CN112931616A - 一种低温诱导羊乳β-酪蛋白从胶束中解离的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低温诱导羊乳β‑酪蛋白从胶束中解离的方法，属于乳品生产领域。本发明所述的一种诱导羊乳β‑酪蛋白从胶束中解离的方法，包括如下步骤：将脱脂羊乳除菌后，加入解离剂混合均匀，之后在4‑10℃、pH5.4‑5.8下平衡120‑240min，分离得到含有β‑酪蛋白的乳清蛋白，其中所述的解离剂包括柠檬酸钠、氯化钠，其中柠檬酸钠在除菌脱脂羊乳中的浓度为1‑5mmol/L；柠檬酸钠在除菌脱脂羊乳中的浓度为25‑250mmol/L。本发明通过低温平衡放置、调整pH和解离剂的相互配合实现了β‑酪蛋白解离含量达到23.72％以上，可以高达49.26％。

Description

一种低温诱导羊乳β-酪蛋白从胶束中解离的方法
技术领域
本发明涉及一种低温诱导羊乳β-酪蛋白从胶束中解离的方法，属于乳品生产领域。
背景技术
羊乳易消化、不易产生乳糖不耐症和过敏反应，其诸多营养价值和功能特性均优于牛乳。近年来，基于羊乳的液态奶、奶酪、酸奶、婴幼儿配方奶粉等乳制品的消费者接受度和市场份额正在逐步扩大。
羊乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为30：70，其中酪蛋白部分主要含β、αs1、αs2和κ，其占比为55、6、19、20％；牛乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为20：80，酪蛋白部分主要含β、αs1、αs2和κ，其占比为36、40、10、14％；人乳中乳清蛋白与酪蛋白的比例为60：40，酪蛋白部分主要含β、αs1、κ，占比为68、12、20％。相较于牛乳，羊乳在蛋白组成和配比方面与人乳更接近。α-酪蛋白为乳中主要的过敏原，羊乳中的α-酪蛋白含量较少，且β-酪蛋白含量较牛乳多。因此，羊乳更适用于婴幼儿配方乳粉的生产。
目前，婴幼儿配方乳粉的母乳化研制主要集中在增加牛乳乳清蛋白含量方面，较少考虑酪蛋白配比的差异。同时提高婴幼儿配方乳粉中乳清蛋白和β-酪蛋白的含量，可以使其蛋白组成与人乳更为接近，更有利于婴幼儿消化吸收。
羊乳中的酪蛋白主要是以胶束形式存在的，其粒径范围为180-301nm，而乳清蛋白和极少量的β-酪蛋白则游离于胶束之外的乳清中。在胶束中，α和部分β-酪蛋白通过其所带的磷酸基团与胶体磷酸钙相互作用形成胶束骨架结构，部分β-酪蛋白则通过疏水作用结合到胶束骨架上。β-酪蛋白是疏水性最强的酪蛋白，在低温条件下，蛋白疏水作用减弱，部分β-酪蛋白逐渐从胶束解离到乳清中，并以分子单体或低分子量聚集体的形式存在。
目前，乳清蛋白通常是从奶酪加工的副产品(乳清)中分离得到的，例如：史怀平(CN201610806041.9)公开了一种提取羊奶乳清的方法，首先将羊奶高速离心去除脂肪，然后通过调节pH至酪蛋白等电点，再次通过离心去除酪蛋白。该方法虽较好的分离了乳清蛋白，但分离出的乳清中并不含有β-酪蛋白，所以分离方法有待提高；余世安(CN201810967916.2)公开了一种通过膜过滤生产奶粉的方法，首先将羊乳杀菌，然后将杀菌羊乳倒入膜过滤装置进行分离，在脱乳清生羊乳中添加牛乳清蛋白等制得牛羊湿混料；经过均质、杀菌、喷雾干燥、添加核苷酸等后制得牛羊混合婴幼儿配方奶粉。但其膜过滤温度较高，对β-酪蛋白的分离会有抑制作用，所以制的乳清蛋白配料中并不含有β-酪蛋白。专利(CN 106417888 A)公开了一种低温微滤分离牛乳β-酪蛋白和乳清蛋白以模拟人乳蛋白组成的方法，其是以脱脂乳、全脂乳、脱脂乳粉、浓缩乳蛋白粉等为原料，首先采用柠檬酸盐、葡萄糖酸-δ-内酯等螯合剂或酸化剂做脱钙预处理，然后在低温(0-15℃)条件下采用30nm陶瓷膜或聚醚砜膜等进行微滤和洗滤，选择性的使β-酪蛋白和乳清蛋白富集到透过液中，所得透过液经超滤浓缩脱除乳糖和矿物质后，再通过喷雾干燥脱水，制备得到富含β-酪蛋白和乳清蛋白的高蛋白粉。但是其采用的原料为市售脱脂巴杀牛乳，且采用的干燥方式为常温常压喷雾干燥，所以得到的牛乳乳清蛋白配料活性较低。
发明内容
[技术问题]
目前从奶酪加工的副产品(乳清)中分离乳清蛋白，但是分离出来的液体中不含有β-酪蛋白；而且，常规微滤分离的温度较高，使得β-酪蛋白的分离存在抑制作用；且很多分离集中于牛乳，对羊乳的分离研究较少；另由于羊乳与牛乳酪蛋白胶束粒径不同，羊乳粒径为180-301nm，牛乳粒径为50-180nm，所以两者的分离也存在很大的区别。
