛋白质和该阳离子交换材料，但足够高的以为该第一组合物提供一个可接受的粘度。
在本发明的一些实施例中，在步骤c)过程中该第一组合物的温度是在2℃-40℃范围内。优选地，在步骤c)过程中该第一组合物的温度是在4℃-20℃范围内，并且甚至更优选地是在6℃-15℃范围内。
关于阳离子交换色谱法及其工业实施的更多细节可以见于视野(Scopes)中，出于所有目的，该参考文献通过引用结合在此。
步骤d)涉及收集未结合该阳离子交换材料的该第一组合物的级分，从而获得该含CMP的组合物。
该收集的级分同样可以用作该含CMP的组合物，或者可替代地，可以使该收集的级分经受额外的过程步骤，例如对该组合物进行脱矿质和浓缩并且随后使它转变成一种粉末。
因此，在本发明的一些优选实施例中，使该收集的级分另外经受选自下组的一个或多个过程步骤，该组由以下各项组成：热处理、浓缩、脱矿质、蒸发溶剂、喷雾干燥以及蛋白质结合的阳离子的取代。例如，可以使该收集的级分经受一个浓缩步骤。
可替代地或另外地，可以例如通过使用保留单体CMP的一个超滤过滤器进行渗滤来使该收集的级分经受脱矿质。
可以在浓缩或渗滤之前将该收集的级分的pH调节到高于pH 4的pH，例如至少pH 5的pH。pH升高导致单体CMP缔合成低聚物，这允许使用具有更大孔径的膜来进行浓缩和/或渗滤。可替代地或另外地，可以使该收集的级分经受一个蒸发步骤。
可替代地或另外地，可以使该收集的级分经受一个喷雾干燥步骤。
在本发明的一些优选实施例中，使该收集的级分经受以下步骤：
i)例如通过超滤、纳米过滤或反渗透来进行浓缩，
ii)例如针对水进行渗滤，
iii)可任选地，例如通过蒸发进行另一浓缩步骤，
iv)巴氏灭菌，以及
v)喷雾干燥以将该巴氏灭菌的组合物转化成一种粉末。
本发明方法可以作为分批方法亦或半分批方法来实施。
本发明的该含CMP的组合物具有非常高的CMP纯度和非常低含量的Phe两者。
在本发明的优选实施例中，该方法用于生产相对于组合物的蛋白质总量具有至少92％(w/w)的CMP纯度的含CMP的组合物。例如，该方法可以用于生产相对于组合物的蛋白质总量具有至少95％(w/w)的CMP纯度的含CMP的组合物。优选地，该方法用于生产相对于组合物的蛋白质总量具有至少97％(w/w)，例如像至少98％(w/w)或甚至约100％(w/w)的CMP纯度的含CMP的组合物。
本发明的方法的一个示例性实施例示意性地示出在图1中。乳清来源的进料(1)被引导到该UF单元上并且因此经受超滤。该UF步骤引起以下各项形成：一种UF渗余液(2)，即由该UF过滤器保留的级分；以及一种UF渗透液，该UF渗透液是已经透过该UF过滤器的级分。在此实施例中，UF渗透液(3)用作经受阳离子交换色谱法的该第一组合物。该第一组合物的非CMP蛋白杂质结合该阳离子交换材料(未描绘)并且收集纯化的含CMP的组合物(4)。
本发明的方法的另一个示例性实施例示意性地描绘于图2中。类似于图1中的该方法，使该乳清来源的进料经受超滤。所得到的CMP富集的UF渗透液(3)被用作该第一组合物并且经受阳离子交换色谱法。收集未结合该阳离子交换材料的蛋白质级分作为该含CMP的组合物。然而，在图2的该方法中，另外用水(5)稀释该UF渗余液并且将其作为该UF过程的进料再循环，从而洗涤掉原始乳清来源的进料中更大部分的CMP并且在该UF渗透液中回收这种CMP。
本发明的又另一个示例性实施例示意性地示出在图3中。在此，在步骤b)中使用一连串三个超滤单元。将乳清来源的进料(1)馈送到该第一UF单元中，从而产生一种第一UF渗余液(2)和一种第一UF渗透液(3)。使第一UF渗余液(2)与水(5)相混合并且将其馈送到该第二UF单元中，从而产生一种第二UF渗余液(2’)和一种第二UF渗透液(3’)。使第二UF渗余液(2’)与水(5)相混合并且将其馈送到该第三UF单元中，从而产生一种第三UF渗余液(2”)和一种第三UF渗透液(3”)。合并第一渗透液、第二渗透液和第三渗透液(3、3’和3”)并且将其用作经受阳离子交换色谱法的该第一组合物。
本发明的另一个方面涉及一种通过其中描述的方法可获得的含CMP的组合物。
该含CMP的组合物相对于蛋白质的总量优选地含有至多0.5％(w/w)苯丙氨酸。例如，该含CMP的组合物可以相对于蛋白质的总量含有至多0.4％(w/w)苯丙氨酸。优选地，该含CMP的组合物相对于蛋白质的总量优选地含有至多0.3％(w/w)苯丙氨酸。甚至更优选地，该含CMP的组合物相对于蛋白质的总量优选地含有至多0.2％(w/w)苯丙氨酸，例如相对于蛋白质的总量至多0.1％(w/w)苯丙氨酸。
