CN108191967A - 一种牛奶中A2-β-酪蛋白的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛奶中A2‑β‑酪蛋白的分离方法，综合考虑了β‑酪蛋白的等电点、Ca2+离子敏感、低温低酸游离等特性，探索出A2‑β‑酪蛋白的提纯方法，能够快速分离富集得到纯度在85％以上的A2‑β‑酪蛋白，该方法不仅能够用于A2‑β‑酪蛋白的分离提纯，也能够用于A1‑β‑酪蛋白或者同时含有A1‑β‑酪蛋白和A2‑β‑酪蛋白的混合β‑酪蛋白的分离提纯，克服了现有技术中β‑酪蛋白分离时间长、步骤繁琐以及耗费高昂的问题，为检测乳制品中β‑酪蛋白种类提供了条件，而且工艺简单、成本低，适于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及分离提纯领域，具体涉及一种牛奶中A2-β-酪蛋白的分离方法。
背景技术
酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白质，占牛乳蛋白含量的80％左右。根据氨基酸组成和电泳行为的不同，酪蛋白可分为αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占牛乳酪蛋白总量的30-35％。β-酪蛋白又存在多种变体，最常见的是A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白，两者的区别在于氨基酸链的第67位存在变异，前者为组氨酸，后者为脯氨酸。研究发现，A1-β-酪蛋白在生物体内会水解产生β-酪啡肽(BCM-7)，该活性肽能够导致缺血性心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症及一些精神方面的疾病，因此含有A2-β-酪蛋白的乳制品更加健康安全，在国内外市场上也更受欢迎。
由于奶牛的基因决定了所产牛乳中β-酪蛋白是A1型或者A2型，所以目前主要通过牛只基因鉴定法来判断牛乳中β-酪蛋白的种类，该法不能判断未知奶牛基因型的牛乳样品。为了定性定量检测未知牛奶中β-酪蛋白的类型及其含量，首要的获得A2-β-酪蛋白，然而由于工艺或者成本等因素，市场上并没有售卖A2-β-酪蛋白的标准化商品，需要从A2型牛奶中分离制备。然而现有的分离纯化酪蛋白的方法不仅步骤繁琐、耗时长、花费高昂，而且对β-酪蛋白的分离纯化效果差。因此，迫切需要一种对牛奶中β-酪蛋白，尤其是A2-β-酪蛋白的高效便捷、廉价易行提纯分离方法。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的就是提供简单、便宜的牛乳β-酪蛋白的分离方法。
本发明提供了一种A2-β-酪蛋白的分离方法，包括下述步骤：
1)将脱脂的A2型牛奶在25-35℃下碱调pH值到10.5-11.5；
2)在搅拌条件下向脱脂奶中加入钙盐，使脱脂奶体系中钙离子浓度在0.05-0.08mol/L，酸调体系pH值至中性，离心，保留沉淀；
3)用纯净水洗涤沉淀1-2次，向沉淀中加入pH值为10.5-11.5的碱溶液，并在2-4℃下冷冻搅拌2h，得到蛋白溶液；
4)酸调蛋白溶液pH值到4-5，在2-4℃下冷冻离心，收集上清液并转移至另一烧杯中，在25-35℃下保持25-35min，离心，保留沉淀；
5)洗涤沉淀，干燥后得到目标蛋白，并在-20℃冷冻保存目标蛋白。
优选的是，步骤1)中所述脱脂的A2型牛奶的制备方法：将A2型牛奶在2℃下冷冻离心，留取下层的脱脂奶。
优选的是，步骤1)中所述碱为1mol/L氢氧化钠溶液，碱调温度为30℃，碱调pH值到11。
优选的是，步骤2)中所述钙盐为0.5mol/L氯化钙溶液，脱脂奶体系中钙离子浓度为0.065mol/L；所述酸为1mol/L盐酸；所述离心时间10min，转速4000r/min。
优选的是，步骤3)中所述洗涤为向沉淀中加入纯净水并搅拌至呈乳浊液，将该乳浊液在4000r/min下离心10min，保留沉淀，即为固体蛋白。
优选的是，步骤3)中所述碱溶液的pH值为11，冷冻搅拌温度为2℃。
优选的是，步骤4)中所述酸为1mol/L或者0.5mol/L盐酸，酸调蛋白溶液pH值到4.6；所述冷冻离心转速6000r/min，时间10min，温度2℃。
优选的呢是，步骤4)中所述转移后的上清液水浴升温至30℃，并保持30min，然后在不低于15℃的温度下以6000r/min离心10min，保留沉淀。
优选的是，步骤5)中所述洗涤沉淀为用纯净水和丙酮各洗涤两遍；所述干燥为在45℃下烘干或者冷冻干燥。