关于β-酪蛋白诱导分离的方法中，有等电点分离、色谱分离、膜分离等，但这些方法均为分离酪蛋白和乳清蛋白，并未分离含有β-酪蛋白的乳清蛋白，且膜过滤分离过程中温度过高，所以得到的蛋白活性较低。
因此，亟需一种能够诱导羊乳中β-酪蛋白从胶束中解离，从而制备富含β-酪蛋白和乳清蛋白的功能性乳蛋白，以使羊乳蛋白在分子组成水平上更接近人乳蛋白，从而推进配方乳粉等婴幼儿食品的研制。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题，本发明直接以新鲜羊乳为原料，采用微滤除菌法进行杀菌处理，从而在一定程度上减少活性营养物质的损失；而且本发明采用膜分离技术从新鲜羊乳中分离乳清蛋白和酪蛋白，可以让有益物质通过膜孔的同时，滤除有害细菌，较大程度上保留羊乳中的活性免疫球蛋白、乳铁蛋白、抗氧化酶等营养成分和功能特性，为消费者提供更多的鲜活营养。此外，通过本发明的方法得到的富含β-酪蛋白和乳清蛋白的高活性蛋白粉，可作为一种新型的功能性乳蛋白配料，以替代乳清蛋白而用于配方乳粉等婴幼儿食品的研发和生产。
本发明的第一个目的是提供一种诱导羊乳β-酪蛋白从胶束中解离的方法，包括如下步骤：
将脱脂羊乳除菌后，加入解离剂混合均匀，之后在4-10℃、pH5.4-5.8下平衡120-240min，分离得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述的解离剂包括柠檬酸钠、氯化钠，其中柠檬酸钠在除菌脱脂羊乳中的浓度为1-5mmol/L，进一步优选为5mmol/L，氯化钠在除菌脱脂羊乳中的浓度为25-250mmol/L，进一步优选为250mmol/L。
在本发明所述的一种实施方式中，所述的分离包括离心、微滤分离。
在本发明的一种实施方式中，所述的离心具体为：在4℃、离心转速为30000-35000rpm下离心50-80min，进一步优选为在4℃、离心转速为31100rpm下离心60min。
在本发明的一种实施方式中，所述的微滤分离具体为：采用50-100nm的微滤膜进行微滤分离。
在本发明的一种实施方式中，所述平衡的温度为4℃，pH为5.8，时间为120min。
本发明的一种实施方式中，所述的除菌是采用微滤除菌，将脱脂乳采用1.4μm孔径陶瓷膜进行除菌处理。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的含有β-酪蛋白的高活性乳清蛋白。
本发明的第三个目的是提供一种低温诱导分离羊乳β-酪蛋白和乳清蛋白的方法，包括如下步骤：
将脱脂羊乳除菌后，加入解离剂混合均匀，之后在4-10℃、pH5.4-5.8下平衡120-240min，之后采用50-100nm的微滤膜进行微滤，得到第一份透过液；之后加水至原体积重复上述微滤的步骤，得到透过液，而后进行超滤、洗滤、浓缩得到含有β-酪蛋白的高活性浓缩乳清蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述的低温诱导分离羊乳β-酪蛋白和乳清蛋白的方法包括如下步骤：
将脱脂羊乳除菌后，加入解离剂混合均匀，之后在4-10℃、pH5.4-5.8下平衡120-240min，之后采用50-100nm的微滤膜进行微滤，得到第一份透过液；之后在截流液中添加4℃的水至原体积，重复微滤操作得到第二部分透过液，重复上述步骤5次，得到六部分的透过液，然后将所有的透过液混匀，而后进行超滤、洗滤、浓缩得到含有β-酪蛋白的高活性浓缩乳清蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述的浓缩倍数为1-5。
在本发明的一种实施方式中，所述的洗滤次数为1-5次。
在本发明的一种实施方式中，所述的超滤浓缩是采用孔径为10kDa的有机膜进行超滤浓缩。
在本发明的一种实施方式中，所述的方法包括如下步骤：
取生鲜羊乳，4℃以下保存运输后，置于碟片式离心机中离心脱脂(9000rpm)至脂肪含量＜0.1％，得到脱脂羊乳；然后采用1.4μm陶瓷膜对脱脂羊乳进行过滤，保持脱脂羊乳温度为50℃，错流分离，收集透过液，得到除菌脱脂羊乳；之后在除菌脱脂羊乳中加入解离剂混合均匀，之后在4-10℃、pH5.4-5.8下平衡120-240min，然后采用100nm陶瓷膜对预处理样品进行分离，保持分离温度为4℃，错流分离，收集透过液，使得分离后的截留液浓缩倍数为3倍，共洗滤5次(洗滤是将截留液加水至原体积，之后进行再次微滤)，再进行超滤浓缩，得到含有β-酪蛋白的浓缩乳清蛋白。