在本发明的优选实施例中，该含CMP的组合物相对于该组合物的蛋白质总量具有至少92％(w/w)的CMP纯度。例如，该含CMP的组合物可以相对于该组合物的蛋白质总量具有至少95％(w/w)的CMP纯度。优选地，该含CMP的组合物相对于该组合物的蛋白质总量具有至少97％(w/w)的CMP纯度，例如像至少98％(w/w)或甚至约100％(w/w)。
上文已经参考多个具体实施例对本发明进行描述。然而，除上文描述以外的其他实施例同样有可能在本发明的范围之内。除非另有说明，否则本发明的各种实施例和方面的不同特征和步骤可以按照除在此描述的这些以外的其他方式进行结合。
实例
实例1：本发明的方法变体
超滤I-分离：
将12000升含有30％干物质和24％蛋白质的乳清蛋白浓缩物(WPC)用脱矿质冷水稀释至10％的干物质含量和8％的蛋白质含量。添加12M盐酸直到pH是2.8为止。使用来自美国加利福利亚州瓦卡维尔星达过滤技术公司(Synder Filtration，Vacaville，California，US)的BN6338型号的6”螺旋卷式膜对溶液进行过滤，其中这些膜具有31密耳间隔和50,000道尔顿的标称截留值。总膜面积是3072m2。在以下条件下进行过滤：使温度维持在10℃下并且使平均压力维持在4.5巴下，其中馈送压力是3.5巴。通过使用12M盐酸使pH维持在2.8下，并且用与去除渗透液相同的流量添加来自超滤II的渗透液(参见下文)。回路中的再循环流量是180m3/h，并且馈送罐上的再循环是大约10m3/h。在10小时过滤之后，停止添加来自超滤II的渗透液。平均通量被测量为8L/m2h。
超滤II-渗滤渗余液和浓缩渗透液：
将来自超滤I的渗透液收集在通向超滤II的一个馈送罐中并且通过使用6％氢氧化钠连续地将pH调节到6.0。与超滤I同时，使用来自美国马萨诸塞州威明顿科氏滤膜系统公司(Koch Membrane Systems，Wilmington，Massachusetts，US)的HFK-3286338型号的6”螺旋卷式膜进行超滤II，其中这些膜具有31密耳间隔和5,000道尔顿的标称截留值。总膜面积是2304m2。在以下条件下进行过滤：使温度维持在10℃下并且使平均压力维持在1.0至5.0巴下，以便用与从超滤I中去除渗透液相同的流量为超滤I供应渗透液。在10小时过滤之后，即在停止超滤I之后，收集该渗余液。随后使该渗余液经受渗滤，其中用与去除滤液相同的流量添加70,000升自来水。在渗滤之后，对该渗余液进行浓缩直到该渗余液中的蛋白质含量是12％为止。该渗余液的最终体积是3450升。这些过滤条件与上文相同。基于HPLC分析，该渗余液中的CMP纯度被测定为79％(79g CMP/100g蛋白质)。
阳离子交换色谱法：
对于一天的生产，将650升来自超滤II的最终渗余液用脱矿质冷水稀释至1.24％(1.24g蛋白质/100g溶液)的蛋白质含量。使用42％w/w柠檬酸将该溶液中的pH调节到3.50并且使用2M NaCl和2M KCl的溶液将电导率调节到2.0mS/cm。使用填充有116升来自瑞典乌普萨拉通用电气医疗公司(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)的食品级SP琼脂糖大珠粒(SP Sepharose Big Beads Food Grade)的一个柱来使725升调节的蛋白质溶液经受阳离子交换色谱法。
以下条件用于阳离子交换色谱法的每个循环：
以1300L/h的流速用290升脱矿质冷水冲洗该柱。以1050L/h的流速将来自上文的725升进料溶液(该调节的蛋白质溶液)泵送穿过该柱并且将流过物(未结合的材料)收集在一个产品罐中，它也表示为CMP溶液。分别以1050L/h和1300L/h的流速用对应地232升和58升的脱矿质水冲洗该柱。通过以943L/h的流速将580升0.5M氢氧化钠泵送穿过该柱来进行同时洗脱和在位清洗步骤。分别以943L/h和1300L/h的流速用对应地290升和580升的脱矿质水冲洗该柱。阳离子交换色谱法的一个循环的时间是2.6小时。对于该阳离子交换色谱法步骤的CMP的相对产率是92％(流过物中的92g CMP/进料中的100g CMP)。