优选的是，所述分离方法能用于分离A1-β-酪蛋白或者同时含有A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白的混合β-酪蛋白。
对本发明及其有益效果的阐述：本发明成功地从A2型牛奶中分离出了A2-β-酪蛋白，其纯度大于85％，该A2-β-酪蛋白可以用于高效液相测试以获取其浓度与峰面积的对应关系，进而用于定量检测出未知牛奶中是否含有A2-β-酪蛋白，及A2-β-酪蛋白的含量；为了定量检测乳制品中β-酪蛋白的类型及含量，必须要获得高纯度的A2-β-酪蛋白用作标样，然而由于工艺或者成本等因素，市场上并没有售卖A2-β-酪蛋白的标准化商品，致使在A2-β-酪蛋白定量检测方面存在一定的技术空白；本发明人结合了β-酪蛋白的等电点、Ca2+离子敏感、低温低酸游离等特性，探索出β-酪蛋白的提纯方法，能够快速分离富集得到纯度在85％以上的β-酪蛋白，该方法不仅能够用于A2-β-酪蛋白的分离提纯，也能够用于A1-β-酪蛋白或者同时含有A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白的混合β-酪蛋白的分离提纯，克服了现有技术中β-酪蛋白分离时间长、步骤繁琐以及耗费高昂的问题，为检测乳制品中β-酪蛋白种类提供了条件；本发明中的提纯方法工艺简单、成本低，适于大规模生产，可以用作未知奶样的β-酪蛋白分型鉴定及含量检测的测定标准品。
附图说明
图1为A2型牛奶的高效液相色谱图；
图2为从A2型牛奶中分离提纯的A2-β-酪蛋白的高效液相色谱图；
图3为样品牛奶的高效液相色谱图；
图4为从样品牛奶中分离提纯的β-酪蛋白的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
1)将A2型牛奶在2℃冷冻离心，除去牛奶中的脂肪成分，留取下层的脱脂奶，将该脱脂奶升温至30℃，并用氢氧化钠溶液调节pH值到11，以促进牛奶中蛋白质充分溶解于溶液之中；
2)在搅拌条件下向脱脂奶中加入氯化钙溶液，控制体系中氯化钙浓度在0.065mol/L，用盐酸调节体系pH值到7，离心分层，保留沉淀；牛奶酪蛋白中αs-酪蛋白和β-酪蛋白容易与钙离子结合沉淀，而κ-酪蛋白不易于钙离子结合沉淀，申请人经过长时间实验探索发现，当氯化钙浓度在0.065mol/L时，既能够保证κ-酪蛋白不沉淀，同时还使αs-酪蛋白和β-酪蛋白沉淀收率最高；
3)向沉淀中加入纯净水并搅拌至呈乳浊液，将该乳浊液离心分层，保留沉淀；重复该离心操作一次，所得到沉淀为固体蛋白质；本步的目的是用纯净水洗涤离心所得蛋白质固体沉淀，充分将蛋白沉淀中残留的乳糖和乳清蛋白冲洗掉；
4)将固体蛋白质转移至烧杯中，加入pH值为11的碱溶液，搅拌至完全溶解得到蛋白溶液，在搅拌条件下将该蛋白溶液在2℃冷冻2h；申请人经过长时间实验探究发现，酪蛋白的在pH值为11的碱溶液中溶解效果最佳，能够有效保证β-酪蛋白溶解度和最终收率；
5)用盐酸调节蛋白溶液pH值到4.6，然后在2℃下冷冻离心，收集上清液并转移至另一干净烧杯中；低温低酸的条件下β-酪蛋白在水溶液中溶解度较大，且远大于αs-酪蛋白在此条件下的溶解度，因此本步通过控制环境温度和酸度实现β-酪蛋白与αs-酪蛋白的分离以及β-酪蛋白的富集；将该富集有β-酪蛋白的上清液在30℃下保持30min，然后在室温离心分层，保留沉淀，该沉淀的主要成分即为β-酪蛋白；室温离心温度不得低于15℃，如温度低于15℃β-酪蛋白容易复溶，导致收率降低；
6)用纯净水和丙酮各洗涤沉淀两次，用以清洗最终产物中杂质，干燥后得到目标蛋白，并在-20℃冷冻保存，所得目标蛋白纯度大于85％。
实施例2
本案中使用的高效液相色谱仪为安捷伦1260，色谱条件如下：
色谱柱：Vydac Everest C18 column，250×4.6mm，5um,
进样量：50μL；
柱温：40℃；
检测波长：241nm，辅助280nm；
流动相A：0.1wt％三氟乙酸水溶液；
流动相B：0.1wt％三氟乙酸乙腈溶液；
洗脱程序：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ | 流速/mL·min-1 |
| 0 | 75.7 | 24.3 | 1 |
| 2 | 71.2 | 28.8 | 1 |
| 17 | 64.8 | 35.2 | 1 |
| 30 | 61.8 | 38.2 | 1 |
| 45 | 55.0 | 45.0 | 1 |