本发明的第四个目的是本发明的方法得到的含有β-酪蛋白的高活性浓缩乳清蛋白。
本发明的第五个目的是提供一种制备含有β-酪蛋白的高活性乳清蛋白粉的方法，包括如下步骤：
将本发明所述的含有β-酪蛋白的高活性浓缩乳清蛋白经低温低压喷雾干燥得到；其中低温低压喷雾干燥的条件为进风温度70-80℃，出风温度50-55℃，真空度0.02-0.04MPa。
本发明的第六个目的是本发明所述的方法制备得到的含有β-酪蛋白的高活性乳清蛋白粉。
[有益效果]
(1)本发明通过低温平衡放置、调整pH和解离剂的相互配合实现了解离β-酪蛋白含量达到23.72％以上，可以高达49.26％。
(2)将本发明的方法得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白通过低温低压喷雾干燥的方法制备得到乳清蛋白粉，其LPO活性达到4.68U/mg乳清粉以上，IgG含量达到0.43g/g乳清粉以上，LF含量达到0.78g/g乳清粉以上，β-酪蛋白含量达到31.53％以上。
附图说明
图1为不同平衡时间诱导解离β-酪蛋白电泳图。
图2为不同pH值诱导解离β-酪蛋白电泳图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
测试方法：
1、游离蛋白组成的电泳分析：取处理过后得到的上清液，采用超纯水稀释8倍，与含5％β-巯基乙醇的样品缓冲液等体积混合，沸水浴3min后冷却，上样量为20μL。浓缩胶和分离胶浓度为4和13％，所采用的电流为20和45mA/胶。
2、游离蛋白组成的液相分析：取处理过后得到的上清液，与缓冲液1(0.1M Bis-Tris丙烷、pH 7、8mom/L尿素、20mmol/L DTT，1.3％柠檬酸钠)等体积混合，室温振荡1h后31100rpm离心5min，取上清液与缓冲液2(乙腈-水-三氟乙酸、100:900:1、v/v/v，6M Urea)以1:3体积比混合，过0.45μm有机膜。采用C8色谱柱，上样量40μL，梯度洗脱所用的流动相A和B中乙腈-水-三氟乙酸的体积比分别为100：900：1和900：100：0.7，流速0.8mL/min，检测波长为220nm。采用Empower软件对各个色谱峰的面积进行积分。
3、解离β-酪蛋白相对含量：解离β-酪蛋白的相对含量为诱导解离后乳清蛋白中含有的β-酪蛋白与脱脂杀菌乳中含有的总的β-酪蛋白含量的比值。即：
解离β-酪蛋白相对含量(％)＝S1/S2×100％
注：S1为诱导解离乳清液含有的β-酪蛋白液相图中峰面积，S2脱脂杀菌羊乳中β酪蛋白的液相图积分后得到的峰面积。
实施例1
一种诱导羊乳β-酪蛋白从胶束中解离的方法，包括如下步骤：
羊乳经乳脂分离器去除脂肪，脱脂至脂肪含量＜0.1％，收集生鲜脱脂羊乳，然后进行膜过滤操作，采用1.4μm陶瓷膜，保持羊乳温度为45-50℃，错流分离，收集透过液，即为膜除菌脱脂羊乳；之后在除菌脱脂羊乳中加入解离剂氯化钠(浓度为250mmol/L)混合均匀，之后在4℃、pH 5.8下平衡120min，最后在4℃、离心转速为31100rpm下离心60min得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
对照例1
省略实施例1中解离剂氯化钠的添加，其他和实施例1保持一致，得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
实施例2
调整实施例1中氯化钠的浓度为25、50、100、150mmol/L，其他和实施例1保持一致，得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
将实施例2得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白进行性能测试，测试结果如下表1，从表中可以看出，设置平衡温度为4℃，时间为120min，调节pH 5.8，随着氯化钠浓度升高，解离β-酪蛋白含量逐渐升高，当氯化钠添加浓度为250mmol/L时，β-酪蛋白的解离相对含量可达49.26％。
表1实施例2的测试结果
Figure BDA0002967176030000061
实施例3
调整实施例1中的解离剂为柠檬酸钠，且调整其浓度为0.5、1、2、3、5mmol/L，其他和实施例1保持一致，得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