每天进行8个循环的阳离子交换色谱法，然后进行标准超滤(来自美国马萨诸塞州威明顿科氏滤膜系统公司的HFK-328膜)，以便浓缩该产品罐中的CMP溶液。在超滤之前，通过氢氧化钾和氢氧化钠的一种混合型溶液将该产品罐中的pH调节到6.5。总共进行32个循环的阳离子交换色谱法，在此之后通过标准超滤(来自美国马萨诸塞州威明顿科氏滤膜系统公司的HFK-328膜)对该CMP溶液进一步浓缩。使用一个标准喷雾干燥器对该浓缩的CMP溶液进行喷雾干燥并且获得196kg的粉末。在表1中给出了粉末的组成与选择的参数。
实例2-本发明的方法变体
以类似于实例1中描述的方式进行超滤I和超滤II。基于HPLC分析，该最终超滤II渗余液中的CMP纯度被测定为80％(80g CMP/100g蛋白质)。
以类似于实例1中描述的方式进行阳离子交换色谱法，除了以下条件：将该稀释的溶液的pH调节到3.37并且总共进行47个循环的阳离子交换色谱法。对于该阳离子交换色谱法步骤的CMP的相对产率是90％(流过物中的90g CMP/进料中的100g CMP)。使用一个标准喷雾干燥器对该浓缩的CMP溶液进行喷雾干燥并且获得357kg的粉末。在表1中给出了粉末的组成与选择的参数。
实例3-本发明的方法变体
以类似于实例1中描述的方式进行超滤I和超滤II。基于HPLC分析，该最终超滤II渗余液中的CMP纯度被测定为83％(83g CMP/100g蛋白质)。
阳离子交换色谱法：
对于一天的生产，将450升来自超滤II的最终渗余液用脱矿质冷水稀释至0.66％(0.66g蛋白质/100g溶液)的蛋白质含量。使用30％w/w盐酸将该溶液中的pH调节到3.25并且使用2M NaCl和2M KCl的溶液将电导率调节到2.0mS/cm。使用填充有80升来自瑞典乌普萨拉通用电气医疗公司的食品级SP琼脂糖大珠粒的一个柱来使1000升调节的蛋白质溶液经受阳离子交换色谱法。
以下条件用于阳离子交换色谱法的一个循环：
以1300L/h的流速用300升脱矿质冷水、300升0.50％w/w乙酸以及200升脱矿质冷水冲洗该柱。以1300L/h的流速将来自上文的该1000升进料溶液泵送穿过该柱并且将流过物(未结合的材料)收集在一个产品罐中，它也表示为CMP溶液。
以1300L/h的流速用200升脱矿质冷水冲洗该柱。通过以700L/h的流速将400升1.0M氢氧化钠泵送穿过该柱来进行同时洗脱和在位清洗步骤。分别以700L/h和1300L/h的流速用对应地200升和400升的脱矿质冷水冲洗该柱。阳离子交换色谱法的一个循环的时间是2.7小时。对于该阳离子交换色谱法步骤的CMP的相对产率是77％(流过物中的77g CMP/进料中的100g CMP)。每天进行8个循环的阳离子交换色谱法，然后进行标准超滤(来自美国马萨诸塞州威明顿科氏滤膜系统公司的HFK-328膜)，以便浓缩该产品罐中的CMP溶液。在超滤之前，使用氢氧化钾和氢氧化钠的一种混合型溶液将该产品罐中的pH调节到6.5。总共进行20个循环的阳离子交换色谱法，在此之后通过标准超滤(来自美国马萨诸塞州威明顿科氏滤膜系统公司的HFK-328膜)对该CMP溶液进一步浓缩。使用一个标准喷雾干燥器对该浓缩的CMP溶液进行喷雾干燥并且获得78kg的粉末。在表1中给出了粉末的组成与选择的参数。
实例4-本发明的方法变体
以类似于实例1中描述的方式进行超滤I和超滤II。基于HPLC分析，该最终超滤II渗余液中的CMP纯度被测定为79％(79g CMP/100g蛋白质)。
阳离子交换色谱法：
对于一天的生产，将278升来自超滤II的最终渗余液用脱矿质冷水稀释至0.68％(0.68g蛋白质/100g溶液)的蛋白质含量。使用30％w/w盐酸将该溶液中的pH调节到3.75并且使用一种5M NaCl溶液将电导率调节到4.0mS/cm。使用填充有80升来自瑞典乌普萨拉通用电气医疗公司的食品级SP琼脂糖大珠粒的一个柱来使1000升的该调节的蛋白质溶液经受阳离子交换色谱法。
以下条件用于阳离子交换色谱法的一个循环：