| 48 | 46.0 | 54.0 | 1 |
| 53 | 46.0 | 54.0 | 1 |
| 55 | 75.7 | 24.3 | 1 |
| 65 | 75.7 | 24.3 | 1 |
实施例3
下面将详细阐述利用分离纯化的A2-β-酪蛋白作为测定标准品来检测未知牛奶中β-酪蛋白的类型。
1)标准品前处理及检测：称取购买的Sigma品牌αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入500μL缓冲液(由6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Bis-Tris、5.37mmol/L二水柠檬酸钠组成)，涡旋混匀，以6000r/min离心15s，室温下静置1h；然后再以6000r/min离心10min，离心后加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β-巯基乙醇，涡旋混匀；最后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于高效液相色谱仪检测，得到αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品的色谱出峰图；
从测得的色谱出峰图中可以识别αs-酪蛋白的出峰时间在38-39min、κ-酪蛋白的出峰时间在20-21min、β-酪蛋白的出峰时间在41-42min，但无法判断该β-酪蛋白是A1型还是A2型或者两者混合物；
2)A1型或A2型牛奶前处理及检测：移取200μL经脱脂的牛奶至1.5mL离心管中，加入600μL缓冲液(由6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Bis-Tris、5.37mmol/L二水柠檬酸钠组成)，涡旋混匀1min，室温下静置1h；然后再以6000r/min离心10min，取下清液500μL至另一干净的1.5mL离心管中，加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β-巯基乙醇，涡旋混匀，用0.45μmPTFE滤膜过滤，滤液即可用于高效液相色谱仪检测，得到A1型和A2型牛奶的色谱出峰图；
对照步骤1)中αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品的色谱出峰图，能够识别A1型和A2型牛奶的色谱出峰图中αs-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白的色谱峰；其中，A1型牛奶中的A1-β-酪蛋白的出峰时间在42min，A2型牛奶中的A2-β-酪蛋白的出峰时间在43min，说明本测试的色谱条件下A1-β-酪蛋白较A2-β-酪蛋白先出峰；
3)A2-β-酪蛋白的分离纯化：将200mL新鲜A2型牛奶在2℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30℃，用1mol/L氢氧化钠溶液调节奶样pH值至11；在搅拌条件下向脱脂奶中加入0.5mol/L氯化钙溶液使最终奶样中氯化钙浓度为0.065mol/L，用1mol/L盐酸调节奶样pH值至7,以4000r/min离心10min，倾倒上层清液，保留沉淀；向沉淀中加入30mL纯净水并强力搅拌至呈乳浊液，以4000r/min离心10min，倾倒上清液，保留沉淀；再次向沉淀中加入30mL纯净水并强力搅拌呈乳浊液，以4000r/min离心10min，倾倒上清液，保留沉淀，即为固体蛋白质；将固体蛋白转移至200mL烧杯中，加入100mL pH值为11的碱溶液，搅拌至蛋白质完全溶解，在搅拌条件下将蛋白溶液降温至2℃，并保持2h；用1mol/L(或0.5mol/L)盐酸调节蛋白溶液pH值到4.6，冷冻离心(2℃、6000r/min)10min，收集上清液并转移至另一干净烧杯中；将该上清液升温至30℃并保持30min，然后在常温条件下(不得低于15℃)以6000r/min离心10min，收集沉淀；用纯净水和丙酮各洗涤沉淀两次，将沉淀在45℃条件下烘干或者冷冻干燥，得到目标蛋白并在-20℃冷冻保存，目标蛋白的纯度不低于85％；
将A2-β-酪蛋白按照步骤1)中的方法进行前处理后，进行测得并获得其高效液相色谱图，即图2，对照图1的A2型牛奶色谱出峰图，通过本提纯方法能够很好的除去A2型牛奶中的αs-酪蛋白和κ-酪蛋白，所得产品的纯度高，能够用于测定A2-β-酪蛋白在高效液相中峰面积与浓度关系，能够定量测出样品奶中A2-β-酪蛋白的含量；