将实施例3得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白进行性能测试，测试结果如下表2，从表2可以看出，设置平衡温度为4℃，时间为120min，调节pH 5.8，随着柠檬酸钠浓度升高，解离β-酪蛋白含量逐渐升高，当柠檬酸钠添加浓度为5mmol/L时，β-酪蛋白的解离相对含量可达44.88％。
表2实施例3的测试结果
Figure BDA0002967176030000062
对照例2
调整实施例3中的柠檬酸钠为氯化钙，且调整其浓度为0、2.5、5、10、15、25mmol/L，其他和实施例3保持一致，得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
将对照例2得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白进行性能测试，测试结果如下表3：
表3对照例2的测试结果
Figure BDA0002967176030000071
对照例3
将实施例1得到的除菌脱脂羊乳直接在25℃、离心转速为31100rpm下离心60min得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
对照例4
将实施例1得到的除菌脱脂羊乳直接在4℃、离心转速为31100rpm下离心60min得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
将对照例3、4得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白进行性能测试，测试结果如下：
表4对照例3、4的测试结果
Figure BDA0002967176030000072
实施例4在未加解离剂下进行平衡参数的优化
(1)平衡时间的优化
羊乳经乳脂分离器去除脂肪，脱脂至脂肪含量＜0.1％，收集生鲜脱脂羊乳，然后进行膜过滤操作，采用1.4μm陶瓷膜，保持羊乳温度为45-50℃，错流分离，收集透过液，即为膜除菌脱脂羊乳；之后在4℃、pH 5.8下平衡0、15、30、60、120、180、240min，最后在4℃、离心转速为31100rpm下离心60min得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
将得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白进行性能测试，测试结果如下表5和图1：
表5平衡时间优化的测试结果
Figure BDA0002967176030000081
(2)平衡pH的优化
羊乳经乳脂分离器去除脂肪，脱脂至脂肪含量＜0.1％，收集生鲜脱脂羊乳，然后进行膜过滤操作，采用1.4μm陶瓷膜，保持羊乳温度为45-50℃，错流分离，收集透过液，即为膜除菌脱脂羊乳；之后在4℃、pH为5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4下平衡120min，最后在4℃、离心转速为31100rpm下离心60min得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
将得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白进行性能测试，测试结果如下表6和图2：
表6平衡pH优化的测试结果
Figure BDA0002967176030000082
(3)平衡温度的优化
羊乳经乳脂分离器去除脂肪，脱脂至脂肪含量＜0.1％，收集生鲜脱脂羊乳，然后进行膜过滤操作，采用1.4μm陶瓷膜，保持羊乳温度为45-50℃，错流分离，收集透过液，即为膜除菌脱脂羊乳；之后在4、10、15、25℃、pH5.8下平衡120min，最后在4℃、离心转速为31100rpm下离心60min得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
将得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白进行性能测试，测试结果如下表7：
表7平衡温度优化的测试结果
Figure BDA0002967176030000091
实施例5最佳膜孔径的优化