以1300L/h的流速用300升1M NaCl、300升脱矿质冷水、300升0.25％w/w乙酸以及200升脱矿质冷水冲洗该柱。以1300L/h的流速将来自上文的该1000升进料溶液(该调节的蛋白质溶液)泵送穿过该柱并且将流过物(未结合的材料)收集在一个产品罐中，它也表示为CMP溶液。以1300L/h的流速用200升脱矿质冷水、300升1M NaCl(洗脱)以及200升脱矿质冷水冲洗该柱。通过以700L/h的流速将400升1.0M氢氧化钠泵送穿过该柱来进行在位清洗步骤。分别以700L/h和1300L/h的流速用对应地200升和400升的脱矿质水冲洗该柱。阳离子交换色谱法的一个循环的时间是3.3小时。对于该阳离子交换色谱法步骤的CMP的相对产率是90％(流过物中的90g CMP/进料中的100g CMP)。每天进行5个循环的阳离子交换色谱法，然后进行标准超滤(来自美国马萨诸塞州威明顿科氏滤膜系统公司的HFK-328膜)以便浓缩该产品罐中的CMP溶液。在超滤之前，通过氢氧化钾和氢氧化钠的一种混合型溶液将该产品罐中的pH调节到6.5。总共进行10个循环的阳离子交换色谱法，在此之后通过标准超滤(来自美国马萨诸塞州威明顿科氏滤膜系统公司的HFK-328膜)对该CMP溶液进一步浓缩。使用一个标准喷雾干燥器对大约一半的该浓缩的CMP溶液进行喷雾干燥并且获得24kg的粉末。在表1中给出了粉末的组成与选择的参数。
实例5-本发明的方法变体
超滤I-分离：
将600升含有23％干物质、20％蛋白质并具有大约24％(24g CMP/100g蛋白质)CMP纯度的β-乳球蛋白减少的WPC浓缩物用脱矿质冷水稀释到11％的干物质含量和8.9％的蛋白质含量。添加30％w/w盐酸直到pH是2.2为止。使用来自美国加利福利亚州瓦卡维尔的星达过滤技术公司的BN6338型号的6”螺旋卷式膜对溶液进行过滤，其中这些膜具有31密耳间隔和50,000道尔顿的标称截留值。总膜面积是64m2。在以下条件下进行过滤：使温度维持在10℃下并且使平均压力维持在2.0巴下(在两个过滤器元件上)，其中馈送压力是3.0巴。通过使用30％w/w盐酸使pH维持在2.2上，并且用与去除渗透液相同的流量添加来自超滤II的渗透液。回路中的再循环流量是30m3/h，并且馈送罐上的再循环是大约5m3/h。在8.5小时过滤之后，停止添加来自超滤II的渗透液。平均通量被测量为22L/m2h。
超滤II-渗滤渗余液和浓缩渗透液：
将来自超滤I的渗透液收集在通向超滤II的一个馈送罐中。与超滤I同时，使用来自美国加利福利亚州瓦卡维尔星达过滤技术公司的VT6338型号的6“螺旋卷式膜进行超滤II，其中这些膜具有31密耳间隔和3,000道尔顿的标称截留值。总膜面积是64m2。在以下条件下进行该过滤：使温度维持在10℃下并且使平均压力维持在1.0-1.5巴下(在两个过滤器元件上)，其中馈送压力是0.5-1.0巴。调节这些压力条件以便用与去除来自超滤I的渗透液相同的流量产生渗透液。在8.5小时过滤之后，即在停止超滤I之后，使用与上文相同的条件对渗余物进行浓缩并且获得600升渗余物。随后使用4％氢氧化钠将该渗余液调节到pH 6.3并且使其经受渗滤，其中用与去除滤液相同的流量添加3,300升自来水。这些过滤条件与上文相同。获得820升具有3.4％干物质含量和2.9％蛋白质含量的渗余液。基于HPLC分析，该渗余液中的CMP纯度被测定为72％(72g CMP/100g蛋白质)。
阳离子交换色谱法：
类似于实例1中给出的说明进行阳离子交换色谱法，除了以下条件：将来自超滤II的最终渗余液用脱矿质冷水稀释到1.14％(1.14g蛋白质/100g溶液)的蛋白质含量，将该稀释的溶液中的pH调节到3.47，将电导率调节到2.3mS/cm。在每个循环过程中将805升进料溶液泵送穿过该柱并且总共进行2个循环的阳离子交换色谱法。对于该阳离子交换色谱法步骤的CMP的相对产率是80％(流过物中的80g CMP/进料中的100g CMP)。使用一个标准喷雾干燥器对大约一半的该浓缩的CMP溶液进行喷雾干燥并且获得6kg的粉末。在表1中给出了粉末的组成与选择的参数。
表1实例1-5的含CMP的产品的组成。
实例6-与现有技术相比较
US 5,278,288 A披露了一种用于生产CMP的方法，该方法按照所述顺序组合阳离子交换色谱法和超滤。例如在第一阳离子交换步骤中，使奶酪乳清与一种阳离子交换树脂接触并且收集未吸附的材料。随后，使用具有10,000至50,000道尔顿截留值的一种膜在低于4的pH下使该未吸附的材料经受超滤，从而在滤液中获得CMP。最后，对该滤液进行pH调节并且进行标准超滤以用于在喷雾干燥之前浓缩CMP溶液。因此，这两个关键的分离步骤按所述顺序是阳离子交换色谱法和在pH<4下进行的超滤。在本发明中，颠倒这两个分离步骤的顺序。在此首先进行在至多pH 4下的超滤(实例中的“超滤I”)，然后进行在未吸附的材料(也表示“流过物”或“非结合材料”)中获得CMP的阳离子交换色谱法。当与US 5,278,288 A中给出的这些分离步骤的顺序相比时，本发明的这些分离步骤的顺序具有若干优点。