4)待测牛奶样品及其中β-酪蛋白的检测：首先对待测牛奶样品进行前处理，处理方法与步骤2)中相同，然后进行高效液相色谱检测，色谱出峰图如图3，能够清楚的识别出αs-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白的色谱峰，其中，该牛乳样品在42-43min先后出现了两个β-酪蛋白峰，根据图2中A2-β-酪蛋白的高效液相色谱图，能够识别待测牛奶的高效液相色谱图中上的A2-β-酪蛋白色谱峰，从而初步判断出本牛乳样品中β-酪蛋白为A1型和A2型的混合，进一步根据A2-β-酪蛋白在高效液相中峰面积与浓度关系，能够计算出牛奶样品中A2-β-酪蛋白的含量；
更进一步，采用步骤3)中的分离纯化方法，分离出待测牛奶样品中的β-酪蛋白，将该β-酪蛋白单独进行高效液相检测，出峰图如图4，图中仅有β-酪蛋白的色谱峰，没有其他酪蛋白的色谱峰，说明本案中的提纯分离方法纯化效果好，还不会破坏目标蛋白的结构。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
Claims (10)
1.一种牛奶中A2-β-酪蛋白的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)将脱脂的A2型牛奶在25-35℃下碱调pH值到10.5-11.5；
2)在搅拌条件下向脱脂奶中加入钙盐，使脱脂奶体系中钙离子浓度在0.05-0.08mol/L，酸调体系pH值至中性，离心，保留沉淀；
3)用纯净水洗涤沉淀1-2次，向沉淀中加入pH值为10.5-11.5的碱溶液，并在2-4℃下冷冻搅拌2h，得到蛋白溶液；
4)酸调蛋白溶液pH值到4-5，在2-4℃下冷冻离心，收集上清液并转移至另一烧杯中，在25-35℃下保持25-35min，离心，保留沉淀；
5)洗涤沉淀，干燥后得到目标蛋白，并在-20℃冷冻保存目标蛋白。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤1)中所述脱脂的A2型牛奶的制备方法：将A2型牛奶在2℃下冷冻离心，留取下层的脱脂奶。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤1)中所述碱为1mol/L氢氧化钠溶液，碱调温度为30℃，碱调pH值到11。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤2)中所述钙盐为0.5mol/L氯化钙溶液，脱脂奶体系中钙离子浓度为0.065mol/L；所述酸为1mol/L盐酸；所述离心时间10min，转速4000r/min。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中所述洗涤为向沉淀中加入纯净水并搅拌至呈乳浊液，将该乳浊液在4000r/min下离心10min，保留沉淀，即为固体蛋白。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中所述碱溶液的pH值为11，冷冻搅拌温度为2℃。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤4)中所述酸为1mol/L或者0.5mol/L盐酸，酸调蛋白溶液pH值到4.6；所述冷冻离心转速6000r/min，时间10min，温度2℃。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤4)中所述转移后的上清液水浴升温至30℃，并保持30min，然后在不低于15℃的温度下以6000r/min离心10min，保留沉淀。
9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤5)中所述洗涤沉淀为用纯净水和丙酮各洗涤两遍；所述干燥为在45℃下烘干或者冷冻干燥。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离方法，其特征在于，所述分离方法能用于分离A1-β-酪蛋白或者同时含有A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白的混合β-酪蛋白。
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