羊乳经乳脂分离器去除脂肪，脱脂至脂肪含量＜0.1％，收集生鲜脱脂羊乳，然后进行膜过滤操作，采用1.4μm陶瓷膜，保持羊乳温度为45-50℃，错流分离，收集透过液，即为膜除菌脱脂羊乳；设置膜孔径为30、50、100nm，保持分离温度为4℃，错流分离，收集透过液，使得分离后的截留液浓缩倍数为3倍，得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白透过液。
将得到的含有β-酪蛋白的乳清蛋白进行性能测试，测试结果如下表8：
表8膜孔径优化的测试结果
孔径(mm) β-酪蛋白透过率(％)
100nm 14.07±1.89
50nm 12.44±1.05
30nm 6.42±0.87
实施例6
一种制备含有β-酪蛋白的乳清蛋白粉的方法，包括如下步骤：
羊乳经乳脂分离器去除脂肪，脱脂至脂肪含量＜0.1％，收集生鲜脱脂羊乳，然后进行膜过滤操作，采用1.4μm陶瓷膜，保持羊乳温度为45-50℃，错流分离，收集透过液，即为膜除菌脱脂羊乳；之后在除菌脱脂羊乳中加入解离剂氯化钠(浓度为250mmol/L)混合均匀，之后在4℃、pH5.8下平衡120min，最后在4℃、采用实施例优化结果中的100nm陶瓷膜进行分离，保持分离温度为4℃，错流分离，收集透过液，使得分离后的截留液浓缩倍数为3倍，共洗滤5次(洗滤是将截留液加水至原体积，之后进行再次微滤)，得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白；之后采用10Kda的有机膜进行超滤，超滤倍数为20；再进行喷雾干燥，其中喷雾干燥的条件为：进风口温度75℃，出风口温度55℃，真空度0.03MPa，得到含有β-酪蛋白的高活性乳清蛋白粉。
将得到的乳清蛋白粉进行性能测试，测试结果如下：
表9乳清粉蛋白的性能测试
Figure BDA0002967176030000101
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种诱导羊乳β-酪蛋白从胶束中解离的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将脱脂羊乳除菌后，加入解离剂混合均匀，之后在4-10℃、pH5.4-5.8下平衡120-240min，分离得到含有β-酪蛋白的乳清蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的解离剂包括柠檬酸钠、氯化钠，其中柠檬酸钠在除菌脱脂羊乳中的浓度为1-5mmol/L；氯化钠在除菌脱脂羊乳中的浓度为25-250mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的分离包括离心、微滤分离，其中离心具体为：在4℃、离心转速为30000-35000rpm下离心50-80min；微滤分离具体为采用50-100nm的微滤膜进行微滤分离。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的除菌是采用微滤除菌，将脱脂乳采用1.4μm孔径陶瓷膜进行除菌处理。
5.权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的含有β-酪蛋白的高活性乳清蛋白。
6.一种低温诱导分离羊乳β-酪蛋白和乳清蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将脱脂羊乳除菌后，加入解离剂混合均匀，之后在4-10℃、pH5.4-5.8下平衡120-240min，之后采用50-100nm的微滤膜进行微滤，得到第一份透过液；之后加水至原体积，重复上述微滤的步骤，得到透过液，而后进行超滤、洗滤、浓缩得到含有β-酪蛋白的高活性浓缩乳清蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的浓缩倍数为1-5；所述的洗滤次数为1-5次。
8.权利要求6或7所述的方法制备得到的含有β-酪蛋白的高活性浓缩乳清蛋白。
9.一种制备含有β-酪蛋白的高活性乳清蛋白粉的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求8所述的含有β-酪蛋白的浓缩乳清蛋白经低温低压喷雾干燥得到；其中低温低压喷雾干燥的条件为进风温度70-80℃，出风温度50-55℃，真空度0.02-0.04MPa。
10.权利要求9所述的方法制备得到的含有β-酪蛋白的高活性乳清蛋白粉。
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