本发明的第一个优点是：使用本发明的该方法得到的最终产品中的CMP纯度(总蛋白的％CMP)与US 5,278,288 A中获得的CMP纯度相比高得多。在US 5,278,288 A中给出了从80％到88％的纯度数值。通过本发明的该方法，可以实现大约98％或以上的纯度。由于通过本发明获得的CMP产品中的非常高的纯度，该产品是适合用作用于罹患苯丙酮尿症的患者的一种营养成分，这也是通过存在于该产品中的非常低水平的苯丙氨酸所指示的。如在通过来自US 5,278,288 A的方法获得的产品中的80％至88％的CMP纯度与对于苯丙酮尿症患者而言太高的苯丙氨酸含量相关。
本发明的第二个优点是：对于每千克分离的CMP，本发明使用比US5,278,288A的方法或提供可比性高纯度CMP的现有技术的任何其他方法更少的离子交换材料。根据本发明，该第一超滤步骤去除了大部分的非CMP乳清蛋白。因此，在通向该阳离子交换色谱法步骤的进料溶液中非CMP乳清蛋白与CMP之间的重量比是比US 5,278,288A中所述低得多，并且因此每个质量单位的CMP需要低得多的体积的阳离子交换树脂来结合所有非CMP乳清蛋白。
本发明的第三个优点是：使用本发明的该方法得到的CMP总产率(与起始材料中的CMP质量比较的最终产品中的CMP质量％)与US 5,278,288A中获得的CMP总产率相比高得多。使用US 5,278,288 A中的实例2并且假设豪达(Gouda)乳清中的蛋白质含量是6.2g/L并且CMP含量相对于总蛋白质含量是18％，可以基于在最终产品中获得的81mg CMP计算总CMP产率(0.73％)。使用本发明的实例2并且假设CMP含量相对于起始材料中的总蛋白质含量是18％，可以计算总CMP产率(50％)，这是通过组合来自超滤步骤的63％产率和包括阳离子交换色谱法步骤到最终粉末产品的80％产率来获得的。
本发明的第四个优点是：相对于US 5,278,288 A，本发明增加了在离子交换树脂报废之前该批离子交换树脂仍可以工作的离子交换循环数。离子交换色谱法是一个相对昂贵的单元操作并且该离子交换树脂的成本是总处理成本的一个重要部分。因此延长该离子交换材料的寿命是改进生产高纯度含CMP的产品的总过程经济的令人感兴趣的方法。

Claims (27)

1.一种生产具有低含量苯丙氨酸的含酪蛋白巨肽的组合物的方法，该方法包括以下步骤
a)提供包含酪蛋白巨肽(CMP)和至少一种额外蛋白质的一种乳清来源的进料，所述乳清来源的进料具有至多4的pH，
b)使用允许单体CMP通过的一个超滤过滤器来使所述乳清来源的进料经受超滤，从而提供一种UF渗透液和一种UF渗余液，针对CMP富集该UF渗透液，
c)使来源于所述UF渗透液的一种第一组合物与一种阳离子交换材料接触，并且
d)收集未结合该阳离子交换材料的该第一组合物的级分，从而获得该含CMP的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该乳清来源的进料是来源于奶酪乳清或其一种浓缩物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该乳清来源的进料是来源于由凝乳酶凝结的酪蛋白或酪蛋白酸盐或其一种浓缩物获得的乳清。
4.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳清来源的进料相对于蛋白质的总量含有至少1％(w/w)的总量的CMP。
5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳清来源的进料相对于蛋白质的总量含有1％-60％(w/w)范围内的总量的CMP。
6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种额外的蛋白质包括选自下组的至少一种蛋白质，该组由以下各项组成：免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、牛血清白蛋白(BSA)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、β酪蛋白、酪蛋白来源的肽、乳脂肪球膜(MFGM)蛋白以及其一个组合。
7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种额外的蛋白质包括选自下组的至少两种蛋白质，该组由以下各项组成：免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、牛血清白蛋白(BSA)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、β酪蛋白、酪蛋白来源的肽、乳脂肪球膜(MFGM)蛋白以及其一个组合。
8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳清来源的进料相对于蛋白质的总量含有至多3％(w/w)的总量的酪蛋白。
9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳清来源的进料相对于该乳清来源的进料的重量含有至少0.2％(w/w)的总量的蛋白质。
10.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳清来源的进料相对于该乳清来源的进料的重量含有0.2％-20％(w/w)范围内的总量的蛋白质。
11.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该乳清来源的进料具有pH 1-4范围内的pH。
12.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该超滤过滤器具有5-300kDa范围内的标称分子量截留。
13.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该UF渗透液相对于蛋白质的总量含有至少55％(w/w)的总量的CMP。
14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该UF渗透液在500nm处具有至多0.1AU的吸光度。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该第一组合物相对于蛋白质的总量含有至少55％(w/w)的总量的CMP。
16.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该第一组合物相对于蛋白质的总量含有55％-95％(w/w)范围内的总量的CMP。
17.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该第一组合物相对于该第一组合物的重量含有至多0.5％(w/w)的总量的酪蛋白。
18.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该第一组合物含有至少0.1％(w/w)的总量的蛋白质。
19.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该第一组合物含有0.1％-20％(w/w)范围内的总量的蛋白质。
20.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该第一组合物具有pH2-5范围内的pH。
21.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该第一组合物具有1-8mS/cm范围内的电导率。
22.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中当与该第一组合物接触时该阳离子交换材料被填充在一个柱中。
23.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中当与该第一组合物接触时该阳离子交换材料作为自由流动颗粒悬浮于该第一组合物中。
24.根据以上权利要求中任一项所述的方法，该方法另外包括对该收集的级分进行浓缩。
25.根据以上权利要求中任一项所述的方法，该方法另外包括对该收集的级分进行喷雾干燥。
26.一种通过权利要求1-25中任一项可获得的含CMP的组合物。
27.根据权利要求26所述的含CMP的组合物，该组合物相对于蛋白质的总量含有至多0.5％(w/w)苯丙氨酸。
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